在絲狀真菌細胞中使用陽性和陰性選擇性基因的方法
                            
            
                            
            文檔序號：581330閱讀：2067來源：國知局
            
                            
                        
            
                        
            
                        
            
                            專利名稱：在絲狀真菌細胞中使用陽性和陰性選擇性基因的方法
            
技術領域：
            本發明涉及在絲狀真菌細胞中使用陽性和陰性選擇性基因的方法。相關技術描述表達特定表型的選擇性標記基因作為表達載體的一部分廣泛應用于重組DNA技術以供鑒定和分離已引入基因的宿主細胞。選擇性標記基因的產物可提供殺生物劑或病毒抗性，對重金屬等的抗性，或可將原養性賦予營養缺陷型。陽性選擇性基因用于鑒定和/或分離保留引入的基因的細胞，而陰性選擇性基因提供消除保留引入基因的細胞的手段。由陽性選擇性基因賦予的表型(例如，對特定抗生素的抗性)，以及因此所述選擇性標記基因在細胞/宿主中的存在，取決于所述細胞/宿主的最終用途，可為不合意的， 例如，在商業生產株中的潮霉素B抗性基因。為此原因，雙向選擇性標記基因如構巢曲霉 (Aspergillus nidulans)乙酰胺酶(amdS)基因，代表著有吸引力的替代方案。amdS基因是顯性雙向選擇性標記，因為該基因在陽性和陰性方向都是顯性的。amdS基因的優點在于其可方便地從宿主細胞利用顯性陰性選擇(dominant negative selection)加以缺失或消除(cure)，這可通過將細胞涂布于含氟代乙酰胺(fluoroacetamide)的生長培養基中來達成。氟代乙酰胺由攜帶amdS的細胞代謝為氟代乙酸，其對于細胞是有毒的。僅那些失去 amdS基因的細胞可在陰性選擇條件下生長。然而，使用amdS作為選擇性標記的一個主要問題在于其相當廣泛地遍布在真菌界中，且野生型宿主株中該基因任何活性內源拷貝必須在使用amdS基因作為選擇性標記之前失活或缺失。可獲得相對少的其它雙向選擇性標記基因(例如pyrG、SC、niaD和oliC)，但其遭受需要在其利用之前生成營養缺陷型突變體的不利之處，其可將未知的和不合意的突變引入宿主基因組，且這些系統可能無法在所有真菌中起作用。舉例而言，一些鐮孢屬(Fusarium)菌株可代謝5-氟代乳清酸，使得pyrG作為雙向選擇性標記是無效的。因此，本領域中有對在絲狀真菌中使用陽性和陰性表型的新方法的需要。美國專利6，555，370號公開了雙功能性選擇性融合基因的用途。本領域中還有對提供用于去除引入經遺傳工程改造的絲狀真菌的外源DNA例如選擇性標記從而使得所述真菌僅含有最小痕量至不含(minimal trace to none)用于生成重組株的DNA的不同方法的需要。任何提供此類DNA去除的技術在本領域中是有價值的。本發明提供了在絲狀真菌細胞中使用陽性和陰性選擇性基因的方法。
            

            發明內容
            
本發明涉及在絲狀真菌細胞基因組中缺失基因或其部分的方法，包括(a)將核酸構建體引入絲狀真菌細胞，所述核酸構建體包含
            
(i)第一多核苷酸，包含顯性陽性選擇性標記編碼序列，當其表達時，賦予所述絲狀真菌細胞顯性陽性選擇性表型；(ii)第二多核苷酸，包含陰性選擇性標記編碼序列，當其表達時，賦予所述絲狀真菌細胞陰性選擇性表型；(iii)第一重復序列，位于第一和第二多核苷酸的5’，以及第二重復序列，位于第一和第二多核苷酸的3’，其中所述第一和第二重復序列包含相同序列；和(iv)第一側翼序列，其位于組分⑴、( )和(iii)的5’，以及第二側翼序列，位于組分(i)、(ii)和(iii)的3’，其中第一側翼序列與所述絲狀真菌細胞基因組的第一區域相同而第二側翼序列與所述絲狀真菌細胞基因組的第二區域相同，其中(1)所述第一區域位于絲狀真菌細胞基因或其部分的5’而所述第二區域位于絲狀真菌細胞基因或其部分的 3', (2)所述第一和第二區域兩者均位于絲狀真菌細胞基因之內，或C3)所述第一和第二區域中的一個位于基因之內而所述第一和第二區域中的另一個位于絲狀真菌細胞基因的5’ 或3，。其中所述第一和第二側翼序列分別與所述絲狀真菌細胞的第一和第二區域發生分子間同源重組以缺失基因或其部分或用核酸構建體替代基因或其部分；(b)通過施以陽性選擇來選擇具有來自步驟(a)的顯性陽性選擇性表型的細胞； 和(c)通過施以陰性選擇來從具有步驟(b)的顯性陽性選擇性表型的所選細胞選擇具有陰性選擇性表型的細胞以迫使第一和第二重復序列發生分子內同源重組以缺失第一和第二多核苷酸。本發明還涉及用于將目標多核苷酸引入絲狀真菌細胞基因組的方法，包括(a)將核酸構建體引入絲狀真菌細胞，所述核酸構建體包含(i)目標第一多核苷酸；(ii)第二多核苷酸，包含顯性陽性選擇性標記編碼序列，當其表達時，賦予所述絲狀真菌細胞顯性陽性選擇性表型；(iii)第三多核苷酸，包含陰性選擇性標記編碼序列，當其表達時，賦予所述絲狀真菌細胞陰性選擇性表型；(iv)第一重復序列，位于第二和第三多核苷酸的5’，以及第二重復序列，位于第二和第三多核苷酸的3’，其中所述第一和第二重復序列包含相同序列，而目標第一多核苷酸位于第一重復的5’或第二重復的3’ ；和(ν)第一側翼序列，其位于組分⑴、(ii)、(iii)和(iv)的5’，以及第二側翼序列，位于組分⑴、(ii)、(iii)和(iv)的3’，其中第一側翼序列與所述絲狀真菌細胞基因組的第一區域相同而第二側翼序列與所述絲狀真菌細胞基因組的第二區域相同；其中所述第一和第二側翼序列分別與所述絲狀真菌細胞基因組的第一和第二區域發生分子間同源重組，以將所述核酸構建體引入所述絲狀真菌細胞的基因組；(b)通過施以陽性選擇來選擇具有來自步驟(a)的顯性陽性選擇性表型的細胞； 和(c)通過施以陰性選擇來從具有步驟(b)的顯性陽性選擇性表型的所選細胞選擇并分離具有陰性選擇性表型的細胞，以迫使第一和第二重復序列發生分子內同源重組從而
            
7缺失第二和第三多核苷酸。本發明還涉及此類核酸構建體和包含此類核酸構建體的載體和絲狀真菌細胞。附圖簡述
            

            
圖1顯示pJaL504_[Bam HI]的限制圖譜。圖2顯示pJaL504-[Bgl II]的限制圖譜。圖3顯示pJaL574的限制圖譜。圖4顯示pWTY1449-02-01的限制圖譜。圖5顯示pEJG61的限制圖譜。圖6顯示pEmY21的限制圖譜。圖7顯示pDM156. 2的限制圖譜。圖8顯示pEmY23的限制圖譜。圖9顯示pWTY1470-19-07的限制圖譜。圖10顯示pWTY1515-02-01的限制圖譜。圖11顯示pJfySlM0-75-5的限制圖譜。圖12顯示pJfyS1579-l_13的限制圖譜。圖13顯示pJfyS1579-8_6的限制圖譜。圖14顯示pJfyS1579-21_16的限制圖譜。圖15顯示pAlLol492_M的限制圖譜。圖16顯示pJfyS1579-;35-2的限制圖譜。圖17顯示pJfyS1579-41_ll的限制圖譜。圖18顯示pJfyS1604-55_13的限制圖譜。
            
圖19顯示pJfyS1579-93_l的限制圖譜。圖20顯示pJfyS1604-17_2的限制圖譜。圖21顯示pEJG69的限制圖譜。圖22顯示pEJG65的限制圖譜。圖23顯示pMMrl9的限制圖譜。圖M顯示pEJG49的限制圖譜。圖25顯示pEmY15的限制圖譜。圖沈顯示pEmYM的限制圖譜。圖27顯示pDM257的限制圖譜。圖28顯示pDM258的限制圖譜。圖四顯示鑲片鐮孢(Fusarium venenatum) amyA缺失株的轉化體的相對乳糖氧化
            
酶產率。圖30顯示鑲片鐮孢amyA缺失株的轉化體的相對α -淀粉酶活性。圖31顯示pJfyS1698-65_15的限制圖譜。圖32顯示pJfyS1698-72_10的限制圖譜。圖33顯示鑲片鐮孢alpA缺失株的轉化體的相對堿性蛋白酶活性。圖34顯示pJfyS1879-32_2的限制圖譜。圖35顯示pJfySlll的限制圖譜。
            
圖36顯示pJfyS2010-13_5的限制圖譜。圖37顯示pJfyS120的限制圖譜。定義選擇性標記本文中術語“選擇性標記”定義為編碼能夠賦予抗生素抗性表型、提供自養型需求(用于顯性陽性選擇)或激活毒性代謝物(用于陰性選擇)的蛋白質的基因。顯性陽性選擇性標記本文中術語“顯性陽性選擇性標記”定義為當轉化入絲狀真菌細胞之后表達允許陽性選擇轉化體的顯性表型的基因。顯性陽性選擇性表型本文中術語“顯性陽性選擇性表型”定義為允許陽性選擇轉化體的表型。陰性選擇性標記本文中術語“陰性選擇性標記”定義為當轉化入絲狀真菌細胞之后表達允許陰性選擇(即，消除)轉化體的表型的基因。陰性選擇性表型本文中術語“陰性選擇性表型”定義為允許陰性選擇(即，消除) 轉化體的表型。基因本文中術語“基因”定義為細胞基因組DNA的區，其控制分立的遺傳特征，通常對應于單一蛋白質或RNA。術語“基因”涵蓋了整個功能性單元，包括編碼序列、非編碼序列、內含子、啟動子和編碼改變表達的蛋白質的其它調節序列。其部分本文中術語“其部分”定義為基因整個功能性單元的組分，如開讀框 (ORF)、啟動子、內含子序列和其它調節序列；或其部分。位于第一和第二多核苷酸的5’或3’ 本文中術語“位于第一和第二多核苷酸的 5”’和位于第一和第二多核苷酸的3”’定義為優選距第一和第二多核苷酸1000至5000bp 之內，更優選100至IOOObp之內，甚至更優選10至IOObp之內，最優選1至IObp之內，甚至最優選緊鄰第一和第二多核苷酸。然而，其位置甚至可相距大于5000bp。位于組分(i)、(ii)和(iii)的5’或3’:本文中術語“位于組分(i)、(ii)和(iii) 的5”’和位于組分(i)、(ii)和(iii)的3”’定義為優選距組分(i)、(ii)和(iii) 1000至 5000bp之內，更優選100至IOOObp之內，甚至更優選10至IOObp之內，最優選1至IObp之內，甚至最優選緊鄰組分(i)、(ii)和(iii)。然而，其位置甚至可相距大于5000bp。位于基因或其部分的5’或3’ 本文中術語“位于基因或其部分的5”’和位于組分 (i)、(ii)和(iii)的3”’定義為優選距基因或其部分1000至5000bp之內，更優選100至 IOOObp之內，甚至更優選10至IOObp之內，最優選1至IObp之內，甚至最優選緊鄰基因或其部分。然而，其位置甚至可相距大于5000bp。分離的多核苷酸本文中術語“分離的多核苷酸”指從來源分離的多核苷酸。在一個優選的方面，如通過瓊脂糖電泳測定的，所述多核苷酸為至少純，優選至少5%純，更優選至少10 %純，更優選至少20 %純，更優選至少40 %純，更優選至少60 %純，甚至更優選至少80%純，并且最優選至少90%純。基本上純的多核苷酸本文中術語“基本上純的多核苷酸”指多核苷酸制備物，其不含其它外來的或不期望的核苷酸，并且處于適合于在遺傳工程蛋白質生產體系中使用的形式。因此，基本上純的多核苷酸含有按重量計至多10%，優選至多8%，更優選至多6%， 更優選至多5 %，更優選至多4 %，更優選至多3 %，甚至更優選至多2 %，最優選至多1 %，并且甚至最優選至多0. 5%的與其天然或重組結合的其它多核苷酸材料。然而，基本上純的多
            
9核苷酸可以包括天然存在的5’和3’非翻譯區，如啟動子和終止子。優選基本上純的多核苷酸是按重量計至少90%純，優選至少92%純，更優選至少94%純，更優選至少95%純，更優選至少96%純，更優選至少97%純，甚至更優選至少98%純，最優選至少99%，并且甚至最優選至少99. 5%純的。本發明的多核苷酸優選為基本上純的形式，即所述多核苷酸制備物基本上(essentially)不含與其天然或重組結合的其它多核苷酸材料。所述多核苷酸可以是基因組、cDNA、RNA、半合成、合成來源的，或它們的任何組合。編碼序列當用于本文中，術語“編碼序列，，意指直接指定其蛋白產物的氨基酸序列的核苷酸序列。編碼序列的邊界通常由開讀框決定，所述開讀框通常以ATG起始密碼子或可供選擇的起始密碼子如GTG和TTG開始，并且以終止密碼子如TAA、TAG和TGA結束。 編碼序列可以是DNA、cDNA、合成的或重組的核苷酸序列，或它們的任意組合。cDNA:術語“cDNA”在本文中定義為能夠通過反轉錄從得自真核細胞的成熟的、已剪接的mRNA分子制備的DNA分子。cDNA缺少通常存在于相應基因組DNA中的內含子序列。 起始的(initial)、初級的RNA轉錄物是mRNA的前體，其通過一系列的步驟加工然后作為成熟的已剪接的mRNA出現。這些步驟包括通過稱為剪接的過程去除內含子序列。因而源自 mRNA的cDNA缺乏任何內含子序列。核酸構建體術語“核酸構建體”用于本文指單鏈或雙鏈的核酸分子，所述核酸分子分離自天然存在的基因，或將所述核酸分子以本來不存在于(not otherwise exist)自然界中的方式修飾以含有核酸的區段或所述核酸分子是合成的。調控序列(control sequence)術語“調控序列”在本文定義為包括表達編碼多肽的多核苷酸必需的所有組分。每個調控序列對于編碼所述多肽的核苷酸序列可以是天然的或外源的，或每個調控序列對于彼此可以是天然的或外源的。此類調控序列包括但不限于前導序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動子、信號肽序列和轉錄終止子。最少的情況，調控序列包括啟動子和轉錄和翻譯的終止信號。調控序列可以和目的為引入特異性限制位點的接頭一起提供，所述特異性限制位點促進調控序列與編碼多肽的核苷酸序列編碼區的連接。可操作地連接術語“可操作地連接”在本文表示這樣的構型，其中將調控序列置于相對于多核苷酸序列的編碼序列的適當位置，使得調控序列指導多肽編碼序列的表達。表達術語“表達”包括涉及多肽產生的任何步驟，其包括但不限于轉錄、轉錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾和分泌。表達載體術語“表達載體”在本文定義為線性的或環狀的DNA分子，其包含編碼多肽的多核苷酸，并且所述多核苷酸與提供用于其表達的額外核苷酸可操作地連接。引入本文中術語“引入”及其變型定義為將DNA轉移入絲狀真菌細胞。將DNA引入絲狀真菌細胞可通過本領域任何已知方法(如轉化)來達成。轉化本文中術語“轉化”定義為將分離的DNA引入絲狀真菌細胞從而使得DNA作為染色體整合體或自主復制的染色體外載體而維持。分離的多肽術語“分離的多肽”用于本文中指從來源分離的多肽。在一個優選的方面，如通過SDS-PAGE測定的，所述多肽為至少純，優選至少5%純，更優選至少10% 純，更優選至少20%純，更優選至少40%純，更優選至少60%純，甚至更優選至少80%純， 并且最優選至少90%純。
            
