專利名稱：通過在體內遞送的胰島轉錄因子基因再生胰島和逆轉糖尿病的制作方法
技術領域：
本發明涉及糖尿病的治療，更具體而言，涉及用于細胞再生的組合物和方法，所述的細胞是葡萄糖反應的、產生胰島素的細胞。
背景技術：
在不限制本發明范圍的情況下，就糖尿病描述了本發明的背景。糖尿病影響全世界大約2億人并且越來越流行。據估計，糖尿病是世界上第五大死亡原因，并且導致嚴重的并發癥，這些并發癥包括心血管疾病、慢性腎病、失明和神經病。盡管對于糖尿病有多種藥物治療，包括胰島素療法，但充分的血糖控制常常是困難的，部分原因是這些藥物不能復制正常胰島的葡萄糖調節功能。因此，新的治療策略已經集中在通過胰島移植或β細胞再生補充糖尿病的兩種主要形式所共有的β細胞量的缺乏。授予Kojima的第6，232，288號美國專利中示教了在糖尿病治療領域中的一個有希望的機會，該專利關于用于提高胰腺功能的組合物。Kojima示教了使用β細胞素 (betacellulin, BTC)蛋白自身或其片段以促進未分化的胰腺細胞分化為產生胰島素的β 細胞或產生胰多肽的F細胞。BTC蛋白組合物提高了患者對葡萄糖的耐受性并抑制了未分化的胰腺細胞的生長。還提供了用于治療包括人類在內的哺乳動物的方法，然而，通過靜脈注射向患者提供β細胞素蛋白沒有實現糖尿病病情的長期治療。發明概述在一個實施方案中，本發明包括用于在胰腺中超聲靶向破壞微泡的組合物和方法，所述組合物包括在微泡之內和附近接觸的預裝配的脂質體-核酸復合物，其中所述預裝配的脂質體-核酸復合物包含在啟動子控制下的NeuroD基因，其中胰腺的靶點微泡的破壞將核酸遞送到位于超聲破壞位置的胰腺細胞，其中摻入核酸的細胞對高血糖水平作出反應表達胰島素。在一個方面，該組合物還包含與高表達、可調節的胰島素啟動子區可操作地連接的一個或多個胰島素反應調節基因，所述胰島素啟動子區包含在NeuroD的轉錄起始位點上游的區域中SEQ ID NO. :1的50個連續堿基。在另一個方面，該組合物還包含一個或多個基因，所述基因選自與胰島素啟動子區可操作地連接的一個或多個胰島素反應調節基因，所述胰島素反應調節基因選自ngn3、GLPl、PDXl、Mafa、β細胞素、Nkx2. 2、Nkx6. 1、 PAX4、Isll、細胞周期蛋白(Cyclin)D2(和細胞周期蛋白家族的其他成員)、CDK4(和細胞周期蛋白依賴性激酶家族的其他成員)和針對細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑的siRNA，例如pl6 (和INK4家族的其他成員)或p27 (和CIP/KIP家族的其他成員)。在又一個方面，該組合物還包含與該組合物聯合給藥的藥物，其中所述藥物選自抗細胞凋亡劑、抗炎劑、JNK 抑制劑、GLP-1、他克莫司、西羅莫司、阿那白滯素、Dervin聚酰胺或它們的組合。在另一個實施方案中，本發明包括在包含NeuroD的微泡的胰腺中利用超聲靶向破壞微泡再生胰腺β細胞的組合物和方法。在一個方面，所述的NeuroD是重組的NeuroD。 在另一個方面，該組合物還包含在CUBI、RIP2. 1、RIP3. 1或HIP3. 1啟動子的控制下的NeuroD基因，并且NeuroD在已通過超聲靶向破壞微泡進行靶向表達的細胞中表達。本發明的再另一個實施方案是用于在糖尿病患者的體內和原位再生胰島素反應細胞的方法，該方法包括向胰腺遞送有效量的，其中胰腺中的細胞對血液中的高葡萄糖水平作出反應，引起細胞分泌胰島素。在一個方面，胰腺細胞中有效量的NeuroD包含遞送表達NeuroD基因的外源核酸片段。在另一個方面，通過超聲靶向破壞微泡將NeuroD遞送至胰腺。在再另一個方面，胰腺細胞中有效量的NeuroD包括遞送外源核酸片段，該外源核酸片段表達CUBI、RIP2. 1、RIP3. 1或HIP3. 1啟動子控制下的NeuroD基因。本發明的再一個實施方案是使得靶細胞變得對胰島素反應的方法，該方法包括 制備核酸片段，所述核酸片段包含在胰島素反應啟動子的控制下的NeuroD基因，所述胰島素反應啟動子選自CUBI、RIP2. 1、RIP3. 1或HIP3. 1啟動子；使該核酸片段載入微泡；向患者注射微泡；將核酸片段遞送至胰腺細胞中；和使靶細胞保持在對于表達所述的胰島素反應調節基因有效的條件下；其中，靶細胞中NeuroD的表達引起細胞對高血糖作出反應。在一個方面，所述方法還包括將一個或多個基因遞送至胰腺，所述基因選自在啟動子控制下的PDXl、Nkx2. 2、Nkx 6. 1、PAX4、MafA、ngn3和它們的組合。在另一個方面，所述方法還包括遞送與該組合物聯合給藥的藥物，其中，所述藥物選自抗細胞凋亡劑、抗炎劑、JNK抑制劑、GLP-1、他克莫司、西羅莫司、阿那白滯素、Dervin聚酰胺或它們的組合。在一個方面，所述微泡包含預裝配的脂質體-核酸復合物脂質體。在另一個方面，所述微泡包含預裝配的脂質體-核酸復合物脂質體，所述脂質體-核酸復合物脂質體含有與質粒混合的二棕櫚酸磷脂酰膽堿和二棕櫚酰基磷脂酰乙醇胺甘油的預裝配的脂質體-核酸復合物脂質體。在再另一個實施方案中，本發明包括恢復胰島素反應性的方法，該方法包括下述步驟獲得分離的核酸片段，該核酸片段包含與高表達胰島素啟動子區可操作地連接的一個或多個胰島素反應調節基因，所述胰島素啟動子區包含胰島素啟動子的基因組片段，所述胰島素啟動子的基因組片段包括胰島素基因的5’非翻譯區、外顯子1、內含子1和外顯子 2 ；將該核酸片段轉移到靶細胞中；和使靶細胞保持在對于表達胰島素反應調節基因有效的條件下；其中靶細胞中胰島素反應調節基因的表達引起細胞對高血糖作出反應。在一個方面，胰島素反應細胞是動物的。在另一個方面，與胰島素啟動子區可操作地連接的一個或多個胰島素反應調節基因存在于病毒載體或質粒載體中。在另一個方面，與胰島素啟動子區可操作地連接的一個或多個胰島素反應調節基因選自NeuroD、ngn3、GLP1、PDX1、Mafa、β 細胞素、Nkx2. 