專利名稱：山葡萄酒中酒石酸降解菌的篩選方法及應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種山葡萄酒中酒石酸降解菌的篩選方法及應用，是一種利用微生物
黑曲霉降低山葡萄酒中酒石酸含量的方法，屬于食品加工領域。
背景技術：
山葡萄產于我國東北地區，與歐亞種釀酒葡萄相比存在較大差異，其含糖量很低， 一般為130 150g/L，而含酸量卻很高，其成熟果實的可滴定酸含量就在15 25g/L(以酒 石酸計)之間。但是正常干型葡萄酒要求酸度在8g/L左右。而目前針對山葡萄酒的降酸 問題還未提出有效的解決方法，因此，山葡萄酒的降酸方法有待進一步提高。
傳統的降酒石酸方法是通過物理方法和化學方法處理達到降酸目的，但傳統的方 法需要借助冷凍設備及需要消耗大量的酒石酸鉀，能源消耗和生產成本較大，并且口感不 協調，降酸幅度達不到理想標準。雖然隨著現代發酵工程技術和基因工程技術的發展，目前 研究出了針對蘋果酸的微生物降酸方法，而利用生物技術降低酒石酸在目前卻沒有報道。
發明內容
本發明的目的在于提供一種山葡萄酒中酒石酸降解菌的篩選方法及應用，其采用 生物技術篩選能降解酒石酸的微生物——黑曲霉菌，并利用該微生物降低山葡萄酒中的酒 石酸含量，確定最佳的降酸參數，以解決葡萄酒中酒石酸的生物降解問題，從而達到降酸的 目的，更好地控制并且容易操作，能更好地改善山葡萄酒的品質。 本發明的技術方案是這樣實現的一種山葡萄酒中酒石酸降解菌的篩選方法及應 用，其特征在于降解山葡萄酒中酒石酸的有效菌為黑曲霉，具體的篩選方法如下采集葡 萄園土壤和生產酒石酸工廠附近的土壤的土樣2g定量加到盛有100mL無菌生理鹽水的三 角瓶中，并加入8 12粒無菌玻璃珠(直徑為3 5mm)，充分振蕩后靜置，取上清液再分別 加入到以濃度為2g/L的酒石酸為唯一碳源的液體富集培養基中進行富集培養，培養條件 為28t:，160r/min，搖床振蕩培養，以72h為一個周期，每個周期結束后，按照以上的操作， 依次將所培養的菌液轉接入新鮮的富集培養基中，同時酒石酸濃度由2g/L、4g/L、6g/L、8g/ L逐漸遞增到10g/L ;再通過初篩和復篩后選出對酒石酸具有較好降酸效果的菌種黑曲霉；
將篩選得到的降酸菌——黑曲霉用平板劃線法進行多次分離純化后，挑取單菌落 接入到YEPD斜面培養基上于2『C培養72h后fC保存。
降酸應用過程如下 將山葡萄原料進行破碎后加入0. 05%的果膠酶和100mg/L的S02，浸汁12小時后 用汁渣分離機進行分離壓榨出汁，澄清后進行降酸發酵，在30 35t:條件下接入降酒石酸 有效菌——黑曲霉后再對葡萄汁進行澄清處理，酒精發酵是在20 25t:條件下接入釀酒 酵母菌，酒精發酵結束后再進行澄清、分離，最后進入陳釀工序。 菌種鑒定通過對篩選后的菌落形態、個體顯微形態和分子生物進行鑒定，如圖1 所示，對所篩選出的具有較高降酸效果的菌株F1進行菌落形態觀察、顯微形態觀察、生理
3生化試驗鑒定以及分子生物學鑒定試驗。最終通過鑒定試驗確定篩選所得到的具有降酒 石酸能力的菌株(命名為F1)屬于曲霉屬[Aspergillus Micheli ex Fr.]中的黑曲霉組 [A. niger]。
不同因素對菌株F1降解酒石酸情況的影響考慮的因素主要有接種量、溫度、酒
石酸濃度、通氣量和菌齡；其中溫度和接種量對降酸率的影響較為明顯。產品標準菌株耐酒精度4%以上；菌株耐S02濃度為400mg/L ;酒石酸降解率
50%以上，可適應山葡萄酒的降酸要求。