基本上純的多肽術語“基本上純的多肽”在本文表示多肽制備物，所述多肽制備物含有按重量計至多10 %，優選至多8 %，更優選至多6 %，更優選至多5 %，更優選至多 4%,更優選至多3%，甚至更優選至多2%，最優選至多1 %，并且甚至最優選至多0. 5%的與其天然或重組結合的(associated)其它多肽材料。因此，優選所述基本上純的多肽按存在于制備物中的全部多肽材料的重量計是至少92%純，優選至少94%純，更優選至少95% 純，更優選至少96%純，更優選至少97%純，更優選至少98%純，甚至更優選至少99%純， 最優選至少99. 5%純，并且甚至最優選100%純。本發明的多肽優選是基本上純的形式，即所述多肽制備物基本上(essentially)不含與其天然或重組結合的其它多肽材料。例如， 這能夠通過如下實現通過公知的重組方法或通過經典純化方法制備多肽。發明詳述本發明涉及在絲狀真菌細胞基因組中缺失基因或其部分的方法，包括(a)將核酸構建體引入絲狀真菌細胞，所述核酸構建體包含(i)第一多核苷酸，包含顯性陽性選擇性標記編碼序列，當其表達時，賦予所述絲狀真菌細胞顯性陽性選擇性表型；(ii)第二多核苷酸，包含陰性選擇性標記編碼序列，當其表達時，賦予所述絲狀真菌細胞陰性選擇性表型；(iii)第一重復序列，位于第一和第二多核苷酸的5’，以及第二重復序列，位于第一和第二多核苷酸的3’，其中所述第一和第二重復序列包含相同序列；和(iv)第一側翼序列， 其位于組分⑴、( )和(iii)的5’，以及第二側翼序列，位于組分⑴、( )和(iii)的 3’，其中第一側翼序列與所述絲狀真菌細胞基因組的第一區域相同而第二側翼序列與所述絲狀真菌細胞基因組的第二區域相同，其中(1)所述第一區域位于絲狀真菌細胞的基因或其部分的5’而所述第二區域位于絲狀真菌細胞的基因或其部分的3’，( 所述第一和第二區域兩者均位于絲狀真菌細胞的基因之內，或C3)所述第一和第二區域中的一個位于基因之內而所述第一和第二區域中的另一個位于絲狀真菌細胞的基因的5’或3’，其中所述第一和第二側翼序列分別與所述絲狀真菌細胞的第一和第二區域發生分子間同源重組以缺失基因或其部分或用核酸構建體替代基因或其部分；(b)通過施以陽性選擇來選擇具有來自步驟(a)的顯性陽性選擇性表型的細胞；和(c)通過施以陰性選擇來從具有步驟(b)的顯性陽性選擇性表型的所選細胞選擇并分離具有陰性選擇性表型的細胞以迫使第一和第二重復序列發生分子內同源重組以缺失第一和第二多核苷酸。在一個方面，使整個基因完全缺失，不留下外源DNA。本發明還涉及用于將目標多核苷酸引入絲狀真菌細胞基因組的方法，包括(a) 將核酸構建體引入絲狀真菌細胞，所述核酸構建體包含(i)目標第一多核苷酸；(ii)第二多核苷酸，包含顯性陽性選擇性標記編碼序列，當其表達時，賦予所述絲狀真菌細胞顯性陽性選擇性表型；(iii)第三多核苷酸，包含陰性選擇性標記編碼序列，當其表達時，賦予所述絲狀真菌細胞陰性選擇性表型；(iv)第一重復序列，位于第二和第三多核苷酸的5’，以及第二重復序列，位于第二和第三多核苷酸的3’，其中所述第一和第二重復序列包含相同序列，而目標第一多核苷酸位于第一重復的5’或第二重復的3’ ；和(ν)第一側翼序列，其位于組分(i)、(ii)、(iii)和(iv)的5’，以及第二側翼序列，位于組分(i)、(ii)、(iii)和 (iv)的3’，其中第一側翼序列與所述絲狀真菌細胞基因組的第一區域相同而第二側翼序列與所述絲狀真菌細胞基因組的第二區域相同；其中所述第一和第二側翼序列分別與所述絲狀真菌細胞基因組的第一和第二區域發生分子間同源重組以將所述核酸構建體引入所述絲狀真菌細胞的基因組；(b)通過施以陽性選擇來選擇具有來自步驟(a)的顯性陽性選擇性表型的細胞；和(C)通過施以陰性選擇來從具有步驟(b)的顯性陽性選擇性表型的所選細胞選擇并分離具有陰性選擇性表型的細胞以迫使第一和第二重復序列發生分子內同源重組以缺失第二和第三多核苷酸。本發明描述了雙功能性陽性和陰性選擇系統，其賦予任何絲狀真菌能夠干凈地 (clean)、最不顯著地(minimally marked)進行基因缺失或插入的能力。這是作為將轉化 DNA片段整合入基因組并由所述DNA片段上攜帶的側翼DNA序列和對應的宿主基因組序列之間的雙交換(double crossover)事件而導致基因缺失或基因插入的結果而達成的。內部重組發生在所述直接重復之間，導致間插序列的切出，其結果為缺失了宿主基因組中的靶基因，或插入了編碼目標多肽的多核苷酸，或多核苷酸插入了基因而沒有留下殘余的DNA 或僅留下單獨的重復。在一個方面，所述雙重標記系統對于任何對潮霉素B敏感而對5-氟代脫氧尿苷有抗性的絲狀真菌提供了通用系統(universal system)。本發明允許對潮霉素B敏感而對 5-氟代脫氧尿苷有抗性的任何絲狀真菌菌株充當為了下述目的而用攜帶雙重陽性和陰性選擇性盒的載體轉化的候選物(1)生成攜帶一個或多個(幾個)干凈的或最不顯著的基因缺失的株或( 將一個或多個(幾個)基因引入絲狀真菌細胞，而不在所述絲狀真菌細胞中留下轉化DNA或僅留下最少的轉化DNA。顯性陽性和陰性選擇性標記在本發明的方法中，可使用任何顯性陽性選擇性標記。在一個方面，所述顯性陽性選擇性標記由選自下組的基因的編碼序列所編碼潮霉素磷酸轉移酶基因(hpt)、草胺膦乙酰轉移酶基因(pat)、博來霉素、zeocin和腐草霉素 (phleomycin)抗性基因(ble/bleO)、乙酰胺酶基因(amdS)、吡啶硫胺抗性基因(ptrA)、嘌呤霉素-N-乙酰-轉移酶基因(pac)、乙酰CoA合酶基因(acuA/facA)、D_絲氨酸脫水酶基因(dsdA)、ATP硫酰酶基因(sC)、線粒體ATP合酶亞基9基因(oliC)、氨基糖苷磷酸轉移酶 3' (I) (aph(3' ) I)基因，和氨基糖苷磷酸轉移酶3' (II) (aph(3' )II)基因。在另一個方面，所述顯性陽性選擇性標記是由潮霉素磷酸轉移酶基因(hpt)的編碼序列編碼的。在另一個方面，所述顯性陽性選擇性標記是由草胺膦乙酰轉移酶基因(pat) 的編碼序列編碼的。在另一個方面，所述顯性陽性選擇性標記是由博來霉素、zeocin和腐草霉素(phleomycin)抗性基因(ble/bleO)的編碼序列編碼的。在另一個方面，所述顯性陽性選擇性標記是由乙酰胺酶基因(amdS)的編碼序列編碼的。在另一個方面，所述顯性陽性選擇性標記是由吡啶硫胺抗性基因(PtrA)的編碼序列編碼的。在另一個方面，所述顯性陽性選擇性標記是由嘌呤霉素-N-乙酰-轉移酶基因(pac)的編碼序列編碼的。在另一個方面，所述顯性陽性選擇性標記是由乙酰CoA合酶基因(acuA/facA)的編碼序列編碼的。 在另一個方面，所述顯性陽性選擇性標記是由D-絲氨酸脫水酶(dsdA)基因的編碼序列編碼的。在另一個方面，所述顯性陽性選擇性標記是由ATP硫酰酶基因(sC)的編碼序列編碼的。在另一個方面，所述顯性陽性選擇性標記是由線粒體ATP合酶亞基9基因(oliC)的編碼序列編碼的。在另一個方面，所述顯性陽性選擇性標記是由氨基糖苷磷酸轉移酶3' (I) (aph(3' ) I)基因的編碼序列編碼的。在另一個方面，所述顯性陽性選擇性標記是由氨基糖苷磷酸轉移酶3' (II) (aph(3' ) II)基因的編碼序列編碼的。
            
所述陽性選擇性標記可從任何可用的來源獲得。例如，編碼潮霉素B磷酸轉移酶(EC 2. 7. 1. 119 ；UniProtKB/Swiss-Prot P09979)的潮霉素磷酸轉移酶基因(hpt) 可從吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus) (Zalacain 等，1986, Nucleic Acids Research 14:1565-1581)和大腸桿菌(Ε. coli) (Lino 等，2007，Acta CrystalIogr. Sect. F Struct. Biol. Cryst. Commun. 63 :685-688)獲得。編碼草胺膦 N-乙酰轉移酶(EC
            
2.3. 1. 183 ； UniProtKB/Swi ss-Prot P16426)的草胺膦乙酰轉移酶基因(pat)可從吸水鏈霉菌(White 等，1990，Nucleic Acids Research 18 1062 ；and Thompson 等，1987，EMBO J. 6 :2519-2523)和綠色產色鏈霉菌(Str印tomyces viridochromogenes) (Lutz 等，2001， Plant Physiol. 125 :1585-1590 ；和 Strauch 等，1988，Gene 63 :65-74)獲得。由例如 ble (UniProtKB/Swiss-Prot P13081)和 bleO(UniProtKB/Swiss-Prot P67925)編碼的博來霉素抗性蛋白質(BRP)可分別從肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumonia) (Mazodier 等，1985，Nucleic Acids Research 13 :195-205)和嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus) (Oskam等，l"l，Plasmid 26 :30-39)獲得。乙酰胺酶基因(amdS) (EC
            
3.5. 1. 4 ；UniProtKB/Swiss-ProtP08158)可從構巢翹孢霉(Emericella nidulans)(構巢曲霉(Aspergillus nidulans)) (Corrick 等，1987，Gene 53 :63-71)、黑曲霉(Aspergillus niger)和產黃青霉(Penicillium chrysogenum) (EP 758, 020)獲得。編碼線粒體噻唑生物合成酶(UniProtKB/Swiss-Prot Q9UUZ9)的吡啶硫胺抗性基因(ptrA或thiA)可從米曲霉 (Aspergillus oryzae) (Kubodera 等，2000, Biosci.Biotechnol. Biochem. 64 :1416-1421) 獲得。編碼嘌呤霉素-N-乙酰-轉移酶(NCBI登錄號CAB42570)的pac基因可從大腸桿菌 (W0 1998/11241)獲得。乙酰 CoA 合酶基因(acuA/facA ；EC6. 2. 1. 1)可從黑曲霉(UniftOt A2QK81)、構巢翹孢霉(構巢曲霉)(Uniprot P16928) (Papadopoulou 和 Sealy-Lewis, 1999，FEMS Microbiology Letters 178 :35-37 ；以及 Sandeman 禾口 Hynes，1989，Mol. Gen. Genet. 218 :87-92)禾口布拉克胡須霉(Phycomyces blakesleeanus) (UniProtKB/Swiss-Prot Q01576) (Garre 等，1994，Mol. Gen. Gen. 244 :278-286)獲得。編碼 D-絲氨酸脫水酶(EC
            
4.3. 1. 18 ；UniProtKB/Swi ss-Prot A1ADP3)的 dsdA 基因可從大腸桿菌(Johnson 等，2007， J. Bacteriol. 189 =3228-3236)獲得。編碼 ATP 硫解酶(NCBI 登錄號:AAN04497)的 sC 基因可從黑曲霉獲得(Varadarajalu 和 Punekar，2005，Microbiol. Methods. 61 :219-224)。線粒體ATP合酶亞基9(oliC)基因(UniProtKB/Swiss-Prot P16000)可從構巢翹孢霉(構巢曲霉)(Ward 和 Turner，1986，Mol. Gen. Genet. 205 :331-338)。氨基糖苷磷酸轉移酶 3' (I 和 II)(aph(3' )1 和 II)基因(EC 2. 7. 1. 95 ;hterproIPR002575)可從環狀芽孢桿菌 (Bacillus circulans)禾口灰色鏈霉菌(Streptomyces griseus)(分別見Sarwar禾口Akhtar， 1991，Biochem. J. 273 :807 ；以及 Trower 禾口 Clark, 1990, N. A. R. 18 :4615)獲得。在本發明的方法中，可使用任何陰性選擇性標記。在一個方面，所述陰性選擇性標記由選自下組的基因的編碼序列所編碼胸苷激酶基因(tk)、乳清苷-5’ -磷酸脫羧酶基因(pyrG)和胞嘧啶脫氨酶基因(codA)。在另一個方面，所述陰性選擇性標記是由胸苷激酶基因(tk)的編碼序列所編碼的。在另一個方面，所述陰性選擇性標記是由乳清苷_5’ -磷酸脫羧酶基因(pyrG)的編碼序列所編碼的。在另一個方面，所述陰性選擇性標記是由胞嘧啶脫氨酶基因(codA)的編碼序列所編碼的。
            
