用于在平面基底上進行細胞附著和培養的方法和組合物的制作方法

專利名稱：用于在平面基底上進行細胞附著和培養的方法和組合物的制作方法
技術領域：
本發明涉及使多能干細胞在缺少吸附層和飼養細胞層的平面基底上生長、擴增和分化的方法。
背景技術：
哺乳動物細胞培養是生命與健康科學中許多方法之一。涉及貼壁依賴性細胞的哺乳動物細胞培養和分析用容器通常由玻璃或聚合物(例如聚苯乙烯)制成，其經常需要額外的表面處理以使得細胞能貼附至容器表面。這樣的處理可包括在表面施加吸附層，例如， 通過吸附、接枝或等離子體聚合技術施加。作為另外一種選擇，表面處理可借助于容器表面自身的化學改性，其可通過(例如)大氣華、射頻真空等離子體、直流輝光放電和微波等離子體處理等實現。目前培養多能干細胞、尤其是胚胎干(EQ細胞的方法要求復雜的培養條件，例如，在具有飼養細胞層的固體基底表面上或在具有胞外基質蛋白的吸附層的固體基底表面上培養胚胎干細胞。采用這些方法的培養體系通常使用飼養細胞或胞外基質蛋白，這些飼養細胞或胞外基質蛋白取自與培養中的干細胞的物種不同的物種(異種材料)。可將通過暴露于飼養細胞獲得的培養基(即經未分化的ES細胞之外的細胞調理過的培養基)用于培養ES細胞，并且可在培養基中補充動物血清。例如，Reubinoff等人(Nature Biotechnol. 18 :399-404,2000)和 Thompson 等人 (Science 282 :1145-1147,1998)公開了用小鼠胚胎成纖維細胞飼養細胞層來培養取自人胚泡的ES細胞系。又如，Xu等人(NatureBiotechnology 19 :971-974,2001)公開了使用MATRIGEL 和層粘連蛋白處理固體基底表面，然后在不發生分化的情況下對人ES細胞進行無飼養細胞培養。又如，Vallier等人(J. Cell Sci. 118 =4495-4509,2005)公開了使用胎牛血清處理固體基底表面，然后在無分化的情況下對人ES細胞培養進行無飼養細胞培養。又如，W02005014799公開了一種用于哺乳動物細胞的維持、增殖和分化的調理過的培養基。W02005014799聲稱“通過鼠細胞、尤其是那些分化的和永生化的轉基因肝細胞 (稱為MMH(Met鼠肝細胞))的細胞分泌活性調理根據本發明制備的培養基”。又如，Wanatabe等人(Nature Biotechnol. 35 :681-686,2007)聲稱“ROCK 抑制劑使得分離的人胚胎干細胞能成活”，并且證實減少了解離誘導的細胞凋亡，增加了克隆效率 (從大約增加到大約27%)和基因轉移后的亞克隆的便捷性，該方法使用小鼠胚胎成纖維細胞作為飼養細胞，使用膠原和MATRIGEL 作為胞外基質蛋白，使用Y-27632或法舒地爾 (Fasudil)抑制R0CK。此外，用Y-27632處理過的解離的人ES細胞可避免在無血清懸浮培養中發生凋亡。
又如，Peerani等人(EMBO Journal 26 :4744_4755，2007)描述“人胚胎干細胞(hESC)培養物中的空間組織的復雜性產生影響hESC命運的異質微環境(小生境 (niche))。本研究證實可通過改造hESC小生境特性來控制hESC的分化速率和分化軌跡。 小生境的大小和組成可調節分化誘導因子和抑制因子之間的平衡。從機制上來講，Smadl信號傳導的小生境大小依賴空間梯度是由于hESC和hESC來源的胚外內胚層(ExE)之間的拮抗相互作用產生。這些相互作用由骨形態發生蛋白2 (BMP》的ExE定位分泌及其拮抗劑生長分化因子3 (GDF3)的hESC定位分泌介導。對用⑶F3、BMP2和Smadl的小干擾RNA (siRNA) 以及Mio相關激酶(ROCK)抑制劑處理過的hESC進行微圖型化證明，對Smadl激活的獨立控制可挽救hESC的集落大小依賴性分化。我們的結果首次闡明了 Smadl在空間信息的空間整合和hESC自我更新和分化的小生境大小依賴性控制中的作用”。又如，Koyanagi,M 等人(J Neurosci Res. 200 年 2 月 1 日；86 (2) :270-80)聲稱 “Iih0-GTP酶涉及許多細胞類型(包括神經元)的細胞凋亡，但是其作用機理未被充分理解。，，在此，我們研究了 Mio和ROCK在胚胎干細胞來源的神經元前體細胞移植期間發生的細胞凋亡中的作用。我們發現神經元前體細胞的離解可激活Mio并誘導細胞凋亡。用他0 抑制劑C3胞外酶和/或ROCK抑制劑Y-27632進行處理可將解離誘導的細胞凋亡(失巢凋亡)降低20%-30%的量。細胞膜起泡(細胞凋亡的早期形態標志)；半胱天冬酶-3的裂解和細胞色素c從線粒體釋放也由于ROCK抑制而減少。這些結果表明神經元前體細胞的離解可引起細胞死亡的內源性通路，其至少部分地由Mio/ROCK通路介導。此外，在動物移植模型中，Mio和/或ROCK的抑制可減少移植細胞的急性細胞凋亡。移植后，腫瘤壞死因子α和神經生長因子前體在移植物周圍高度表達。ROCK抑制也可減少由這些炎性細胞因子促進的細胞凋亡。合在一起，這些結果表明Mio/ROCK信號傳導的抑制可改善細胞替代療法中移植細胞的存活。使用異種材料可能不適用于采用多能干細胞的某些應用。可使用替代材料。例如， Mojkovic等人(Stem Cells 23 =895-902,2005)公開了使用人血清處理固體基底表面，然后在不發生分化的情況下對人ES細胞進行無飼養細胞培養。一種可供選擇的培養系統采用補充有能促進胚胎干細胞增殖的生長因子的無血
清培養基。例如，Cheon等人(BioR印rod DOI :10. 1095/biolreprod. 105. 046870 ；2005 年 10
月19日)公開了一種無飼養細胞、無血清的培養體系，其中ES細胞維持于補充有能夠引發 ES細胞自我更新的不同生長因子的未經調理的血清置換培養基中。又如，Levenstein等人(Stem Cells 24 :568-574,2006)公開了用于在不含成纖維細胞或調理培養基的情況下使用補充有堿性成纖維細胞生長因子(FGF)的培養基長期培養人ES細胞的方法。又如，US20050148070公開了在無血清、無成纖維細胞飼養的已知成分的培養基中培養人ES細胞的方法，該方法包括在含有白蛋白、氨基酸、維生素、礦物質、至少一種轉鐵蛋白或轉鐵蛋白替代物、至少一種胰島素或胰島素替代物的培養基中培養干細胞，所述培養基基本上不含哺乳動物胎兒血清，并含有至少約lOOng/ml的能夠激活FGF信號傳導受體的FGF，其中所述生長因子由來自除了單獨的成纖維細胞飼養層之外的來源提供，所述培養基支持在無飼養細胞或調理培養基的情況下干細胞以不分化的狀態增殖。
4