檢測方法酸度檢測采用氫氧化鈉滴定法(以酒石酸計)。 本發明的積極效果是采用微生物——黑曲霉降解葡萄酒中的酒石酸，是在35t:溫 度下靜止培養3d后，降酸率能達到70%以上，該菌株具有較高的耐S02能力，對酒精的耐受 性能達到4%以上，該黑曲霉采用巴氏殺菌的方式在65t:、30min或85t:、5min即可達到殺 菌的目的，并且通過毒性鑒定試驗確定該黑曲霉菌株無任何毒副作用，可以運用到葡萄酒 的生產工藝中；與以往的物理降酸方法和化學降酸方法相比，它不需要采用任何特殊設備 及原料，成本低，降酸操作過程容易控制，也不會向葡萄酒中引入其他金屬離子，且降酸率 較高。試驗得出將菌齡為4d的菌種以4X的接種量(孢子液濃度為8X106個/ml)接入到 以酒石酸為唯一碳源的培養液中，在35t:、160r/min的條件下恒溫振蕩培養4d后，其降酸 率能達到89%。
圖1為本發明篩選得到的10株菌株對酒石酸的降解率的比較圖表；
圖2為本發明的溫度對降解率的影響圖；
圖3為本發明的接種量對降解率的影響；
圖4為本發明的通氣量對降解率的影響；
具體實施例方式
下面結合附圖和實施例對本發明做進一步的描述
實施例1 :
1、菌種篩選； (1)富集培養將采集的樣品定量加到無菌生理鹽水中，加數粒玻璃珠，充分振蕩 后靜置取上清液分別加入到以酒石酸(酒石酸濃度為2g/L)為唯一碳源的液體富集培養基 中，28t:，160r/min，搖床振蕩培養72h。 72h為一個周期，每個周期結束后，按照以上的操 作，依次將所培養的菌液轉接入新鮮的富集培養基中，連續轉接培養多次。同時酒石酸濃度 由2g/L、4g/L、6g/L、8g/L逐漸遞增到10g/L。 (2)初篩在富集培養后取一定量的富集菌液，用生理鹽水稀釋到10—5，選擇10—3、 10—4、 10—5稀釋度，分別吸取0. 5mL稀釋液涂布于含酒石酸濃度為10g/L的瓊脂平板培養基 上，2『C恒溫培養72h。將所得的典型單菌落點植于分離培養基上，相同條件下培養。
(3)復篩將初篩所得到的單菌落用平板劃線法進行多次分離純化，挑取單菌落 接入YEPD斜面培養基于28。C培養72h后4。C保存。
2、菌種鑒定
(1)菌落形態觀察；將分離出的菌株分別接種于各種類型的培養基上，在3(TC下 培養3-4d，對形成的菌落進行特征觀察并記錄。
(2)顯微形態觀察；采用光學顯微鏡觀察菌株的細胞形態。
(3)生化試驗鑒定；對篩選出的菌株做淀粉水解試驗、明膠液化試驗、M R試驗、硝
酸鹽還原試驗等各種生化鑒定試驗，觀察菌株對各種碳源和氮源的利用情況。 (4)分子生物學鑒定；測定該菌株的ITS保守序列組成，并與Genbank中的相關
序列進行比對，以確定該菌的具體種類。結果得出該菌株的ITS基因序列與黑曲霉的同
源性和相似性分別為98%、99%，可鑒定該菌株為半知菌類[F皿gi Imperfecti]、曲霉屬中的黑曲霉組[A. niger]。 3、菌種特性 (1)菌種生長曲線的測定；將菌株以相同的接種量接入多瓶相同體積的培養液 中，在30°C ， 160r/min條件下搖床培養，每隔24h取出三瓶培養液過濾菌絲體并稱量菌絲體 干重，取其平均值以確定菌株的生長曲線，結果得到該菌株的對數生長期為4 6d。
(2)最適生長溫度；將菌株以相同的接種量接入多瓶相同體積的培養液中，分別 在18"、2(TC、25t:、28t:、3(rC、35t:的條件下160r/min恒溫搖床培養，每個溫度做三個處 理，培養3d后過濾稱量菌絲體干重，結果得出該菌株的最適生長溫度為30°C 。