2、Nkx6. l、PAX4、Isll、細胞周期蛋白D2(和細胞周期蛋白家族的其他成員)、 CDK4(和細胞周期蛋白依賴性激酶家族的其他成員)和針對細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑的siRNA，例如pl6 (和INK4家族的其他成員)或p27 (和CIP/KIP家族的其他成員)。本發明的另一個實施方案是恢復胰島素反應性的方法，該方法包括下述步驟獲得分離的核酸片段，該核酸片段包含與胰島素啟動子區可操作地連接的一個或多個胰島素反應調節基因，所述的胰島素啟動子區包含胰島素啟動子的基因組片段，該胰島素啟動子的基因組片段包括胰島素基因的5’非翻譯區、外顯子1、內含子1和外顯子2 ；將所述的核酸片段轉移到胰腺細胞中；和使靶細胞保持在對于表達胰島素反應調節基因有效的條件下；其中靶細胞中胰島素反應調節基因的表達引起細胞對高血糖作出反應。在一個方面，所述的胰島素啟動子區包括在轉錄起始位點的區域上游中SEQ ID NO. :1的100至500個連續堿基。在一個實施方案中，所述的胰島素啟動子區包括SEQ ID NO. :1中轉錄起始位點上游的全部區域，或者甚至轉錄起始位點的區域上游中SEQ ID NO. :1的100至500個連續堿基。另一個方面是包含高表達胰島素啟動子區的分離的核酸，該高表達胰島素啟動子區包含一個或多個胰島素反應基因的轉錄起始位點的區域上游中SEQ ID NO. :1的50個連續堿基。在又一個實施方案中，本發明是用于在胰腺中超聲靶向破壞微泡的組合物，該組合物包含與微泡接觸的預裝配的脂質體-核酸復合物，其中預裝配的脂質體-核酸復合物包含與高表達、可調節胰島素啟動子區可操作地連接的一個或多個胰島素反應調節基因，所述胰島素啟動子區包含胰島素啟動子的基因組片段，所述胰島素啟動子的基因組片段包含胰島素基因的5’非翻譯區、外顯子1、內含子1和外顯子2，其中在胰腺中靶點處微泡的超聲破壞將核酸遞送到超聲破壞位置的胰腺細胞。在一個方面，所述的預裝配的脂質體-核酸復合物包含陽離子脂質、陰離子脂質或它們的混合物和組合。在另一個方面，在藥學上可接收的載體中處理所述的微泡。在另一個方面，活性劑核酸包含胰島素基因。在一個方面，所述的活性劑核酸包含含有啟動子控制下的己糖激酶基因的核酸載體。在另一個方面，所述的活性劑核酸包含含有啟動子控制下的NeuroD基因的核酸載體。所述的預裝配的脂質體-核酸復合物脂質體可以是例如與質粒混合的二棕櫚酸磷脂酰膽堿和二棕櫚酰基磷脂酰乙醇胺甘油。在另一個方面，所述組合物還可以包含覆蓋層。在另一個方面，所述組合物還可以包含與胰島素啟動子區可操作地連接的一個或多個胰島素反應調節基因，該胰島素反應調節基因選自 NeuroD、ngn3、GLPl、PDXl、Mafa、β 細胞素、Nkx2. 2、Nkx6. 1、PAX4、 Isll、細胞周期蛋白D2(和細胞周期蛋白家族的其他成員)、CDK4(和細胞周期蛋白依賴性激酶家族的其他成員)和針對細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑的siRNA，例如pl6(和INK4 家族的其他成員)或P27 (和CIP/KIP家族的其他成員)。通過以下方法使得細胞成為胰島素反應的，所述方法包括向細胞中注射預裝配的脂質體-核酸微泡復合物，其中，該預裝配的脂質體-核酸復合物包含胰島素啟動子控制下的NeuroD基因，所述胰島素啟動子包含與胰島素啟動子區可操作地連接的一個或多個胰島素反應調節基因，該胰島素啟動子區包含胰島素啟動子的基因組片段，該胰島素啟動子的基因組片段包含胰島素基因的5’非翻譯區、外顯子1、內含子1和外顯子2，其中，在胰腺中靶位點處微泡的破壞將核酸遞送至超聲破壞位置的胰腺細胞，其中，摻入核酸的細胞對高血糖水平作出反應，表達胰島素。在一個方面，所述細胞還包含與可調節胰島素啟動子區可操作地連接的一個或多個胰島素反應調節基因，所述可調節胰島素啟動子區包含來自 NeuroD基因的胰島素起始位點上游的區域上游的50個連續堿基。在另一個方面，所述細胞還包含一個或多個基因，所述基因選自與胰島素啟動子區可操作地連接的一個或多個胰島素反應調節基因，該胰島素反應調節基因選自ngn3、GLPl、PDXl、Mafa、β細胞素、Nkx2.2、 Nkx6. 1、PAX4、Isll、細胞周期蛋白D2 (和細胞周期蛋白家族的其他成員)、CDK4 (和細胞周期蛋白依賴性激酶家族的其他成員)和針對細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑的siRNA，例如pl6 (和INK4家族的其他成員)或p27 (和CIP/KIP家族的其他成員)。附圖的簡要說明附圖中相同的參考編號在分離的視圖中是指相同或功能上類似的元件，將其并入說明書中并形成說明書的一部分，附圖進一步說明本發明并與發明詳述一起用于解釋本發明的原理。
圖1是大鼠胰島素啟動子區和外顯子1、內含子1和外顯子2的示意圖。大鼠胰島素啟動子顯示具有已知的序列元件和融合的外顯子1與外顯子2 ；圖2 頂部的圖(top panel)是在三種不同的葡萄糖濃度下轉染rips-luc之后48 小時INS-I細胞溶解的熒光素酶活性。底部的圖(bottom panel)是在高葡萄糖濃度下轉染 rips-luc之后，在不同的培養時間，培養基溶液的熒光素酶活性，在沒有葡萄糖和正常葡萄糖濃度中沒有熒光素酶活性(數據未顯示)；圖3 (3A) :RIP3. I-DsRed載玻片，頂部左側綠色表示抗胰島素；頂部中間紅色表示抗-dsred;頂部右側表示它們的共聚焦圖像。底部表示連續的切片和類似的胰島結構，底部左側綠色表示抗胰高血糖素；底部中間紅色表示抗-dsred。底部右側表示它們的共聚焦圖像。(3B) :RIP-4. 1-dsred ； (3C) :RIP-1. 1-dsred ； (3D) :RIP-1. 1-dsred 載玻片；(3E) :pCMV-dsred ；F 正常對照；圖4:(4A)喂食10%葡萄糖的RIP3. I-DsRed大鼠的圖像，頂部右側綠色表示抗胰島素；頂部中間紅色表示抗-dsred;頂部左側表示它們的共聚焦圖像。