通過質譜分析法檢測雙氫睪酮的方法

專利名稱：通過質譜分析法檢測雙氫睪酮的方法
技術領域：
本申請涉及雙氫睪酮(DHT)的檢測。在具體方面中，本申請涉及通過質譜分析法檢測雙氫睪酮(DHT)的方法。
背景技術：
提供下列的背景技術描述僅僅作為幫助理解本發明，并不承認其描述或構成本發明的現有技術。雙氫睪酮(DHT) [ (17 β -羥基-5a_雄烷_3_酮)]是分子量為四0. 4道爾頓的類固醇激素。DHT是由睪酮外周組織合成的有效雄激素。過量的DHT分泌經由轉化為睪酮可以產生痤瘡、多毛癥和男性化。DHT是前列腺增生的病因(causal agent)，并且血液中的測量可用于評估對睪酮到DHT轉化的抑制劑的順應性和應答。測量樣品中DHT的質譜分析法已被報導。參見，例如Chang，Y.，等人，Analyst 2003,128 :363-8 ；Caruso, D.,等人，Neurochem Int 2008,52 560-8 ；Wang，C.,等人， Steroids 2008, XXX=XXX-XXX(doi :10. 1016/j.steroids.2008.05. 004) ；Zhao, Μ.， 等人，Meroids 2004，69 :721-6 Janzen，N.，等人，J Chroma B 2008,861 :117-22 ； Licea-Perez, H. ， ·入，Steroids 2008,73 :601-10 ；Kashiwagi, B. ， ·入，J Andrology 2005,26 :586-91 ；Kashiwagi, B. , ^A, Urology 2005,66 :218-23 ；Umera, M. ,^A, Cancer Sci 2007,99 :81-86 ；和 Mohler，等人，美國專利申請號 11/973，127 (2007 年 10 月 8 日提交)°

發明內容
本發明提供通過包括串聯質譜分析法在內的質譜分析法檢測樣品中雙氫睪酮 (DHT)的量的方法。優選地，本發明的方法不包括在質譜分析法分析之前衍生樣品中的 DHT。在一個方面，提供測定體液樣品中未衍生的雙氫睪酮(DHT)的量的方法。該方面的方法包括(a)通過固相萃取(solid phase extraction)純化體液樣品中的DHT ； (b)離子化來自體液樣品的DHT以產生一種或多種通過質譜分析法可檢測的DHT離子，其中所產生的離子選自質荷比為四1. 10士0. 50的DHT先驅離子，和選自255. 20士0. 50和 79. 20士0. 50的一種或多種DHT碎片離子；和(c)通過質譜分析法測定一種或多種DHT離子的量。在測量一種或多種DHT離子的量之后，DHT離子(一種或多種)的量被用于計算測試樣品中的未衍生的DHT的量。在一些實施方式中，質譜分析法是串聯質譜分析法。在一些實施方式中，固相萃取和質譜分析以聯機方式進行。在一些實施方式中，作為高紊度液相色譜(high turbulence liquid chromatography,HTLC)進行固相萃取。在一些實施方式中， 方法進一步包括在質譜分析法之前使用高效液相色譜(HPLC)純化體液樣品中的DHT ；優選使用聯機處理。在一些實施方式中，體液樣品是血漿或血清。在一些實施方式中，方法具有在5ng/dL到200ng/dL——包括5ng/dL和200ng/dL——的范圍內的定量限制。在一些實施方式中，通過質譜分析法檢測的一種或多種DHT離子(一種或多種)的量通過與內標比較被用于計算測試樣品中未衍生的DHT的量；內標優選地為16，16，17-d3雙氫睪酮。上面列出的實施方式的特征在本發明的方法中可以沒有限制地進行組合使用。在第二方面，提供通過質譜分析法測定測試樣品中未衍生的雙氫睪酮(DHT)的量的方法。該方面的方法包括(a)使用高紊度液相色譜(HTLC)純化測試樣品中的DHT; (b) 離子化來自測試樣品的DHT以產生一種或多種通過質譜分析法可檢測的DHT離子；和(c) 通過質譜分析法測定一種或多種DHT離子的量。在這些方法中，測量的DHT離子(一種或多種)的量被用于計算測試樣品中的DHT的量。在一些實施方式中，質譜分析法是串聯質譜分析法。在一些實施方式中，純化測試樣品中的DHT包括用高效液相色譜(HPLC)純化；優選地配置用于聯機處理。在一些實施方式中，測試樣品是體液樣品；優選地是血漿或血清。 在一些實施方式中，通過質譜分析法可檢測的DHT離子包括選自質/荷比為四1. 10士0. 50、 255. 20士0. 50和79. 20士0. 50的離子的一種或多種離子。在一些實施方式中，離子化DHT的步驟包括生成質/荷比為四1. 10士0. 50的先驅離子，和生成選自質/荷比為255. 20士0. 50 和79. 20士0. 50的離子的一種或多種碎片離子。在一些實施方式中，方法具有在5ng/dL到 200ng/dL——包括5ng/dL和200ng/dL——的范圍內的定量限制。在一些實施方式中，通過質譜分析法檢測的一種或多種DHT離子(一種或多種)的量通過與內標比較被用于確定測試樣品中未衍生的DHT的量；內標優選地為16，16，17-d3雙氫睪酮。上面列出的實施方式的特征在本發明的方法中可以沒有限制地進行組合使用。在第三方面，提供通過串聯質譜分析法測定體液樣品中未衍生的雙氫睪酮(DHT) 的量的方法。該方面的方法包括(a)通過高紊度液相色譜(HTLC)從體液樣品純化DHT ； (b)生成具有四1. 10士0. 50的質/荷比的所述DHT的先驅離子；(c)生成先驅離子的一種或多種碎片離子，其中所述的一種或多種碎片離子的至少一種包括選自具有255. 20士0. 50 和79. 20士0. 