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所述陰性選擇性標記可為來自任何可用的來源。例如，胸苷激酶基因(tk)(EC 2. 7. 1. 21 ；UniProtKB/Swiss-Prot P03176)可從人單純皰疹(Herpes simplex)病毒 1 獲得 (McKnight，1980，Nucleic Acids Research 8:5949-5964)。乳清苷 _5，-磷酸脫羧酶基因 (pyrG) (EC 4. 1. 1. 23 ； UniProtKB/Swi ss-Prot P07817)可從黑曲霉獲得(Wilson 等，1988， N. A. R. 16 2339)。胞嘧啶脫氨酶基因(codA) (EC3. 5. 4. 1 ； UniProtKB/Swi ss-Prot C0DA_ EC0LI)可從大腸桿菌(K12 株)獲得(Danielsen 等，1992，Molecular Microbiology 6  1335-1344)。在核酸構建體中，編碼陽性和陰性選擇性標記的多核苷酸可為相對于彼此的任何順序，無論例如其是否命名為第一和第二多核苷酸或者第二或第三多核苷酸。此外，編碼所述陽性和陰性選擇性標記的多核苷酸可為相同的取向或為相反的取向。在另一個方面，所述顯性陽性選擇性標記是由潮霉素磷酸轉移酶基因(hpt)的編碼序列編碼的，而所述陰性選擇性標記是由胸苷激酶基因(tk)的編碼序列編碼的。在另一個方面，所述顯性陽性選擇性標記是由草胺膦乙酰轉移酶基因(pat)的編碼序列編碼的， 而所述陰性選擇性標記是由胸苷激酶基因(tk)的編碼序列編碼的。在另一個方面，所述顯性陽性選擇性標記是由博來霉素、zeocin和腐草霉素(phleomycin)抗性基因(ble/bleO) 的編碼序列編碼的，而所述陰性選擇性標記是由胸苷激酶基因(tk)的編碼序列編碼的。在另一個方面，所述顯性陽性選擇性標記是由乙酰胺酶基因(amdS)的編碼序列編碼的，而所述陰性選擇性標記是由胸苷激酶基因(tk)的編碼序列編碼的。在另一個方面，所述顯性陽性選擇性標記是由吡啶硫胺抗性基因(PtrA)的編碼序列編碼的，而所述陰性選擇性標記是由胸苷激酶基因(tk)的編碼序列編碼的。在另一個方面，所述顯性陽性選擇性標記是由嘌呤霉素-N-乙酰-轉移酶基因(pac)的編碼序列編碼的，而所述陰性選擇性標記是由胸苷激酶基因(tk)的編碼序列編碼的。在另一個方面，所述顯性陽性選擇性標記是由乙酰 CoA合酶基因(acuA/facA)的編碼序列編碼的，而所述陰性選擇性標記是由胸苷激酶基因 (tk)的編碼序列編碼的。在另一個方面，所述顯性陽性選擇性標記是由D-絲氨酸脫水酶基因(dsdA)的編碼序列編碼的，而所述陰性選擇性標記是由胸苷激酶基因(tk)的編碼序列編碼的。在另一個方面，所述顯性陽性選擇性標記是由ATP硫酰酶基因(sC)的編碼序列編碼的，而所述陰性選擇性標記是由胸苷激酶基因(tk)的編碼序列編碼的。在另一個方面， 所述顯性陽性選擇性標記是由線粒體ATP合酶亞基9基因(oliC)的編碼序列編碼的，而所述陰性選擇性標記是由胸苷激酶基因(tk)的編碼序列編碼的。在另一個方面，所述顯性陽性選擇性標記是由氨基糖苷磷酸轉移酶3' (I) (aph(3' )1)基因的編碼序列編碼的，而所述陰性選擇性標記是由胸苷激酶基因(tk)的編碼序列編碼的。在另一個方面，所述顯性陽性選擇性標記是由氨基糖苷磷酸轉移酶3' (II) (aph(3' )II)基因的編碼序列編碼的，而所述陰性選擇性標記是由胸苷激酶基因(tk)的編碼序列編碼的。在另一個方面，所述顯性陽性選擇性標記是由潮霉素磷酸轉移酶基因(hpt)的編碼序列編碼的，而所述陰性選擇性標記是由乳清苷-5’ -磷酸脫羧酶基因(pyrG)的編碼序列編碼的。在另一個方面，所述顯性陽性選擇性標記是由草胺膦乙酰轉移酶基因(pat)的編碼序列編碼的，而所述陰性選擇性標記是由乳清苷-5’ -磷酸脫羧酶基因(pyrG)的編碼序列編碼的。在另一個方面，所述顯性陽性選擇性標記是由博來霉素、zeocin和腐草霉素(phleomycin)抗性基因(ble/bleO)的編碼序列編碼的，而所述陰性選擇性標記是由乳清苷-5’ -磷酸脫羧酶基因(pyrG)的編碼序列編碼的。在另一個方面，所述顯性陽性選擇性標記是由乙酰胺酶基因(amdS)的編碼序列編碼的，而所述陰性選擇性標記是由乳清苷-5’-磷酸脫羧酶基因(pyrG)的編碼序列編碼的。在另一個方面，所述顯性陽性選擇性標記是由吡啶硫胺抗性基因(PtrA)的編碼序列編碼的，而所述陰性選擇性標記是由乳清苷-5’-磷酸脫羧酶基因(pyrG)的編碼序列編碼的。在另一個方面，所述顯性陽性選擇性標記是由嘌呤霉素-N-乙酰-轉移酶基因(pac)的編碼序列編碼的，而所述陰性選擇性標記是由乳清苷-5’ -磷酸脫羧酶基因(pyrG)的編碼序列編碼的。在另一個方面，所述顯性陽性選擇性標記是由乙酰CoA合酶基因(acuA/facA)的編碼序列編碼的，而所述陰性選擇性標記是由乳清苷-5’ -磷酸脫羧酶基因(pyrG)的編碼序列編碼的。在另一個方面，所述顯性陽性選擇性標記是由D-絲氨酸脫水酶基因(dsdA)的編碼序列編碼的，而所述陰性選擇性標記是由乳清苷-5’ -磷酸脫羧酶基因(pyrG)的編碼序列編碼的。在另一個方面，所述顯性陽性選擇性標記是由ATP硫酰酶基因(sC)的編碼序列編碼的，而所述陰性選擇性標記是由乳清苷-5’ -磷酸脫羧酶基因(pyrG)的編碼序列編碼的。在另一個方面，所述顯性陽性選擇性標記是由線粒體ATP合酶亞基9基因(oliC)的編碼序列編碼的，而所述陰性選擇性標記是由乳清苷-5’ -磷酸脫羧酶基因(pyrG)的編碼序列編碼的。在另一個方面，所述顯性陽性選擇性標記是由氨基糖苷磷酸轉移酶3' (I) (aph(3' )1)基因的編碼序列編碼的，而所述陰性選擇性標記是由乳清苷-5’-磷酸脫羧酶基因(pyrG)的編碼序列編碼的。 在另一個方面，所述顯性陽性選擇性標記是由氨基糖苷磷酸轉移酶3' (II) (aph(3' )II) 基因的編碼序列編碼的，而所述陰性選擇性標記是由乳清苷-5’ -磷酸脫羧酶基因(pyrG) 的編碼序列編碼的。 在另一個方面，所述顯性陽性選擇性標記是由潮霉素磷酸轉移酶基因(hpt)的編碼序列編碼的，而所述陰性選擇性標記是由胞嘧啶脫氨酶基因(codA)的編碼序列編碼的。 在另一個方面，所述顯性陽性選擇性標記是由草胺膦乙酰轉移酶基因(Pat)的編碼序列編碼的，而所述陰性選擇性標記是由胞嘧啶脫氨酶基因(codA)的編碼序列編碼的。在另一個方面，所述顯性陽性選擇性標記是由博來霉素、zeocin和腐草霉素(phleomycin)抗性基因 (ble/bleO)的編碼序列編碼的，而所述陰性選擇性標記是由胞嘧啶脫氨酶基因(codA)的編碼序列編碼的。在另一個方面，所述顯性陽性選擇性標記是由乙酰胺酶基因(amcK)的編碼序列編碼的，而所述陰性選擇性標記是由胞嘧啶脫氨酶基因(codA)的編碼序列編碼的。 在另一個方面，所述顯性陽性選擇性標記是由吡啶硫胺抗性基因(PtrA)的編碼序列編碼的，而所述陰性選擇性標記是由胞嘧啶脫氨酶基因(codA)的編碼序列編碼的。在另一個方面，所述顯性陽性選擇性標記是由嘌呤霉素-N-乙酰-轉移酶基因(pac)的編碼序列編碼的，而所述陰性選擇性標記是由胞嘧啶脫氨酶基因(codA)的編碼序列編碼的。在另一個方面，所述顯性陽性選擇性標記是由乙酰CoA合酶基因(acuA/facA)的編碼序列編碼的，而所述陰性選擇性標記是由胞嘧啶脫氨酶基因(codA)的編碼序列編碼的。在另一個方面，所述顯性陽性選擇性標記是由D-絲氨酸脫水酶基因(dsdA)的編碼序列編碼的，而所述陰性選擇性標記是由胞嘧啶脫氨酶基因(codA)的編碼序列編碼的。在另一個方面，所述顯性陽性選擇性標記是由ATP硫酰酶基因(sC)的編碼序列編碼的，而所述陰性選擇性標記是由胞嘧啶脫氨酶基因(codA)的編碼序列編碼的。在另一個方面，所述顯性陽性選擇性標記是由線粒體ATP合酶亞基9基因(oliC)的編碼序列編碼的，而所述陰性選擇性標記是由胞嘧啶脫氨酶基因(codA)的編碼序列編碼的。在另一個方面，所述顯性陽性選擇性標記是由氨基糖苷磷酸轉移酶3' (I) (aph(3' ) I)基因的編碼序列編碼的，而所述陰性選擇性標記是由胞嘧啶脫氨酶基因(codA)的編碼序列編碼的。在另一個方面，所述顯性陽性選擇性標記是由氨基糖苷磷酸轉移酶3' (II) (aph(3' ) II)基因的編碼序列編碼的，而所述陰性選擇性標記是由胞嘧啶脫氨酶基因(codA)的編碼序列編碼的。本發明還涉及選自下組的分離的乳清苷-5’ -磷酸脫羧酶(a)乳清苷_5’ -磷酸脫羧酶，其包含與SEQ ID NO :52的成熟多肽具有優選至少70%，更優選至少75%，更優選至少80 %，更優選至少85 %，甚至更優選至少90 %，甚至更優選至少95 %相同，且最優選至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%相同的氨基酸序列；(b)乳清苷_5，-磷酸脫羧酶，其由在優選至少中等嚴格條件下，更優選至少中-高嚴格條件下，甚至更優選至少高嚴格條件下且最優選非常高嚴格條件下與SEQ ID NO 51的成熟多肽編碼序列或其全長互補鏈雜交的多核苷酸編碼；和(c)乳清苷_5’ -磷酸脫羧酶，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含與SEQ ID NO :51的成熟多肽編碼序列具有優選至少80%，更優選至少85%，甚至更優選至少90 %，甚至更優選至少95 %同一性，且最優選至少96 %，至少97 %，至少98 %，或至少99%同一性的核苷酸序列。在一個優選的方面，所述乳清苷-5’ -磷酸脫羧酶包含SEQ ID NO 52或其具有乳清苷-5’-磷酸脫羧酶活性的片段，或由SEQ ID NO :52或其具有乳清苷-5’-磷酸脫羧酶活性的片段組成。在另一個方面，所述乳清苷_5，-磷酸脫羧酶包含SEQ ID N0:52或由SEQ ID NO 52 組成。本發明還涉及選自下組的包含編碼乳清苷-5’ -磷酸脫羧酶的核苷酸序列的分離的多核苷酸(a)多核苷酸，其包含編碼乳清苷_5’ -磷酸脫羧酶的核苷酸序列，所述乳清苷-5，-磷酸脫羧酶包含與SEQ ID NO :52的成熟多肽具有優選至少70%，更優選至少 75 %，更優選至少80 %，更優選至少85 %，甚至更優選至少90 %，甚至更優選至少95 %同一性，且最優選至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%同一性的氨基酸序列；(b)多核苷酸，其編碼乳清苷-5’ -磷酸脫羧酶，所述多核苷酸包含在優選至少中等嚴格條件下，更優選至少中高嚴格條件下，甚至更優選至少高嚴格條件下，且最優選非常高嚴格條件下與 SEQ ID NO :51或其全長互補鏈雜交的核苷酸序列；和(c)多核苷酸，其編碼乳清苷_5’_磷酸脫羧酶，所述多核苷酸包含與SEQ ID NO :51的成熟多肽編碼序列具有優選至少80%，更優選至少85 %，甚至更優選至少90 %，甚至更優選至少95 %同一性，且最優選至少96 %，至少97 %，至少98 %，或至少99 %同一性的核苷酸序列。在一個優選的方面，編碼乳清苷_5，-磷酸脫羧酶的多核苷酸包含SEQ IDNO 51 或其編碼具有乳清苷-5’ -磷酸脫羧酶活性的片段的亞序列，或由SEQID NO 51或其編碼具有乳清苷-5’ -磷酸脫羧酶活性的片段的亞序列組成。在另一個優選的方面，編碼乳清苷-5，-磷酸脫羧酶的多核苷酸包含SEQ ID NO :51或由SEQ ID NO 51組成。用于分離或克隆編碼多肽的多核苷酸在本領域是已知的，且包括從基因組DNA分離，從cDNA制備或其組合。從此類基因組DNA克隆本發明的多核苷酸可例如通過使用公知的聚合酶鏈式反應(PCR)或表達文庫的抗體篩選以檢測具有共同結構特征的克隆的DNA 片段來實施。參見，例如 hnis 等，1990，PCR :A Guide to Methods and Application, Academic Press,New York。可使用其它核酸擴增方法如連接酶鏈式反應(LCR)、連接活化轉錄(LAT)和基于核苷酸序列的擴增(NASBA)。SEQ ID N0:51的核苷酸序列，或其亞序列；以及SEQ ID NO 52的氨基酸序列，或其片段；可用于根據本領域公知的方法設計核酸探針以從不同屬或種的株鑒定并克隆編碼乳清苷-5’ -磷酸脫羧酶的DNA。具體而言，此類探針可用于遵循標準的Southern印跡方法與目標屬或種的基因組或cDNA雜交，以鑒定并分離其中的對應基因。此類探針可明顯短于完整序列，但其長度應為至少14，優選至少25，更優選至少35，且最優選至少70個核苷酸。然而，優選所述核酸探針長度為至少100個核苷酸。例如，所述核酸探針長度可為至少 200個核苷酸，優選至少300個核苷酸，更優選至少400個核苷酸，或最優選至少500個核苷酸。甚至可使用更長的探針，例如長度優選為至少600個核苷酸，更優選至少700個核苷酸，甚至更優選至少800個核苷酸，或最優選至少900個核苷酸的核酸探針。DNA和RNA探針兩者均可使用。通常標記探針以供檢測相應的基因(例如，用32p、3H、35S、生物素或抗生物素蛋白標記)。本發明涵蓋此類探針。因此，可就與上述探針雜交并編碼乳清苷-5，-磷酸脫羧酶的DNA對從一個株制備的基因組DNA或cDNA文庫進行篩選。來自此類其它株的基因組或其它DNA可通過瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳或其它分離技術來分離。來自文庫的DNA或分離的DNA可轉移至并固化于硝酸纖維素或其它適當的載體材料上。為了鑒定與SEQ ID NO :1或其亞序列同源的克隆或DNA，載體材料優選用于Southern印跡。就本發明而言，雜交表明核苷酸序列與對應于SEQ ID NO :51或其亞序列的標記的核酸探針在非常低至非常高嚴格條件下雜交。在這些條件下與核酸探針雜交的分子可使用例如X射線片來檢測。在一個優選的方面，所述核酸探針是SEQ ID N0:51。在另一個優選的方面，所述核酸探針是編碼SEQ ID NO :52或其亞序列的多核苷酸序列。在另一個優選的方面，所述核酸探針是編碼SEQ ID NO 52的多核苷酸序列。對于長度至少為100個核苷酸的探針，非常低至非常高嚴格條件定義為在42°C在 5X SSPE，0. 3% SDS，200 μ g/ml經剪切和變性的鮭精DNA中進行預雜交和雜交，且對于非常低和低嚴格條件，使用25%甲酰胺，對于中等和中等-高嚴格條件，使用35%甲酰胺，或者對于高或非常高嚴格條件，使用50%甲酰胺，根據標準Southern印跡方法進行最佳12至 24小時。對于長度至少為100個核苷酸的探針，使用2X SSC, 0.2% SDS，優選在45°C (非常低嚴格度)，更優選在50°C (低嚴格度)，更優選在55°C (中等嚴格度)，更優選在 60 0C (中-高嚴格度)，甚至更優選在65°C (高嚴格度)，且最優選在70°C (非常高嚴格度)將載體材料最終洗滌三次，每次15分鐘。本發明還涉及包含此種乳清苷_5’ -磷酸脫羧酶的核酸構建體、重組表達載體和重組絲狀真菌細胞。本發明還涉及產生乳清苷_5’ -磷酸脫羧酶的方法，包括在有助于產生乳清苷-5’ -磷酸脫羧酶的條件下，培養包含核酸構建體的宿主細胞，所述核酸構建體包含編碼該多肽的核苷酸序列。在一個優選的方面，所述宿主細胞是絲狀真菌細胞。重復序列在本發明的在絲狀真菌基因組中缺失基因的方法中，包含編碼顯性陽性選擇性標記的第一多核苷酸和編碼陰性選擇性標記的第二多核苷酸的核酸構建體還包含位于第一和第二多核苷酸5’的第一重復序列和位于第一和第二多核苷酸3’的第二重復序列。在本發明將目標多核苷酸引入絲狀真菌基因組的方法中，包含目標第一多核苷酸、編碼顯性陽性選擇性標記的第二多核苷酸和編碼陰性選擇性標記的第三多核苷酸的核酸構建體還包含位于第二和第三多核苷酸5’的第一重復序列和位于第二和第三多核苷酸 3’的第二重復序列，其中所述目標第一多核苷酸位于第一重復的5’或第二重復的3’。兩種方法的重復序列均優選包含相同序列從而使得第一和第二重復序列可發生分子內同源重組以缺失編碼所述陽性和陰性選擇性標記的多核苷酸。所述重復序列可為任何多核苷酸序列。在一個方面，所述重復序列為絲狀真菌細胞天然的序列。在另一個方面，所述重復序列為對于所述絲狀真菌細胞為外源(異源)的序列。所述重復序列可為非編碼或編碼的多核苷酸序列。在另一個方面，所述重復序列為絲狀真菌細胞天然的多核苷酸序列。在另一個方面，所述重復序列與3’側翼序列或5’側翼序列相同以確保規則的(clean)基因缺失、破壞或插入。為了增加發生分子內同源重組以缺失所述陽性和陰性選擇性標記的多核苷酸的可能性，重復序列應含有足夠數量的核酸，如優選20至10，000個堿基對，50至10，000個堿基對，100至10，000個堿基對，200至10，000個堿基對，更優選400至10，000個堿基對， and最優選800至10，000個堿基對。側翼序列在本發明的在絲狀真菌基因組中缺失目標基因的方法中，包含編碼顯性陽性選擇性標記的第一多核苷酸、編碼陰性選擇性標記的第二多核苷酸、第一重復序列和第二重復序列的核酸構建體還包含位于上述多核苷酸5’的第一側翼序列和位于上述多核苷酸3’的第二側翼序列。為了缺失目標基因，第一側翼序列與位于絲狀真菌細胞基因5’端的第一區域相同，而第二側翼序列與位于該基因3’端的第二區域相同。所述第一和第二側翼序列分別與絲狀真菌細胞基因組的所述第一和第二區域發生分子間同源重組以缺失所述基因，并用所述核酸構建體替代所述基因。在本發明的將目標多核苷酸引入絲狀真菌基因組的方法中，包含目標多核苷酸， 編碼顯性陽性選擇性標記的第二多核苷酸，編碼陰性選擇性標記的第三多核苷酸，第一重復序列和第二重復序列的核酸構建體還包含位于上述多核苷酸5’的第一側翼序列和位于上述多核苷酸3’的第二側翼序列。為了引入目標多核苷酸，第一側翼序列與絲狀真菌細胞基因組的第一區域相同， 而第二側翼序列與絲狀真菌細胞基因組的第二區域相同。所述第一和第二側翼序列分別與絲狀真菌細胞基因組的所述第一和第二區域發生分子間同源重組以將包含目標多核苷酸的核酸構建體引入絲狀真菌細胞的基因組。在一個方面，第一區域位于絲狀真菌細胞基因的5’，而第二區域位于絲狀真菌細胞基因的3’。在另一個方面，第一和第二區域兩者均位于絲狀真菌細胞的一個基因之內。 在另一個方面，第一和第二區域之一位于絲狀真菌細胞的一個基因之內而另一個位于該基因的5’或3’。在另一個方面，所述第一和第二重復序列與第一側翼序列或第二側翼序列相同。
            