底部右側綠色表示抗胰高血糖素；底部中間紅色表示抗-dsred ；底部左側它們的共聚焦圖像J4B) PRIP3. I-DsRed大鼠禁食過夜的圖像；圖5 頂部的圖來自對照大鼠(左側)和UTMD處理的大鼠(中間表示喂食的大鼠，右側表示禁食的大鼠)的顯微切片G00X)。采用原位PCT對DsRed質粒DNA進行染色，其在整個處理的胰腺中可以看到。胰島清晰可見(箭頭所示)。底部的圖來自使用對照大鼠(左側)和UTMD處理的大鼠的RIP6. I-DsRed切片000X)(中間表示喂食大鼠，右側表示禁食大鼠)。采用原位PCT對DsRed mRNA染色，其位于胰島中心(中間/喂食)。在胰島邊緣進行染色(右側/禁食大鼠)；圖6顯示了免疫熒光顯微鏡的結果。頂部的圖顯示了來自30天實驗的胰島的代表性實例。FITC標記的抗胰島素(綠色)證明了 β細胞，而DsRed標記的抗胰高血糖素證明了 α細胞。利用Nkx2. 2、Nkx6. 1、Pax4、Ngn3和MafA的超聲靶向的基因治療導致了 α 細胞占優勢的胰島的形成。相反，NeuroDl處理的大鼠具有接近正常的胰島結構，其中周圍 α細胞圍繞中央的β細胞。底部左側圖顯示了不同組中每個載玻片的胰島數。正常對照和NeuroDl處理的大鼠具有的每載玻片的胰島數均顯著高于所有其他組(通過ANOVA，*ρ < 0.0001)。底部右側圖顯示了每個胰島β細胞的數量。正常對照和NeuroDl處理的大鼠具有的每個胰島的β細胞的比例均顯著高于所有其他組(通過AN0VA，*p < 0.0001)；圖7顯示了在30天實驗中血糖(右側上面的圖)、血液胰島素(右側下面的圖) 和C肽(右側上面的圖)的結果。在第3天，與正常對照相比，所有STZ處理的大鼠均具有明顯升高的血糖以及降低的胰島素和C肽(p< 0. 0001)。但是，到第30天之前，僅NeuroDl 處理的大鼠的血糖、胰島素和C肽恢復到了正常或接近正常的水平。底部右側圖顯示了與正常對照(n = 3)和DsRed處理的大鼠(n = 3)相比，6只NeuroDl處理的大鼠(n = 6)的不同的組中葡萄糖耐量試驗的結果。在STZ誘發糖尿病之后，用NeuroDl進行基因治療導致葡萄糖耐量恢復正常；圖8顯示了細胞增殖的標記物。頂部左側和中間圖顯示了用FICT標記的抗胰島素(綠色)和DsRed標記的抗BrdU(左側)和抗_Ki67(中間)共染色的胰島。頂部右側圖顯示了 Ki67陽性、胰島素陽性細胞的數量，在NeuroDl處理的STZ大鼠中該數值在統計學上顯著地高于正常對照、STZ處理對照大鼠、或通過UTMD采用DsRed處理的STZ處理大鼠(ρ < 0.0001)。底部的圖顯示了來自采用抗Ckl9(左側，綠色)、抗胰島素(左側中間， 紅色)、抗ngn3(藍色，右側中間)染色的NeuroDl處理的STZ大鼠的胰島和它們的共聚焦圖像(右側)。胰島素陽性的β細胞由ngn3而不是Ckl9共染，表明再生的胰島不是從導管細胞起源的；圖9顯示了來自通過UTMD用各種基因和基因的組合處理大鼠的實驗中的代表性胰島圖像。采用DAPI (對于細胞核為藍色染色)、抗胰島素(綠色)和抗胰高血糖素(紅色)的三重染色。當用組合處理時的細胞周期蛋白D2、CDK4和GLPl (胰島穩定時間多達 180天)。上面左側圖顯示了來自未經UTMD處理的正常對照大鼠的代表性胰島。表達胰島素的β細胞的致密胰島核心(綠色)被表達胰高血糖素(紅色)的周圍α細胞的小囊環繞。上部右側圖顯示了在STZ誘發糖尿病之后的代表性胰島殘余物。僅存在少數β (beat) 細胞。底部左側圖顯示了在采用GLPl基因通過UTMD處理之后胰島再生的實例。比正常小的胰島存在一些β細胞(綠色)和α細胞(紅色)，但結構不正常。對于利用細胞周期蛋白D2、⑶Κ4和⑶Κ6的單個基因通過UTMD處理的大鼠存在類似發現(未顯示)。底部右側圖顯示了在采用細胞周期蛋白D2、⑶Κ4和GLPl的組合通過UTMD處理后幾乎正常的胰島(這些胰島穩定時間多達180天，并伴隨逆轉糖尿病使其具有正常血糖、胰島素和C肽水平)；圖10是線圖，顯示了對于利用UTMD基因治療處理的大鼠以及正常對照和未采用 UTMD處理的STZ糖尿病大鼠的各組胰島，隨時間的血糖水平。可以看出，采用細胞周期蛋白 D2、⑶Κ4、⑶Κ6或GLPl的單基因治療未導致血糖的正常化。然而，在該具體實驗中，包含細胞周期蛋白D2、⑶Κ4和GLPl的組合，或者細胞周期蛋白D2、⑶Κ4、⑶Κ6和GLPl的組合的組合物使血糖恢復至正常水平，持續4周。對另一組動物進行的更長時期的研究證實了效應的持續時間多達180天；圖11是HIP-hNeuroDl質粒的圖譜；圖12是RIP3. I-DsRed質粒的圖譜；圖13是RIP-DsRed 4. 1質粒的圖譜；圖14是RIP-DsRed 5. 1質粒的圖譜；禾口圖15是RIP-DsRed 2. 1質粒的圖譜。發明詳述通過研究以下本發明的詳細描述，本發明的新特征對于本領域技術人員來說將變得明顯。但是，應當理解，所提供的發明詳述和具體實例在表明本發明的特定實施方案的同時僅用于說明目的，因為通過發明詳述和隨后的權利要求書，在本發明的精神和范圍內進行的各種改變和修改對于本領域的技術人員來說將變得明顯。在不脫離隨后的權利要求書的精神和范圍的情況下，本發明可以包括根據本文所描述的教導可能的各種修改和變化。預期本發明的用途可以涉及具有不同特征的組分。意圖是通過所附的權利要求書來定義本發明的范圍，對各方面的等同替代給出完整認識。如本文所用，術語“大體上如SEQ ID NO. (#)中記載的序列”，“類似于......的