50的質/荷比的碎片離子的碎片離子；和(d)檢測在步驟(b)或(c)或兩者中生成的所述離子的一種或多種的量。檢測的離子的量被用于計算體液樣品中未衍生的DHT 的量。在一些實施方式中，從測試樣品純化DHT進一步包括用高效液相色譜(HPLC)；優選地配置進行聯機處理。在一些實施方式中，體液樣品是血漿或血清。在一些實施方式中，方法具有在5ng/dL到200ng/dL——包括5ng/dL和200ng/dL——的范圍內的定量限制。在一些實施方式中，通過質譜分析法檢測的一種或多種DHT離子(一種或多種)的量通過與內標比較被用于計算測試樣品中未衍生的DHT的量；內標優選地為16，16，17-d3雙氫睪酮。 上面列出的實施方式的特征在本發明的方法中可以沒有限制地進行組合使用。本發明的方法包括液相色譜與質譜分析法的組合。在優選的實施方式中，液相色譜是HPLC。一個優選的實施方式只使用HPLC或者與一種或多種純化方法例如諸如HTLC和 /或蛋白質沉淀和過濾組合使用HPLC，以純化樣品中的DHT。在另一優選的實施方式中，質譜分析法是串聯質譜分析法(MS/MS)。
在本文公開的方法的某些優選實施方式中，質譜分析法以正離子模式進行。可選地，質譜分析法以負離子模式進行。多種離子化源——包括例如大氣壓化學電離
(atmospheric pressure chemical ionization) (APCI)或電噴身寸離子化(ESI)-可被用
于本發明的實施方式中。在某些優選的實施方式中，以正離子模式使用APCI測量DHT。在優選的實施方式中，質譜儀中可檢測的DHT離子選自質/荷比(m/z)為 291. 10士0. 50,255. 20士0. 50和79. 20士0. 50的正離子。在特別優選的實施方式中，DHT 先驅離子具有四1. 10士0. 50的m/z，和一種或多種碎片離子選自具有255. 20士0. 50和 79. 20 士0. 50 的 m/z 的離子。在優選的實施方式中，單獨地可檢測內標在樣品中提供，其量也在樣品中測定。在這些實施方式中，在樣品中存在的內源性DHT和內標的全部或部分被離子化以產生在質譜儀中可檢測的多種離子，并且從內源性DHT和內標每個產生的一種或多種離子通過質譜分析法進行檢測。優選的內標是16，16，17-(13雙氫睪酮(16，16，17-(130!110。在優選的實施方式中， 在質譜儀中可檢測的內標離子選自具有四4. 10 士0. 50和258. 20 士0. 50的m/z的正離子。 在特別優選的實施方式中，內標先驅離子具有四4. 10士0. 50的m/z ；和內標碎片離子具有 258. 20 + 0. 50 的 m/z ο在優選的實施方式中，通過與參比物例如16，16，17-d3雙氫睪酮比較，將DHT離子的存在或量與測試樣品中DHT的存在或量相關聯。在某些優選的實施方式中，DHT的定量限制(LOQ)在5. Ong/dL到200ng/dL的范圍內——包括5. Ong/dL和200ng/dL ；優選地在5. 0ng/dL到100ng/dL的范圍內——包括5. Ong/dL和100ng/dL ；優選地在5. Ong/dL到50ng/dL的范圍內——包括5. Ong/dL和 50ng/dL ；優選地在5. Ong/dL到25ng/dL的范圍內——包括5. Ong/dL和25ng/dL ；優選地在 5. Ong/dL 到 15ng/dL 的范圍內——包括 5. Ong/dL和 15ng/dL ；優選地在 5. Ong/dL 到 IOng/ dL的范圍內——包括5. Ong/dL和lOng/dL ；優選地為大約5. Ong/dL。如本文使用的，除非另有陳述，單數形式“一”、“一”和“該”("a","an"and “the”) 包括復數參考。因此，例如提及“蛋白質(a protein)”包括多個蛋白質分子。如本文使用的，“衍生”指使兩個分子反應以形成新的分子。衍生雄激素的分子， 例如DHT的分子，可以使用本領域熟知的多種衍生試劑進行。參見，例如，Kashiwagi，B.，等人，J Andrology 2005，26 :586-91 和 Kashiwagi，B.，等人，Urology 2005，66 :218_23，其報告在萃取前使用氟-1-甲基吡啶-P-甲苯磺酸酯衍生DHT。如本文使用的，“未衍生的”指沒有被衍生。因此，沒有指出衍生的雙氫睪酮(DHT)是未衍生的DHT。如本文使用的，術語“純化”(“purification”或“purifying”)不是指從樣品除去目的分析物(一種或多種)以外的所有物質。相反地，純化指相對于樣品中可能干擾目的分析物檢測的其他組分富集一種或多種目的分析物的量的方法。通過多種方法純化樣品可使一種或多種干擾物質相對減少，例如可能干擾或可能不干擾通過質譜分析法檢測選擇的DHT母離子或子離子的一種或多種物質。如使用的術語，相對減少并不要求在待被純化的物質中與目的分析物一起存在的任何物質通過純化被完全除去。如本文使用的，術語“測試樣品(試樣)”指可包含DHT的任何樣品。如本文使用的，術語“體液”指可從個體的身體分離的任何流體。例如，“體液”可包括血液、血漿、血清、膽汁、唾液、尿液、眼淚、汗液等。如本文使用的，術語“色譜法”指其中由液體或氣體攜帶的化學混合物當繞或通過固定液或固相流動時由于化學個體的差別分配而被分離成組分的方法。如本文使用的，術語“液相色譜”或“LC”指當流體均勻滲濾通過細分物質的柱或通過毛細管路徑時，流體溶液的一種或多種組分選擇性延遲的方法。延遲是當流體相對于固定相(一種或多種)移動時，由混合物組分在一種或多種固定相和主體流體(即，流動相) 之間的分配產生。