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為了增加在準確位置整合的可能性，側翼序列應優選含有足夠數目的核酸，如100 至10，000個堿基對，優選400至10，000個堿基對，且最優選800至10，000個堿基對，足以確保同源重組。側翼序列可為任何與絲狀真菌細胞基因組中的靶序列相同的序列。此外， 側翼序列可為非編碼或編碼核苷酸序列。多核苷酸在本發明的方法中，目標多核苷酸可為任何DNA。所述DNA對于目標絲狀真菌細胞可為天然的或異源的(外源的)。所述多核苷酸可編碼任何具有目標生物活性的多肽。所述多肽對于目標絲狀真菌細胞可以是天然的或異源的(外源的)。術語“異源多肽”在本申請中定義為對于絲狀真菌細胞不是天然的多肽；其中進行了結構性修飾例如缺失、取代和/或插入以改變天然多肽的天然多肽；或其表達作為通過重組DNA技術操縱編碼多肽的DNA的結果而發生定量改變的天然多肽。多肽可為下述多肽和雜合多肽的天然存在的等位基因變體和工程變體。術語“多肽”在本文并非指特定長度的編碼產物，并且因此涵蓋肽、寡肽和蛋白質。 術語“多肽”還包括雜合多肽和融合多肽。多肽還可為多肽的天然存在的等位基因變體和工程變體。在一個方面，所述多肽是抗體、抗原、抗微生物肽、酶、生長因子、激素、免疫調節劑 (immunodilator)、神經遞質、受體、報道蛋白、結構蛋白和轉錄因子。在另一個方面，多肽是氧化還原酶、轉移酶、水解酶、裂合酶、異構酶或連接酶。在另一個方面，所述多肽是α-葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、幾丁質酶(chitinase)、角質酶、環糊精糖基轉移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、α -半乳糖苷酶、β -半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、葡糖腦苷脂酶、α -葡糖苷酶、β -葡糖苷酶、轉化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、變聚糖酶(mutanase)、氧化酶、果膠分解酶、過氧化物酶、磷脂酶、 肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉谷氨酰胺酶、尿激酶或木聚糖酶。在另一個方面，所述多肽是白蛋白、膠原、原彈性蛋白、彈性蛋白或明膠。在另一個方面，所述多肽是雜合多肽，其包含從至少兩個不同多肽獲得的部分或完整多肽序列的組合，其中一種或多種對于所述絲狀真菌細胞可為異源的。在另一個方面，所述多肽是融合多肽，其中另一個多肽融合于所述多肽或其片段的N-端或C-端。融合多肽是通過將編碼一種多肽的核苷酸序列(或其部分)融合于編碼另一種多肽的核苷酸序列(或其部分)而產生的。用于產生融合多肽的技術在本領域中是已知的，且包括將編碼多肽的編碼序列連接從而使得其在框內(in frame)，且融合多肽的表達是在相同的啟動子和終止子的控制之下。編碼目標多肽的多核苷酸可以獲得自任何原核、真核或其它來源。就本發明而言， 用于本申請與給定的來源有關的術語“獲得自”，應表示所述多肽由所述來源產生，或由其中插入了來自所述來源的基因的細胞產生。用于分離或克隆編碼目標多肽的多核苷酸的技術是本領域已知的，并且包括從基因組DNA分離，從cDNA制備，或其組合。可通過例如使用公知的聚合酶鏈式反應(PCR)實現從這種基因組DNA克隆目標多核苷酸。參見，例如，Innis等，1990，PCR Protocols =A Guide to Methods and Application,Academic Press,New York。所述克隆方法可涉及切出禾口分離包含編碼所述多肽的核酸序列的所需核酸片段，將所述片段插入載體分子，和將重組載體并入突變體真菌細胞，其中所述核酸序列的多個拷貝或克隆會被復制。所述多核苷酸可為基因組、cDNA、RNA、半合成、合成來源的，或其任何組合。編碼目標多肽的多核苷酸可以多種方式操縱以提供所述多核苷酸在合適的絲狀真菌細胞中的表達。構建編碼目標多肽的DNA的重組表達載體和核酸構建體可如本文中所述加以實施。多核苷酸還可為用于操縱目標基因表達的調控序列，例如啟動子。調控序列的非限定性實例如本文所述。所述多核苷酸還可為任何可用于破壞絲狀真菌基因組中基因的核酸分子。所述多核苷酸可為編碼或非編碼的多核苷酸。所述多核苷酸可編碼除了之前公開的那些之外的另一種選擇性標記。所述多核苷酸可編碼多肽如上述那些。所述多核苷酸可簡單地為其長度足夠破壞基因的任何核酸分子。多核苷酸的范圍并不受上面公開的具體實例的限制，因為這些實例意欲作為本發明的幾個方面的說明。核酸構建體本發明還涉及用于在絲狀真菌細胞基因組中缺失基因或其部分的核酸構建體，包含(i)第一多核苷酸，包含顯性陽性選擇性標記編碼序列，當其表達時，賦予所述絲狀真菌細胞顯性陽性選擇性表型；(ii)第二多核苷酸，包含陰性選擇性標記編碼序列，當其表達時，賦予所述絲狀真菌細胞陰性選擇性表型；(iii)第一重復序列，位于第一和第二多核苷酸的5’，以及第二重復序列，位于第一和第二多核苷酸的3’，其中所述第一和第二重復序列包含相同序列；和(iv)第一側翼序列，其位于組分(i)、(ii)和(iii)的5’，以及第二側翼序列，位于組分(i)、(ii)和(iii)的3’，其中第一側翼序列與所述絲狀真菌細胞基因組的第一區域相同而第二側翼序列與所述絲狀真菌細胞基因組的第二區域相同，其中(1)所述第一區域位于絲狀真菌細胞基因或其部分的5’而所述第二區域位于絲狀真菌細胞基因或其部分的3’，( 所述第一和第二區域兩者均位于絲狀真菌細胞的基因之內，或C3)所述第一和第二區域中的一個位于絲狀真菌細胞基因之內而所述第一和第二區域中的另一個位于絲狀真菌細胞基因的5’或3’，其中所述第一和第二側翼序列分別與所述絲狀真菌細胞的第一和第二區域發生分子間同源重組以缺失基因或其部分或用核酸構建體替代基因或其部分。本發明還涉及用于將多核苷酸引入絲狀真菌細胞基因組的核酸構建體，包含(i) 目標第一多核苷酸；(ii)第二多核苷酸，包含顯性陽性選擇性標記編碼序列，當其表達時， 賦予所述絲狀真菌細胞顯性陽性選擇性表型；(iii)第三多核苷酸，包含陰性選擇性標記編碼序列，當其表達時，賦予所述絲狀真菌細胞陰性選擇性表型；(iv)第一重復序列，位于第二和第三多核苷酸的5’，以及第二重復序列，位于第二和第三多核苷酸的3’，其中所述第一和第二重復序列包含相同序列，而且目標第一多核苷酸位于第一重復的5’或第二重復的3’ ；和(ν)第一側翼序列，其位于組分⑴、(ii)、(iii)和(iv)的5’，以及第二側翼序列，位于組分⑴、(ii)、(iii)和(iv)的3’，其中第一側翼序列與所述絲狀真菌細胞基因組的第一區域相同而第二側翼序列與所述絲狀真菌細胞基因組的第二區域相同；所述第一和第二側翼序列分別與所述絲狀真菌細胞基因組的第一和第二區域發生分子間同源重組以將所述核酸構建體引入所述絲狀真菌細胞的基因組；且第一和第二重復序列可發生分子內同源重組以缺失所述第二和第三多核苷酸。編碼目標多肽、顯性陽性選擇性標記或陰性選擇性標記的分離的多核苷酸可以以多種方式操縱以供其表達。在將其插入載體之前操縱此種多核苷酸序列取決于表達載體可為合意的或必需的。利用重組DNA方法修飾多核苷酸序列的技術在本領域中是公知的。所述調控序列可為任何適當的啟動子序列，其為由絲狀真菌細胞識別用于表達編碼目標多肽的多核苷酸的核苷酸序列。所述啟動子序列含有介導多肽表達的轉錄調控序列。啟動子可以是在所選的絲狀真菌細胞中顯示轉錄活性的任何核苷酸序列，包括突變的、 截短的和雜合的啟動子，并且可以從編碼對于該絲狀真菌細胞是同源或異源的胞外或胞內多肽的基因獲得。用于在絲狀真菌細胞中指導本發明的核酸構建體的轉錄的合適啟動子的實例是從下列的基因獲得的啟動子米曲霉TAKA淀粉酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸穩定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、曼赫根毛霉脂肪酶、米曲霉堿性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸異構酶、構巢曲霉乙酰胺酶、鑲片鐮孢淀粉葡糖苷酶(W000/56900)、鑲片鐮孢amyA、鑲片鐮孢Daria (W0 00/56900)、鑲片鐮孢 Quinn(ff0 00/56900)、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶(W0 96/00787)、里氏木霉β -葡糖苷酶、 里氏木霉纖維二糖水解酶I、里氏木霉纖維二糖水解酶II、里氏木霉內切葡聚糖酶I、里氏木霉內切葡聚糖酶II、里氏木霉內切葡聚糖酶III、里氏木霉內切葡聚糖酶IV、里氏木霉內切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，以及 NA2-tpi啟動子(來自黑曲霉中性α-淀粉酶基因和米曲霉丙糖磷酸異構酶基因的啟動子的雜合體)；和它們的突變的、截短的和雜合的啟動子。調控序列也可以是合適的轉錄終止子序列，其為由絲狀真菌細胞識別以終止轉錄的序列。所述終止子序列與編碼多肽的核酸序列的3’末端可操作地連接。在所選的絲狀真菌細胞中有功能的任何終止子可用于本發明。對于絲狀真菌細胞優選的終止子從以下各項的基因獲得米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡糖苷酶和尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶。調控序列還可以是合適的前導序列，其是對于絲狀真菌細胞的翻譯重要的mRNA 非翻譯區。前導序列可操作地連接于編碼多肽的核苷酸序列的5’末端。可以將在所選絲狀真菌細胞中有功能的任何前導序列用在本發明中。對于絲狀真菌細胞優選的前導序列從如下酶的基因獲得米曲霉TAKA淀粉酶和構巢曲霉丙糖磷酸異構酶。調控序列也可以是聚腺苷酸化序列，其為與核苷酸序列的3，末端可操作地連接的序列，并且當其轉錄時，絲狀真菌細胞將其識別為信號以將聚腺苷殘基添加至轉錄的mRNA。 在所選絲狀真菌宿主細胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列可用于本發明。對于絲狀真菌細胞優選的聚腺苷酸化序列從如下酶的基因獲得米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶和黑曲霉 α-葡糖苷酶。調控序列還可以是信號肽編碼序列，其編碼與多肽的氨基末端相連的信號肽序列，并且指導編碼的多肽進入細胞分泌途徑。核苷酸序列的編碼序列5’端可固有地包含信號肽編碼序列，其與編碼分泌多肽的編碼序列片段一起天然地連接在翻譯閱讀框中。或者， 編碼序列5’端可含有對于所述編碼序列外源的信號肽編碼序列。外源信號肽編碼序列在編碼序列不天然地含有信號肽編碼序列時可為必需的。或者，外源信號肽編碼序列可以簡單地替代天然信號肽編碼序列以增強多肽的分泌。然而，指導表達的多肽進入所選絲狀真菌細胞的分泌途徑(即分泌入培養基)的任何信號肽編碼序列可用于本發明。對于絲狀真菌細胞有效的信號肽編碼序列是從如下酶的基因獲得的信號肽編碼序列米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、特異腐質霉纖維素酶、特異腐質霉內切葡聚糖酶V和疏棉狀腐質霉脂肪酶。調控序列還可以是前肽編碼序列，其編碼位于多肽氨基末端的前肽。所得多肽稱為酶原(proenzyme)或前多肽(propolypeptide)(或在某些情況下稱為酶原(zymogen))。 前肽通常是無活性的并且能夠通過前肽的催化或自催化切割從前多肽轉化為成熟活性多肽。前肽編碼序列可從如下酶的基因獲得枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶(aprE)，枯草芽孢桿菌中性蛋白酶(nprT)、釀酒酵母α因子、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和嗜熱毀絲霉 (Myceliophthora thermophila)漆酶(WO 95/33836)的基因獲得。當信號肽和前肽序列二者均出現在多肽的氨基末端時，將前肽序列置于緊接著 (next to)多肽氨基末端，并且將信號肽序列置于緊接著前肽序列的氨基末端。同樣理想的是添加調節序列，其使得能夠相對于絲狀真菌細胞的生長來調節多肽表達。調節系統的實例是引起基因表達響應化學或物理刺激物，包括調節化合物的存在而開啟或關閉的那些系統。在酵母中，可以使用ADH2系統或GALl系統。在絲狀真菌中，可以使用TAKAa-淀粉酶啟動子、黑曲霉葡糖淀粉酶啟動子和米曲霉葡糖淀粉酶啟動子作為調節序列。調節序列的其它實例是那些允許基因擴增的序列。在真核系統中，這些調節序列包括在氨甲蝶呤(methotrexate)存在下擴增的二氫葉酸還原酶基因，和以重金屬(with heavy metal)擴增的金屬硫蛋白基因。在這些情況下，編碼多肽的核苷酸序列可與調節序列可操作地連接。表達載體本發明還涉及包含本發明核酸構建體的重組表達載體。所述重組表達載體可為任何可方便地對其進行重組DNA方法并可導致多核苷酸序列表達的質粒。載體的選擇通常取決于載體與待引入的絲狀真菌細胞之間的相容性。載體優選為直鏈的，從而使得第一和第二側翼序列與絲狀真菌細胞的第一和第二區域發生有效的分子間同源重組。用于構建本發明的重組表達載體的方法對于本領域技術人員是公知的(參見，例如 Sambrook 等，1989，見上)。絲狀真菌細胞本發明還涉及包含本發明核酸構建體的重組絲狀真菌細胞。在本發明的方法中，所述絲狀真菌細胞可為任何絲狀真菌細胞。術語“絲狀真菌細胞”涵蓋任何由于復制過程中發生的突變而與親本細胞不同的親本細胞的后代。“絲狀真菌”包括真菌(Eumycota)和卵菌(Oomycota)亞門(如由Hawksworth等， 于Ainsworth and Bisby's Dictionary of the Fungi,第8版，1995,CAB International, University Press，Cambridge，UK所定義)的所有絲狀形式。絲狀真菌通常的特征在于由殼多糖(chitin)、纖維素、葡聚糖、殼聚糖(chitosan)、甘露聚糖和其它復雜多糖組成的菌絲體壁。通過菌絲延伸進行營養生長，而碳分解代謝是專性需氧的。相反，酵母例如釀酒酵母的營養生長通過單細胞菌體的出芽生殖(budding)進行，而碳分解代謝可以是發酵的。在一個方面，所述絲狀真菌細胞是枝頂孢霉屬(Acremonium)、曲霉屬 (Aspergillus)、短梗霉屬(Aureobasidium)、煙管霉屬(Bjerkandera)、擬蠟菌屬(Ceriporiopsis)、金孢子菌屬(Chrysosporium)、鬼傘屬(Coprinus)、革蓋菌屬 (Coriolus)、隱球菌屬(Cryptococcus)、Filibasidium、,廉抱屬(Fusarium)、腐質霉屬 (Humicola)(Magnaporthe) λ β M (Mucor) Λ^ jg (Myceliophthora) Λ fr 考瑪月旨霉屬(Neocallimastix)、脈孢菌屬(Neurospora)、擬青霉屬(Paecilomyces)、 青霉屬(Penicillium)、平革菌屬(Phmerochaete)、射脈菌屬(Phlebia)、瘤胃壺菌屬 (Piromyces)、側耳屬(Pleurotus)、裂褶菌屬 Gchizophyllum)、踝節菌屬(Talaromyces)、 嗜熱子囊菌屬(Thermoascus)、梭孢殼屬(Thielavia)、彎頸霉屬(Tolypocladium)、栓菌屬 (Trametes)或木霉屬(Trichoderma)細胞。在一個更優選的方面，所述絲狀真菌細胞是泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、煙曲霉(Aspergillus fumigatus)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、曰本曲霉(Aspergillus japonicus)、構巢曲霉(Aspergillus nidulans)、漂曲霉(Aspergillus niger)或米曲霉(Aspergillus oryzae)細胞。在另一個更優選的方面，所述絲狀真菌細胞是桿孢狀 ,廉抱(Fusarium bactridioides)、禾谷德抱(Fusarium cerealis)、庫威德抱(Fusarium crookwellense)、大刀德抱(Fusarium culmorum)、禾本禾斗德抱(Fusarium graminearum)、 禾赤德抱(Fusarium graminum)、異抱德抱(Fusarium heterosporum)、合歡木德抱 (Fusarium negundi)、尖,廉抱(Fusarium oxysporum)、多枝德抱(Fusarium reticulatum)、 粉紅德抱(Fusarium roseum)、接骨木德抱(Fusarium sambucinum)、膚色德抱(Fusarium sarcochroum)、擬分枝抱,廉抱(Fusarium sporotrichioides)、硫色德抱(Fusarium sulphureum)、圓德抱(Fusarium torulosum)、擬絲抱德抱(Fusarium trichothecioides) 或鑲片鐮孢(Fusarium venenatum)細胞。在另一個更優選的方面，所述絲狀真菌細胞是黑剌煙管菌(Bjerkandera adusta)、干擬錯菌(Ceriporiopsis aneirina)、干擬錯菌、 Ceriporiopsis caregiea、 Ceriporiopsis gilvescens、 Ceriporiopsis pannocinta、 Ceriporiopsis rivulosa、Ceriporiopsis subrufa、 蟲擬錯 菌(Ceriporiopsis subvermispora)、嗜角質金抱子菌(Chrysosporium keratinophilum)、Chrysosporium lucknowense、熱帶金抱子菌(Chrysosporium tropicum)、Chrysosporium merdarium、 Chrysosporium inops、   金抱子菌(Chrysosporium pannicola)、Chrysosporium queenslandicum、Chrysosporium zonatum、灰蓋鬼傘(Coprinus cinereus)、毛革蓋菌(Coriolus hirsutus)、特異腐質霉(Humicola insolens)、疏棉狀腐質霉(Humicola lanuginosa)、米漂毛霉(Mucor miehei)、嗜熱毀絲霉(Myceliophthora thermophila)、 粗糙脈孢菌(Neurospora crassa)、產紫青霉(Penicillium purpurogenum)、黃孢平革菌 (Phanerochaete chrysosporium)、福身寸身寸脈菌(Phlebia radiata)、朿Ij序側耳(Pleurotus eryngii)、土生梭孢霉(Thielavia terrestris)、長絨毛栓菌(Trametes villosa)、變色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康寧木霉(Trichoderma koningji)、長枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei) 或綠色木霉(Trichoderma viride)細胞。
            
在一個最優選的方面，所述絲狀真菌細胞是鑲片鐮孢細胞。在另一個最優選的方面，所述絲狀真菌細胞是鑲片鐮孢NRRL 30747。在另一個最優選的方面，所述絲狀真菌細胞是鑲片鐮孢ATCC 20334。在另一個最優選的方面，所述絲狀真菌細胞是黑曲霉細胞。在另一個最優選的方面，所述絲狀真菌細胞是米曲霉細胞。在另一個最優選的方面，所述絲狀真菌細胞是里氏木霉細胞。絲狀真菌可通過本身已知的方式以涉及原生質體形成、原生質體轉化和再生細胞壁的方法來進行轉化。轉化曲霉屬和木霉屬細胞的合適方法描述于EP 238 023和如1切11 φ, 1984, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81 :1470—1474。 鐮孢屬菌種的合適方法如Malardier等，1989，Gene78 :147-156和WO 96/00787所述。產生方法本發明還涉及產生目標多肽的方法，包括(a)在有助于所述多肽形成的條件下培養如本文中所述獲得的絲狀真菌細胞；和(b)回收多肽。在本發明的產生方法中，將細胞在適于產生多肽的營養培養基中使用本領域公知方法來培養。例如，可以通過在合適培養基中和允許表達和/或分離所述多肽的條件下進行的搖瓶培養，和實驗室或工業發酵罐中的小規模或大規模發酵(包括連續、分批、補料分批或固態發酵)來培養細胞。使用本領域已知的方法在包含碳源和氮源和無機鹽的合適營養培養基中進行培養。合適的培養基可從商業供應商獲得或可以根據公布的組成制備(例如，在美國典型培養物保藏中心的目錄中)。如果多肽分泌至營養培養基中，該多肽能夠從所述培養基中直接回收。如果多肽不分泌至培養基中，其能夠從細胞裂解物(Iysate)回收。可以使用本領域已知的對于所述多肽是特異性的方法來檢測多肽。這些檢測方法可包括特異性抗體的使用、酶產物的形成或酶底物的消失。例如，酶測定法(enzyme assay) 可用于確定所述多肽的活性。所得多肽可以使用本領域已知的方法回收。例如，多肽可以通過常規方法從營養培養基中回收，所述常規方法包括但不限于離心、過濾、提取、噴霧干燥、蒸發或沉淀。本發明的多肽可以通過多種本領域已知的方法純化以獲得基本上純的多肽，所述方法包括但不限于層析(例如，離子交換、親和、疏水、層析聚焦和大小排阻)、電泳方法(例如，制備型(pr印arative)等電聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸銨沉淀)、SDS_PAGE或提取 (參見，例如，Protein Purification，J.-C. Janson 禾口 Lars Ryden 編，VCH Publishers,New York,1989)。本發明進一步由下述實施例來描述，其不應視為限制本發明的保護范圍。 實施例材料用作緩沖劑和底物的化學物為至少試劑級的商業產品。所有的引物和寡核苷酸由 MWG Biotech, Inc.，High Point, NC, USA 提供。真菌菌株鑲片鐮孢株WTY842-1-11描述于美國專利7368271號。鑲片鐮孢株EmYllM-46-4. 3是鑲片鐮孢株WTY842-1-11的Atri5、amdS+、ApyrG衍生物。鑲片鐮孢株 WTY1449-03-03 是鑲片鐮孢株 WTY842-1-11 的 Atri5、amdS+、bar+、tk+轉化體。鑲片鐮孢株 WTY1449-09-01 是鑲片鐮孢株 WTY1449-03-03 的 Atri5、amdS+、bar+、tk-消除的衍生物。鐮孢屬株A3/5，現在重新分類為鑲片鐮孢(Yoder和Christianson，1998，Fungal Genetics and Biology 23 :62-80 ；0' Donnell 等，1998, Fungal Genetics and Biology 23 :57-67)從 Dr. Anthony Trinci, University of Manchester, Manchester, England 獲得。該株的保藏可從美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA) I^flifeMtt ATCC20334 Agricultural Research Service Patent Culture Collection(農業研究機構專利培養物保藏中心)(NRRL)，Northern Regional Research Center (北區研究中心)，Peoria，IL，USA作為鐮孢屬株NRRL 30747獲得。里氏木霄 RutC30 如 Montenecourt 禾口 Eveleigh，1979，Adv. Chem. Ser. 181 :289-301 所述。培養基和溶液LB板由每升IOg的胰蛋白胨、5g的酵母提取物、5g的NaCl和15g的細菌用瓊脂組成。NZY頂層瓊脂由每升5g的NaCl、5g的酵母提取物、IOg的NZ胺、2g的MgSO4和7g 的瓊脂糖組成。M400培養基由每升50g的麥芽糊精、2g的MgSO4-7H20,2g的KH2P04、4g的檸檬酸、 8g的酵母提取物、2g的尿素、0. 5g的CaCl2和0. 5ml的AMG痕量金屬溶液，pH 6. O組成。AMG 痕量金屬溶液由每升 14. 3g 的 ZnSO4 ·7Η20、2· 5g 的 CuSO4 ·5Η20、0· 5g 的 NiCl2, 13. 8g的FeS04、8. 5g的MnSO4和3. Og的檸檬酸組成。2XYT培養基由每升16g的胰蛋白胨、IOg的酵母提取物、5g的NaCl和5g的細菌用瓊脂組成。YP培養基由每升IOg的酵母提取物和20g的細菌用蛋白胨組成。YP(}2%培養基由每升IOg的酵母提取物、20g的細菌用蛋白胨和20g的葡萄糖組成。YP(i5%培養基由每升IOg的酵母提取物、20g的細菌用蛋白胨和50g的葡萄糖組成。RA培養基由每升50g的琥珀酸、12. Ig的NaN03、Ig的葡萄糖和20ml的50X Vogels 鹽溶液(無C、無NaNO3)組成。RA+尿苷培養基由每升50g的琥珀酸、12. Ig的NaNO3Ug的葡萄糖和20ml的50X Vogels鹽溶液(無C、無NaNO3)組成。在RA培養基的過濾滅菌之后，將過濾滅菌的尿苷添加至終濃度為10mM。RA+BASTA 培養基由每升50g的琥珀酸、12. Ig的NaN03、Ig的葡萄糖和20ml的50X Vogels鹽溶液(無C、無NaNO3)組成。在RA培養基的過濾滅菌之后，使用250mg/ml的工作儲液將過濾滅菌的 BASTA (草銨膦(glufosinate)，Hoechst Schering AgrEvo, Frankfurt, Germany)添加至終濃度為6mg/ml。50X Vogels 鹽溶液(無 C、無 NaNO3)由每升 250g 的 KH2PO4UOg 的 MgSO4 .7H20、5g 的CaCl22H20、2. 5ml的生物素溶液和5ml的Vogels痕量元素溶液組成。生物素儲液由IOOml 50%乙醇中的5mg生物素組成。Vogels痕量元素溶液由每IOOml 5g的檸檬酸、5g的ZnSO4 · 7H20、lg的 Fe (NH4) 2 (SO4) 2 · 6Η20、0· 25g 的 CuSO4 · 5Η20、0· 05g 的 MnSO4 · H20,0. 05g 的 H3BO3 和 0. 05g
            