序列”，“核苷酸序列”和類似術語，針對核苷酸，實質上指相當于本文確定稱作SEQ ID NO. 1.的序列的任何部分。這些術語是指合成的以及天然得到的的分子，并包括具有生物學上、免疫學上、實驗地或其他功能上相等的活性，例如關于通過核酸片段的雜交或者編碼所有或者具有編碼全部或部分NeuroD活性的能力的序列。自然地，這些術語意在包括如通過其線性順序所指定的此序列中的信息。如本文所用，術語“基因”是指編碼功能蛋白、多肽或肽的單位。本領域的技術人員將理解，該功能術語包括基因組序列、cDNA序列或其片段或組合，以及基因產物，基因產物包括通過人類勞動可以改變的那些。純化的基因、核酸、蛋白質等用于指代當從至少一個污染了其通常相關的核酸或蛋白質中鑒定和分離的這些實體。如本文所用，術語“載體”是指將DNA片段(或者多個片段)從一個細胞轉移到另一個細胞的核酸分子。該載體可以進一步地定義為用于傳送特定的序列的載體或者包括可操作地連接至該特定的序列的啟動子的表達載體，或者用于引起該啟動子被引入的載體。 該載體可以獨立于宿主細胞染色體的狀態存在，或者可以被整合到宿主細胞染色體中。如本文所用，術語“宿主細胞”是指已被改造為包含核酸片段或改變的片段的細胞，無論是古菌、原核或真核細胞。因此，改造的或者重組的細胞能與自然存在的不含通過人類勞動經重組引入的基因的細胞相區分。如本文所用，術語“控制序列”是指對于特定宿主有機體內可操作連接的序列的表達必須的DNA序列。適合于原核生物的控制序列，例如包括啟動子、任選地包括操縱序列、 核糖體結合位點和轉錄終止子。當細胞培養物生長并成熟時，例如對數期過程中，可以使用高度調節的可誘導啟動子，其將Fab’多肽合成抑制在生長抑制量以下。如本文所用，術語“可操作地連接”是指第一和第二核酸序列之間的有功能的聯系。例如前導肽或分泌導肽的DNA如果其被表達為參與多肽分泌的前蛋白質，則被可操作地連接至多肽的DNA;啟動子或增強子如果其影響序列的轉錄，則可操作地連接至編碼序列；或者核糖體結合位點如果其定位在有利于翻譯的位置，則可操作地連接至編碼序列。一般來說，“可操作地連接”意味著要連接的DNA序列是連續的，并且在分泌前導的條件下是連續的并處在同一個閱讀框。增強子不必是連續的。連接通過在合適的限制性位點的接合來完成。如果此位點不存在，則按照常規做法使用合成的寡核苷酸接頭或連接子。如本文所用，術語“細胞”和“細胞培養物”可交換地使用，最終目的是此名稱包括后代。因此，單詞“轉化體”和“轉化細胞”包括原代的受試者細胞和從其中衍生的培養物， 不考慮轉移的數量。還應理解，由于有意或偶然突變，可能不是所有后代的DNA含量都恰好完全相同。與最初轉化細胞具有相同的所篩選的功能或生物學活性的突變后代包括在內。 不同名稱從上下文中將變得清楚。如本文所用，“質粒”通過小寫字母ρ開頭和/或接著是大寫字母和/或數字來命名。起始質粒可以是商業上可得的，在不受限的基礎上可以買到，或者可以根據公開的步驟由該可買到的質粒構建。此外，其他等同質粒在本領域中是已知的并且對于普通技術人員來說是顯而易見的。如本文所用，術語“蛋白質”、“多肽”或“肽”是指包含經肽鍵連接的氨基酸的化合物并且可以交換地使用。如本文所用，術語“內源性”是指其來源來自細胞之內的物質。內源性物質通過細胞的代謝活性產生。但是，內源性物質仍然可以通過操作細胞代謝，例如，使細胞表達編碼該物質的基因來產生。
如本文所用，術語“外源性”是指其來源為細胞之外的物質。當涉及核酸時，“外源性”是指細胞的外部，或者與細胞同源但位于宿主細胞核酸之內的位置的核酸序列，在宿主細胞核酸內通常找不到該元件。外源性物質仍然可以通過本領域技術人員已知的多種代謝或誘導方式中的任一種，通過細胞進行內化。基因的基因組形式或克隆包含由稱為“內含子”或“間隔區(interveningregion) ” 或“間隔序列(intervening sequence) ”的非編碼序列隔開的編碼區。內含子是被轉錄為核 RNA(hnRNA)的基因的片段；內含子可以包含調節元件例如增強子。內含子可以從核或初級轉錄物中去除(removed)、切割(excised)或“剪切(spliced out) ”；因此在信使RNA(mRNA) 轉錄物中不存在內含子。在翻譯過程中，mRNA起作用，指定新生多肽中氨基酸的序列或順序。除了包含內含子之外，基因的基因組形式也可以包含位于存在于RNA轉錄物中的序列的5’和3’端的序列。這些序列稱作“側翼”序列或區域(這些側翼序列位于存在于 mRNA轉錄物中的非翻譯序列的5’和3’端)。5’側翼區可以包含調節序列，例如控制或影響基因的轉錄的啟動子和增強子。3’側翼區可以包含指導轉錄終止、轉錄后剪切和多聚腺苷酸化的序列。將DNA分子稱為具有“5’端”和“3’端”，因為采用使一個單核甘酸五糖環的5’磷酸根與其臨近的3’氧在一個方向經磷酸二酯鍵連接的方式使單核甘酸反應為寡核苷酸。 因此對于寡核苷酸的末端而言，如果其5’磷酸根未與單核甘酸戊糖環的3’氧連接則稱之為5’端”，如果其3’氧未與隨后的單核甘酸戊糖環的5’磷酸根連接則稱為3’端”。如本文所用，即使在較長寡核苷酸之內的核酸序列也可以稱為具有“5’端”和“3’端”。在線型或環狀DNA分子中，分立元件(discrete element)稱之為5’的“上游”或3’的“下游”元件。該術語反映了這樣的事實，即轉錄沿DNA鏈以5’到3’的方式進行。如本文所用，術語“轉化”是指一種方法，通過該方法使外源DNA進入和改變受體細胞，所述的外源DNA例如包括啟動子和編碼序列的一個或多個質粒，所述的編碼序列表達 NeuroD、ngn3、GLPl、PDXl、Mafa、β 細胞素、Nkx2. 2、Nkx6. 1、PAX4、Isll、細胞周期蛋白 D2(和細胞周期蛋白家族的其他成員)、CDK4(和細胞周期蛋白依賴性激酶家族的其他成員)和針對細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑的siRNA，例如pl6(和INK4家族的其他成員) 或p27(和CIP/KIP家族的其他成員)。其可以在自然條件下發生，或者利用本領域中熟知的各種方法在人工條件下發生。轉化可以依賴于任何用于將外源核酸序列插入到原核或真核宿主細胞中的已知的方法。所述方法基于所轉化的宿主細胞來選擇并且可以包括但不限于病毒感染、電穿孔、脂質轉染和粒子轟擊(particle bombardment)。此種“經轉化的”細胞包括穩定地轉化的細胞，其中所插入的DNA能夠作為自主地復制的質粒，或者作為宿主染色體的一部分復制。如本文所用，術語“轉染”是指將外來的DNA引入到真核細胞中。轉染可以通過本領域中已知的多種方式來實現，這些方式包括，例如磷酸鈣-DNA共沉淀、DEAE葡聚糖介導的轉染、聚凝胺介導的轉染、電穿孔、微注射、脂質體融合、脂質轉染、原生質體融合、反轉錄病毒感染和基因槍法(biolistics)。