(3)最適生長pH值；將菌株以相同的接種量分別接入pH值為2.0、2.5、3.0、3.5、 4. 0、4. 5、5. 0的相同體積培養液中，在30°C， 160r/min條件下恒溫搖床培養，每個酸度做三 個處理，培養3d后過濾稱量菌絲體干重，結果得到該菌株的最適宜生長pH為3. 0。
(4)最適生長通氣量；將菌株以相同的接種量分別接入到50、100、150、200、250、 300、350mL的液體培養基中，在30°C ， 160r/min條件下恒溫搖床培養，每個通氣量做三個處 理，培養3d后過濾稱量菌絲體干重，結果得出該菌株的最適生長通氣量為300ml 。。
4、菌種耐受性試驗 (1)耐S02試驗；S02添加劑為固體偏重亞硫酸鉀，其理論S02含量為57% 。將純化 的菌種培養至對數期后分別接種到S02濃度為50 500mg/L不等的固體培養基上，3(TC恒 溫培養，得出該菌株能耐受的S02濃度為400mg/L。 (2)菌種耐酒精試驗；將純化的菌種培養至對數期后接種到含1%無水乙醇的 lOOmL液體培養基中，于30°C 、 160r/min恒溫振蕩培養72h后，在依次轉入無水乙醇含量分 別為2%、3%、4%、5% (體積比)的裝有100mL液體培養基的250mL三角瓶中，在相同條件 下培養，得出該菌株對酒精的耐受情況能達到4%以上。
5、降解參數測定 (1)不同接種量對降酸效果的影響；將培養生長至對數期的Fl孢子用無菌水洗下 制成孢子液后，分別以1 % 、2 % 、3 % 、4 % 、5 % 、6 %的接種量接種到以酒石酸為唯一碳源的 培養液中，于30°C 、 160r/min恒溫振蕩培養4d后，采用氫氧化鈉滴定法測降酸量，結果得到 當接種量為4% (孢子液濃度為8X106個/ml)時，降酸效果明顯。 (2)不同菌齡對降酸效果的影響；將培養3d、4d、5d、和6d的菌種Fl以相同的接種 量接入到以酒石酸為唯一碳源的培養液中，于3(TC、160r/min恒溫振蕩培養4d后，采用氫 氧化鈉滴定法測降酸量，結果得到菌齡為4d的菌株降酸效果好。 (3)不同溫度對降酸效果的影響；如圖2所示，將菌種Fl以相同的接種量接種到以酒石酸為唯一碳源的培養液中，分別在20°C 、25°C 、28°C 、30°C 、35°C和37°C的溫度下培
養4d后，采用氫氧化鈉滴定法測降酸量，結果得到在35t:條件下降酸幅度大。 (4)不同酒石酸濃度對降酸效果的影響；如圖3所示，將菌種Fl以相同的接種量
接種到以酒石酸為唯一碳源的培養液中，酒石酸濃度分別為lg/L、3g/L、5g/L、7g/L、9g/L、
llg/L和13g/L，于30°C、160r/min恒溫振蕩培養4d后，采用氫氧化鈉滴定法測降酸量，結
果得到酒石酸濃度的大小對該菌株的降酸效果無明顯影響。 (5)不同通氣量對降酸效果的影響；如圖4所示，將菌種F1以1ml的接種量分別接 種到以酒石酸為唯一碳源裝液量分別為50ml、 100ml、 150ml、200ml、250ml、300ml和350ml 的液體培養基中，于30°C 、 160r/min恒溫振蕩培養4d后，采用氫氧化鈉滴定法測降酸量，結 果得出菌株在通氣量為100ml的條件下降酸效果好。
權利要求