又如，US20050233446公開了一種可用于培養干細胞的已知成分的培養基，所述干細胞包括未分化的靈長類原始干細胞。在溶液中，該培養基與被培養的干細胞基本上等滲。 在給定培養物中，具體的培養基包含基礎培養基以及各一定量的堿性FGF、胰島素和抗壞血酸，這些成分對于支持原始干細胞的基本上未分化的生長是必需的。又如，US6800480聲稱“在一個實施例中，提供了用于以基本上未分化狀態培養靈長類來源的原始干細胞的細胞培養基，其包括低滲透壓、低內毒素基礎培養基，所述培養基可有效支持靈長類來源的原始干細胞的生長。該基礎培養基與可有效支持源于靈長類的原始干細胞生長的營養血清和選自飼養細胞和衍生自飼養細胞的胞外基質組分的基質相混合。該培養基還包括非必需氨基酸、抗氧化劑和選自核苷和丙酮酸鹽的第一生長因子”。又如，US20050244962聲稱“在一個方面，本發明提供了培養靈長類胚胎干細胞的方法。可在基本上無哺乳動物胎兒血清(優選還基本上無任何動物血清)的培養物中且在存在成纖維細胞生長因子的情況下培養所述干細胞，該成纖維細胞生長因子由除了單獨的成纖維細胞飼養層外的來源提供。在優選的形式中，通過添加足量的成纖維細胞生長因子，使得之前為維持干細胞培養物所需的成纖維細胞飼養層變為非必需的”。又如，W020050653M公開了一種基本上無飼養細胞和無血清的成分確定的等滲培養基，其包含a.基礎培養基；b. —定量的足以支持基本上未分化的哺乳動物干細胞生長的堿性成纖維細胞生長因子；c. 一定量的足以支持基本上未分化的哺乳動物干細胞生長的胰島素；和d. —定量的足以支持基本上未分化的哺乳動物干細胞生長的抗壞血酸。又如，W02005086845公開了一種維持未分化的干細胞的方法，所述方法包括使干細胞暴露于轉化生長因子-β (TGFi3)蛋白家族的成員、成纖維細胞生長因子(FGF)蛋白家族的成員或煙酰胺(NIC)，所述成員或煙酰胺的量足以維持所述細胞處于未分化狀態達足以實現所需結果的一段時間。多能干細胞為研究和藥物篩選提供潛在資源。目前，人ES細胞系的大規模培養是困難的，并且帶來了嚴峻挑戰。針對這些挑戰的可能解決方案是以單細胞形式傳代和培養人ES細胞。單細胞更適合標準組織培養技術，例如，計數、轉染等等。例如，Nicolas等人提供了一種用于從單細胞生產和擴增人ES細胞系的方法， 所述單細胞已通過慢病毒載體進行遺傳修飾，然后通過熒光激活細胞分選來分離Gtem Cells Dev. 16 :109-118,2007)。又如，美國專利申請US2005158852公開了一種“用于改善單個人胚胎干細胞的生長和存活的方法。該方法包括如下步驟獲得未分化的單hES細胞；將該未分化的單細胞與細胞外基質混合；以及將該混合物接種至飼養細胞上，其中在生長環境中具有營養介質。”又如，Sidhu等人(Stem Cells Dev. 15 =61-69,2006)描述了對三種衍生自親本系 hES3的人ES細胞克隆hES 3. 1、3.2和3.3的首次報道，所述克隆是通過流式細胞術進行單細胞制備物的分選而得到。然而，人ES細胞作為單細胞的傳代和培養會導致遺傳異常和多潛能性喪失。培養條件對于多潛能性和遺傳穩定性的保持是重要的。通常，通過人工或用酶學試劑(例如膠原酶、釋放酶(Iiberase)或分散酶(dispase))進行人ES細胞系的傳代。例如，Draper等人指出了“在五種獨立的情形下，三種獨立的人胚胎干細胞系中涉及染色體17q的獲得的核型改變”的存在(Nature Biotechnol. 22 =53-54,2004)。
又如，Buzzard等人聲稱，“我們僅曾經檢測到一個核型改變事件…考慮到我們的方法與大部分其他研究組所用的方法完全不同，所用的培養方法可能對我們的結果有一些影響。通常我們在7天后通過首先用破碎的移液管邊緣分離集落來對人ES細胞進行傳代…在該方法中并未采用酶學細胞解離方法或化學細胞解離方法。我們推測這可解釋我們擁有的hES(人ES)細胞的相對細胞遺傳復原能力(cytogenetic resilience)/' (Nature Biotechnol. 22 :381-382,2004)。又如，Mitalipova等人聲稱“批量傳代方法…在長期傳代后能在培養物中保持非整倍性細胞群，但可用于較短的周期(最高至至少15次傳代)而無核型異常…有可能在長期人工增殖條件下，隨后在要求比人工傳代方法單獨能夠提供的數量更多的hES細胞的實驗中進行有限的批量傳代后，保持hES細胞中的正常核型。” (Nature Biotechnol. 23 19-20,2005)。又如，Heng等人聲稱“結果證明第二個方案(伴隨輕輕抽吸進行胰蛋白酶消化) 比第一個方案(伴隨刮擦進行膠原酶處理)對細胞活力的危害更小。這繼而轉化為更高的凍融存活率，，。(Biotechnology and Applied Biochemistry 47 :33-37, 2007)。又如，Hasegawa等人聲稱“我們已建立了能耐受完全解離的hESC亞系。這些細胞顯示具有高的再次平板接種(relating)的效率和高克隆效率，并且它們保持分化成三個胚層的能力”。(Stem Cells 24 :2649-2660,2006) 又如，美國專利申請61/030，544提供了用于細胞附著至固體基底表面上、在其上培養細胞和從其上使細胞脫落的方法和組合物，所述基底表面含有至少約0. 9%的氮至約 11%的氮以及至少約12%的氧至至少約30%的氧并且不含吸附層和飼養細胞。在本發明的一個實施例中，用能夠抑制Mio激酶活性的化合物處理細胞。明顯需要用于在缺少飼養細胞和吸附層，同時保持細胞的多潛能性的情況下培養細胞(包括多能干細胞)的方法和組合物。本發明提供了用于在不缺少吸附層和飼養細胞層的平面基底上生長、擴增和分化多能干細胞的方法，其中所述細胞不需要用能夠抑制Mio 激酶活性的化合物處理以粘結至所述平面基底。

發明內容
在一個實施例中，本發明提供了一種使多能干細胞在平面基底上附著、培養和分化的方法，所述平面基底含有最多約12%的N、至少約12%的0至至少約55%的0，接觸角為約18度至約32度，并且缺少吸附層和飼養細胞層。