因此，術語“穩定的轉染”或“穩定地轉染的”是指將外來的DNA引入并整合到被轉染的細胞的基因組中。術語“穩定的轉染子”是指已將外來的 DNA穩定地整合到基因組DNA的細胞。該術語還包含在有限的時間內瞬時表達插入的DNA或RNA的細胞。因此，術語“瞬時轉染”或者“瞬時地轉染的”是指將外來的DNA弓I入到細胞中，在該細胞中外來的DNA未整合到轉染細胞的基因組中。外來的DNA在被轉染的細胞的核中停留數天。在該時間期間，所述的外來的DNA受到控制染色體中外源基因表達的調節控制。術語“瞬時轉染子”是指已接受外來的DNA但未能整合該DNA的細胞。如本文所用，術語“載體(vector)，，與核酸分子有關地使用，所述核酸分子將DNA 片段(或者多個片段)從一個細胞轉移到另一個細胞。術語“載體(vehicle)”有時與“載體(vector)”交換使用。如本文所用的術語“載體(vector)”也包括與重組DNA分子有關的表達載體，所述的重組DNA分子包含需要的編碼序列和合適的核酸序列，其對于在特定宿主生物中表達可操作地連接的編碼序列是必需的。對于在原核生物中表達，核酸序列通常必需包括常與其他序列一起存在的啟動子、操縱基因(任選)和核糖體結合位點。已知真核細胞利用啟動子、增強子以及終止和多聚腺苷酸化信號。如本文所用，術語“擴增”當用于核酸時是指通過本領域中已知的任何方法生成核酸序列的大量拷貝。擴增是涉及模板特異性的核酸復制的特殊情況。模圖特異性頻繁地以 “靶”特異性的術語進行描述。靶序列在探尋與其他核酸區分的意義上是“靶”。擴增技術已主要設計用于該區分。如本文所用，術語“引物”是指寡核苷酸，無論是在純化的限制性酶切產物中自然產生的還是合成產生的，當置于誘導合成與核酸鏈互補的引物延伸產物的條件下(即，在核苷酸和誘導劑例如DNA聚合酶的存在下并在合適的溫度和pH下)，其能夠作為合成的起始點。為了進行最大效率擴增，引物可以是單鏈的，但也可選地為雙鏈的。如果是雙鏈的， 則在用于制備延伸產物之前，首先將引物處理，從而將其鏈分離。引物必須足夠長從而在誘導劑存在下引導延伸產物的合成。引物的準確長度將取決于多種因素，包括溫度、引物的來源和方法的應用。如本文所用，術語“探針”是指寡核苷酸(即核苷酸序列)，無論其是在純化的限制性酶切物中自然產生的還是合成、重組或者通過PCR擴增產生的，其能夠雜交至另一個目的寡核苷酸。探針可以是單鏈的或者雙鏈的。探針在具體基因序列的檢測、鑒定和分離中是有用的。預期在本發明中使用的任何探針將用任何“報告分子”標記，以便在任何檢測系統中均可檢測到，所述檢測系統包括但不限于酶(例如ELISA，以及基于酶的組織化學試驗)、熒光的、放射性的和發光系統。本發明無意于受到任何特定檢測系統或標記的限制。如本文所用，術語“靶”如果用于聚合酶鏈式反應，是指與用于聚合物鏈式反應的引物結合的核酸區域。因此，試圖將“靶”與其他核酸序列區別。將“片段”定義為靶序列之內的核酸區。當靶用在細胞或組織時，是指靶向利用細胞的外源載體(例如病毒、脂質體甚至裸露的核酸)將核酸遞送到細胞中，從而使其改變細胞的功能例如表達一個或多個BTC 或PDXl基因。如本文所用，術語“聚合酶鏈式反應”(“PCR”)是指K. B. Mullis的第4，683，195、 4，683，202和4，965，188號美國專利的方法，據此通過引用并入本文，其描述了不克隆或純化，增加基因組DNA混合物中靶序列的片段的濃度的方法。這種用于擴增靶序列的過程包括相對于包含需要的靶序列的DNA混合物，遠遠過量的兩種寡核苷酸引物，接著是在DNA 聚合酶存在下按照精確順序的熱循環。該兩種引物與雙鏈靶序列中其相應的鏈互補。為了使擴增有效，使混合物變性，然后使引物退火到靶分子內其互補序列上。在退火之后，采用聚合酶延伸引物從而形成一對新互補鏈。變性、引物退火和聚合物延伸的步驟可以重復多次(即變性、退火和延伸構成一個“循環”;可以有多個“循環”)以便獲得需要的靶序列的高濃度擴增片段。需要的靶序列的擴增片段的長度由各引物之間的相對位置確定，因此，該長度為可控制的參數。由于過程的重復方面，該方法被稱之為“聚合酶鏈式反應”(下文稱 “PCR”)。由于靶序列的需要的擴增片段成為混合物中主要的序列(在濃度上)，因此將它們稱為“PCR擴增的”。通過PCR，可以通過幾種不同的方法(例如，采用標記探針的雜交；并入生物素化引物，接著是親和素-酶綴合物檢測；將32P標記的脫氧核苷三磷酸例如dCTP或 dATP包括于擴增片段中)將基因組中特異性靶序列的單拷貝擴增至可檢測的水平。除了基因組DNA外，任何寡核苷酸序列都可以采用合適的引物分子進行擴增。特別地，通過PCR方法自身產生的擴增片段本身是隨后PCR擴增的有效模板。如本文所用，術語“染色試劑(staining reagent) ”是指包含該試劑的核酸序列的全部雜交帶(hybridization pattern) 0對部分基因組特異的染色試劑提供靶向和非靶向染色體物質之間的對比。通過采用一種或多種顏色(多色染色帶)和/或其他指示劑方法檢測到的部分基因組上的任何需要的染色帶可以檢測到大量不同的畸變。如本文所用，術語“轉基因”是指可以人工插入到哺乳動物基因組，例如活體動物的哺乳動物細胞中的遺傳物質。本文使用術語“轉基因動物”來描述非人類動物，通常是哺乳動物中存在的非內源(即異源)核酸序列，該序列作為其細胞的一部分中的染色體外元件存在或者穩定地整合到種系DNA中(即在其細胞的大部分或全部的基因組序列中)。根據本領域中熟知的方法，通過例如宿主細胞的胚胎或胚胎干細胞的基因操作，將異源核酸引入到該轉基因動物的種系中。 如本文所用，術語“轉基因”是指這樣的異源核酸，例如，諸如表達構建物(例如用于生成“敲入”轉基因動物)等形式的異源核酸或者通過插入在靶基因之內或者鄰近導致靶基因表達(例如用于生產“敲除”轉基因動物)降低的異源核酸。基因的“敲除”意思是基因的序列的改變，這種改變導致了靶基因的功能降低，優選地，使得靶基因表達不能檢測到或者不明顯。