“液相色譜”的實例包括反相液相色譜(RPLC)、高效液相色譜(HPLC)和高紊度液相色譜(HTLC)。如本文使用的，術語“高效液相色譜”或“HPLC”指其中通過在壓力下迫使流動相通過固定相——通常為致密填充柱——增加分離程度的液相色譜。如本文使用的，術語“高紊度液相色譜”或“HTLC”指這樣的色譜法形式，其使用分析物質通過填充作為進行分離的基礎的柱的紊流。HTLC在通過質譜分析法以前，已應用于含有兩種不知名藥物的樣品的制備。參見，例如Zimmer等人，JChromatogr A 854 23-35(1999)；也參見美國專利號 5，968，367,5, 919，368,5, 795，469 和 5，772，874，其進一步解釋HTLC。本領域普通技術人員理解“紊流”。當流體緩慢且平穩地流動時，流體被稱為 “層流”。例如，以低流速移動通過HPLC柱的流體是層流的。在層流中，流體的顆粒運動是有序的，其中顆粒大體上以直線移動。在較快的速度下，水的慣性克服了流體摩擦力，并且紊流產生。不與不規則邊界接觸的流體比被摩擦減慢或被不均勻表面轉向的流體“移動更快 (outruns)”。當流體紊流地流動時，其以旋渦和回旋(或渦流)形式流動，其比流動為層流時具有更大的“阻力”。許多參考文獻可用于幫助確定何時流體流動為層流或紊流(例如， Turbulent Flow Analysis -Measurement and Prediction，P.S.Bernard & J. M. Wallace, John Wiley & Sons，Inc.，(2000) ；An Introduction to Turbulent Flow, Jean Mathieu & Julian Scott，Cambridge University Press (2001))。如本文使用的，術語“氣相色譜”或“GC”指如此色譜法，其中樣品混合物被汽化并且注入移動通過含有由液體或顆粒固體組成的固定相的柱的載氣流(如氮氣或氦氣)，并且樣品混合物根據對固定相的化合物的親和力被分離成其組分化合物。如本文使用的，術語“大顆粒柱”或“提取柱”指含有大于大約50 μ m的平均粒徑的色譜柱。如該內容中使用的，術語“大約”指士 10%。如本文使用的，術語“分析柱”指具有充足色譜板(chromatographic plate)以實現樣品中物質分離的色譜柱，所述物質從柱洗脫足以對分析物的存在或量進行測定。這樣的柱通常與“提取柱”不同，所述提取柱具有從未保留(non-retained)的物質分離或提取保留的物質以獲得用于進一步分析的純化樣品的一般目的。如該內容中使用的，術語“大約”指士 10%。在優選的實施方式中，分析柱含有直徑大約4μπι的顆粒。如本文使用的，術語“聯機(on-line)”或“在線(inline) ”，例如如在“聯機自動方式”或“聯機提取”中使用的，指不需要操作員介入而進行的過程。相反地，如本文使用的術語“脫機的(off-line)”指要求操作員手動介入的過程。因此，如果樣品經歷沉淀并且然后將上清液手動加載到自動采樣器中，那么沉淀和加載步驟是與接下來的步驟脫機的。在該方法的不同實施方式中，一個或多個步驟可以以聯機自動方式進行。如本文使用的，術語“質譜分析法”或“MS”指通過其質量鑒定化合物的分析技術。MS指基于其質荷比或“m/z”的過濾、檢測和測量離子的方法。MS技術通常包括(1)離子化化合物以形成帶電化合物；和( 檢測帶電化合物的分子量并計算質荷比。化合物可通過任何合適的方法離子化并檢測。“質譜儀”一般包括電離器和離子檢測器。一般而言， 一種或多種目的分子被離子化，并且隨后將離子引入質譜儀，在那里由于磁場和電場的組合，離子遵從空間中沿依賴于質量(“m”)和電荷(“ζ”)的路徑。參見例如美國專利號 6，204，500，其名稱為“Mass Spectrometry From Surfaces”;6, 107，623，其名稱為“Methods and Apparatus for Tandem Mass Spectrometry";6, 268, 144，其名稱為“DNA Diagnostics Based On Mass Spectrometry" ；6, 124, 137,"Surface-Enhanced Photolabile
Attachment And Release For Desorption And Detection Of Analytes，，；Wright 等人， Prostate Cancer and Prostatic Diseases 1999，2 :264_76 ；禾口 Merchant 禾口 ffeinberger， Electrophoresis 2000,21:1164-67。如本文使用的，術語“以負離子模式操作”指其中生成和檢測負離子的那些質譜分析法。如本文使用的，術語“以正離子模式操作”指其中生成和檢測正離子的那些質譜分析法。如本文使用的，術語“離子化(ionization) ”或“電離(ionizing) ”指生成具有等于一個或多個電子單位(electron unit)的凈電荷的分析物離子的過程。負離子是具有一個或多個電子單位的凈負電荷的那些，而正離子是具有一個或多個電子單位的凈正電荷的那些。如本文使用的，術語“電子電離”或‘ Ι”指其中氣相或蒸汽相的目的分析物與電子流相互作用的方法。電子沖擊分析物產生分析物離子，其然后經歷質譜分析法技術。如本文使用的，術語“化學電離”或“Cl”指其中反應氣體(例如氨)經歷電子沖擊并且分析物離子通過反應氣體離子與分析物分子相互作用形成的方法。如本文使用的，術語“快原子轟擊”或“FAB”指其中高能原子束(通常為Xe或Ar) 沖擊不揮發性樣品，解吸并離子化樣品中包含的分子的方法。