圖1示出了 Iih0激酶抑制劑H-1152對人胚胎干細胞系Hl附著至平面基底的影響。 分圖a)示出了混合纖維素酯膜(表1中的2號膜)上的細胞附著。分圖b)示出了尼龍膜(表1中的4號膜)上的細胞附著。分圖c)示出了乙酸纖維素膜(表1中的5號膜) 上的細胞附著。分圖d)示出了聚碳酸酯膜(表1中的7號膜)上的細胞附著。分圖e): 示出了聚對苯二甲酸乙二醇酯膜(表1中的12號膜)上的細胞附著。圖2 示出了他0激酶抑制劑Y-26732對人胚胎干細胞系H9附著至混合纖維素酯膜(表1中的1號膜)的影響。分圖a)示出了對照孔中的細胞附著。分圖b)示出了用ΙΟμΜ的Y46732處理過的細胞的細胞附著。分圖c)示出了用20 μ M的Υ46732處理過的細胞的細胞附著。圖3 示出了在MATRIGEL 涂覆表面上的人胚胎干細胞系Hl的增殖曲線(實線) 和混合纖維素酯膜(表1中的1號膜)上的人胚胎干細胞系Hl的增殖曲線(虛線)。圖4 示出了細胞系Hl的人胚胎干細胞中代表性細胞的G顯帶染色體。分圖a) 示出了在MATRIGEL 涂覆表面上培養10代的細胞的染色體。分圖b)示出了在混合纖維素酯膜(表1中的1號膜)上培養10代的細胞的染色體。圖5 示出了他0激酶抑制劑Y26732對人胚胎干細胞系H9的細胞附著于聚碳酸酯膜(表1中的7號膜)的影響。分圖a)示出了對照孔中的細胞附著。分圖b)示出了用10 μ M的Υ-26732處理之后的細胞附著。分圖c)示出了用20 μ M的Υ-26732處理之后的細胞附著。圖6 示出了他0激酶抑制劑H-1152對人胚胎干細胞系Hl的細胞附著于聚碳酸酯膜(表1中的7號膜)的影響。分圖a)示出了對照孔中的細胞附著。分圖b)示出了當將0.03μΜ的H-1152添加至培養基時的細胞附著。分圖c)示出了當將0. 1 μ M的H-1152 添加至培養基時的細胞附著。分圖d)示出了當將0.3μΜ的H-1152添加至培養基時的細胞附著。分圖e)示出了當將IyM的H-1152添加至培養基中時的細胞附著。分圖f)示出了當將3 μ M的Η-1152添加至培養基時的細胞附著。圖7示出了從細胞培養基除去Mio激酶抑制劑Η-1152之后人胚胎干細胞系Hl的細胞與聚碳酸酯膜(表1中的9號膜)的脫離。分圖a)示出了在培養基中保持3μ M的 Η-1152時細胞的附著。分圖b)示出了當從培養基除去H-1152時細胞的脫離。圖8示出了膜孔徑和Iih0激酶抑制劑處理對人胚胎干細胞系Hl附著至平面基底的影響，所述平面基底包括如下在分圖a和c中為表1中的10號聚碳酸酯膜；在分圖b和 d中為表1中的11號聚碳酸酯膜。分圖a和b)示出了當在培養基中保持3μΜ的H-1152 時細胞的附著。分圖c和d)示出了當從培養基除去H-1152時細胞的脫離。圖9示出了聚碳酸酯膜(表1中的8號膜)上培養3代的人胚胎干細胞系Hl的細胞中的多潛能性相關標志物的表達的維持。附圖中指出的基因的表達是通過實時PCR來確定。實心條柱表示從未分化的人胚胎干細胞系Hl得到的數據。帶斜條紋的條柱表示從聚碳酸酯膜上培養的細胞得到的數據。圖10示出了在聚碳酸酯膜(表1中的8號膜)上培養12代后人胚胎干細胞系Hl 的細胞形成胚狀體的能力。附圖示出來自單個實驗的代表性數據。圖11示出了本發明的平面基底的掃描電子顯微圖。圖12示出了 ULTRAWEB 平面基底的掃描電子顯微圖。圖13示出了成分確定的培養基mTESR 對人胚胎干細胞系Hl的細胞粘結至多種平面基底的影響。
具體實施例方式將本發明的具體實施方式
部分分成以下幾個分部分，來描述或說明本發明的某些特征、實施例或應用，這是為了使公開內容清楚起見，并非限制本發明。定義
本文所用的“吸附層”指固體基底表面上通過共價鍵(也稱為接枝)或非共價鍵 (也稱為吸附)將分子連接至表面上而形成的一層。用于制備吸附層的分子可以為(例如) 蛋白質性分子，其可包括(例如)胞外基質蛋白、氨基酸等，還可以為非生物分子，例如，聚乙烯亞胺。“ β -細胞譜系”指對于轉錄因子PDX-I和下列轉錄因子中的至少一種具有陽性基因表達的細胞NGN3、NKX2. 2、NKX6. 1、NEUROD、ISLl、HNF_3 β、MAFA、PAX4 或 ΡΑ)(6。表達 β 細胞譜系特征性標志物的細胞包括β細胞。本文所用的“表達定形內胚層譜系特征性標志物的細胞”指表達至少一種下列標志物的細胞S0X17、GATA4、HNF3 β、GSC、CERl、Nodal、FGF8、Brachyury、Mix 樣同源盒蛋白、 FGF4 CD48、脫中胚蛋白(eomesodermin，EOMES)、DKK4、FGF17、GATA6、C)(CR4、C-Kit、CD99 或 0TX2。表達定形內胚層譜系特征性標志物的細胞包括原條前體細胞、原條細胞、中內胚層細胞和定形內胚層細胞。本文所用的“表達胰腺內胚層譜系特征性標志物的細胞”指表達至少一種下列標志物的細胞PDX1、HNF1 β ,PTFl α、HNF6、NKX6. 1或HB9。表達胰腺內胚層譜系特征性標志物的細胞包括胰腺內胚層細胞、原腸管細胞和后前腸細胞。本文所用的“定形內胚層”指具有在原腸胚形成過程中從上胚層產生的細胞的特性并形成胃腸道及其衍生物的細胞。定形內胚層細胞表達下列標志物HNF3i3、GATA4、 S0X17、Cerberus、0TX2、goosecoid、C-Kit, CD99 和 MIXLl。本文所用的“胰腺內分泌細胞”或“胰腺激素表達細胞”指能夠表達至少一種下列激素的細胞胰島素、胰高血糖素、生長抑素和胰腺多肽。本文所用的“胚外內胚層”指表達至少一種下列標志物的細胞群S0X7、AFP或 SPARC。“胞外基質蛋白”指通常在體內或在胎盤內的細胞間存在的蛋白質性分子。胞外基質蛋白可來自組織、體液(如血液)或通過非重組細胞或重組細胞或細菌調理過的培養基。本文所用的“標志物”是在所關注的細胞中差異表達的核酸或多肽分子。在該語境中，差異表達意指陽性標志物的水平增加，而陰性標志物的水平降低。與其他細胞相比， 所關注的細胞中標志核酸或多肽的可檢測水平足夠高或足夠低，使得可使用多種本領域公知的方法中的任何一種鑒定所關注的細胞與將其與其他細胞區分開來。本文所用的“中內胚層細胞”指表達至少一種下列標志物的細胞⑶48、脫中胚蛋白(EOMES)、S0X-17、DKK4、HNF3 β、GSC、FGF17 或 GATA6。本文所用的“胰腺激素分泌細胞”指能夠分泌至少一種以下激素的細胞胰島素、 胰高血糖素、生長抑素和胰多肽。本文所用的“前原條細胞”指表達至少一種以下標志物的細胞=Nodal或FGF8。本文所用的“原條細胞”指表達至少一種以下標志物的細胞BraChyury、MiX-like 同源盒蛋白或FGF4。干細胞是由它們在單細胞水平上既自我更新又分化產生子代細胞的能力來定義的未分化細胞，包括自我更新祖細胞、非更新祖細胞和末端分化細胞。干細胞的特征還在于其具有在體外由多種胚層(內胚層、中胚層和外胚層)分化成各種細胞譜系的功能細胞以及移植后產生多種胚層的組織和注入胚泡后基本上有助于大部分(如果不是所有的話)