轉基因敲除動物包括靶基因的異源敲除或者靶基因的同源敲除(homozygous knock-out) 0如本文所用，術語“干細胞”是指全能或多能干細胞，例如胚胎干細胞，以及胚胎發育的非常早期中的這種多能細胞，包括但不限于發育的囊胚期中的細胞。在本發明中應用的一個具體實例中，干細胞可以是尚未分化為腺泡細胞或β細胞的胰腺細胞前體，并且用作靶點以表達 NeuroD、ngn3、GLPl、PDXl、Mafa、β 細胞素、Nkx2. 2、Nkx6. 1、PAX4、Isll、細胞周期蛋白D2(和細胞周期蛋白家族的其他成員)、CDK4(和細胞周期蛋白依賴性激酶家族的其他成員)和針對細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑的siRNA，例如pl6(和INK4家族的其他成員)或P27 (和CIP/KIP家族的其他成員)。在先前的專利申請中，本發明人證明了利用超聲靶向破壞微泡(UTMD)可以使基因治療在正常大鼠中靶向胰島。通過超聲，在胰腺微循環內選擇性地破壞攜帶質粒DNA的靜脈注射微泡，從而局部地遞送質粒。通過在質粒DNA內并入大鼠胰島素-I啟動子實現胰島特異性。現已發現，使用UTMD可以用于遞送單獨的和與PDXl聯合的β細胞素(BTC)至鏈脲霉素(STZ)誘導的糖尿病大鼠中。在采用BTC和PDXl處理的大鼠中觀察到導致胰高血糖素染色細胞的原始胰島樣細胞團的靶細胞的轉化。在該研究中，在處理之后，細胞團消失了 30天。在使用UTMD將胰腺腺泡細胞轉化為具有β細胞標記物的產胰島素細胞之后， 盡管未觀察到正常胰島的再生，但使糖尿病逆轉多達15天。糖尿病越來越流行，影響全世界超過5%的人口。正在大力尋找包括新藥物、胰島移植和基因治療在內的新的治療策略以治療糖尿病。在體內控制胰腺基因靶向胰島遞送是用于糖尿病基因治療的關鍵方法。到目前為止，研究表明在體內腺病毒、腺相關病毒、慢病毒(Ientivirus)和單純性皰疹病毒_1載體呈現出向胰島中的有效基因轉移，但遭受宿主免疫反應和載體細胞毒性。包括裸露DNA和DNA復合物的非病毒基因遞送系統也已經證明， 由于具有瞬時轉基因表達，胰島細胞轉染水平要低得多。然而，似乎可能的是非病毒載體系統將更容易滿足臨床試驗中的生物安全性問題。超聲靶向破壞微泡(UTMD)已被用于在體內遞送基因或藥物至胰島。簡單地說，將基因摻入到陽離子脂質體中，然后連接到含氣體微泡的磷脂外殼，然后將其靜脈注射并通過超聲在完整胰島的微循環內破壞。UTMD方法使能夠轉染存在大部分β細胞的整個胰島中心。已將UTMD與大鼠胰島素啟動子(RIP)結合以增強β細胞的特異性。本發明通過改變RIP片段的長度，極大地提高了基因表達的差異效率。使胰島素基因的外顯子1和外顯子 2的非編碼區融合，以使質粒的下游基因功能增強。在轉錄水平上，胰島素mRNA的融合在如此高的水平上調基因表達，以至于使得它們模擬正常胰島β細胞中的正常胰島素mRNA水平。隨后，使用UTMD將在大鼠胰島素啟動子驅動的控制下的胰島素基因融合質粒遞送至成人、活體動物的完整胰島中，從而提供了用于糖尿病的基因治療的安全的、組織特異性的、 高效有效的和受調節的基因表達。新的啟動子材料和方法。大鼠胰島素啟動子和質粒構建物。利用分別含有KpnI和xhol限制性位點的 PCR RIP 正向引物(5' -G CTG AGC TAA GAA TCC A_3' ) (SEQ ID NO. :3)、 RIP2. 1 反向引物(5 ‘ -CTGAGC ATTTTCCACC-3 ‘ ) (SEQ ID NO. 4)、RIP1. 1 反向引物 (5，-GGGAGTTACTGGGTCTCCA-3，)(SEQ ID NO. :5)、RIP4. 1 反向引物(5，_GCAGAATTCCTGCTTGC TGATGGTCTA-3，)(SEQ ID NO. :6)、RIP3. 1 反向引物(5，-GTTGGMCAATGACCTGGA-3，)(SEQ ID NO. :7)和反向引物(5-GGCAGAAGGACAGTGATCT-3) (SEQ ID NO. :8)，從 SD 大鼠 DNA 中擴增得到大鼠胰島素基因1啟動子片段(RIP2. 1 (-412到-303) ,RIP1. 1 (-412到-1)、RIP4. 1 (-412 到+43)、RIP3. 1(-412 到+165) ,Genbank 登記號 J00747，其在本文中被定義為 SEQ ID N0. 1，和人胰島素啟動子的Genbank登記號NC_000011-定義為SEQ ID N0. :2，通過引用將二者并入本文)。這些引物的序列列于表1中。將產生的DNA片段亞克隆至pGL2-basiC螢火蟲報告質粒和pDsRedl-Ι報告載體中。SV40-啟動子螢火蟲熒光素酶報告質粒、pGL2-Control 來自 Promega，pDsRedl-1 和 pCMV-DsRed-express-l 來自 Clonetech。大鼠基因組 DNA 采用QIAampBlood試劑盒Oliagen Inc，Valencia，CA)，按照生產商的說明從大鼠的外周血液中提取。相應的PCR產物通過瓊脂糖凝膠電泳驗證并通過QIAquickGel Extraction試劑盒 ^jIAGEN)純化。為了確認序列，采用 dRhodamineTerminator Cycle Sequencing Kit (ΡΕ Applied Biosystems, Foster City, CA) ^ABI 3100 Genomic Analyzer ±M PCR Γ^Μ. 接進行測序。質粒切割、連接、亞克隆、分離和純化通過標準程序進行，并再次測序以確認不存在人工突變。表1 引物序列(利用相同正向引物的大鼠胰島素基因啟動子)
權利要求
1.一種用于在胰腺中超聲靶向破壞微泡的組合物，所述組合物包含預裝配的脂質體-核酸微泡復合物，其中所述預裝配的脂質體-核酸復合物包含在胰島素啟動子的控制下的NeuroD基因，所述胰島素啟動子包含與胰島素啟動子區可操作地連接的一個或多個胰島素反應調節基因，所述胰島素啟動子區包含胰島素啟動子的基因組片段，所述胰島素啟動子的基因組片段包含胰島素基因的5’非翻譯區、外顯子1、內含子 1和外顯子2，其中在胰腺的靶位點微泡的破壞將核酸遞送到位于超聲破壞位置的胰腺細胞中，其中摻入核酸的細胞對高血糖水平作出反應表達胰島素。