25的 Na2MoO4 · 2H20 組成。PDA板由每升39g的Potato Dextrose Agar(馬鈴薯右旋糖瓊脂) (BDBiosciences、San Jose、CA、USA)組成。PDA+1M蔗糖板由每升39g的馬鈴薯右旋糖瓊脂(BD Biosciences、San Jose, CA, USA)和342g的蔗糖組成。VNO3RLMT 板由每升 20ml 的 50X Vogels 鹽溶液(25mM NaNO3) >273. 33g 的蔗糖和 15g 的 LMT 瓊脂糖(Sigma，St. Louis, MO, USA)組成。50X Vogels 鹽溶液 Q5mM NaNO3)由每升 125g 的檸檬酸鈉、250g 的ΚΗ2Ρ04、106. 25g 的 NaNO3UOg 的 MgSO4 ·7Η20、5β 的 CaCl22H20、2. 5ml 的生物素儲液和 5ml 的 Vogels 痕量元素溶液組成。VN03RLMT-BASTA  板由每升 20ml 的 50X Vogels 鹽溶液(25mMNaN03) ,273. 33g 的蔗糖和15g的LMT瓊脂糖組成。在高壓滅菌和冷卻之后，添加BASTA 至終濃度為6mg/ml。COVE 鹽溶液由每升 ^g KCl、26g MgS047H20、76g KH2P04、50mlC0VE 痕量元素組成。COVE 痕量元素溶液由每升 0. 004g 的 Na2B4O7IOH2O^O. 4g 的 CuS045H20、1. 2g 的 FeS047H20、0. 7g 的 MnSO4H2O^O. 8g Na2Mo022H20、IOg 的 ZnS047H20 組成。Tr匪培養基由20ml的COVE鹽溶液、0. 6g的CaCl2、6g的(NH4) 2S04、30g的蔗糖和 25gAgar Noble 組成。TrMM-G 由 20ml 的 COVE 鹽溶液、0. 6g 的 CaCl2、6g 的(NH4) 2S04、25g 的 Agar Noble 組成，高壓滅菌、冷卻并添加40ml的50%葡萄糖。STC 由 0. 8M 山梨醇、2. 5mM Tris pH 8 和 5mM CaCl2 組成。TrSTC 由 IM 山梨醇、IOmM Tris pH 8 禾口 IOmM CaCl2 組成。PEG 由 50% PEG 4000、IOmM Tris pH7. 5 禾口 IOmM CaCl2 組成。STC 由 0. 8M 山梨醇、25 或 50mM Tris pH 8 和 50mM CaCl2 組成。SPTC 由 40%聚乙二醇 4000、0. 8M 山梨醇、25 或 50mM Tris pH 8 和 50mM CaCl2 組成。SY50 培養基(pH 6. 0)由每升 50g 的蔗糖、2. Og 的 MgSO4 WH2OUOg 的 KH2PO4,2. Og 的K2S04、2. Og的檸檬酸、IOg的酵母提取物、2. Og的尿素、0. 5g的CaCl2 ·2Η20和5ml的200X
            
AMG痕量金屬溶液(不含鎳)組成。200X AMG痕量金屬溶液(不含鎳)由每升3. Og的檸檬酸、14. 3g的SiSO4 · 7H20、 2. 5g 的 CuSO4 · 5H20、13. 8g 的 FeSO4 · 7H20 和 8. 5g 的 MnSO4 · H2O 組成。20X SSC由0. 3M檸檬酸鈉pH 7和3M氯化鈉組成。DNA 測序DNA 測序是用 ABI PRIZM  3700DNA Analyzer (Applied Biosystems, Inc.， Foster City, CA, USA)進行的。實施例1 鑲片鐮孢WTY842-1-11對5_氟代脫氧尿苷(FdU)的敏感性測試為了使胸苷激酶(tk)能夠用作陰性選擇性標記，真菌必需對相當高濃度的核苷類似物5-氟代脫氧尿苷(FdU)不敏感。為了確定鑲片鐮孢WTY842-1-11對FdU的敏感程度， 通過將取自在-140°C儲藏的10%甘油儲備的菌株的集落瓊脂糖栓(colonized agar plug) 鋪于 VNO3RLMT板并在 ChexAll Instant Seal Sterilization Pouch (Fisher Scientific,Pittsburgh, PA, USA)中在沈-28°C培育7日來制備鑲片鐮孢WTY842-1-11的一周齡培養物。在7日之后，從一周齡培養物將栓靠近邊緣切出(cut sub-marginally)，并朝下置于 6 孔板中補充了不同濃度的 FdU(0 至 500 μ M) (Sigma Chemical Co.，St. Louis, MO, USA) 的 VNO3RLMT 培養基上。將板在打開的ZIPLOC 袋(S. C. JohnsonHome Storage, Inc., Racine，WI，USA)中在沈-28°C溫育14日，之后記錄在每個FdU濃度的生長程度。發現鑲片鐮孢WTY842-1-11對所有測試的FdU濃度均不敏感，盡管當濃度超過 100 μ M時，與50 μ M以下的濃度相比生長略微減少。實施例2 構建質粒pJaL574質粒pDV8 (美國專利6，806，062號)攜帶單純皰疹病毒1型胸苷激酶(HSV1-TK ； tk)基因(DNA序列為SEQ ID NO 37而推導的氨基酸序列為SEQ IDNO :38)，其為插入構巢曲霉甘油醛-3-磷酸脫氫酶(gpdA)啟動子的1.01Λ Xho Ι/BglII片段和攜帶三功能性構巢曲霉吲哚甘油磷酸酯合酶、磷酸核糖鄰氨基苯甲酸異構酶和谷氨酰胺氨基轉移酶(trpC) 轉錄終止子的1.8kb Bam Hi/Hind III片段之間的1. 2kb Bgl II/Bam HI片段。將質粒 PDV8用Bam HI消化，用酚-氯仿提取，用乙醇沉淀，然后使用Klenow聚合酶(Stratagene， La Jolla, CA, USA)填充(fill in)。將消化的質粒使用 QUICK LIGATION  Kit (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN, USA)依照生產商的實驗方案重新連接，用 MINELUTE  GelExtraction Kit(QIAGEN Inc. , Valencia, CA, USA)處理，并將所得的連接產物使用TOPO  Blunt Cloning Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)依照生產商的指示克隆入pCR 4Blunt-TOPO  (Invitrogen，Carlsbad, CA, USA)。將克隆反應物根據生產商的指示轉化入ONE SHOT 化學感受態T0P10細胞(Invitrogen，Carlsbad, CA, USA)。 使用BIOROBOT  960(KQIAGEN Inc, Valencia, CA, USA)從八個所得的轉化體提取質粒 DNA，并通過使用Bio I/BamHI和Bio I/Hind III限制消化來篩選。來自兩個具有正確限制性消化樣式的轉化體的質粒DNA的DNA測序確證了兩者均攜帶所需序列。一個命名為 pJaL504-[Bam HI](圖 1)。將質粒pJaL 504-[Bam HI]用Bgl II消化，用酚-氯仿提取，用乙醇沉淀，然后使用Klenow聚合酶填充。將消化的質粒依照生產商的實驗方案使用QUICK LIGATION  Kit重新連接，用MINELUTE  Reaction Cleanup Kit處理，然后將所得的連接物使用 TOPO  Blunt Cloning Kit依照生產商的指示克隆入pCR 4Blunt-TOPO 。將克隆反應物依照生產商的指示轉化入ONE SHOT 化學感受態T0P10細胞。使用BIOROBOT  9600從八個所得的轉化體提取質粒DNA，并通過使用Bio I/Bgl II和Bio I/Hind III的限制消化篩選。來自兩個具有正確地限制性消化樣式的轉化體的質粒DNA的DNA測序確證兩者均攜帶所需序列。一個命名為pJaL504-[Bgl II](圖2)。Punt等(1990，Gene 3  101-109)之前顯示可缺失構巢曲霉gpdA啟動子的364bp而不影響該啟動子的強度。基于這些作者的觀察，設計如下所示的引物#172450以截短構巢曲霉gpdA啟動子并減少載體的大小。引物 172450 5’-GACGAATTCTCTAGAAGATCTCTCGAGGAGCTCAAGCTTCTGTACAGTGACCGGTGACTC-3’ (SE Q ID NO 1)下劃線序列對應于gpdA啟動子序列。剩余序列是攜帶下述限制性位點的手柄(handle) :Eco RI、Xba I、Bgl II、Xho I 禾口 Hind III。為了截短構巢曲霉trpC終止子(同樣為了減少載體大小)，設計了攜帶Eco RI手柄的如下所示的引物#172499。引物 172499 5，-GACGAATTCCGATGAATGTGTGTCCTG-3 ’ (SEQ ID NO 2)下劃線序列對應于trpC終止子序列。使用引物17M99和17M50的擴增將啟動子截短了 364bp而將trpC終止子序列截短了 239bp。PCR用上述兩個引物使用pJaL504-[Bgl II]作為模板實施以生成由構巢曲霉 gpdA啟動子的截短形式、HSVl-TK基因的編碼序列和構巢曲霉trpC終止子的截短形式組成的2. 522kb片段。 Γ ±| β. IS ^   5 μ 1 IOX Buffer (Promega Corporation, Madison, WI, USA)、 0. 4μ 1 25mM dNTPsU. 25 μ 1 引物 172450 (lOOng/μ 1)、1. 25 μ 1 引物 172499 (lOOng/ μ1)、0·5μ1 PJaL 504_[Bgl II] (lOOng/μ 1)、2 μ 1 Pfu DNA 聚合酶(Promega Corporation，Madison，WI，USA) (2. 5U/μ 1)和39. 6 μ 1滅菌蒸餾水組成。將擴增反應物在 ROBOCYCLER  (Stratagene，La Jolla, CA, USA)中溫育，其程序為在 95°C進行 1 個循環45秒，然后進行28個循環，每個在95°C進行45秒，57°C進行45秒和72°C進行5分鐘。 在72°C進行10分鐘的最終延伸。對擴增反應物使用低熔點瓊脂糖凝膠在50mM Tri s-50mM硼酸-ImMEDTA 二鈉 (TBE)緩沖液中進行瓊脂糖凝膠電泳。從凝膠切出2522bp片段，并使用QIAQUICK  Gel Extraction Kit(QIAGEN Inc.，Valencia, CA, USA)提取。然后將凝膠純化的 DNA 使用TOPO Blunt Cloning Kit依照生產商的指示插入pCR 4Blunt-TOPO 。將克隆反應物根據生產商的指示轉化入ONE SHOT 化學感受態T0P10細胞。使用BIOROBOT  9600從八個所得的轉化體提取質粒DNA，并通過使用Eco RI和Bgl II的限制消化篩選。來自兩個具有正確限制消化樣式的質粒DNA的DNA測序確證兩者均攜帶所需序列。一個命名為 pJaL574(圖 3)。實施例3 構建質粒 pWTY1449-02-01將質粒PJaL574依照生產商推薦的試驗方案轉化入感受態大腸桿菌SCSllO細胞 (Stratagene, La Jolla, CA, USA)。使用BIOROBOT  9600 從二十四個所得的轉化體提取質粒DNA，然后使用Eco RI和Bgl II對其進行分析性消化。之后的DNA序列分析導致了具有正確序列的克隆的鑒定，其命名為PWTY1449-02-01 (圖4)。實施例4 構建質粒pEJG61將質粒pEJG61 (圖5)如美國專利7368271所述進行構建，只是倒轉了 bar盒的取向(即，核苷酸5901-5210編碼amdS啟動子，核苷酸5209-4661編碼bar編碼序列，而核苷酸4660-4110編碼黑曲霉葡糖淀粉酶(AMG)終止子)。實施例5 鑲片鐮孢WTY842-01-11的孢子和原生質體的生成為了生成鑲片鐮孢WTY842-01-11的孢子，將如實施例1中所述的16個來自新鮮瓊脂糖培養(大約一周齡)的瓊脂栓(大約lcmxlem)接種入2. 8LFernbach瓶中的500ml RA培養基，并在沈.5°C以150rpm振蕩溫育對小時，然后在觀.5°C再溫育12小時。然后將培養物經過滅菌塑料漏斗中的滅菌MIRACL0TH (CalBiochem，San Diego, CA, USA)經過0. 45 μ M過濾器過濾入1升過濾單元的基部(base)。將在過濾器上收集的孢子用500ml滅菌蒸餾水洗滌，然后重懸于IOml滅菌蒸餾水中，并使用血細胞計數器計數。將濃度調整至 2xl08/mL·將新鮮生成的孢子用于接種500ml帶擋板的搖瓶，每個含有IOOmlYPG5^If養基， 以Iml新鮮孢子OxlO8Ail)接種。將搖瓶在23. 5°C以150rpm振蕩溫育15小時，此時種系物 (germline)大約長為3-5個孢子長度。將在IMMgSO4中過濾滅菌的二十ml的每ml 5mg的 N0V0ZYME  234(Novozymes A/S,Bagsvaerd,Denmark)等分入八個滅菌的 50ml 管。然后將種系物經過滅菌漏斗中的滅菌MIRACL0TH 過濾，并用IOOml滅菌蒸餾水繼以IOOml滅菌IM MgSOJi]洗。使用滅菌刮鏟將經潤洗的種系物輕柔地刮入含有在IM MgSO4中的N0V0ZYME  234的管中，并輕柔地混合。將管橫置楔入夾子中在以90rpm振蕩溫育多至1小時。將三十ml的IM山梨醇添加至每個管，并將管在室溫(大約M-28°C)以377xg在Sorvall RT 6000B 浮筒式離心機(Thermo-Fischer Scientific,ffaltham,MA,USA)中離心 10 分鐘。在傾去上清之后，將沉淀輕柔地重懸于Iml IM山梨醇中。然后添加三十ml的IM山梨醇，并將試管輕柔地顛倒若干次。將其在室溫以377xg離心5分鐘，并將沉淀輕柔地重懸于Iml IM 山梨醇。在輕柔地顛倒試管若干次之后，添加30ml IM山梨醇，并將試管輕柔地混合。在此時點從每個試管移出100 μ 1的等分試樣，并添加至含有900 μ 1 STC的EPPENDORF 管以供計算原生質體濃度。將剩余的懸液在室溫(大約M_28°C)以377xg離心5分鐘。去除上清，并將沉淀重懸于STC  SPTC  DMSO(9  1  0. 1)從而使得原生質體的終濃度為每ml 5xl07。立即將原生質體用于共轉化。實施例6 將 pEJG61 和 pWTY1449-01_02 共轉化入鑲片鐮孢 WTY842-01-11將兩ml新鮮生成的鑲片鐮孢WTY842-01-11原生質體(5x107ml)與體積80 μ 1 中的環狀PEJG61和pWTY1449-02-01各50μ g(每種40 μ 1) 一同添加至50ml滅菌的離心管。將原生質體和DNA輕柔地混合，然后在冰上溫育30分鐘。緩慢添加一百μ  SPTC 并輕柔地混合。將試管在室溫)溫育10分鐘。緩慢添加八ml的SPTC并通過輕柔地渦旋混合。然后將試管在室溫(^rc )溫育10分鐘。然后將反應物分至十個滅菌的 50ml管(lml/管)。然后將三十五ml的VNO3RLMT培養基(頂層瓊脂糖)逐次添加至一個管，并通過輕柔地顛倒三次來混合。然后將每個試管的內容物傾至含有35ml補充以每 ml iang的BASTA 的VNO3RLMT培養基的預傾板之上。將板儲藏于ChexAll Instant Seal Sterilization Pouches 3_4日，然后轉移至塑料袋中再儲藏7_8日。將板上產生的菌落亞培養于VN03RLMT-BASTA 板。推定的轉化體命名為鑲片鐮孢WTY1449-03-01至四。實施例7 =BASTAtm抗性轉化體的表型分析將鑲片鐮孢轉化體WTY1449-03-01至四在另外三個培養基上篩選(1)補充以不同濃度的 FdU (0-500 μ Μ)的 VNO3RLMT 培養基；(2) VN03RLMT-BASTA  和(3) VN03RLMT-BASTA -FdU (后者補充以0至500 μ M的FdU)。將板在開放的塑料袋中在環境溫度(^TC )溫育多至15日。推定的轉化體的百分之四十是共轉化體(表型上)，即能夠在 VN03RLMT-BASTA 上生長，但不能在補充了不同濃度的FdU的VNO3RLMT培養基或補充了不同濃度的FdU的VN03RLMT_BASTA 培養基上生長。實施例8 推定的bar+，tk+共轉化體的基因型分析對于五個表型為bar+，tk+的共轉化體(實施例7)，將四個小栓從生長于VN03RLMT+BASTA 培養基上的7日齡培養物(描述于實施例1)切出，并接種入含有25ml M400培養基的帶擋板的125ml搖瓶中以生成用于DNA提取的生物質。將搖瓶在以 150rpm振蕩溫育4日。然后通過滅菌的MIRACL0TH 收獲生物質。將生物質用200ml滅菌蒸餾水徹底潤洗，使用戴手套的手擠壓，并使用干凈的長鑷子浸于液氮中。將冰凍的生物質立即加工或在_80°C在滅菌的50ml塑料管中暫時儲存。在杵和研缽中磨碎生物質之后，使用DNEASY  Plant Maxi Kit(QIAGEN Inc.，Valencia, CA, USA)依照生產商的指示只是將起始裂解溫育(由生產商建議的10分鐘)延長至90分鐘來提取基因組DNA。 DNA 使用NANODROP  ND-1000 Spectrophotometer (Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA)定量。然后將含有8yg DNA的來自每個儲備的等分試樣使用SPEEDVAC  Concentrator (Thermo-Electron Corp.，Waltham，MA，USA)濃縮至干燥，其后將 60 μ 1 IOmM Tris ρΗ 8.0添加至每個樣品并混合。將來自每個菌株的八微克DNA用Eco RI消化，對選定菌株還用Bam HI消化。Eco RI反應物由IX Eco RI緩沖液，8 μ g DNA, 65單位Eco RI，并用滅菌水調至終體積100 μ 1 組成。在37°C溫育10小時之后，添加上樣緩沖液(40%蔗糖，5mM EDTA，0. 025%溴酚藍， 0. 025%二甲苯藍)，并將樣品上樣至四個瓊脂糖凝膠上，將其在TBE緩沖液中在60伏運行5小時。BamHI 限制性消化物由 IX NEB緩沖液3(New England Biolabs Inc. ,Ipswich, MA, USA),8y g DNA，65單位Bam HI，每ml 100 μ g牛血清白蛋白并用滅菌水調至終體積 100 μ 1組成。在37°C溫育10小時之后，添加上樣緩沖液，并將樣品上樣至瓊脂糖凝膠上，然后在60伏在TBE緩沖液中運行5小時。在溴化乙錠染色并脫色之后，從凝膠使用HYB0ND  N尼龍膜(Amer sham Biosciences, Buckinghamshire, UK)如下制備 Southern 印跡。脫嘌呤是在 0. 25N HCl 中在
            