8組織形成的能力。干細胞根據其發育潛能分為(1)全能，指能夠產生所有的胚胎和胚胎外細胞類型；( 多能，指能夠產生所有的胚胎細胞類型；C3)多能，指能夠產生細胞譜系的亞群，但在特定組織、器官或生理系統內能產生所有的細胞(例如造血干細胞(HSC)可產生的后代細胞包括HSC(自我更新)、局限于血細胞的寡能祖細胞以及作為血液正常組分的所有細胞類型和成分(如血小板))；(4)寡能，指能夠產生比多能干細胞更具限制性的細胞譜系亞群；以及( 單能，指能夠產生單一細胞譜系(如生精干細胞)。分化是未特化的(“未定向的”)或特化不足的細胞獲得特化細胞(如神經細胞或肌肉細胞)的特征的過程。分化的細胞或誘導分化的細胞是已經在細胞譜系中占據更特化的(“定向的”)位置的細胞。術語“定向的”當應用到分化的過程時，指在分化途徑中已經進行到這么一種程度的細胞在正常環境下，它會繼續分化成特定的細胞類型或細胞類型子集，且在正常環境下不能分化成另一細胞類型或回復到分化程度較低的細胞類型。去分化指細胞回復到細胞的譜系當中特化(或定向)程度較低的地位的過程。本文所用的“細胞的譜系”限定了細胞的遺傳關系，即它來自哪些細胞和它能產生什么細胞。細胞譜系將細胞定位于發育和分化的遺傳計劃內。譜系特異性標志物是指與所關注譜系的細胞表型特異性相關并能夠用于評價非定向細胞向所關注譜系的分化的特征。本文所用的“表面”指旨在用于細胞培養或分析的固體基底容器或基質的最外面的分子層。可分別用X射線光電子能譜(XPQ、原子力顯微鏡(AFM)和接觸角測量法來分析表面的元素組成、粗糙度和潤濕性。有多個術語用來描述培養中的細胞。“維持”通常指將細胞在有利于細胞生長和/ 或分裂的條件下置于培養基中，這有可能或可能不導致產生更大的細胞群體。“傳代”指將細胞從一個培養容器移出并將它們在有利于細胞生長和/或分裂的條件下置于第二培養容器中的過程。細胞的特定群體或細胞系，有時由它已被傳代的次數來指稱或表征。例如，已被傳代十次的培養細胞群體可稱為Pio培養物。首次培養物(S卩，在將細胞從組織分離后的第一次培養物)被指定為Po。在第一次繼代培養后，細胞被描述為次代培養物(Pl或第1代)。 在第二次繼代培養后，細胞變成三代培養物(P2或第2代)，依此類推。本領域技術人員會理解，在傳代期間可能有多次群體倍增；因此培養物的群體倍增數目大于傳代數目。細胞在各次傳代之間的期間中的擴增(即群體倍增數目)取決于許多因素，包括但不限于接種密度、基底、培養基、生長條件和各次傳代之間的時間。本發明的平面基底適用于本發明的平面基底可由能夠提供多能細胞可附著其上的支撐物的任何材料構成。例如，平面基底可由聚碳酸酯構成。或者，平面基底可由聚對苯二甲酸乙二醇酯 (PETE)構成。或者，平面基底可由尼龍構成。或者，平面基底可由乙酸纖維素構成。或者， 平面基底可由混合纖維素酯構成。適用于本發明的平面基底的例子可見于表1。在一個實施例中，本發明提供了一種使多能干細胞在平面基底上附著、培養和分化的方法，所述平面基底含有最多約12%的N、至少約12%的0至至少約55%的0，接觸角為約18度至約32度，并且缺少吸附層和飼養細胞層。含有至少約8%的N至至少約12% 的N和至少約12%的0至至少約55%的氧的平面基底可以是粗糙的纖維表面，或者可以是平滑的表面。在一個實施例中，本發明提供了使多能干細胞附著于平面基底的方法，所述平面基底含有最多約12%的N、至少約12%的0至至少約55%的0，接觸角為約18度至約32 度，并且缺少吸附層和飼養細胞層，所述方法包括如下步驟a.獲得多能干細胞的懸浮液；以及b.將該細胞懸浮液添加至所述平面基底并允許細胞附著。在一個實施例中，將多能干細胞在附著于表面后進行培養。在一個實施例中，使多能干細胞在附著于表面后在平面基底上分化。在一個實施例中，通過用能夠抑制Iih0激酶活性的物質處理多能干細胞來增強多能干細胞與平面基底的附著，所述平面基底含有最多約12%的N、至少約12%的0至至少約55%的0，接觸角為約18度至約32度，并且缺少吸附層和飼養細胞層。在細胞附著后， 可將能抑制Mio激酶活性的化合物從細胞除去。能抑制Iih0激酶活性的化合物選自Y-27632、法舒地爾、Η-1152和羥基法舒地爾 (Hydroxyfasudil)。在一個實施例中，能抑制他0激酶活性的化合物可在約0. 1 μ M至約100 μ M的濃度下使用。在一個實施例中，能夠抑制Mio激酶活性的至少一種化合物在約10 μ M的濃度下使用。本發明的平面基底的表征在一個實施例中，本發明的平面基底表面的元素組成可以由X射線光電子能譜 (XPS)來分析。將XPS(也稱為化學分析電子能譜(ESCA))用作測定什么元素或原子存在于固體基底表面(可檢測濃度大于0. 1原子百分數的除氫和氦以外的所有元素)和測定這些元素或原子的鍵合環境的方法。在一個實施例中，本發明的平面基底表面的粗糙度可通過原子力顯微鏡法(AFM) 來分析。可用AFM以低至1人的水平分辨率和低至0.1人的垂直分辨率為表面原子或分子成像。在一個實施例中，可通過測量接觸角來分析本發明的平面基底表面的潤濕性。例如，使用靜滴法進行的接觸角測量可提供固體基底表面和液體表面之間相互作用的信息。 接觸角描述停留在固體基底表面上的液滴的形狀，其為固體基底表面上的液體接觸角，并在液、固和氣三相交界的接觸線處的液體內測得。具有大于90°的水接觸角的表面稱為疏水的，具有小于90°的水接觸角的表面稱為親水的。在極其親水的表面，也就是說，對水具有高親和力的表面，小水滴將完全鋪展(有效接觸角為0° )。在一個實施例中，通過測量表面與結晶紫的反應性來分析本發明的平面基底表面的負電荷密度。結晶紫帶有正電荷，使得其能夠結合到帶負電的分子和分子部分上，例如， 聚合物表面上的帶負電的官能團。如果表面具有相同的粗糙度和面積，則具有高結晶紫反應性的表面比具有低結晶紫反應性的表面具有更高密度的負電荷。多能干細胞多能干細胞的表征多能干細胞可表達階段特征性胚胎抗原(SSEA) 3和4以及可用稱為Tra-1_60和 Tra-1-81的抗體檢測的標志物中的一種或多種(Thomson等人，Science 282 =1145,1998) 多能干細胞體外分化會導致喪失SSEA-4、Tra-1-60和 ει-1-81的表達并增加SSEA-I的表達。未分化的多能干細胞通常具有堿性磷酸酶活性，該酶可通過用4%多聚甲醛固定細胞，然后用Vector Red作為底物顯影來檢測，如生產商所描述的(Vector Laboratories, Burlingame Calif)。未分化的多能干細胞還通常表達0CT-4和TERT，這可通過RT-PCR檢測。增殖的多能干細胞的另一理想表型是分化成所有三個胚層即內胚層、中胚層和外胚層組織的細胞的潛能。可以通過如下方式來確定干細胞的多潛能性例如，將細胞注射入重癥聯合免疫缺陷(SCID)小鼠，使用4%的多聚甲醛固定形成的畸胎瘤，然后對其進行組織學檢測，找出來自三個胚層的細胞類型的證據。作為另一種選擇，多潛能性可通過這樣來確定產生胚狀體并評價該胚狀體是否存在與三個胚層相關的標志物。增殖的多能干細胞系可用標準G顯帶技術進行核型分析并與公開的相應靈長類物種的核型相比較。理想的是獲得具有“正常核型”的細胞，“正常核型”的細胞意指該細胞是整倍體，其中所有人染色體都存在并且沒有顯著改變。