測試樣品被溶解在粘性液體基質例如甘油、硫代甘油、m-硝基芐醇、18-冠-6冠醚(18-croWn-6-croWn ether)、2-硝基苯基辛醚、環丁砜、二乙醇胺和三乙醇胺。化合物或樣品的適當基質的選擇是經驗過程。如本文使用的，術語“基質輔助激光解吸電離(matrix-assisted laser desorption ionization) ”或“MALDI”指其中不揮發性樣品暴露于激光輻照，其通過不同的離子化途徑解吸和離子化樣品中分析物的方法，所述離子化途徑包括光致電離、質子化、去質子化和線束衰減(cluster decay) 0對于MALDI，樣品與促進分析物分子解吸的能量吸收基質混合。如本文使用的，術語“表面增強的激光解吸電離”或“SELDI”指其中非揮發性樣品暴露于激光輻照，其通過不同的離子化途徑解吸和離子化樣品中分析物的另一種方法，所述離子化途徑包括光致電離、質子化、去質子化和線束衰減。對于SELDI，樣品一般結合到優先保留一種或多種目的分析物的表面。如在MALDI中一樣，該方法也可使用能量吸收物質以促進離子化。如本文使用的，術語“電噴射離子化”或“ESI”指其中溶液沿著毛細管的短的長度通過到被施加高的正或負電勢的末端的方法。到達管末端的溶液被汽化(使霧化)成溶劑蒸汽中的非常小的溶液液滴的噴出或噴射。該液滴霧流過蒸發室，所述蒸發室被稍微加熱以防止冷凝和使溶劑蒸發。隨著液滴變得更小，電表面電荷密度增加，直到相同電荷之間的天然排斥力引起離子以及中性分子被釋放的時刻。如本文使用的，術語“大氣壓化學電離”或“APCI”指與ESI相似的質譜分析法 ’然而，APCI通過在大氣壓下等離子體內部發生的離子-分子反應產生離子。等離子體通過噴射毛細管和對電極(counter electrode)之間的放電而得以保持。然后，一般地利用差別泵送的分離器(skimmer)階段將離子提取入質量分析器。干燥和預熱的N2氣體的逆流可用來提高溶劑去除。對于分析較小極性的種類，APCI的氣相離子化可比ESI更有效。如本文使用的，術語“大氣壓光致電離"或"APPI"指這樣的質譜分析法形式，其中分子M的光致電離機理是光子吸收和電子發射以形成分子離子M+。因為一般地，光子能量剛好高于電離電勢，所以分子離子不易于解離。在很多情況下，分析樣品而無需進行色譜法也許是可能的，因此節省了大量時間和費用。在水蒸氣或質子溶劑的存在下，分子離子可以奪取H以形成MH+。在M具有高的質子親和力情況下，這傾向于發生。這不影響定量準確性，因為M+和MH+的和是常數。質子溶劑中的藥物化合物通常被觀測為MH+，而非極性化合物例如萘或睪酮通常形成M+。參見例如，Robb等人，Anal. Chem. 2000, 72 (15) :3653_3659。如本文使用的，術語“電感耦合等離子體”或“ICP”指其中樣品與部分離子化的氣體在足夠高的溫度下相互作用以便大多數元素被原子化和離子化的方法。如本文使用的，術語“場解吸”指其中不揮發性測試樣品被置于離子化表面上，使用強電場生成分析物離子的方法。如本文使用的，術語“解吸”指從表面移出分析物和/或使分析物進入氣相。激光解吸熱解吸是其中包含分析物的樣品通過激光脈沖熱解吸入氣相的技術。激光撞擊具有金屬基底的特制96孔板的背面。激光脈沖加熱基底并且熱使樣品轉移入氣相。然后將氣相樣品吸入質譜儀。如本文使用的，術語“選擇的離子監控”是質譜儀的檢測方式，其中僅相對窄質量范圍內的離子——一般是大約一個質量單位——被檢測。如本文使用的，有時被稱為“選擇反應監控”的“多重反應模式”是質譜儀的檢測方式，其中選擇檢測先驅離子和一種或多種碎片離子。如本文使用的，術語“量化限制”、“定量限制”或“L0Q”指測量在數量上有意義的點。在該LOQ下的分析物反應是可鑒定的、離散的和可重現的，其相對標準差(RSD%)為 20%，準確度為80%到120%。如本文使用的，術語“檢測限(檢測極限，limit of detection)”或“L0D”是如此點，在該點下測量值大于與其相關的不確定度。LOD是如此點，在該點值超過與其測量相關的不確定度，并且被定義為在0濃度下二倍的平均值的RSD。如本文使用的，體液樣品中DHT的“量”一般指反映體液體積中可檢測的DHT的質量的絕對值。然而，量也考慮與其他DHT的量相比的相對量。例如體液中的DHT的量可以是大于對照或正常存在的DHT的正常水平的量。如本文使用的，涉及定量測量——不包括離子質量測量——的術語“大約”指所示出的值加或減10%。質譜分析法儀器在測定給定分析物的質量可以稍微變化。在離子質量或離子質/荷比的情況中的術語“大約”指+/-0. 50原子質量單位。上述的發明內容是非限制性的，并且根據下面的具體實施方式
和權利要求書，本發明的其他特征和優點將是明顯的。


圖1示出用于測定DHT分析的定量限制的空白和5個標準品的分析的變異系數的圖。細節在實施例5中討論。圖2示出使用LC-MS/MS分析的系列稀釋的原料樣品(stock sample)中DHT的定量的線性。細節在實施例6中描述。圖3A和;3B示出通過本發明的示例性HPLC-MS方法的DHT測定與通過參照放射免疫測定法(RIA)的DHT測定的相關性。圖3A中示出的相關性通過線性回歸測定。圖中示出的相關性通過Deming分析測定。細節在實施例10中描述。