輕柔振蕩10分鐘繼以在在滅菌蒸餾水中進行5分鐘洗滌來進行的。在洗滌之后， 進行兩個變性反應使用0. 5N NaOH/1. 5MNaCl輕柔振蕩反應15分鐘(第一反應)和20分鐘(第二反應)。之后進行另一次洗滌在滅菌水中在M_26°C輕柔振蕩洗滌2分鐘。最終洗滌之后進行兩次中和反應，分別在對_261使用1. 5M NaCl, 0. 5M Tris ρΗ 7. 5和0. 001M EDTA輕柔振蕩反應30分鐘。然后將膜使用TURBO BLOTTER  Kit (Schleicher &khuell， Keene，NH, USA)在M_26°C在10X SSC中印跡過夜。將膜在M_26°C在2X SSC中振蕩洗滌5分鐘。然后將膜在M_26°C空氣干燥10分鐘，使用STRATALINKER (Stratagene，La Jolla，CA，USA)(用自動設定，其生成120mJ/cm2的總劑量)的UV交聯，并最終在真空烤箱中在80°C烘烤1小時。如下所示的用于產生bar-和tk基因特異性探針的引物是使用Vector NTI 軟件(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)設計的。bar基因正向引物#996023 5，-CGAGTGTAAACTGGGAGTTG-3，(SEQ ID NO 3)bar基因反向引物#996024 5，-GAGCAAGCCCAGATGAGAAC-3，(SEQ ID NO 4)tk基因正向引物#998744 5，-GGCGATTGGTCGTAATCCAG-3，(SEQ ID NO 5)tk基因反向引物#998745 
            
5，-TCTTCGACCGCCATCCCATC-3” (SEQ ID NO 6)將bar和tk基因的DIG標記的探針使用PCR DIG Probe Synthesis Kit依照生 /^ '  (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN, USA)  。 環之后，將反應物置于冰上，在微離心機中短暫離心，然后上樣于瓊脂糖凝膠。在TBE緩沖液中電泳之后，將預計大小的條帶切出，并使用MINELUTE  Gel Extraction Kit凝膠純化。將濾紙在 35ml DIG Easy Hyb (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN, USA)中在玻璃管中在42°C預雜交3小時，之后去除DIG Easy Hyb，并用7. 5ml新鮮DIG Easy Hyb加上10 μ 1標記的探針替代，將其煮沸5分鐘然后置于冰上(S卩，使用了得自PCR 反應的凝膠純化的DNA的大約30% )。在雜交爐中在42°C實施12小時雜交。在室溫在 2XSSC，0. SDS中實施兩次5分鐘的雜交后洗滌，然后在65°C在0. 2X SSC, 0. SDS中兩次15分鐘洗滌。后續的洗滌和檢測是使用DIG Wash和Block Set.Anti-Digoxigenin-AP Fab Fragments CDP-Star Chemi-Iuminescent 底物(Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN,USA)依照生產商的推薦進行的。通過表型(實施例7)和Southern(此實施例)分析確證為真正的bar+，tk+共轉化體的一個鑲片鐮孢菌株命名為鑲片鐮孢 WTY1449-03-03。實施例9 從鑲片鐮孢bar+，tk+共轉化體消除tk基因如實施例5中所述，在RA+BASTA 培養基中誘導鑲片鐮孢菌株WTY1449-03-03的孢子形成。然后對所述孢子就其在補充FdU的培養基上的生長(其應誘導tk基因的喪失) 進行篩選。通過用四個切自該株的新鮮培養物的栓接種25ml RA培養基，獲得了 1.06x10s 個孢子。使用該孢子儲備以制備一系列稀釋物以供鋪板于15mm直徑補充FdU的VNO3RLMT 板和未補充的VNO3RLMT板(后者用于存活率估計)。將孢子(100至IxlO7個)鋪于重復的板上，并在大約在 ChexAll Instant Seal Sterilization Pouch 中溫育 5 日。對五個選定的菌落進行了 Southern分析(使用實施例8中所述的bar和tk探針)，當使用實施例7中所述的方法將所述菌落亞培養于25 μ M FdU中時其能夠生長。 其結果解釋了所有五個單一孢子分離物均消除了 tk基因。一個菌株命名為鑲片鐮孢 WTY1449-09-0I0實施例10 確證尿苷的補充抵消了 tk攜帶轉化體的FdU敏感表型為了優化用于pyrG-缺失菌株(其需要尿苷補充以供存活)的基因缺失系統，確定對生長培養基補充尿苷是否干擾tk+株的FdU敏感性的機理是重要的。為此，使bar+，tk+ 株鑲片鐮孢 WTY1449-03-03 在 VN03RLMT_BASTA  板(如實施例1中所述)上再生，并如實施例5中所述誘導產生孢子。在收獲和洗滌之后，將孢子鋪板 (每14cm直徑板50，000個孢子)于含有50 μ M FdU和不同濃度的尿苷(0. I-ImM)的補充了 FdU 的 VNO3RLMT 板。將這些板在 28°C在 ChexAll Instant Seal Sterilization Pouch 中溫育6日，之后就生長對其進行評價。盡管未在無尿苷的補充了 FdU的VNO3RLMT板上觀察到生長，但在補充了所有濃度 (0. I-ImM)的尿苷和FdU的VNO3RLMT上均發生了 tk+株的大量生長。該情況使得在含有 FdU的培養基上分辨tk-株與tk+株變得困難或不可能。其結果，必需優化尿苷和FdU濃度以確定是否存在會使得tk+和tk-株在補充了 FdU和尿苷的培養基上能夠分辨的任何組合
            
31(實施例15和16)。實施例11 :pEmY21的生成從質粒pPHTI (Cummings 等，1999，Current Genetics 36 :371-382)使用下述引物擴增大腸桿菌潮霉素磷酸轉移酶(hpt)基因G)NA序列為SEQ ID NO :7而推導的氨基酸序列為 SEQ ID NO :8)。正向引物5，-GGGttcgaaTTCATTTAAACGGCT-3，(SEQ ID NO 9)反向引物5' -GGGagcgctCAATATTCATCTCTC-3  (SEQ ID NO 10)將由下劃線序列表示的限制性位點Bst BI (正向引物)和Eco 47111(反向引物) 工程引入所述引物以供克隆。(用于擴增 hpt 基因)的 PCR 反應物由 IX ThermoPol Buffer (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA)，200 μ M dNTPs，50pmol 正向和反向引物，IOOpg ρΡΗΤ1，1 單位 Vent  DNA 聚合酶(New England Biolabs Inc.，Ipswich, MAUSA)并用滅菌蒸餾水調至總體積100 μ 1組成。該擴增反應使用ROBOCYCLER 實施，其程序為在95°C進行1個循環2分鐘，25個循環，每個在95°C進行1分鐘，51°C進行1分鐘和72°C進行2分鐘，并在 72 °C進行1個循環7分鐘。將PCR產物在40mM Tris堿_20mM乙酸鈉-ImM EDTA 二鈉(TAE)緩沖液中通過
            
瓊脂糖凝膠電泳分離。將1.81Λ片段從凝膠切出，并使用QIAQUICK Gel Extraction Kit提取瓊脂糖。然后將凝膠純化的片段使用TOPO  Blunt Cloning Kit克隆入 pCR -BluntII-TOPO  (Invitrogen，Carlsbad, CA, USA)。所得的質粒命名為 pEmYlO。使用QUIKCHANGE  Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, La Jolla,CA,USA)依照生產商的指示使用如下所示的引物將Eco RI位點從pEmYlO中hpt基因的編碼序列去除，所述引物中小寫字母代表靶Eco RI位點的未突變的核苷酸而下劃線字母代表突變的核苷酸。所得的質粒命名為PBK3。正向引物5' -GGGTACCCCAAGGGCgTattcTGCAGATGGG-3' (SEQ ID NO 11)反向引物5' -CCCATCTGCAgaatAcGCCCTTGGGGTACCC-3 ‘ (SEQ ID NO :12)將所得不含所述Eco RI位點的hpt基因從pBK3使用如下所示的正向和反向引物進行PCR擴增。正向引物5，-GGRRtaccTTCATTTAAACGGCTTCAC-3，(SEQ ID NO 13)反向引物5' -GGRRtaccCGACCAGCAGACGGCCC-3  (SEQ ID NO 14)下劃線部分代表引入用于克隆的Kpn I位點。將米曲霉pyrG基因的部分用于生成直接重復，并使用下述引物從pS02 (W0 98/12300)進行 PCR 擴增重復1 
            
正向引物5，-TCCcccgggTCTCTGGTACTCTTCGATC-3，(SEQ ID NO 15)反向引物5' -GGggtaccCGACCAGCAGACGGCCC-3  (SEQ ID NO 16)重復2 正向引物5，-GGggtaccTCTCTGGTACTCTTCGATC-3，(SEQ ID NO 17)反向引物5 ’ -TCCcccgggCGACCAGCAGACGGCCC-3’ (SEQ ID NO 18)下劃線部分代表引入用于克隆的限制性位點Sma I (cccggg)或Kpn I (ggtacc)。將三個片段(hpt，重復#1和重復#2)在不同的反應(各50μ1)中擴增，所述反應物由 IX ThermoPol Buffer, 200 μ M dNTPs，0. 25 μ M 每種引物，50ng 模板 DNA 和 1 單位 Vent  DNA聚合酶組成。所述擴增反應使用ROBOCYCLER 進行，其程序為在95°C進行一個循環2分鐘，30個循環，每個在95°C進行1分鐘，61°C的進行1分鐘和72°C進行2分鐘，并在72°C進行1個循環7分鐘。將PCR產物在TAE緩沖液中通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離。將大約21Λ 的擴增的hpt片段和大約0. 2kb的重復片段從凝膠切出，并使用MINELUTE  Gel Extraction Kit進行瓊脂糖提取。將兩個pyrG重復片段用Kpn I消化，用小牛小腸磷酸酶(New England Biolabs Inc.，Ipswich, MA, USA)脫磷酸，并用 MINELUTE  Reaction Cleanup Kit(QIAGEN Inc.，Valencia, CA, USA)依照生產商的指示處理。然后將攜帶重復#1和hpt的片段使用QUICK LIGATION  Kit依照生產商的指示連接在一起，用 MINELUTE  Reaction Cleanup Kit 處理，并使用TOPO  Blunt Cloning Kit 克隆入 pCR -BluntII-TOPO 。序列分析確證了一個其中重復#1和hpt片段連接在一起的克隆。 該質粒命名為pEmY18。為了將第二個重復克隆入pEmY18，用Eco RV消化pEmy 18，并將消化物在TAE緩沖液中通過瓊脂糖凝膠電泳純化。將5. 6kb片段從凝膠切出，并使用QIAQUICK  Gel Extraction Kit進行瓊脂糖提取。將0. 2kb重復2片段(如上所述)和消化的pEmY18 使用QUICK LIGATION  Kit連接在一起。將連接混合物用于轉化SOLOPACK  Gold Supercompetent Cells (Stratagene, La Jolla, CA, USA)。序列分析鑒定了其中三個組分 (重復#1、hpt和重復#2)為所需的順序和取向且無PCR錯誤的質粒。所得的質粒命名為 pEmY20o為了確保后續用Eco RI對pEmY20的消化會釋放單一片段，使用 QUIKCHANGE  Site-Directed Mutagenesis Kit依照生產商的指示和如下所示的正向和反向引物去除Eco RI位點。在序列驗證之后，所得的質粒命名為pEmY21(圖6)。正向引物5' -GGGTACCCCAAGGGCQTATTCTGCAGATGGG-3' (SEQ ID NO  19)反向引物5' -CCCATCTGCAGAATACGCCCTTGGGGTACCC-3' (SEQ ID NO 20)實施例12 構建質粒PDM156. 2，其攜帶并入鑲片鐮孢乳清苷-5’ -單磷酸脫羧酶(pyrG)基因的基因組DNA片段粗糙脈孢菌乳清苷-5’ -單磷酸脫羧酶(pyr-4)基因的探針(DNA序列為SEQ ID NO :21而推導的氨基酸序列為SEQ ID NO 22)通過摻入異羥基洋地黃毒甙元標記的脫氧尿苷三磷酸(dUTP)的PCR使用下述引物來制備。引物(有義)5，-GTCAGGAAACGCAGCCACAC-3，(SEQ ID NO 23)引物(反義)5，-AGGCAGCCCTTGGACGACAT-3，(SEQ ID NO 24)將質粒 pFB6 (Buxton 等，1983，Molecular and General Genetics 190:403-405) 用Hind III消化，并將消化物通過使用TAE緩沖液的瓊脂糖凝膠電泳純化。將1. 11Λ pyr-4片段切出，并使用QIAQUICK  Gel Extraction Kit依照生產商建議的實驗方案進行瓊脂糖提取。擴增反應物由 IX Taq DNA Polymerase Buffer (New England Biolabs Inc., Ipswich, MA, USA),5 μ 1 PCR DIG Labeling Mix(Boehringer Mannheim, Manheim, Germany)，IOng 的 1. Ikb Hind III pyr_4 片段，IOpmol 的有義引物，IOpmol 反義引物，以及 1 單位 Taq DNA 聚合酶(New England Biolabs Inc. , Ipswich,MA,USA)組成。將反應物在 ROBOCYCLER 中溫育，其程序為在95°C進行1個循環3分鐘，然后35個循環，每個在 95°C進行30秒，55 °C進行1分鐘，和72°C進行1分鐘。在72°C實施5分鐘的最終延伸。將擴增翻譯產物通過使用TAE緩沖液的瓊脂糖凝膠電泳純化。將大約 0. 78kb的異羥基洋地黃毒甙元(DIG)標記的探針從凝膠切出，并使用QIAQUICK Gel Extraction Kit進行瓊脂糖提取。如WO 99/60137所述，生成鑲片鐮孢株A3/5的基因組DNA文庫，并克隆入lambda 載體EMBL4。使用DIG標記的探針篩選克隆入lambda載體EMBL4的鑲片鐮孢A3/5DNA的基因組文庫。將lambda噬菌體與大腸桿菌K802細胞(New England Biolabs, Ipswich, ΜΑ, USA) —同鋪板于具有附Z頂層瓊脂糖的LB板。使用Sambrook等(Molecular Cloning, A Laboratory Manual,第 2 版；J. Sambrook, Ε. F. Fritsch 禾口 Τ· Maniatis ；Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)的技術進行噬菌斑上移(plaque lift)至 HYB0ND  尼龍膜。DNA通過UV交聯使用UVSTRATALINKER 結合于膜。然后將濾紙與0. 78kb DIG標記的粗糙脈孢菌pyr-4探針雜交。pyrG克隆的雜交和檢測依照GENIUS  System User' s Guide (Boehringer Hammhe im, Manheim, Germany)在 42°C 用由 5X SSC，35% 甲酰胺，0. 1% L-月桂酰肌氨酸(Iauroylsarcosine)，0· 02% SDS 和封閉試劑(BoehringerHammheim， Manheim, Germany)組成的雜交溶液來實施。使用的DIG標記的探針的濃度是2. 5ng每 ml雜交溶液。雜交DNA用堿性磷酸酶偶聯的抗異羥基洋地黃毒甙元抗體(Boehringer Hammheim, Manheim, Germany)免疫檢測，并用化學發光底物(Boehringer Hammheim, Manheim, Germany)Lumiphos 530來顯現。DNA制備物是從推定的陽性lambda克隆使用 Lambda Midi Kit(QIAGEN Inc.，Valencia, CA, USA)來制備的。將來自上述鑒定的克隆的lambda DNA用Eco RI消化，并將其在TAE緩沖液中進行瓊脂糖凝膠電泳。將3. 91Λ片段切出，并使用QIAEX Gel Extraction Kit(QIAGEN Inc.,Valencia, CA)進行瓊脂糖提取。然后將該片段克隆入pUC118 (Viera和Messing，1987， Methods in Enzymology 153 :3_11)的EcoRI 位點。并用 2 μ 1 克隆反應物轉化0NESHOT  TOPlO感受態細胞。通過DNA測序分析來自八個所得的轉化體的質粒DNA。選取一個具有所需序列的克隆并命名為PDM156. 2(圖7)。pyrG片段攜帶整個編碼區加上1. 3kb的啟動子和1. 5kb的終止子。 實施例13 構建鑲片鐮孢pyrG缺失載體pEmY23將鑲片鐮孢pyrG編碼序列Q678bp，DNA序列為SEQ ID NO  51，而推導的氨基酸序列為SEQ ID NO 52)通過用Eco RV和Mu I的消化從pDM156. 2切出(實施例 12)，并使用QIAQUICK Gel Extraction Kit依照生產商的指示進行凝膠純化。分離pEm Y21的Sma I片段并使用QIAQUICK  Gel Extraction Kit進行凝膠純化，并使用QUICK LIGATION  Kit依照生產商的指示將兩個凝膠純化的片段連接在一起，并用 MINELUTE  ReactionCleanup Kit處理，并將2 μ 1所得的連接物用于依照生產商的指示轉化ONE SHOT 化學感受態T0P10細胞。使用BIOROBOT  9600從八個所得的轉化體提取質粒DNA。對這些DNA篩選插入物的取向，就錯誤不存在進行測序，并選取一個具有正確插入序列的克隆，并命名為 pEmY23 (圖 8)。實施例14 構建pyrG缺失的株EmYllM-46_4. 3將質粒pEmY23用Eco RI和Xmn I消化，并對其在TAE緩沖液中進行1 %瓊脂糖凝膠電泳以分離3. 6kb的DNA片段。使用QIAQUICK  GelExtraction Kit依照生產商的指示凝膠純化該3. 61Λ片段，并將其用于轉化鑲片鐮孢WTY842-1-11的原生質體，如實施例6中所述，有兩點不同第一，僅使用一種類型的轉化DNA(3. 61Λ的經Eco RI-Xmn I消化的pEmY23片段)，以及第二，轉化體是在補充了 ImM尿苷和每ml 0. 125mg潮霉素B (Roche， Indianapolis, IN,USA)的VNO3RLMT上選擇的。選取十個轉化體以供在25ml未補充的M400 液體培養基中進行篩選，并還在VN03RLMT+lmM尿苷(用于生長的陽性對照)，VNO3RLMT+ImM 尿苷+每ml 0. 125mg的潮霉素B (用于轉化的陽性對照)和未補充的VNO3RLMT (篩選pyrG 缺失)上的表型篩選中進行篩選。尿苷原養型的候選物可在三日內在液體培養基上鑒定， 而在七日內通過基于板的表型篩選中鑒定。一個選用于進一步篩選和孢子純化的候選物命名為EmYlK4-46-4。對來源于該菌株的孢子純化的分離物(如實施例21中所述獲得，只是瓊脂培養基是補充了 IOmM尿苷的VNO3RLMT)進行如上所述相同的篩選實驗方案，并選取兩個單獨的孢子分離物用于Southern雜交分析以供與親本株比較。這些孢子純化的株命名為鑲片鐮孢 EmYl 154-46-4. 3 和 EmYllM-46_4. 5。如實施例8中所述從存在pyrG和缺乏hpt的鑲片鐮孢WTY842-1-11 (對照株)、 主要轉化體鑲片鐮孢EmYl 154-46-4和單一孢子分離物鑲片鐮孢EmYl 1M-46-4. 3和 EmYllM-46-4. 5制備基因組DNA。將來自每個株的八微克DNA用Mu I和Mfe I消化。Stu I 反應物由 IX NEB 緩沖液 2 (New England Biolabs Inc. , Ipswich, MA, USA), 8 μ g DNA, 65 單位Mu I，并用滅菌水調至總體積100 μ 1組成。在37°C溫育10小時之后，添加上樣緩沖液(40%蔗糖，5mM EDTA，0.025%溴酚藍，0.025%二甲苯藍)，并將樣品上樣于兩個1%瓊脂糖凝膠上，將其在TBE緩沖液中以60伏運行5小時。Mfe I限制性消化物由IX NEB緩沖液 4 (New England Biolabs Inc. , Ipswich, MA, USA), 8 μ g DNA，65 單位 MFe I 并用滅菌水
            