一種山葡萄酒中酒石酸降解菌的篩選方法，其特征在于降解山葡萄酒中酒石酸的有效菌為黑曲霉，具體的篩選方法如下采集葡萄園土壤和生產酒石酸工廠附近的土壤的土樣2g定量加到盛有100mL無菌生理鹽水的三角瓶中，并加入8～12粒無菌玻璃珠(直徑為3～5mm)，充分振蕩后靜置，取上清液再分別加入到以濃度為2g/L的酒石酸為唯一碳源的液體富集培養基中進行富集培養，培養條件為28℃，160r/min，搖床振蕩培養，以72h為一個周期，每個周期結束后，按照以上的操作，依次將所培養的菌液轉接入新鮮的富集培養基中，同時酒石酸濃度由2g/L、4g/L、6g/L、8g/L逐漸遞增到10g/L；再通過初篩和復篩后選出對酒石酸具有較好降酸效果的菌種黑曲霉；將篩選得到的降酸菌——黑曲霉用平板劃線法進行多次分離純化后，挑取單菌落接入到YEPD斜面培養基上于28℃培養72h后4℃保存。
2. 根據權利要求1所示的一種山葡萄酒中酒石酸降解菌的篩選方法，其特征在于所述 的降酸應用過程如下將山葡萄原料進行破碎后加入0. 05%的果膠酶和100mg/L的S(^，浸汁12小時后用 汁渣分離機進行分離壓榨出汁，澄清后進行降酸發酵，在30 35t:條件下接入酒石酸降解 菌一一黑曲霉后再對葡萄汁進行澄清處理，酒精發酵是在20 25t:條件下接入釀酒酵母 菌，酒精發酵結束后再進行澄清、分離，最后進入陳釀工序。
3. 根據權利要求1所示的一種山葡萄酒中酒石酸降解菌的篩選方法，其特征在于所述 的初篩過程如下在富集培養后取一定量的富集菌液，用生理鹽水稀釋到10—5，選擇10一3、 10—4、 10—5稀釋度，分別吸取0. 5mL稀釋液涂布于含酒石酸濃度為10g/L的瓊脂平板培養基 上，2『C恒溫培養72h。將所得的典型單菌落點植于分離培養基上，相同條件下培養。
4. 根據權利要求1所示的一種山葡萄酒中酒石酸降解菌的篩選方法，其特征在于所述 的復篩過程如下將初篩所得到的單菌落用平板劃線法進行多次分離純化，挑取單菌落接 入YEPD斜面培養基于28。C培養72h后4。C保存。
5. 根據權利要求1所示的一種山葡萄酒中酒石酸降解菌的篩選方法，其特征在于所述 的菌種鑒定方法如下(1) 菌落形態觀察；將分離出的菌株分別接種于各種類型的培養基上，在3(TC下培養 3-4d，對形成的菌落進行特征觀察并記錄。(2) 顯微形態觀察；采用光學顯微鏡觀察菌株的細胞形態。(3) 生化試驗鑒定；對篩選出的菌株做淀粉水解試驗、明膠液化試驗、MR試驗、硝酸鹽 還原試驗等各種生化鑒定試驗，觀察菌株對各種碳源和氮源的利用情況。(4) 分子生物學鑒定；測定該菌株的ITS保守序列組成，并與Genbank中的相關序 列進行比對，以確定該菌的具體種類。結果得出該菌株的ITS基因序列與黑曲霉的同源 性和相似性分別為98%、99%，可鑒定該菌株為半知菌類[Fungi Imperfecti]、曲霉屬 [AspergillusMicheli ex Fr.]中的黑曲霉組[A. niger]。
全文摘要
本發明涉及一種山葡萄酒中酒石酸降解菌的篩選方法及應用，其特征在于采集葡萄園土壤和生產酒石酸工廠附近的土壤的土樣加到無菌生理鹽水中，加入玻璃珠，充分振蕩后靜置，取上清液再分別加入到以濃度為2g/L的酒石酸為唯一碳源的液體富集培養基中進行富集培養，培養條件為28℃，160r/min，搖床振蕩培養，以72h為一個周期，每個周期結束后，按照以上的操作，依次將所培養的菌液轉接入新鮮的富集培養基中，同時酒石酸濃度由2g/L、4g/L、6g/L、8g/L逐漸遞增到10g/L；再通過初篩和復篩后選出對酒石酸具有較好降酸效果的菌種黑曲霉；其不需要特殊設備及原料，成本低，降酸操作過程容易控制，且降酸率能達到89％。
文檔編號C12R1/685GK101735957SQ201010030818
公開日2010年6月16日 申請日期2010年1月8日 優先權日2010年1月8日
發明者文連奎, 王治同, 趙薇, 邊忠博 申請人:吉林農業大學