多能干細胞的來源可使用的多能干細胞的類型包括從妊娠后形成的組織衍生而來的確立多能細胞系，包括在妊娠期間任何時間取得的胚前組織(例如胚泡)、胚胎組織或胎兒組織，所述時間通常是但不一定是在大約10至12周妊娠前。非限制性的例子是已確立的人胚胎干細胞系或人胚胎生殖細胞系，例如人胚胎干細胞系HI、H7和H9 (WiCell)。還可設想的是，在此類細胞的初始建立或穩定期間使用本公開的組合物，在此情況下，源細胞將是直接取自源組織的原代多潛能細胞。另外合適的是取自已在不存在飼養細胞的情況下培養的多能干細胞群體的細胞。同樣合適的是突變型人胚胎干細胞系，例如BGOlv (BresaGen，Athens，GA)。 另外合適的是衍生自非多能細胞例如成人體細胞的多能干細胞。在一個實施例中，人胚胎干細胞是如Thomson等人所述制備(美國專利 No. 5, 843, 780 ；Science 282 :1145,1998 ；Curr. Top. Dev. Biol. 38 133 ff. ，1998 ；Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 92 :7844,1995)。多能干細胞的培養在一個實施例中，在按照本發明的方法培養之前，將多能干細胞培養在以多種方式支持多能干細胞的飼養細胞層或胞外基質蛋白上。例如，將多能干細胞培養在支持多能干細胞增殖而不進行大量分化的飼養細胞層上。多能干細胞在飼養細胞層上生長而不分化是利用如下來支持的(i)獲得含有飼養細胞層的培養容器；以及(ii)通過先前用另一細胞類型進行培養而調理的培養基或者(例如)不含血清甚至沒有化學成分確定的未經調理的培養基。又如，將多能干細胞培養在基本上不含飼養細胞、但支持多能干細胞增殖而不進行大量分化的培養體系中。多能干細胞在不含飼養細胞的培養物中生長而不進行分化是利用以下條件來支持的(i)固體基底表面上具有一種或多種細胞外基質蛋白的吸附層；和 (ii)通過先前用另一細胞類型進行培養而調理的培養基或者未經調理的培養基(例如不含血清的培養基或甚至是化學成分確定的培養基)。在一個替代實施例中，將多能干細胞在通過先前用另一細胞類型進行培養而調理的培養基或者未經調理的培養基(例如不含血清的培養基或甚至是化學成分確定的培養基)中，在包括混合纖維素酯的平面表面上培養。培養基適用于本發明的細胞培養基的例子可見于US20020072117。適用于本發明的細胞培養基的另一例子可見于US6642048。適用于本發明的細胞培養基的另一例子可見于W02005014799。適用于本發明的細胞培養基的另一例子可見于Xu等人(Stem Cells 22:972-980,2004)。適用于本發明的細胞培養基的另一例子可見于US20070010011。適用于本發明的細胞培養基的另一例子可見于Cheon等人(BioR印rod DOI 10. 1095/ biolr印rod. 105. 046870 ；2005年10月19日)。適用于本發明的細胞培養基的另外一個例子可見于Levenstein等人(Stem Cells M :568_574，2006)。適用于本發明的細胞培養基的另一例子可見于US20050148070。適用于本發明的細胞培養基的另一例子可見于 US20050233446。適用于本發明的細胞培養基的另一例子可見于US6800480。適用于本發明的細胞培養基的另一例子可見于US20050244962。適用于本發明的細胞培養基的另一例子可見于W020050653M。適用于本發明的細胞培養基的另一例子可見于W02005086845。合適的培養基也可以由下列組分制成，例如，Dulbecco改進的Eagle培養基 (DMEM) ,Gibco # 11965_092、Knockout Dulbecco 改進的 Eagle 培養基(K0 DMEM)、Gibco # 10829-018、Ham' s F12/50% DMEM 基本培養基、200mM L-谷氨酰胺、Gibco # 15039-027、 非必需氨基酸溶液、Gibco 11140-050、β-巰基乙醇、Sigma # M7522、人重組堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、Gibco # 13256-029o多能干細胞的分化在本發明的一個實施例中，將多能干細胞在培養中進行擴增，同時保持它們的多能性。可通過檢測與多能性相關的標志物的表達水平的變化，來確定細胞的多能性隨時間的變化。或者，可通過檢測與分化相關的標志物或者與別的細胞類型相關的標志物的表達水平的變化來監測多能性的變化。在一個替代實施例中，使多能干細胞在培養物中增殖，然后以可促進其分化為另一細胞類型的方式處理多能干細胞。別的細胞類型可以是表達定形內胚層譜系特征性標志物的細胞。或者，細胞類型可以是表達胰腺內胚層譜系特征性標志物的細胞。或者，細胞類型可以是表達胰腺內分泌譜系特征性標志物的細胞。或者，細胞類型可以是表達細胞譜系特征性標志物的細胞。可通過本領域任何合適的方法，使按照本發明方法處理的多能干細胞分化成多種別的細胞類型。例如，可使按照本發明方法處理的多能干細胞分化成神經細胞、心臟細胞、肝細胞寸。例如，根據W02007030870中公開的方法，根據本發明的方法處理的多能干細胞可分化為神經祖細胞和心肌細胞。在另一個實例中，可按照美國專利6，458，589中公開的方法，使按照本發明方法處理的多能干細胞分化成肝細胞。例如，可根據D，Amour 等人，Nature Biotechnol. 23 :1534-1541,2005 中公開的方法，使多能干細胞分化為表達定形內胚層譜系特征性標志物的細胞。例如，可根據Shinozaki 等人，Development 131 1651-1662，2004 中公開的方法， 使多能干細胞分化為表達定形內胚層譜系特征性標志物的細胞。