35調至總體積100 μ 1組成。在37°C溫育10小時之后，添加上樣緩沖液，并將樣品上樣于瓊脂糖凝膠上，將其在TBE緩沖液中以60伏運行5小時。在溴乙錠染色和脫色之后，從凝膠使用HYB0ND  N尼龍膜如下所述制備Southern 印跡。脫嘌呤是在0. 25N HCl中在輕柔振蕩10分鐘繼以在在滅菌蒸餾水中進行 5分鐘洗滌來進行的。在洗滌之后，進行兩個變性反應使用0. 5N NaOH/1. 5M NaCl輕柔振蕩反應15分鐘(第一反應)和20分鐘(第二反應)。之后進行另一次洗滌在滅菌水中在 ^TC輕柔振蕩洗滌2分鐘。最終洗滌之后進行兩次中和反應，分別在^TC使用1.5M NaCl, 0. 5MTris pH 7. 5和0. OOlM EDTA輕柔振蕩反應30分鐘。然后將膜使用TURB0BL0TTER  Kit在在IOX SSC中印跡過夜。將膜在在2X SSC中振蕩洗滌5分鐘。然后將在
            
膜空氣干燥10分鐘，使用STRATALINKER (用自動設定，其生成120mJ/cm2的總劑量) UV交聯，并最終在真空爐中在80°C烘烤1小時。如下所示的用于產生pyrG和hpt基因特異性探針的引物是使用Vector NTI 軟件(Invitrogen，Carl sbad, CA, USA)設計的。鑲片鐮孢pyrG正向引物5，-GCCATGCGATCCAGCGTTTGAATCC-3，(SEQ. ID NO 25) 
            
 鑲片鐮孢pyrG反向引物5，-GCGTCCGCAACTGACGATGGTCCTC-3，(SEQ.ID NO 26)大腸桿菌hpt正向引物5，-CAGATACCACAGACGGCAAGC-3，(SEQ. ID NO 27)大腸桿菌hpt反向引物5，-GGGCAGTTCGGTTTCAGG-3，(SEQ. ID NO 28)將pyrG和hpt基因的DIG標記的探針使用PCR DIG Probe Synthesis Kit依照生產商的實驗方案生成。在循環之后，將反應物置于冰上，在微離心機中短暫離心，然后上樣于瓊脂糖凝膠。在TBE緩沖液中電泳之后，將預計大小的條帶切出，并使用 MINELUTE Gel Extraction Kit 凝膠純化。將濾紙在:35ml DIG Easy Hyb (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN, USA)中在玻璃管中在 42°C預雜交 3 小時，之后去除DIG Easy Hyb，并用7. 5ml新鮮DIG Easy Hyb加上10 μ 1標記的探針替代(由PCR 反應擴增的凝膠純化的DNA的大約30% )，將其煮沸5分鐘然后置于冰上。在雜交爐中在 42°C實施12小時雜交。在室溫在2X SSC,0. 1% SDS中實施兩次5分鐘的雜交后洗滌，然后是在65°C在0. 2X SSC,0. 1% SDS中的兩次15分鐘洗滌。后續的洗滌和檢測是使用DIG Wash禾口 Block Set>Anti-Digoxigenin-AP Fab Fragments 禾口 CDP-Star Chemi-Iuminescent 底物(Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN, USA)依照生產商的推薦進行的。Southern雜交結果揭示鑲片鐮孢EmYl 154_46_4及其兩個單孢子分離物 EmYl 154-46-4. 3 和 EmYl 154-46-4. 5 保持了 pyrG 缺失事件，并攜帶 hpt 基因。實施例15 :pyrG缺失的鑲片鐮孢株EmYllM-46_4. 3的孢子在補充尿苷和FdU的培養基上的萌發效率測試了來自pyrG缺失的鑲片鐮孢株EmYllM-46-4. 3的孢子在補充尿苷和FdU的培養基上的萌發效率。鑲片鐮孢EmYllM-46-4. 3的孢子如實施例5中所述使用補充了 IOmM尿苷的RA培養基生成。將200 μ 1體積的五十個孢子等分至45個補充了 0、25或50 μ M FdU 和0,0. 01,0. 05,0. 1或0. 25mM尿苷的VNO3RLMT板(Hcm直徑)上。設置每種FdU和尿苷組合的三次重復的板并將其在26°C在ChexAll Instant Seal Sterilization Pouch中溫
            
育10日。當尿苷濃度為0. OlmM時，鑲片鐮孢EmYllM-46_4. 3的孢子并不在25或50 μ M FdU的存在下萌發，但其在FdU不存在時在相同的培養基上容易地萌發。然而，當尿苷濃度為0. ImM時，pyrG缺失株的孢子在25和50 μ MFdU存在下可以以大約25%的頻率萌發(與 FdU不存在時的75%的頻率相比較)。實施例16 在低尿苷濃度在FdU補充基本培養基上分辨tk+和tk-株為了確定非常低的尿苷濃度是否在tk+株中賦予對FdU的抗性，實施了重構實驗。 使用了 tk+株鑲片鐮孢WTY1449-3-3和tk-株鑲片鐮孢WTY1449-9-1。誘導每株的孢子并將其以每板50個孢子(鑲片鐮孢WTY1449-9-1)或每14em直徑板50，000個孢子(鑲片鐮孢 WTY1449-3-3)鋪板。此外，將 WTY1449-3-3 和 WTY1449-9-1 孢子(分別為 50 個和 50，000) 的組合混合并鋪板。所有板含有補充了 50 μ M FdU的VNO3RLMT。板中尿苷濃度為1、0. 5、 0. 25或0. ImM。每種處理以三次重復實施。tk+株在所有板上以均一的霧狀(haze)生長，唯獨在缺乏尿苷的培養基上不生長。tk-株在所有濃度的尿苷，以及缺乏尿苷的培養基上生長良好。在混合板上，結果為純的tk+和tk-株的板的結果的組合。在每個含有尿苷的板上，明顯的tk-菌落重疊在tk+ 株霧狀的背景生長之上。將出現在tk+和tk-孢子的混合物鋪板的板上的菌落亞培養至補充了 50μΜ FdU (不含尿苷)的新鮮VNO3RLMT培養基板。還從背景生長(每個混合板3個菌落)將相同數量的樣品亞培養至VN03RLMT+50yM FdU(不含尿苷)。此外，將菌落和背景生長從純 tk-板和純tk+板亞培養至VN03RLMT+50 μ M FdU(不含尿苷)板。這是為了評價(1)混合板上的背景生長(假定的FdU敏感、tk+株)之后是否會在缺乏尿苷情況下表現出預計的表型(對FdU敏感)；和( 假定的FdU抗性、tk-菌株是否會在這些情況下正常生長。在溫育之后，顯然tk+株絕對無法在50 μ M FdU存在下在缺乏尿苷的培養基上生長，而tk-株在50 μ M FdU存在下在缺乏尿苷的培養基上正常生長。盡管tk+在含有尿苷的混合板上有背景霧狀生長，但tk-株是容易分辨的，并可容易地將其從補充了 0. ImM尿苷的含FdU培養基亞培養至不含尿苷的培養基，而沒有被tk+株污染的危險，這正是要求保護的雙重選擇技術所需的。結果闡明了可成功地將tk基因在補充了尿苷的生長條件下用作陰性選擇性標記 (與尿苷的補充消除了對FdU抑制作用的發表論斷，例如Sachs等，1997，Nucleic Acids Research 25 :2389-2395 相反)。實施例17 構建質粒 pWTY1470-19-07將攜帶鑲片鐮孢trichodiene合酶(tri5)基因的5，和3，側翼序列(DNA序列為 SEQ ID NO: 29，推導的氨基酸序列為SEQ ID NO 30)的質粒pJRoy40 (美國專利7，332，341 號)用作模板以供擴增5’ tri5基因側翼序列的部分。PCR反應物在終體積50 μ 1中含有 200 μ M dNTPs, IX Taq DNA 聚合酶緩沖液，125pg pJRoy40DNA，50pmol 每種下示引物和 1 單位Taq DNA聚合酶。
            
正向引物5，-GGGAGATCTTCGTTATCTGTGCC-3’ (SEQ ID NO 31)反向引物5，-GGGAGATCTTAGTAGTCGGCATTTGAAAC-3‘ (SEQ ID NO 32)(下劃線的核苷酸顯示引入的BglII位點)。將擴增反應物在ROBOCYCLER 中溫育，程序為在95°C進行1個循環3分鐘； 10個循環，每個在95°C進行30秒，在52°C進行45秒和在72°C進行2分鐘；20個循環，每個在95°C進行30秒，在52°C進行45秒和在72°C進行5分鐘；以及在72°C進行1個循環7 分鐘。PCR產物通過使用TBE緩沖液的1. 5%瓊脂糖凝膠電泳分離。將大約600bp的片段從凝膠切出，并使用MINELUTE Gel Extraction Kit進行瓊脂糖提取。將片段使用 TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)插入pCR  2. 1 (Invitrogen, 0^1讓￡1(1丄4，舊4)，并用2111克隆反應物轉化ONE SHOT  T0P10感受態細胞。將來自八個所得的轉化體的質粒DNA用Eco RI和Bgl II在不同的反應中消化，且三個具有正確的限制消化樣式的轉化體的插入通過DNA測序得到確證。選取一個具有所需序列的克隆并命名為 pWTY1470-09-05。通過用Bgl II消化從pWTY1470-09-05釋放出攜帶tri5基因5，重復的608bp Bgl II片段，通過使用TBE緩沖液的1.0%瓊脂糖凝膠電泳純化，從凝膠切出，并使用 MINELUTE Gel Extraction Kit 進行瓊脂糖提取。質粒ρJRoy40通過Bgl II消化線性化，之后將其使用蝦堿性磷酸酶(Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN, USA)依照生產商的指示脫磷酸，并使用 QIAQUICK PCR Purification Kit(QIAGEN Inc.，Valencia, CA, USA)純化。將線性化的pJRoy40和凝膠純化的Bgl II片段使用T4DNA連接酶(New England Biolabs Inc.， Ipswich, MA, USA)依照生產商的指示連接在一起。大腸桿菌SURE 化學感受態細胞 (Stratagene，LA Jolla,CA,USA)的轉化依照生產商的指示加以實施。一個轉化體通過DNA 測序確證含有所需的載體，即攜帶tri55’和3’側翼序列并另外含有5’側翼序列一部分的重復。所得的質粒命名為pWTY1470-19-07(圖9)。實施例18 構建質粒 pWTY1515-02-01對質粒pWTY1470-19-07使用QUDCCHANGE Site-DirectedMutagenesisKit 依照生產商的指示以及如下所示的正向和反向引物進行體外誘變。正向引物5，-CAAGTAACAGACGCGACAGCTTGCAAAATCTTCGTTATCTGTG-3，(SEQ ID NO 33)反向引物5，-CACAGATAACGAAGATTTTGCAAGCTGTCGCGTCTGTTACTTG-3，(SEQ ID NO 34)該誘變去除了 1779bp處的Bgl II位點，并使得2386bp處的Bgl II位點變成唯一，并可用于后續的操作中以插入攜帶胸苷激酶(tk)和潮霉素磷酸轉移酶(hpt)基因盒的片段。將該誘變反應用于依照生產商推薦的實驗方案轉化試劑盒提供的大腸桿菌 XLlO-GOLD  Ultra-感受態細胞(Stratagene，La Jolla, CA, USA)。一個根據序列分析驗證的攜帶如上所示的突變的轉化體，命名為pffTY1515-02-01(   10)，并用作實施例19中的骨架。實施例19 :tri5缺失載體pJfyS1579-21_16的生成使用ADVANTAGE GC Genomic PCR Kit (Clonetech, Palo Alto, CA, USA)和如下所示的基因特異性正向和反向引物從質粒pEmY23 PCR擴增大腸桿菌潮霉素磷酸轉移酶(hpt)基因盒。反向引物中的下劃線部分是用于克隆的Bgl II位點。正向引物5，-TTGAACTCTCAGATCCCTTCATTTAAACGGCTTCACGGGC-3，(SEQ ID NO 35)反向引物5，-CAGATAACGAAGATCTACGCCCTTGGGGTACCCAATATTC-3> (SEQ TD NO :36)PCR反應物在50 μ 1的終體積中含有362ng pEmY23作為DNA模板，200 μ m dNTPs, 1. ImM 乙酸鎂，0·4μΜ 引物，IX GC Reaction Buffer (Clonetech, Palo Alto, CA, USA), 0. 5M GC Melt(Clonetech, Palo Alto,CA, USA)禾口 IX GC Genomic Polymerase Mix(Clonetech, Palo Alto, CA, USA)。將擴增反應物在EPPENDORF MASTERCYCLER (Eppendorf, Munich, Germany)中溫育，其程序為在95°C進行1個循環2分鐘；25個循環，每個在94°C進行30秒和66°C進行3分鐘；和在66°C進行1個循環3分鐘；以及在4°C維持。將PCR產物通過使用TAE緩沖液的1 %瓊脂糖凝膠電泳分離。將大約1. 9kb的片段從凝膠切出，并使用MINIELUTE Gel Extraction Kit (QIAGENInc.，Valencia, CA, USA)進行瓊脂糖提取。將所述片段使用TOPO  TACloning Kit依照生產商的指示克隆入pCR  2. 1。將 ONE SHOT  T0P10 感受態細胞 Qnvitrogen, Carlsbad, CA, USA)用 2 μ 1 TOPO  TA反應物轉化。來自8個轉化體的質粒DNA的序列分析確證了與預計序列并無偏差，且該質粒命名為PJfySlM0-75-5(圖11)。將hpt插入物通過用Bam HI和Bgl II的消化而從pJfySlM0-75_05釋放，并在 TAE緩沖液中通過瓊脂糖凝膠電泳分離。將1. 9kb的片段切出，并使用MINIELUTE  Gel Extraction Kit進行瓊脂糖提取。使用Rapid DNALigation Kit將該片段連接至經 Bgl II線性化的空tri5缺失載體pWTY1515-02-01 (實施例18)，其已經使用小牛小腸磷酸酶脫磷酸。將大腸桿菌SURE 化學感受態細胞用所述連接反應物轉化，并將來自M個所得的轉化體的質粒DNA通過用Eco RI的限制性消化分析確證插入的取向。選取了一個攜帶所需取向的插入的轉化體并命名為pJfyS1579-l-13(圖12)。將單純皰疹病毒胸苷激酶(tk)基因(DNA序列為SEQ ID NO :37，而推導的氨基酸序列為SEQ ID NO 38)使用pWTY1449-2_l作為模板和如下所示的基因特異性正向和反向引物進行PCR擴增。粗體序列代表引入的Bgl II位點。正向引物5，-GCCGACTACTAGATCGACCGGTGACTCTTTCTGGCATGCG-3，(SEQ ID NO 39)反向引物5，-CAGATAACGAAGATCTGAGAGTTCAAGGAAGAAACAGTGC-3，(SEQ ID NO 40)PCR反應物在50 μ 1的終體積中含有IX HERCULASE 反應緩沖液 (Stratagene, La Jolla, CA, USA)，200 μ M dNTPs, 55ng pWTY1449-2_l，0. 2 μ M 引物，2 % DMSO 和 2· 5 單位HERCULASE  DNA 聚合酶(Stratagene，La Jolla, CA, USA)。
            