具體實施例方式描述了用于測量樣品中DHT的量的本發明的方法。更具體地說，描述了用于檢測并定量測試樣品中的DHT的質譜法。方法可利用高紊度液相色譜(HTLC)以進行選擇的分析物的純化，并將該純化與質譜分析法(MQ組合，從而提供用于檢測并定量測試樣品中DHT 的高通量分析系統。優選實施方式特別適合于在大規模臨床實驗室中應用，用于自動DHT 分析。用于本發明方法的適當的測試樣品包括可包含目的分析物的任何測試樣品。在一些優選實施方式中，樣品是生物樣品；即，從任何生物源例如動物、細胞培養物、器官培養物等獲得的樣品。在某些優選的實施方式中，樣品從哺乳動物例如狗、貓、馬等獲得。特別優選的哺乳動物是靈長類，最優選地是男人或女人。特別優選的樣品包括體液例如血液、血漿、血清、唾液、腦脊髓液、或組織樣品。這類樣品例如可以從患者獲得；患者即活人，男性或女性，它們本身處于臨床環境中進行疾病或狀況的診斷、預后或治療。測試樣品優選地從患者獲得，例如血清或血漿。大約0. 5mL的樣品體積是優選的；然而可以分析大約0. ImL的樣品。本發明考慮用于DHT定量分析的試劑盒。本發明的用于DHT定量分析的試劑盒可包括包含足以進行至少一個分析的量的內標的試劑盒。一般地，試劑盒也將包括以有形形式記錄的說明書(例如包含在紙上或電子介質上)用以將包裝的試劑在測定DHT量的測量分析中使用。用于本發明實施方式的校準和QC庫(pool)可以使用“貧化((stripped) ”血漿或血清(貧化DHT)進行制備例如，雙活性炭解吸并去脂的血清。所有的人或非人貧化血漿或血清的源應該被檢查以確保它們不含有可測量數量的DHT。用于質譜分析法的樣品分離測試樣品可在室溫以下儲存。首先使儲存在室溫以下的測試樣品(包括對照)達到室溫，并且通過機械渦旋混合。在該時刻，可將內標加至測試樣品。然后，可通過液-液或固相萃取制備樣品進行質譜分析法。可使用多種方法以在質譜分析法之前相對于樣品中其他組分(例如蛋白質)富集DHT，所述方法包括例如液相色譜、過濾、離心、薄層層析(TLC)、電泳——包括毛細管電泳、親和分離——包括免疫親和分離、提取法——包括乙酸乙酯或甲醇提取、和使用離液劑或任何上述組合等。
蛋白質沉淀是制備測試樣品特別是生物測試樣品例如血清或血漿的一種方法。這類蛋白純化方法是本領域熟知的，例如Poison等，Journal of Chromatography B2003, 785 J63-275，描述適合用于本發明方法的蛋白質沉淀技術。蛋白質沉淀可用于從樣品除去大多數蛋白質，在上清液中留下DHT。樣品可被離心以將液體上清液與沉淀蛋白質分離；可選地，可過濾樣品以除去沉淀蛋白質。然后，所形成的上清液或濾液可直接應用到質譜分析法分析；或可選地，應用到液相色譜和隨后的質譜分析法分析。在某些實施方式中，利用蛋白質沉淀例如甲酸蛋白質沉淀可避免在質譜分析法或HPLC和質譜分析法之前對HTLC或其他聯機提取的需要。因此，在一些實施方式中，蛋白質沉淀單獨或與一種或多種純化方法組合可用于在質譜分析法之前純化DHT。在這些實施方式中，方法可包括(1)進行目的樣品的蛋白質沉淀；和( 將上清液直接加載到LC-質譜儀上，而無需使用聯機提取或HTLC。可選地，該方法可包括(1)進行目的樣品的蛋白質沉淀；和( 在質譜分析法之前，使用聯機提取將上清液加載到HTLC上以進一步純化。可在質譜分析法之前使用的一個樣品純化方法是液相色譜(LC)。液相色譜的某些方法——包括HPLC，依賴于相對慢的層流技術。傳統的HPLC分析依賴于柱填充物，其中通過該柱的樣品的層流是將目的分析物從樣品分離的基礎。本領域普通技術人員將理解在這類柱中的分離是擴散過程，并且可選擇適用于DHT使用的HPLC儀器和柱。一般地，色譜柱包括介質(即填充材料)以促進化學部分的分離(即分級)。介質可包括微小的顆粒。顆粒包括與不同的化學部分相互作用以促進化學部分分離的鍵合表面(bonded surface)。一種適當的鍵合表面是疏水鍵合表面，例如烷基鍵合或氰基鍵合表面。烷基鍵合表面可包括 C-4、C-8、C-12或C-18鍵合的烷基。在優選的實施方式中，柱是氰基柱。色譜柱包括用于從固相萃取或HTLC柱直接地或間接地接收樣品的入口和排放包括分餾樣品的流出液的出在一個實施方式中，樣品可在入口處被施加到LC柱，用溶劑或溶劑混合物洗脫， 并在出口處排放。可選擇不同的溶劑模式以洗脫目的分析物(一種或多種)。例如，可使用梯度模式、等度模式或多型(polytyptic)(即混合的)模式進行液相色譜。在色譜法期間，物質的分離用過多個變量例如洗脫液(也稱為“流動相”)、洗脫方式、梯度條件、溫度等的選擇來實現。在某些實施方式中，可在目的分析物通過柱填充物質可逆地保留而一種或多種其他物質不保留的條件下，通過將樣品施加到柱來純化分析物。在這些實施方式中，可以使用第一流動相條件，其中目的分析物被柱保留，并且在未保留物質被洗滌通過后，可隨后使用第二流動相條件以從柱移出保留的物質。可選地，可以在其中目的分析物以與一種或多種其他物質相比的差別速度洗脫的流動相條件下，通過將樣品施加到柱來純化分析物。這類過程可相對于樣品的一種或多種其他組分，富集一種或多種目的分析物的量。在一個優選的實施方式中，用疏水柱色譜系統進行HPLC。在某些優選的實施方式中，使用氰基分析柱(例如，Thermo Scientific, Inc.的BetaBasic氰基分析柱(5 μ m顆粒大小，50 X 2. Imm)或等同物)。在某些優選的實施方式中，使用HPLC級0. 含水甲酸和 100%甲醇作為流動相，進行HTLC和/或HPLC。通過小心選擇閥和連接器管道(connector plumbing)，兩個或更多色譜柱可根據