例如，可根據McLean等人，Stem Cells, 25 =29-38,2007中公開的方法，使多能干細胞分化為表達定形內胚層譜系特征性標志物的細胞。例如，可根據D，Amour 等人，Nature Biotechnol. 23 :1534-1541,2005 中公開的方法，使多能干細胞分化為表達定形內胚層譜系特征性標志物的細胞。定形內胚層譜系特征性標志物選自SOX17、GATA4、HNF3 0、GSC、CERl、Nodal、FGF8、 Brachyury、Mix樣同源盒蛋白、FGF4 CD48、脫中胚蛋白(EOMES)、DKK4、FGF17、GATA6、CXCR4、 C-Kit,⑶99和0TX2。適用于本發明的是表達至少一種定形內胚層譜系特征性標志物的細胞。在本發明的一個方面，表達定形內胚層譜系特征性標記物的細胞為原條前體細胞。在一個替代方面，表達定形內胚層譜系特征性標記物的細胞為中內胚層細胞。在一個替代方面，表達定形內胚層譜系特征性標記物的細胞為定形內胚層細胞。例如，根據D，Amour 等人，Nature Biotechnol. 24 :1392-1401,2006)中公開的方法，多能干細胞可分化為表達胰內胚層系特征性標記物的細胞。胰腺內胚層譜系特征性標志物選自PDX1、HNF1 β ,PTFl α、HNF6、HB9和PR0X1。適用于本發明的是表達至少一種胰腺內胚層譜系特征性標志物的細胞。在本發明的一個方面，表達胰腺內胚層譜系特征性標記物的細胞為胰腺內胚層細胞。可根據本領域的任何方法使多能干細胞分化為表達胰內分泌系特征性標記物的細胞。例如，可根據D，Amour 等人，Nature Biotechnol. 24 1392-1401，2006 中公開的方法，使多能干細胞分化為表達胰內分泌譜系特征性標記物的細胞。例如，可根據D，Amour 等人，Nature Biotechnol. 24 1392-1401，2006 中公開的方法，使多能干細胞分化為表達胰內分泌譜系特征性標記物的細胞。胰腺內分泌譜系特征性標志物選自NGN3、NEUR0D、ISLl、PDXl、NKX6. 1、PAX4、NGN3 和PTF-I α。在一個實施例中，胰腺內分泌細胞能夠表達以下激素中的至少一種胰島素、 胰高血糖素、生長抑素和胰多肽。適用于本發明的是表達至少一種胰腺內分泌譜系特征性標志物的細胞。在本發明的一個方面，表達胰腺內分泌譜系特征性標志物的細胞是胰腺內分泌細胞。胰內分泌細胞可為表達胰激素的細胞。作為另外一種選擇，胰內分泌細胞可為分泌胰激素的細胞。在本發明的一個方面，胰腺內分泌細胞是表達β細胞譜系特征性標志物的細胞。表達β細胞譜系特征性標志物的細胞可表達PDXl和至少一種下列轉錄因子NGN3、 ΝΚΧ2. 2、NKX6. 1、NEUR0D、ISL1、HNF3 β、MAFA、PAX4 禾口 PAX6。在本發明的一個方面，表達 β 細胞譜系特征性標志物的細胞是β細胞。本發明進一步通過如下實例舉例說明，但不受限于如下實例。鍾1 人K胎干細朐,附著于本發日月的平面基底。他0激酶抑制劑Υ26732已顯示出能增強人胚胎干細胞在表面改性板上的附著(參見美國專利申請No. 61/030, 544)。本發明的研究目的在于確定人胚胎干細胞附著于其它平面表面的能力。表1中示出了本發明中所測試的平面表面。在測試之前，將人胚胎干細胞系Hl細胞中的細胞在涂覆有低生長因子MATRIGEL 的1 30稀釋液的組織培養板上擴增。將細胞接種至處于補充有20ng/ml bFGF(MEF_CM/bFGF)的IOml MEF調理培養基中的IOOmm培養皿上。將細胞在具有5% CO2的濕潤氣氛中于37°C下培養。每天用新鮮的MEF-CM/bFGF更新培養基。一旦細胞達到大約80%的匯合度，通過在37°C下用lmg/ml釋放酶處理5分鐘來將細胞傳代。通過從培養皿中除去酶并用 MEF-CM/bFGF沖洗細胞來停止消化。通過在IOml的MEF-CM/bFGF中人工刮下細胞并將其轉移至50ml錐形管來收集細胞。在臺式離心機上以200Xg(1000rpm)將細胞離心而形成沉淀。在移除上清液后，將細胞再次懸浮于40ml的MEF-CM/bFGF中，并且平均分配在4個涂覆有低生長因子MATRIGEL 的1 30稀釋液的IOOmm培養皿中。將人胚胎干細胞系Hl的細胞以100，000個細胞/cm2的密度接種至表1所示的各種平面基底上。這些平面基底缺少吸附層和成纖維細胞飼養細胞層。如上所述，將細胞在 MEF-CM/bFGF中培養。測定Iiho激酶抑制劑H-1152對細胞附著于平面基底的影響。將3 μ M 的Η-1152添加至用于接種細胞的培養基中。讓細胞附著M小時。此后，在室溫下用4%的多聚甲醛將細胞固定5分鐘。然后，用的蘇木精對細胞進行染色，并借助光學顯微鏡確定細胞的數目。包括了裝有溶媒的孔作為對照。人胚胎干細胞系Hl的細胞以不依賴于Mio激酶抑制劑的方式附著于如下膜混合纖維素酯膜O號膜，圖1的分圖a)；尼龍膜G號膜，圖1的分圖b)和乙酸纖維素膜(5 號膜，圖1的分圖c)。添加3μΜ的H-1152增強了細胞與這些膜的附著(參見圖1的分圖 a~c) ο人胚胎干細胞系Hl的細胞需要存在3 μ M的H-1152來附著于如下平面基底聚碳酸酯膜(7號膜，圖1的分圖d)和聚對苯二甲酸乙二醇酯膜(12號膜，圖1的分圖e)。從培養基中除去H-1152導致Hl細胞與這兩種膜都脫離。在不存在H-1152的情況下，沒有發現與這些膜形成了附著。實例2 =Rho激酶處理對人胚胎干細胞附著于包含混合纖維素酯的平面基底(1號膜)的影響。在進行實驗操作之前，將人胚胎干細胞系H9的細胞在MATRIGEL 涂覆的培養皿上培養。將細胞在MEF調理培養基中以150，000個細胞/cm2的密度接種于混合纖維素酯膜 (1號膜)上。所述平面基底缺少吸附層和成纖維細胞飼養細胞層。檢驗Mio激酶抑制劑處理對附著于平面基底的影響。用0、10或20μΜ的Y26732處理細胞。在M小時后，將細胞用4%的多聚甲醛固定、用PBS沖洗、風干并用結晶紫染料進行染色。借助光學顯微鏡確定細胞的數目。包括了裝有溶媒的孔作為對照。觀察到在不存在Υ26732的情況下細胞附著于平面基底(圖2的分圖a)。添加10 和20 μ M的Υ26732增強了細胞與平面基底的附著(圖2的分圖b和c)。從培養基除去 Y26732后M小時并沒有導致細胞與平面基底脫離。割列3 在1號平面某底臘卜.培養對人臺干細胞,的 曾葙諫率的影口向。將在MATRIGEL 涂覆培養皿上培養的人胚胎干細胞系的細胞和在1號膜上培養的細胞的增殖速率進行比較。將細胞以相等密度接種在這兩個基底上。通過TrypLE處理使細胞從基底脫離而形成單細胞懸浮液以確定細胞數目。按圖3中所標明的時刻對細胞進行取樣。觀察到細胞以相當的速率增殖。MATRIGEL 上和1號膜上的倍增時間分別為約1. 151 天和1. 138天。實例4:人胚胎干細胞在包括混合纖維素酯的平面基底(1號膜)上保持其多潛能