2.權利要求1所述的組合物，所述組合物還包含與可調節胰島素啟動子區可操作地連接的一個或多個胰島素反應調節基因，所述胰島素啟動子區包含來自NeuroD基因的胰島素起始位點上游的區域上游的50個連續堿基。
3.權利要求1所述的組合物，所述組合物還包含一個或多個基因，所述基因選自與胰島素啟動子區可操作地連接的一個或多個胰島素反應調節基因，所述胰島素反應調節基因選自 ngn3、GLP1、PDX1、Mafa、β 細胞素、Nkx2. 2、Nkx6. 1、PAX4、Isll、細胞周期蛋白 D2 (和細胞周期蛋白家族的其他成員)、CDK4(和細胞周期蛋白依賴性激酶家族的其他成員)和針對細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑的siRNA，例如pl6 (和INK4家族的其他成員)或p27 (和 CIP/KIP家族的其他成員)。
4.權利要求1所述的組合物，所述組合物還包含與所述組合物聯合給藥的藥物，其中， 所述藥物選自抗細胞凋亡劑、抗炎劑、JNK抑制劑、GLP-1、他克莫司、西羅莫司、阿那白滯素、 Dervin聚酰胺或它們的組合。
5.一種用于在胰腺中利用超聲靶向破壞微泡再生胰腺β細胞的組合物，所述組合物包含微泡，所述微泡包含NeuroD，其中，所述微泡包含脂質，所述脂質在胰腺中通過超聲破壞釋放NeuroD。
6.權利要求5所述的組合物，其中，所述NeuroD為重組NeuroD。
7.權利要求5所述的組合物，其中，所述NeuroD包含在CUBI、RIP2.1、RIP3. 1或HIP3. 1 啟動子的控制下的NeuroD基因，并且所述NeuroD在已通過超聲靶向破壞微泡進行靶向表達的細胞中表達。
8.一種用于在糖尿病患者的體內和原位再生胰島素反應細胞的方法，所述方法包括以下步驟遞送有效量的Neuro D到胰腺，其中，胰腺中的細胞引起細胞對血液中的高葡萄糖水平作出反應分泌胰島素。
9.權利要求8所述的方法，其中，胰腺細胞中有效量的NeuroD包含遞送表達NeuroD基因的外源核酸片段。
10.權利要求8所述的方法，其中，通過超聲靶向破壞微泡將NeuroD遞送到胰腺中。
11.權利要求8所述的方法，其中，胰腺細胞中有效量的NeuroD包含遞送外源核酸片段，所述外源核酸片段在CUBI、RIP2. 1、RIP3. 1或HIP3. 1啟動子控制下表達NeuroD基因。
12.一種使得靶細胞變得對胰島素反應的方法，所述方法包括制備包含NeuroD基因的核酸片段，所述核酸片段包含在胰島素反應啟動子的控制下的NeuroD基因，所述胰島素反應啟動子選自CUBI、RIP2. 1、RIP3. 1或HIP3. 1啟動子；將該核酸片段載入微泡中；向患者注射微泡；將核酸片段遞送到胰腺細胞中；和將靶細胞保持在對于表達所述的胰島素反應調節基因有效的條件下；其中，在靶細胞中NeuroD基因的表達引起細胞對高血糖作出反應。
13.權利要求12所述的方法，所述方法還包括一個或多個基因，所述基因選自在啟動子的控制下的 PDXl、Nkx2. 2,Nkx 6. l、PAX4、MafA、ngn3、GLPl、細胞周期蛋白 D2、CDK4 和它們的組合。
14.權利要求12所述的方法，所述方法還包括與所述組合物聯合給藥的藥物，其中，所述藥物選自抗細胞凋亡劑、抗炎劑、JNK抑制劑、GLP-1、他克莫司、西羅莫司、阿那白滯素、 Dervin聚酰胺或它們的組合。
15.權利要求12所述的方法，其中，所述微泡包含預裝配的脂質體-核酸復合物脂質體。
16.權利要求12所述的方法，其中，所述微泡包含預裝配的脂質體-核酸復合物脂質體，所述脂質體-核酸復合物脂質體包含與質粒混合的二棕櫚酸磷脂酰膽堿和二棕櫚酰基磷脂酰乙醇胺甘油。
17.一種恢復胰島素反應性的方法，所述方法包括以下步驟獲得分離的核酸片段，所述核酸片段包含與高表達胰島素啟動子區可操作地連接的一個或多個胰島素反應調節基因，所述胰島素啟動子區包含胰島素啟動子的基因組片段，所述胰島素啟動子的基因組片段包含胰島素基因的5’非翻譯區、外顯子1、內含子1和外顯子 2 ；將核酸片段轉移到靶細胞中；和將靶細胞保持在對于表達胰島素反應調節基因有效的條件下；其中，在靶細胞中胰島素反應調節基因的表達弓丨起細胞對高血糖作出反應。
18.權利要求17所述的方法，其中，所述胰島素反應細胞是動物細胞。
19.權利要求17所述的方法，其中，與胰島素啟動子區可操作地連接的一個或多個胰島素反應調節基因存在于病毒載體或質粒載體中。
20.權利要求17所述的方法，其中，與胰島素啟動子區可操作地連接的一個或多個胰島素反應調節基因選自 NeuroD、ngn3、GLP1、PDX1、Mafa、β 細胞素、Nkx2. 2、Nkx6. 1、PAX4、 Isll、細胞周期蛋白D2(和細胞周期蛋白家族的其他成員)、CDK4(和細胞周期蛋白依賴性激酶家族的其他成員)和針對細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑的siRNA，例如pl6(和INK4 家族的其他成員)或P27 (和CIP/KIP家族的其他成員)。
21.一種恢復胰島素反應性的方法，所述方法包括以下步驟獲得分離的核酸片段，所述核酸片段包含與胰島素啟動子區可操作地連接的一個或多個胰島素反應調節基因，所述胰島素啟動子區包含胰島素啟動子的基因組片段，所述胰島素啟動子的基因組片段包含胰島素基因的5’非翻譯區、外顯子1、內含子1和外顯子2 ；將核酸片段轉移到胰腺細胞中；和將靶細胞保持在對于表達胰島素反應調節基因有效的條件下；其中，在靶細胞中胰島素反應調節基因的表達弓丨起細胞對高血糖作出反應。
22.權利要求21所述的方法，其中，所述胰島素啟動子區包含在轉錄起始位點的區域上游中SEQ ID NO. 1的100到500個連續堿基。
23.權利要求21所述的方法，其中，所述胰島素啟動子區包含SEQIDN0. :1中轉錄起始位點上游的整個區域。