11需要連接，以便物質從一個通過到下一個，而無需任何手動步驟。在優選的實施方式中，閥和管道的選擇通過預編程的計算機控制，以進行必要的步驟。最優選地，也以這樣的聯機方式連接色譜系統至檢測器系統，例如MS系統。因此，操作員可將樣品托盤置于自動采樣器中，并且剩余操作在計算機控制下進行，這導致所有選擇的樣品的純化和分析。在一些實施方式中，HTLC可被用于在質譜分析法之前純化DHT。在這類實施方式中，可以使用俘獲分析物的HTLC提取柱柱體(HTLC extraction cartridge)提取樣品，然后洗脫并在第二 HTLC柱或分析HPLC柱上進行色譜，然后離子化。例如，使用HTLC提取柱柱體的提取樣品可使用大粒子大小(50 μ m)填充柱進行。然后，該柱洗脫出的樣品可被轉移到HPLC分析柱，例如氰基分析柱，以在質譜分析法之前進一步純化。因為涉及這些色譜過程的步驟可以以自動方式連接，所以在分析物純化期間操作員介入的需要可被最小化。該特征可導致節約時間和成本，并且消除操作員錯誤的機會。通過質譜分析法檢測和定量在不同的實施方式中，在測試樣品中存在的DHT可通過本領域普通技術人員已知的任何方法進行離子化。使用質譜儀進行質譜分析法，所述質譜儀包括用于離子化分餾樣品和產生帶電分子以進行進一步分析的離子源。例如，樣品的離子化可通過如下進行電子電離、化學電離、電噴射離子化(ESI)、光子電離、大氣壓化學電離(APCI)、光致電離、大氣壓光致電離(APPI)、快原子轟擊(FAB)、液體次級電離(LSI)、基質輔助激光解吸電離(MALDI)、場致電離、場解吸、熱噴射/等離子體噴射電離、表面增強的激光解吸電離 (SELDI)、電感耦合等離子體(ICP)和粒子束電離。本領域普通技術人員將理解選擇離子化方法可基于待被測量的分析物、樣品類型、檢測器類型、正對負模式的選擇等進行確定。可以以正或負模式離子化DHT。在優選的實施方式中，以正模式，通過APCI離子化 DHT。在相關的優選實施方式中，DHT離子處于氣狀態，并且惰性碰撞氣體為氬氣或氮氣；優選地為氬氣。在質譜分析法技術中，通常地，在樣品已經離子化之后，可分析由此產生的帶正電或帶負電的離子，以測定質荷比。測定質荷比的適當的分析器包括四極分析器、離子阱分析器和飛行時間分析器(time-of-flight analyzer) 0可以使用數種檢測模式檢測離子。例如，可以檢測選擇的離子，即使用選擇的離子監測模式(selective ion monitoring mode) (SIM)，或可選地，使用掃描模式例如多重反應監測(multiple reaction monitoring) (MRM)或選擇反應監測(selected reaction monitoring) (SRM)檢測離子。優選地，使用四極分析器測定質荷比。例如，在“四極”或“四極離子阱”儀器中，振蕩射頻場(oscillating radio frequency field)中的離子經歷與施加在電極之間的直流電勢、RF信號的振幅和質 /荷比成比例的力。可以選擇電壓和振幅以便僅具有特定質/荷比的離子行進四極的長度， 而所有其他的離子被偏轉。因此，對于注入該儀器的離子，四極儀器可充當“質量過濾器”和 “質量檢測器”。通過使用“串聯質譜分析法”或“MS/MS”，可提高MS技術的分辨率。在該技術中， 從目的分子生成的先驅離子(也稱為母離子)可在MS儀器中過濾，并且隨后，將先驅離子碎裂，以產生一種或多種碎片離子(也稱為子代離子或產物離子)，然后將其在第二MS過程中分析。通過小心的選擇先驅離子，僅某些分析物產生的離子被傳送到碎裂室，在那里與惰性氣體原子的碰撞產生碎片離子。因為在給定組的離子化/碎裂條件下，先驅離子和碎片離子以可再現的方式產生，所以MS/MS技術可提供極強大的分析工具。例如，過濾/碎裂的組合可用于消除干擾物質，并且特別可用于復雜樣品，例如生物樣品。一般地，質譜儀給用戶提供離子掃描；即，在給定范圍(例如100到1000原子質量單位(amu))內具有特定質量/電荷的每種離子的相對豐度。通過多種本領域已知的方法， 分析物分析的結果——即質譜——可與在原始樣品中分析物的量相關。例如，倘若采樣樣品和分析參數被小心地控制，則給定離子的相對豐度可以與轉換那些相對豐度為原始分子絕對量的表進行比較。可選地，分子標準品可以與樣品一起分析(run)，并且基于從那些標準品生成的離子構造標準曲線。使用這類標準曲線，給定離子的相對豐度可以被轉變為原始分子的絕對量。在某些優選的實施方式中，使用內標生成計算DHT量的標準曲線。生成和使用這類標準曲線的方法是本領域熟知的，并且普通技術人員能夠選擇適當的內標。例如，同位素標記的類固醇可以用作內標；在某些優選實施方式中，標準是16，16，17-d3雙氫睪酮(16，16，17-d3DHT)。將離子的量與原始分子的量相關聯的許多其他方法是本領域普通技術人員熟知的。該方法的一個或多個步驟可以使用自動儀器進行。在某些實施方式中，一個或多個純化步驟聯機進行，更優選地，所有純化和質譜分析法步驟可以以聯機方式進行。在某些實施方式中，例如MS/MS，其中先驅離子被分離以進行進一步碎裂，碰撞活化解離經常用于生成碎片離子以進行進一步檢測。在CAD中，先驅離子通過與惰性氣體碰撞獲得能量，并且隨后通過稱為“單分子分解”的方法破碎。足夠的能量必須沉積在先驅離子中，以便離子內的某些鍵可由于振動能增加而破裂。在特別優選的實施方式中，如下使用MS/MS檢測和/或定量DHT。使樣品經歷液相色譜，優選地HTLC ；來自色譜柱的液體溶劑流進入MS/MS分析器的加熱的霧化器界面；和在界面的加熱管中，將溶劑/分析物混合物轉化為蒸汽。包含在霧化溶劑中的分析物(例如 DHT)通過界面的電暈放電針頭離子化，所述針頭將大的電勢施加到霧化溶劑/分析物混合物。離子例如先驅離子通過儀器的孔，并且進入第一四極。四極1和3(Q1和Q3)是質量過濾器，其允許基于其質荷比(m/z)選擇離子(即，在Ql和Q3中分別選擇“先驅”和“碎片” 離子)。四極2 是碰撞室，在那里離子破碎。質譜儀的第一四極Oil)選擇具有DHT質荷比的分子。