14件3代。在含有20ng/ml bFGF的MEF-CM中，將人胚胎干細胞系Hl的細胞以75，000個細胞/cm2的密度接種于包括混合纖維素酯膜(1號膜)的平面基底上。根據上述方法，在將細胞傳代至達到大約75%至90%匯合度之前將其培養5或6天。每天更新培養基。在培養 3代后，收集細胞并且通過流式細胞術確定多潛能性相關的標志物的表達。如表2中所示， 超過95%的細胞保持了多潛能性相關的細胞表面標志物(包括Tral-60、Tral_81、SSEA-3 和SSEA-4)的表達，從而表明細胞仍為多潛能性的。實例5:人胚胎干細胞在包括混合纖維素酯(1號膜)的平面基底上保持穩定的核型10代。將人胚胎干細胞系Hl的細胞在MATRIGEL 徐覆的培養板上或者在混合纖維素酯膜上培養10代。根據上述方法培養細胞。通過分析20個G顯帶中期細胞進行細胞遺傳學分析來確定核型。如圖4中所示，MATRIGEL 涂覆培養板上培養的代表性細胞的G-顯帶染色體(圖4的分圖a)和混合纖維素酯膜上培養的其它細胞的G-顯帶染色體(圖4的分圖 b)證實了正常的男性染色體核型。還使用采用染色體12p探針和17p探針的熒光原位雜交法(FISH)檢驗200個分裂間期的核來確定核型，以鑒別不能用常規細胞遺傳學方法檢測的染色體12和17拷貝數有改變的非常小的細胞群體。在MATRIGEL 上和混合纖維素酯膜上培養的細胞中，未檢測到具有三體型12號染色體和/或17號染色體的異常細胞。實例6 人胚胎干細胞能夠在包括混合纖維素酯的平面基底(1號膜)上分化成胰島素牛成細胞。在含有20ng/ml bFGF的MEF調理培養基中，將人胚胎干細胞系Hl的細胞以 150，000個細胞/cm2的密度接種至包括混合纖維素酯的平面基底(1號膜)上。通過根據表 3中列出的分化方案處理細胞，使細胞向胰島素生成細胞分化。將細胞在含有20ng/ml bFGF 的MEF調理培養基中培養3至4天，以達到大約75 %至90 %的匯合度。將細胞在含有2 %的無脂肪酸牛血清白蛋白(FAF-BSA)、100ng/Im的激活素A和20ng/ml的Wnt3A的DMEM-F12 培養基中處理2天，然后用DMEM-F12培養基、2%的無脂肪酸牛血清白蛋白(FAF-BSA)和 100ng/ml的激活素A將細胞再處理2天。接著，將細胞在含有2%的BSA、20ng/ml的FGF7和 250nM的環巴胺-KAAD的DMEF-F12培養基中處理3天，然后在含有1 %的B27補充劑、20ng/ ml的FGF7、250nM的環巴胺_KAAD、2 μ M的視黃酸(RA)和100ng/ml的成頭蛋白(Noggin) 的DMEM-F12培養基中處理4天。將細胞在含有1 %的B27補充劑、1 μ M的ALK5抑制劑 2(Axxora產品目錄號ALX-270-445_M001)、100ng/ml的成頭蛋白、100ng/ml的軸突導向因子-4(Netrin-4)、50ng/ml 的 Exendin-4 禾口 1 μ M 的 DAPT 的 DMEM-F12 培養基中處理 3 天。 將細胞在DMEM-F12培養基、1 %的Β27補充劑和1 μ M的ALK5抑制劑2中培養7天并在含有的Β27補充劑的DMEM-F12培養基中再培養7天。在分化方案的最后，收集RNA樣本來確定胰內分泌譜系特征性標志物的表達。觀察到胰島素的CT數約為17。GAPDH相應的CT值約為19 ；這些數據表明在處理后細胞表達高水平的胰島素。實例7 人胚胎干細胞以I^h0激酶抑制劑依賴件方式附著于包括聚碳酸酯膜的平
面基底。
在MEF調理培養基中，將人胚胎干細胞系H9的細胞以150，000個細胞/cm2的密度接種至包括聚碳酸酯的平面基底(7號膜)。檢驗Iih0激酶抑制劑處理對附著的影響將 Rho激酶抑制劑Y26732以0、10或20 μ M的濃度添加至培養基。在M小時后，將膜上的細胞在室溫下用4%的多聚甲醛固定、用PBS沖洗、風干、用結晶紫染料進行染色。借助光學顯微鏡確定細胞的數目。包括了裝有溶媒的孔作為對照。細胞沒有附著于對照皿中的膜上(圖5的分圖a)。添加Y26732導致細胞附著于膜上(圖5的分圖b和c)。在單獨的實驗中，確定了 Iiho激酶抑制劑H-1152對人胚胎干細胞系Hl的細胞附著于 號膜的影響。在含有20ng/ml bFGF的MEF-CM中，將細胞以150，000個細胞/cm2的密度接種至包括聚碳酸酯膜(7號膜)的平面基底上。將Mio激酶抑制劑H-1152以0、0. 03、 0. 1、0. 3、1和3μ M的濃度添加至培養基。在M小時后，將膜上的細胞用4%的多聚甲醛固定、用PBS沖洗、風干、用結晶紫染料進行染色。借助光學顯微鏡確定細胞的數目。包括了裝有溶媒的孔作為對照。細胞沒有附著至對照皿中的膜(圖6的分圖a)和具有0. 03或0. 1 μ M的Η-1152 的培養皿中的膜(圖6的分圖b和C)。然而，在用0.3、1和3μΜ的H-1152處理過的培養物中觀察到附著(圖6的分圖d-f)。實例8 從培養基除去I^h0激酶抑制劑導致人胚胎干細胞從包括聚碳酸酯膜的平面基底脫離。在含有20ng/ml bFGF和3 μ M的I ho激酶抑制劑H-1152的MEF調理培養基中，將人胚胎干細胞系Hl的細胞以100，000個細胞/cm2的密度接種至包括聚碳酸酯的平面基底 (9號膜)上。將細胞培養M小時。此后，用含有20ng/ml bFGF而缺少H-1152的MEF調理培養基替代原培養基。在M小時后，將膜上的細胞用4%的多聚甲醛固定、用PBS沖洗、風干、用結晶紫染料進行染色。借助光學顯微鏡確定細胞的數目。包括了含有H-1152的孔作為對照。從培養基中除去H-1152導致細胞與平面基底脫離(圖7)。勒列9將第42代的人胚胎干細胞系Hl的細胞接種至如下平面基底10號膜(孔徑為 0.4μπι) ;11號膜(孔徑為3μπι)。在含有20ng/ml bFGF的MEF調理培養基中，將細胞以 100, 000個細胞/cm2的密度接種。還檢驗了 Iih0激酶抑制對細胞附著于平面基底的影響。 將該細胞培養基補充3μΜ的H-1152。在對小時后，用含有20ng/ml bFGF且缺少H-1152 的MEF調理培養基替代原培養基。再培養M小時后，將膜上的細胞用4%的多聚甲醛固定、 用PBS沖洗、風干、用結晶紫染料進行染色。包括了含有IyM的H-1152的孔作為對照。借助光學顯微鏡確定細胞的數目。包括了裝有溶媒的孔作為對照。附著于10號膜(圖8的分圖a)的細胞數量比附著于11號膜(圖8的分圖b)的細胞數量多。要求培養基中存在1 μ M的Η-1152以保持Hl細胞附著于膜(圖8的分圖a 和b)上。從培養基除去H-1152導致細胞從10號膜和11號膜(圖8的分圖c和d)脫離。 [on ]能件。 將人胚胎干細胞系Hl的細胞接種至包括聚碳酸酯膜(8號膜)的平面基底上。將細胞在含有20ng/ml bFGF且補充有3 μ M的H-1152的MEF調理培養基中培養。每天更換細胞培養基。通過從培養基中去除H-1152來對細胞進行傳代，并通過輕輕地渦旋從平面基底除去細胞。將細胞培養3代并將其收集以用于流式細胞術和定量RT-PCR分析。如表4 中所示，通過流式細胞術測定，超過95%的細胞表達與多潛能性相關的細胞表面標志物，包括1Tra 1-60、1Tral-8l、SSEA-3和SSEA-4。圖9示出定量RT-PCR的結果，表明在聚碳酸酯膜上培養3代的Hl中表達的多個基因與未分化的Hl細胞中的處于相當水平。在單獨的研究中，將人胚胎干細胞系Hl的細胞接種至包括聚碳酸酯膜(8號膜) 的平面基底上。將細胞在含有20ng/ml bFGF且補充有1 μ M的H-1152的MEF調理培養基中培養。