24.權利要求21所述的方法，其中，所述胰島素啟動子區包含SEQIDN0. :2中轉錄起始位點上游的整個區域。
25.一種分離的核酸，所述核酸包含胰島素啟動子區，所述胰島素啟動子區包含胰島素啟動子的基因組片段，所述胰島素啟動子的基因組片段包含來自一個或多個胰島素反應基因的胰島素基因上游的5’非翻譯區、外顯子1、內含子1和外顯子2。
26.一種用于在胰腺中超聲靶向破壞微泡的組合物，所述組合物包含與微泡接觸的預裝配的脂質體-核酸復合物，其中，所述預裝配的脂質體-核酸復合物包含與高表達、可調節胰島素啟動子區可操作地連接的一個或多個胰島素反應調節基因， 所述胰島素啟動子區包含胰島素啟動子的基因組片段，所述胰島素啟動子的基因組片段包含胰島素基因的5’非翻譯區、外顯子1、內含子1和外顯子2，其中在胰腺中靶位點處采用超聲波破壞微泡，將核酸遞送到位于超聲破壞位置的胰腺細胞中。
27.權利要求沈的組合物，其中，所述預裝配的脂質體-核酸復合物包含陽離子脂質、 陰離子脂質或者它們的混合物和組合。
28.權利要求沈的組合物，其中，所述微泡在藥學上可接受的載體中處理。
29.權利要求沈的組合物，其中，所述活性劑核酸包含胰島素基因。
30.權利要求沈的組合物，其中，所述活性劑核酸包含核酸載體，所述核酸載體包含在啟動子控制下的己糖激酶基因。
31.權利要求沈的組合物，其中，所述活性劑核酸包含核酸載體，所述核酸載體包含在啟動子控制下的NeuroD基因。
32.權利要求沈的組合物，其中，所述預裝配的脂質體-核酸復合物脂質體包含與質粒混合的二棕櫚酸磷脂酰膽堿和二棕櫚酰基磷脂酰乙醇胺甘油。
33.權利要求沈的組合物，其中，所述組合物還包含覆蓋層。
34.權利要求沈的組合物，其中，所述組合物還包含與胰島素啟動子區可操作地連接的一個或多個胰島素反應調節基因，所述胰島素反應調節基因選自NeuroD、ngn3、GLP1、 PDXU Mafa, β細胞素、Nkx2. 2、Nkx6. 1、ΡΑΧ4、Isll、細胞周期蛋白D2 (和細胞周期蛋白家族的其他成員)、CDK4(和細胞周期蛋白依賴性激酶家族的其他成員)和針對細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑的siRNA，例如pl6 (和INK4家族的其他成員)或p27 (和CIP/KIP家族的其他成員)。
35.一種載體，所述載體包含在啟動子控制下的己糖激酶基因，所述啟動子包含與胰島素啟動子區可操作地連接的一個或多個胰島素反應調節基因，所述胰島素啟動子區包含 胰島素啟動子的基因組片段，所述胰島素啟動子的基因組片段包含胰島素基因的5’非翻譯區、外顯子1、內含子1和外顯子2。
36.權利要求35的載體，其中，所述己糖激酶基因包含核酸載體，所述核酸載體包含在啟動子控制下的NeuroD基因。
37.權利要求35的載體，其中，所述己糖激酶基因包含核酸載體，所述核酸載體包含在啟動子控制下的GLP-I (7-37)基因。
38.權利要求35的載體，其中，所述己糖激酶基因包含核酸載體，所述核酸載體包含在啟動子控制下的細胞周期蛋白D2基因。
39.權利要求35的載體，其中，所述預裝配的脂質體-核酸復合物脂質體包含與質粒混合的二棕櫚酸磷脂酰膽堿和二棕櫚酰基磷脂酰乙醇胺甘油。
40.權利要求35的載體，所述載體還包含與啟動子區可操作地連接的一個或多個胰島素反應調節基因，所述胰島素反應調節基因選自NeuroD、ngn3、GLPl、PDXl、Mafa, β細胞素、Nkx2. 2、Nkx6. 1、PAX4、Isl 1、細胞周期蛋白D2 (和細胞周期蛋白家族的其他成員)、 CDK4(和細胞周期蛋白依賴性激酶家族的其他成員)和針對細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑的siRNA，例如pl6 (和INK4家族的其他成員)或p27 (和CIP/KIP家族的其他成員)。
41.通過以下方法成為胰島素反應性的細胞，所述方法包括將細胞注射到預裝配的脂質體-核酸微泡復合物中，其中所述預裝配的脂質體-核酸復合物包含在胰島素啟動子的控制下的NeuroD基因，所述胰島素啟動子包含與胰島素啟動子區可操作地連接的一個或多個胰島素反應調節基因，所述胰島素啟動子區包含，胰島素啟動子的基因組片段，所述胰島素啟動子的基因組片段包含胰島素基因的5’非翻譯區、 外顯子1、內含子1和外顯子2，其中在胰腺的靶位點處微泡的破壞將核酸遞送到位于超聲破壞位置的胰腺細胞中，其中摻入核酸的細胞對高血糖作出反應表達胰島素。
42.權利要求41的細胞，所述細胞還包含與可調節胰島素啟動子區可操作地連接的一個或多個胰島素反應調節基因，所述可調節胰島素啟動子區包含來自NeuroD基因的胰島素起始位點上游的區域上游的50個連續堿基。
43.權利要求41的細胞，所述細胞還包含一個或多個基因，所述基因選自與胰島素啟動子區可操作地連接的一個或多個胰島素反應調節基因，所述胰島素反應調節基因選自 ngn3、GLPl、PDXl、Mafa、β 細胞素、Nkx2. 2、Nkx6. 1、PAX4、Isll、細胞周期蛋白 D2(和細胞周期蛋白家族的其他成員)、CDK4(和細胞周期蛋白依賴性激酶家族的其他成員)和針對細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑的siRNA，例如pl6 (和INK4家族的其他成員)或p27 (和 CIP/KIP家族的其他成員)。
全文摘要
本發明包括用于在胰腺中通過超聲靶向破壞微泡，從而再生葡萄糖反應細胞的組合物和方法，其中所述組合物包含與微泡在內部和附近接觸的預裝配的脂質體-核酸復合物，其中所述預裝配的脂質體-核酸復合物包含在啟動子控制下的NeuroD基因，其中在胰腺的靶位點微泡的破壞將核酸遞送到位于超聲破壞位置的胰腺細胞中，其中摻入核酸的細胞對高血糖水平作出反應表達胰島素。
文檔編號C12N5/071GK102282263SQ200980154476
公開日2011年12月14日 申請日期2009年11月13日 優先權日2008年11月13日
發明者J·丁, P·A·格雷布恩, S·陳 申請人:貝勒研究院