允許具有正確質/荷比的先驅離子傳送進入碰撞室(Q2)，而具有任何其他質 /荷比的不想要離子與四極的側面碰撞，并被消除。進入Q2的先驅離子與中性氬氣體分子碰撞并破碎。該過程被稱為碰撞活化解離(collision activated dissociation) (CAD)。 生成的碎片離子被傳送入四極3 (Q3)，在那里選擇DHT的碎片離子，而其他離子被消除。該方法可包括以正或負離子模式進行的MS/MS ；優選正離子模式。使用本領域熟知的標準方法，本領域普通技術人員能夠鑒定可被用于選擇四極3 的DHT的特定先驅離子的一種或多種碎片離子。當離子與檢測器碰撞時，它們產生轉變為數字信號的電子脈沖。獲得的數據被傳遞到計算機，其繪制收集的離子個數對時間的圖。得到的質譜圖與在傳統的HPLC方法中生成的色譜圖相似。在與特定離子相應的峰下面的面積或這類峰的振幅被測量，并且面積或振幅與目的分析物的量相關。在某些實施方式中，對于碎片離子(一種或多種)和/或先驅離子，曲線下的面積或峰的振幅被測量以測定DHT的量。如上所述，可以使用基于內標分子例如16，16，17-d3雙氫睪酮的一種或多種離子峰的校準標準曲線，將給定離子的相對豐度轉化為原始分析物例如DHT的絕對量。下面的實施例用于說明本發明。這些實施例絕不意圖限制本方法的范圍。實施例實施例1 血清樣品和試劑制備通過在不具有添加劑的Vacutainer管中收集血液制備血漿樣品，并且使血漿樣品在室溫下凝塊大約30分鐘。然后離心樣品，并且將血清與細胞分離。顯示總溶血(gross hemolysis)的樣品被排除。使用DHT(Sigma Chemical Company，目錄號A7755，或等價物)制備三份儲液 (stock solution) 0在容量瓶中制備甲醇中的lmg/mL的DHT儲備標準溶液。然后，以 1 100稀釋DHT儲備標準溶液的部分，以制備甲醇中1，000, 000ng/dL的DHT中間儲備標準溶液。使用中間儲備標準溶液的部分部分制備甲醇中2，000ng/dL的第二中間儲備標準溶液。使用第二中間儲備標準溶液制備貧化血清中的200ng/dL的DHT工作標準品。使用16，16，17_d3雙氫睪酮(CDN，目錄號D-5079，或等價物)制備氘化甲醇中 1. 0mg/mL的16，16，17_d3雙氫睪酮內標儲液，其被用于制備氘化甲醇中1，000, 000ng/dL的 16，16，17-d3雙氫睪酮中間內標儲液。使用1. OmL的該中間儲液制備水中的1000ng/dL的 16，16，17-d3雙氫睪酮的第二中間內標儲液。通過用DI水稀釋20mL的第二中間內標儲液至200mL容量瓶的體積，制備500ng/dL的16，16，17_d3雙氫睪酮內標工作溶液。實施例2 使用液相餼譜從樣品提取DHT通過使用機械渦旋首先混合，制備用于液相色譜(LC)的室溫標準品、對照和患者樣品。然后將300μ L的每種渦旋的標準品、對照和患者樣品轉移到96孔板的孔中。然后，將300 μ L的20%甲酸和100 μ L的500ng/mL的16，16，17_d3雙氫睪酮內標工作溶液加入到每一孔中。然后，渦旋并在室溫下溫育所述板30分鐘，然后將其加載到自動采樣器取出器(autosampIer drawer)中。用使用Aria OS V 1. 5 或更新軟件的 Cohesive Technologies Aria TLX-1HTLC 系統進行樣品注入。使用60%乙腈、30%異丙醇和10%丙酮(ν/ν)制備自動采樣器洗滌溶液。HTLC系統自動地將100 μ L的上述制備的樣品注入填充有大顆粒的TurboFlow柱 (來自 Cohesive Technologies 的 50 X 1. 0mm，50 μ m C-18 柱)。以高流速(5. OmL/min，力口載試劑0. 甲酸)加載樣品以在提取柱內產生紊流。該紊流確保DHT與柱中大顆粒優化結合，以及殘留蛋白質通過和碎片廢棄。在加載后，使流動方向變得相反，并且將樣品洗脫出到分析柱(Thermo Scientific, BetaBasic氰基柱，5 μ m顆粒大小，50 X 2. 1mm)。將二元HPLC梯度施加到分析柱以將DHT與樣品中包含的其他分析物分離。流動相A是0. 甲酸，流動相B是100% 甲醇。HPLC梯度開始于3%有機梯度(organic gradient)，其在大約4. 75分鐘內，上升到 50%。然后，使分離的樣品經歷MS/MS，進行DHT的量化。DHT對相似分析物的特異性針對下述化合物(每一種濃度在貧化血清中為 1000ng/dL)進行確定睪酮、雌三醇、脫氫表雄酮(DHEA)、雌酮、孕烯醇酮、雌二醇、雄烯二酮、17-0H孕烯醇酮、皮質酮和醛留酮。對于這些化合物的任一種，沒有觀察到顯著干擾。
實施例3 通過MS/MS檢測和量化DHT使用 Finnigan TSQ Quantum Ultra MS/MS系統(Thermo Electron Corporation) 進行MS/MS。全部來自ThermoElectron的下述軟件程序被用于本文描述的實施例中 Quantum Tune Master V 1. 2 或更新的、Xcalibur V 1. 4 SRl 或更新的、TSQ Quantuml. 4 或更新的和具有SPl的LCQuan V 2.0或更新的。排出分析柱的液體溶劑/分析物流動到 Thermo Finnigan MS/MS分析器的加熱的霧化器界面。在界面的加熱管中，將溶劑/分析物混合物轉化為蒸汽。霧化溶劑中的分析物通過APCI離子化。離子傳送到第一四極(Ql)，其選擇質荷比為四1. 10士0. 50m/z的離子。進入四極 2(Q2)的離子與氬氣碰撞以生成離子碎片，其被傳送到四極3(Q3)，以進一步選擇。同時，用內標16，16，17-(13雙氫睪酮，進行使用同位素稀釋質譜分析法的相同過程。在正極性上進行確認期間，使用下述質量轉變用于檢測和定量。表1. DHT的質量轉變(正極性)