每天更換細胞培養基。通過從培養基中去除Η-1152來對細胞進行傳代，并通過輕輕地渦旋從平面基底除去細胞。將細胞培養9代并將其收集以用于流式細胞術。如表5 中所示，超過95%的細胞表達與多潛能性相關的細胞表面標志物，包括Tral-60、Tral-SU SSEA-3 和 SSEA-4。一種用于評估多潛能性的備選方法是借助細胞形成胚狀體的能力。將人胚胎干細胞系Hl的細胞接種至包括聚碳酸酯膜(8號膜)的平面基底上。將細胞在含有20ng/ml bFGF且補充有3 μ M的Η-1152的MEF調理培養基中培養。每天更換細胞培養基。通過從培養基中去除Η-1152來對細胞進行傳代，并通過輕輕地渦旋從平面基底除去細胞。將細胞培養12代。通過如下方案來實現胚狀體的形成。收集Hl細胞并將其在超低簇平板(Ultra Low Cluster Plate) (Corning產品目錄號3471)中在補充有20%胎牛血清的DMEM/F12培養基中培養。通過更新培養基的50%來隔天給細胞供料。在14天后形成胚狀體(圖10)。實例11 :人胚胎干細胞在包括聚碳酸酯膜的平面基底上培養后能夠形成定形內腿。將人胚胎干細胞系Hl的細胞接種至包括聚碳酸酯(8號膜)的平面基底上。最開始，將細胞在含有20ng/ml bFGF且補充有3 μ M的Η-1152的MEF調理培養基中培養。然后， 在進行實驗操作之前，將細胞在含有20ng/ml bFGF且補充有1 μ M的H-1152的MEF調理培養基中培養10代。然后，將細胞接種至涂覆有MATRIGEL 的1 30稀釋液的IOOmm組織培養板上。 將細胞在含有20ng/ml bFGF的MEF調理培養基中培養3天。接著，將細胞在補充有2%的無脂肪酸牛血清白蛋白、lOOng/lm的激活素A和20ng/ml的Wnt3a的DMEM-F12中處理2 天，然后用補充有2%的無脂肪酸牛血清白蛋白和lOOng/ml的激活素A的DMEM-F12再處理 2天。此后，通過TRYPLE處理使細胞脫離以形成單細胞懸浮液并通過流式細胞術確定定形內胚層譜系特征性標志物的表達。超過90%的細胞是⑶99和CXCR4(⑶184)雙陽性的并且12%的細胞是⑶9陽性和C)(CR4陰性的，如表6中所示。這些數據表明細胞保持了分化成定形內胚層的能力。實例12 本發明的平面基底的物理特件。測定了本發明的平面基底上的表面化學。表7-10示出了 X射線光電子能譜(XPS) 分析和接觸角。對于XPS，采用了對大約50-100人的分析深度。通常，95%的信號源自該深度內。膜1-3含有類似濃度的氧、碳(主要為C-O和C_(C，H)，有可能是0-C-0)以及氮 (為N03、NO2,有可能是C-N和R4-N+)。膜3還含有痕量濃度的Na+和SOx以及較高濃度的
17C-(CjH)0膜4含有C-(C，H)、C-(0，N)和(0，N)-C = 0以及可能有痕量的鈉。膜5主要含有C-O并且還含有C-(C，H)以及O-C-O和/或O-C = 0。還檢測到痕量濃度的Na+和S0X。 膜 6-11 含有 C-(C，H)、C-0、O-C = 0、C-N、C03、p-p* 和痕量濃度的 &-N+、SOx 以及 Na+ 或 Cr3+。膜6的表面還可能含有痕量濃度的氯。僅在膜10和11上檢測到痕量濃度的氯，而在膜6-9上檢測到Na+。膜12的表面含有C-(C，H)、C_0、O-C = 0和符合PET的pi-pi*。還檢測到痕量濃度的氮和鈉。圖11示出本發明的平面基底的掃描電子顯微圖。觀察到兩種類型的形態。一種類型的特征在于纖維的開放網絡。第二種類型的特征在于在整個表面上分散了圓形孔的平滑片層。表10示出本發明的表面的接觸角測量結果。表面1至5具有約18°至約32°的接觸角測量值。多能干細胞不需要存在Mio激酶活性抑制劑來附著于表面1-5。表面6至12具有大于32°的接觸角測量值。多能干細胞需要存在Mio激酶活性抑制劑來附著于這些表面。輔丨丨13 斜imffl胞編〒■_成解商底,。根據US6743273 以及 Schindler M 等人，Biomaterials 26(28) :5624-5631 ； 2005的方法來制備由聚胺組成的平面基底。該平面基底可以商標ULTRAWEB 商購獲得。ULTRAWEB 合成表面由隨機取向的靜電紡紗聚酰胺納米纖維構成，其平均纖維直徑為觀0歷。纖維尺寸分布在200nm和400nm之間。所測試的第一 ULTRAWEB 表面具有稍微親水性的表面(產品目錄號為3870XX1)，而第二表面，即表面(產品目錄號為3871XX1)為稍微親水性的并且覆蓋有聚胺材料，所述聚胺材料為納米纖維提供了用于凈正電荷的游離氨基。這兩個表面均通過疏水相互作用高效吸收蛋白質。圖12中示出了 5微米分辨率和 10，000倍放大率的掃描電子顯微圖。然而，人胚胎干細胞系Hl的細胞不能附著于所測試的任一個UTRAWEB 表面。實例14 成分確定的培養基對多能干細胞附著于本發明的平面基底的影響。將人胚胎干細胞系Hl的細胞接種至如下平面基底上膜1 (混合纖維素酯)、膜 4(尼龍)、膜5(乙酸纖維素)和硝化纖維。將細胞以1 3稀釋度接種至成分確定的培養基mTESR 中并且培養M小時。包括了 MEF調理培養基中的平行培養物作為對照。mTESR 中的細胞培養沒有影響細胞附著于平面表面的能力。細胞能夠附著于膜1、4和5以及硝化纖維。使用mTESR 表現出細胞的最強粘結的膜是膜4，之后是膜5 (等于硝化纖維)，接著是膜1。
權利要求
1.一種使多能干細胞附著于平面基底的方法，所述平面基底含有最多約12%的N、至少約12%的0至至少約55%的0，接觸角為約18度至約32度，并且缺少吸附層和飼養細胞層，所述方法包括如下步驟a.獲得多能干細胞的懸浮液；以及b.將所述細胞懸浮液添加至所述平面基底并允許所述細胞附著。
2.根據權利要求1所述的方法，其中在所述細胞已附著于所述基底后將所述細胞在培養物中維持。
3.根據權利要求1所述的方法，其中在所述細胞已附著于所述基底后使所述細胞分化。
4.根據權利要求1所述的方法，其中通過用能夠抑制Mio激酶活性的化合物處理所述細胞懸浮液來增強所述多能干細胞與所述基底的附著。
5.根據權利要求4所述的方法，其中在所述多能干細胞附著于所述基底后除去所述能夠抑制Mio激酶活性的化合物。
6.根據權利要求4所述的方法，其中所述能夠抑制Mio激酶活性的化合物選自 Y-27632、法舒地爾、H-1152和羥基法舒地爾。
全文摘要
本發明涉及使多能干細胞在缺少吸附層和飼養細胞層的平面基底上生長、擴增和分化的方法。
文檔編號C12N5/0735GK102257132SQ200980147112
公開日2011年11月23日 申請日期2009年11月19日 優先權日2008年11月20日
發明者B·弗賴爾, Y·X·陳 申請人:森托科爾奧索生物科技公司