權利要求
1.測定體液樣品中未衍生的雙氫睪酮(DHT)的量的方法，所述方法包括a.在適合于產生一種或多種通過質譜分析法可檢測的離子的條件下，離子化通過固相萃取(SPE)從所述體液樣品純化的未衍生的DHT;其中所述離子包括選自具有質荷比 291. 10士0. 50,255. 20士0. 50和79. 20士0. 50的離子的一種或多種離子；和b.通過質譜分析法測定一種或多種離子的量，并且使用測定的所述量計算所述體液樣品中未衍生的DHT的量。
2.權利要求1所述的方法，其中所述質譜分析法是串聯質譜分析法。
3.權利要求1-2任一項所述的方法，其中所述離子化包括生成具有質/荷比 291. 10士0. 50的先驅離子以及生成選自具有質/荷比255. 20士0. 50和79. 20士0. 50的離子的一種或多種碎片離子。
4.權利要求1-3任一項所述的方法，其中所述SPE和質譜分析法以聯機方式進行。
5.權利要求1-4任一項所述的方法，其中所述SPE作為高紊度液相色譜(HTLC)進行。
6.權利要求1-5任一項所述的方法，其中所述純化進一步包括用高效液相色譜(HPLC) 進行純化。
7.權利要求6所述的方法，其中所述SPE和所述HPLC被連接以進行所述樣品的聯機處理。
8.權利要求1-7任一項所述的方法，其中所述體液樣品是血漿或血清。
9.權利要求1-8的任一項所述的方法，其中所述方法具有在5ng/dL到200ng/dL—— 包括5ng/dL和200ng/dL——的范圍內的定量限制。
10.權利要求1-9任一項所述的方法，其中通過與內標比較，將由質譜分析法測定的所述一種或多種離子的量與測試樣品中未衍生的DHT的存在或量相關聯。
11.權利要求10所述的方法，其中所述內標包括16，16，17-d3雙氫睪酮。
12.通過質譜分析法測定測試樣品中未衍生的雙氫睪酮(DHT)的量的方法，所述方法包括a.在適合于產生一種或多種質譜分析法可檢測的離子的條件下，離子化通過高紊度液相色譜(HTLC)從所述測試樣品純化的未衍生的DHT;和b.通過質譜分析法測定一種或多種離子的量，并且使用測定的所述量來計算體液樣品中未衍生的DHT的量。
13.權利要求12所述的方法，其中所述質譜分析法是串聯質譜分析法。
14.權利要求12-13任一項所述的方法，其中所述純化進一步包括用高效液相色譜 (HPLC)進行純化。
15.權利要求12-14任一項所述的方法，其中所述HTLC和所述HPLC被配置用于聯機處理。
16.權利要求12-15任一項所述的方法，其中所述測試樣品是體液樣品。
17.權利要求12-16任一項所述的方法，其中所述測試樣品是血漿或血清。
18.權利要求12-17任一項所述的方法，其中質譜分析法可檢測的所述一種或多種離子包括選自具有質/荷比291. 10士0. 50,255. 20士0. 50和79. 20士0. 50的離子的一種或多種離子。
19.權利要求12-18任一項所述的方法，其中所述離子化包括生成具有質/荷比`291. 10士0. 50的先驅離子以及選自具有質/荷比255. 20士0. 50和79. 20士0. 50的離子的一種或多種碎片離子。
20.權利要求12-19任一項所述的方法，其中所述方法具有在5ng/dL到200ng/dL—— 包括5ng/dL和200ng/dL——的范圍內的定量限制。
21.權利要求12-20任一項所述的方法，其中通過與內標比較，將由質譜分析法測定的所述一種或多種離子的量與所述測試樣品中未衍生的DHT的存在或量相關聯。
22.權利要求21所述的方法，其中所述內標包括16，16，17-d3雙氫睪酮。
23.通過串聯質譜分析法測定體液樣品中未衍生的雙氫睪酮(DHT)的量的方法，所述方法包括a.生成通過高紊度液相色譜(HTLC)從體液樣品純化的未衍生的DHT的先驅離子，其具 W 291. 10士0. 50 的質 / 荷比；b.生成所述先驅離子的一種或多種碎片離子，其中所述一種或多種碎片離子的至少一種包括選自具有質/荷比255. 20士0. 50和79. 20士0. 50的離子的碎片離子；和c.測定在步驟(b)或(c)或兩者中生成的所述離子的一種或多種的量，并且使用測定的所述量計算所述測試樣品中未衍生的DHT的量。
24.權利要求23所述的方法，其中所述純化進一步包括用高效液相色譜(HPLC)進行純化。
25.權利要求M所述的方法，其中所述HTLC和所述HPLC被配置用于聯機處理。
26.權利要求23-25任一項所述的方法，其中所述體液樣品是血漿或血清。
27.權利要求2346任一項所述的方法，其中所述方法具有在5ng/dL到200ng/dL—— 包括5ng/dL和200ng/dL——的范圍內的定量限制。
28.權利要求23-27任一項所述的方法，其中通過與內標比較，將由質譜分析法測定的所述一種或多種離子的量與所述測試樣品中未衍生的DHT的存在或量相關聯。
29.權利要求觀所述的方法，其中所述內標包括16，16，17-d3雙氫睪酮。
全文摘要
提供的是使用質譜分析法測定樣品中雙氫睪酮(DHT)的量的方法。一般而言，該方法包括離子化樣品中的DHT，并且檢測和定量所述離子的量以測定樣品中DHT的量。
文檔編號C12Q1/02GK102239266SQ200980148812
公開日2011年11月9日 申請日期2009年9月30日 優先權日2008年10月6日
發明者A·戈沙爾, N·J·克拉克, R·瑞茨 申請人:奎斯特診斷投資公司