將擴增反應物在EPPENDORF MASTERCYCLER 中溫育，程序為在95°C 進行ι個循環ι分鐘；25個循環，每個在94°C進行30秒，在60°C進行30秒，和在68°C進行 2分45秒；和在68°C進行1個循環2分45秒；并在4°C維持。將PCR產物通過使用TAE緩沖液的1 %瓊脂糖凝膠電泳分離。將大約2. Skb的片段從凝膠切出，并使用MINIELUTE Gel Extraction Kit進行瓊脂糖提取。將所述片段使用TOPO TA Cloning Kit 克隆入pCR  2. 1。將 ONE SHOT  T0P10 感受態細胞 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)用2 μ 1 TOPO  TA反應物轉化。來自一個轉化體的質粒 DNA的序列分析在tk編碼序列鑒定了一個突變(C1621G)，其導致甘氨酸至丙氨酸的氨基酸變化。使用QUIKCHANGE  II XL Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, La Jolla,CA,USA)依照生產商的指示和如下所示的正向和反向引物校正了該突變。小寫字母表示所需變化。16個克隆的序列分析導致選取其中一個，命名為pJfyS1579-8-6(圖13)。正向引物5，-CCCTGTTTCGGGGCCCCGAGTTGCTGG-3，(SEQ ID NO 41)反向引物5，-CCAGCAACTCGGGGCCCCGAAACAGGG-3，(SEQ ID NO 42)將質粒pJfyS1579-08-06用Bam HI和Bgl II消化以釋放所述2. 8kb tk片段，并如上所述純化片段。將該片段使用QUICK LIGATION  Kit連接于經Bgl II線性化并經小牛小腸磷酸酶處理的pJfyS1579-l-13，并用于依照生產商的實驗方案轉化大腸桿菌SURE  化學感受態細胞。將所得的質粒命名為pJfyS1579-21-16(圖14)并用作tri5缺失盒。實施例20 鑲片鐮孢轉化方法將一百微克每種下述實施例中所述的缺失盒用Bst Z171/Bam HI (實施例21)或 Not I (實施例M、26、37和39)消化。將每個消化反應物在TAE緩沖液中通過1 %瓊脂糖凝膠電泳純化，并使用QIAQUICK Gel Extraction Kit提取DNA條帶。將所得的純化DNA 在1. 5ml微離心管中通過乙醇沉淀來濃縮，即添加10%反應物體積的3M乙酸鈉pH 5，然后添加2. 5體積的冰冷的乙醇(94% )并在冰上溫育20分鐘。然后將管在EPPENDORF  5424桌上離心機(Eppendorf,Hamburg,Germany)中以15，OOOxg離心10分鐘。棄去上清， 并用Iml冰冷的70%乙醇洗滌沉淀，并將其以15，OOOxg離心5分鐘。棄去上清并使沉淀風干。然后將沉淀重懸于70 μ 1 IOmM Tris pH 8緩沖液。所得的含DNA溶液的濃度使用 NANODROP  1000 分光光度計(ThermoFischer Scientific, ffaltham, MA, USA)確定。適當受體株的原生質體是通過下述方法生成。首先通過用含有VNO3RLMT培養基的 7日齡培養物的Ihlcm2瓊脂栓接種2. 8L Fernbach燒瓶中的500ml的RA培養基(實施例 21)或補充了 IOmM尿苷的RA培養基(實施例M、26、37和39)并將燒瓶在以150rpm 振蕩溫育36小時來獲得孢子。將孢子培養物經過滅菌MIRACL0TH 過濾，并將孢子捕獲于 MILLIPORE  STERICUP  0. 2 μ m 過濾單元(Millipore，Bellerica, MA, USA)之上。 用200ml滅菌玻璃蒸餾水洗滌孢子，并將其重懸于IOml滅菌玻璃蒸餾水。將一 ml的孢子溶液用于接種100ml補充了 5%葡萄糖的YP培養基(實施例21)或補充了 5%葡萄糖和IOmM尿苷的YP培養基(實施例M、26、37和39)。將接種的培養基在 17°C以150rpm振蕩溫育16小時。將培養物經過MIRACL0TH 過濾以收集菌絲體，然后使用滅菌的刮鏟將其轉移至50ml聚丙烯管。將菌絲體重懸于20ml在每ml IM的MgSO4中含有每ml 5mg 的 N0V0ZYME  234 和 5mg 的 GLUCANEX  (兩者均來自 Novozymes A/S, Bagsvaerd, Denmark)的原生質體化溶液，并轉移至50ml聚丙烯管。將管在29. 5°C以90rpm振蕩溫育一小時，之后添加30ml IM山梨醇。然后將管以800xg在Sorvall RT 6000B浮筒式離心機 (ThermoFischer Scientific,ffaltham,MA,USA)中離心10分鐘。棄去上清并將原生質體沉淀用30ml IM山梨醇洗滌兩次。將管在SOOxg離心5分鐘并棄去上清。將原生質體以切107 每ml的濃度重懸于過濾滅菌的9  1  0. 1 (v/v) STC  SPTC  DMSO的溶液中，并以受控冷凍速率使用 NALGENE  Cryo 1°C Freezing Container(ThermoFischer Scientific, ffaltham, MA, USA)在 _80°C冷凍過夜。轉化通過將原生質體在冰上融化并將200 μ 1原生質體添加至四個Hml管中的每一個來達成。將五μ g DNA (以少于10 μ 1)添加至前三個管中，而不將DNA添加至第四個管。然后將750 μ 1 SPTC添加至每個管，并將管輕柔倒轉6次。將管在室溫溫育30分鐘， 并將6ml STC添加至每個管。將每個轉化物分為三部分，并添加至150mm直徑板，其含有補充了每ml 125 μ g潮霉素的VNO3RLMT培養基(實施例21)或補充了每ml 125yg潮霉素和IOmM尿苷的VNO3RLMT培養基(實施例M、26、37和39)，并在室溫溫育7日。實施例21 構建Δ tri5鑲片鐮孢株JfyS1604-47_02將鑲片鐮孢A3/5原生質體用經Bst Z171/Bam HI線性化的pJfyS1579-21_16使用實施例20所述方法轉化。將轉化體在含有每ml 125 μ g潮霉素B的VNO3RLMT板上選擇。在第7日之后，將123個轉化體中的48個亞培養至含有相同培養基的新板上。然后通過Southern分析來分析八個轉化體如下。通過用來自如上所述獲得的7日齡轉化體的四個Icm瓊脂栓接種25ml的M400培養基來生成這些株的真菌生物質。將培養物在28V以 150rpm振蕩溫育3日。去除瓊脂栓，并將培養物經過MIRACL0TH 過濾。將收獲的生物質用液氮冷凍，并使用研缽和杵磨碎菌絲體。使用DNEASY  Plant Maxi Kit依照生產商的指示分離基因組DNA，只是65°C 的裂解溫育期從10分鐘延長至1. 5小時。將二 μ g基因組DNA用16單位的SphI和22單位的DraI在50 μ 1反應體積中在 37°C消化22小時。對消化物進行TAE緩沖液中的1. 0%瓊脂糖凝膠電泳。將DNA在凝膠中通過用 0. 25M HCl 處理片段化，用 1. 5MNaCl-0. 5M NaOH 變性，用 1. 5M NaCl-IM Tris pH 8 中和，然后在 20X SSC 中使用 TURBOBLOTTER  Kit 轉移至NYTRAN  Supercharge 尼龍膜(均來自 Whatman，Kent，UK)。將 DNA 使用 UV STRATALINKER  UV 交聯至膜上，并在 20ml DIG Easy Hyb中在42°C預雜交1小時。針對tri5基因的3’側翼序列的PCR探針是使用下述正向和反向引物生成的。正向引物5' -GTGGGAGGATCTGATGGATCACCATGGGC-3' (SEQ ID NO 43)反向引物5' -CCGGGTTTCGTTCCGAACGATCTTTACAAGG-3' (SEQ ID NO 44)探針是使用PCR Dig Probe Synthesis Kit依照生產商的指示生成的。將探針在TAE緩沖液中通過1. 2%瓊脂糖凝膠電泳純化，并將對應于探針的條帶切出，并使用 MINELUTE Gel Extraction Kit進行瓊脂糖提取。將探針煮沸5分鐘，并添加至IOml DIG Easy Hyb以產生雜交溶液。雜交在42°C實施15_17小時。然后將膜在高嚴格條件下在室溫在2X SSC加0. 1 % SDS中洗滌，然后在65 °C進行兩次洗滌，每次在0. IX SSC加 0.1% SDS中進行15分鐘。探針-靶雜交體通過化學發光測定法(Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA)依照生產商的指示檢測。將一個如Southern分析確定的在tri5位點攜帶單一拷貝的缺失盒的轉化體鑲片鐮孢JfyS1579-43-23通過從含有VNO3RLMT培養基的7日齡板使用滅菌牙簽切下四個 Icm2栓并將其轉移至含有25ml RA培養基的125ml帶擋板的搖瓶來進行孢子形成。將燒瓶在以150rpm振蕩溫育48小時。將孢子培養物經過滅菌的MIRACL0TH 過濾，并收集于50ml聚丙烯管。使用血細胞計數器確定孢子濃度，并將IO5個孢子(Iml中)轉移至含有補充了 50 μ M FdU的VNO3RLMT培養基的150mm板，并在溫育4日。使用滅菌牙簽挑取孢子分離物，并將其轉移至含有補充了 10 μ M FdU的VNO3RLMT培養基的新板，并使其在 24-  °C生長7日。將基因組DNA從7個孢子分離物提取，并如上所述實施Southern分析以確保盒從基因組正確切出。如預計，所有通過Southern印跡分析的孢子分離物切出了盒，留下一個重復序列。將一個孢子分離物通過如前述段落中所述在株中誘導孢子形成來純化孢子一次，并使用血細胞計數器確定孢子濃度，并稀釋至每ml 40個孢子。將一 ml的稀釋孢子溶液鋪板于含有VNO3RLMT培養基的150mm板，并將板在溫育4日。將孢子分離物亞培養至含有VNO3RLMT培養基的新板，并將一個命名為鑲片鐮孢JfyS1604-17-02 ( Δ tri5)的孢子分離物用作缺失PyrG基因的起始株。實施例22 構建攜帶胸苷激酶(tk)陰性選擇性標記和潮霉素磷酸轉移酶(hpt) 陽性選擇性標記的通用缺失載體。構建了攜帶胸苷激酶(tk)和潮霉素磷酸轉移酶(hpt)標記兩者的通用缺失載體以便于裝配后續的缺失質粒。靶向缺失的基因的5’和3’區域的側翼序列在用Riie I或 Asc I (對于5’側翼序列)以及Sbf I或Swa I (對于3’側翼序列)消化載體之后可容易地連接于后者。為了 PCR擴增來源于鑲片鐮孢pyrG基因5’側翼區域的直接重復，在兩個PCR反應物中使用50皮摩爾如下所示的引物，所述反應物在50 μ 1的總體積中含有50ng pDM156. 2， IX Pfx Amplification Buffer (Invitrogen, Carlsbad, CA,USA), 6 μ 1 IOmM dNTPs混合物， 2. 5 單位PLATINUM  Pfx DNA 聚合酶(Invitrogen，Carlsbad, CA, USA)和 1 μ 1 50mM MgSO4。引物重復 #1有義引物5，-GTTTAAACGGCGCGCC CGACAAAACAAGGCTACTGCAGGCAGG-3，(SEQ ID NO 45)反義引物5，-TTGTCGCCCGGG AATACTCCAACTAGGCCTTG-3，(SEQ ID NO 46)重復#2有義引物5，-AGTATTCCCGGG CGACAAAACAAGGCTACTGCA-3，(SEQ ID NO 47)反義引物
            
5，-ATTTAAATCCTGCAGG AATACTCCAACTAGGCCTTG-3，(SEQ ID NO 48)將擴增反應物在EPPENDORF  MASTERCYCLER 中溫育，其程序如下。
            
對于重復#1 在98°c進行1個循環2分鐘，然后5個循環，每個在94°C進行30秒，55°C進行30秒和68°C進行1分鐘。接著進行35個循環，每個在94°C進行30秒，在59°C進行30 秒和68°C進行1分鐘。對于重復#2，循環參數為在98°C進行1個循環2分鐘；然后5個循環，每個在94°C進行30秒，在55°C進行30秒，和68°C進行1分鐘。然后是35個循環，每個在94°C進行30秒，在56°C進行30秒，和68°C進行1分鐘。在35個循環之后，將兩個反應物(即重復#1和#2)在68°C溫育10分鐘，然后在10°C冷卻直至進一步加工。將來自兩個反應的PCR產物使用TAE緩沖液通過0. 8 % GTG-瓊脂糖(Cambrex Bioproducts, East Rutherford, NJ, USA)分離。對于重復#1和重復#2，從凝膠切出大約 0. 26kb 的片段，并使用 Ultrafree -DA旋轉杯(spin cup) (Millipore, Billerica, MA, USA)依照生產商的指示純化。然后將十微升每種純化的重復用于單一的重疊 PCR (overlapping PCR)反應，其反應物在50 μ 1的總體積中含有IX Pfx擴增緩沖液，6 μ 1 IOmM dATP、dTTP、dGTP 和 dCTP 混合物，2. 5 單位PLATINUM  Pfx DNA 聚合物和 1 μ 1 50mM MgSO4。將擴增反應物在EPPENDORF MASTERCYCLER 中溫育，其程序為在
            
98°C進行1個循環2分鐘，然后5個循環，每個在94°C進行30秒，在50°C進行30秒和68°C 進行1分鐘。然后將反應物與預溫的溶液混合，所述溶液在50 μ 1的終體積中含有50皮摩爾用于重復#1的有義引物和50皮摩爾用于重復#2的反義引物，IX Pfx擴增緩沖液，6 μ 1 IOmM dNTPs, 2. 5 單位PLATINUM  Pfx DNA 聚合酶和 1 μ 1 50mM MgSO4。將新的100 μ 1的擴增反應物在EPPENDORF MASTERCYCLER 中溫育， 程序為35個循環，每個在94°C進行30秒，在58°C進行30秒和68°C進行1分鐘。在35個循環之后，將反應物在68°C溫育10分鐘，然后在10°C冷卻直至進一步加工。將0. 5kb PCR 產物(攜帶所述重復裝配體)如上所述通過0. 8% GTG-瓊脂糖凝膠電泳分離。將質粒pCR4(Invitrogen，Carlsbad, CA, USA)用作用于構建通用缺失載體的載體骨架的來源。為了去除PCR4DNA的非必需部分，將2. 5μ g質粒pTter61C(W0 2005/074647) 順序用 Bsp LUll I 和Bst XI 消化。然后用 Antarctic磷酸酶(New England Biolabs Inc., Ipswich,MA, USA)處理消化的載體。將3. Ikb經消化的骨架如上所述通過0. 8% GTG-瓊脂糖凝膠電泳來分離。然后將純化的重復裝配體用Rapid Ligation Kit (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN,USA)連接于純化的載體骨架。連接反應物由75ng純化的載體骨架和3μ 1純化的重復裝配體組成。將一微升該連接反應物用于使用生產商推薦的實驗方案來轉化化學感受態SOLOPACK Supercompetent 細胞 Gtratagene，Carlsl^ad， CA, USA) 0將二十四個轉化體通過Nco I/Pme I限制性消化分析。二十四個轉化體中的二十三個具有預計的限制消化樣式。隨機選擇克隆PFvRs #10用于測序以確證無PCR誘導的錯誤。序列分析顯示克隆PFvRs #10中的重復裝配體具有預計的序列，并因此將其選作鑲片鐮孢通用載體的骨架，并命名為pAlLol492-M(圖15)。將攜帶潮霉素磷酸轉移酶(htp)基因的盒從pEmY23使用如下所示的基因特異性正向和反向引物進行PCR擴增。下劃線序列代表Xma I位點，而粗體字母代表Bgl II位點。 在每個5’端的四個“a”使得PCR產物的末端能夠進行后續的消化。
            
正向引物5，-aaaacccKggCCTTCATTTAAACGGCTTCACGGGC-3' (SEQ ID NO :49)反向引物5，-aaaacccgggAGATCTACGCCCTTGGGGTACCCAATATTC-3，(SEQ ID NO :50)擴增反應物在50 μ 1的終體積中含有60ng pEmY23, 200 μ m dNTPs, ImM乙酸鎂， 0. 4μΜ引物，IX Pfx Amplification Buffer,0. 5M GC Melt和2. 5單位PLATINUM Pfx 聚合酶。將反應物在EPPENDORF MASTERCYCLER 中溫育，其程序為在95°C進行1個循環2分鐘；10個循環，每個在94°C進行30秒，在60°C進行30秒和68°C進行1分 50秒；和在68°C進行一個循環7分鐘，接著在4°C維持。將PCR產物通過使用TAE緩沖液的1 %瓊脂糖凝膠電泳分離。將大約1. Skb的片段從凝膠切出，并使用MIMELUTE Gel Extraction Kit進行瓊脂糖提取。隨后將經凝膠純化的PCR產物用Xma I消化，并在1 %瓊脂糖凝膠上運行并如上所述再次凝膠純化。將 QUICK LIGATION  Kit用于將hpt PCR產物連接于經小牛小腸磷酸酶處理、經Xma I-線性化的pAlLol492-24。將所得的質粒命名為pJfyS1579-35_2 (圖16)并用作受體以供插入胸苷激酶基因。單純皰疹病毒tk盒的來源是質粒pJfyS 1579-08-06 (實施例19)，通過用Bam HI 和Bgl II的消化將該插入物釋放。將消化產物通過使用TAE緩沖液的1 %瓊脂糖凝膠電泳分離，并將對應于2. 81ibtk基因插入物的片段切出，并使用MINELUTE Gel Extraction Kit進行瓊脂糖提取。將QUICKLIGATION  Kit用于將tk基因和連接于經小牛小腸磷酸酶處理的、經Bgl II-線性化的pJfyS1579-;35-02。所得的質粒命名為pJfyS1579-41_ll (圖 17)并將其用作起始點以供構建pyrG、amyA、alpA和dpsl缺失載體。實施例23 :pyrG缺失載體pJfyS1604-55_13的生成將鑲片鐮孢A3/5pyrG基因(DNA序列為SEQ ID NO  51而推導的氨基酸序列堿 SEQ ID NO 52)的 3，側翼序列使用 EXPAND  High Fidelity PCR System (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN, USA)和如下所示基因特異性正向和反向引物進行擴增。下劃線部分是引入用于克隆的Sbf I位點，而斜體部分是引入用于之后的消化以在轉化前去除質粒的pCR  2. 1部分的Not I位點。正向引物5，-aaaaaacctgcaggatcctgcgcggactcttgattattt-3' (SEQ ID NO :53)反向引物5' -aaaaaacctgcagggcggccgcaattccattcctgtagctgagtata-3' (SEQ ID NO :54)擴增反應物以50 μ 1的終體積含有125ng鑲片鐮孢A3/5基因組DNA，200 μ m dNTPs，0. 4μΜ 弓 I 物，含 5mM MgCl2 的 IX EXPAND  Buffer (RocheDiagnostics Corporation, Indianapolis, IN, USA)和 2. 5 單位 EXPAND  DNA 聚合酶 (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN， USA) 。
            
Γ ±| Jx jS ^   EPPENDORF  MASTERCYCLER 中溫育，程序為在95°C進行1個循環2分鐘，10 個循環，每個在94°C進行30秒，進行30秒，和72°C進行1分鐘；和20個循環，每個在 94°C進行30秒，54°C進行30秒，和72°C進行1分10秒。將PCR產物通過使用TAE緩沖液的瓊脂糖凝膠電泳分離，并將0. 71Λ片段切出并使用MINELUTE Gel Extraction Kit進行瓊脂糖提取。 將0. 7kb PCR產物用SbfI消化，并通過使用TAE緩沖液的1 %瓊脂糖凝膠電泳消化。將大約0. 7kb的片段從凝膠切出，并進一步使用Ultrafree -DA旋轉杯(spin cup)純化。將 0. 7kb 片段使用 QUICK LIGATI0N Kit 連接于 pJfyS1579-41-ll (其經 SbfI 消化并使用小牛小腸磷酸酶脫磷酸)，并將連接混合物用于依照生產商的實驗方案轉化大腸桿菌 SURE 化學感受態細胞。所得的質粒命名為pJfyS1604-35-13。將5，pyrG 側翼序列使用EXPAND  High Fidelity PCR System 和如下所示的基因特異性正向和反向引物來從pEmY23(實施例13)擴增。下劃線部分是引入用于克隆的Pme I位點而斜體部分是引入用于之后的消化以在真菌轉化前去除內酰胺酶基因的 Not I位點。正向引物5，-aaaaaagtttaaacgcggccgcctgttgcctttgggccaatcaatg-3' (SEQ ID NO :55)反向引物5，-aaaaaagtttaaacctagttggagtattgtttgttctt~3' (SEQ ID NO :56)擴增反應物含有20ng pEmY23,200ym dNTPs，0. 4 μ M 引物，含有 15mM MgCl2W IX EXPAND  Buffer 和 2. 5 單位EXPAND  DNA 聚合酶。將擴增反應物在EPPENDORF  MASTERCYCLER 中溫育，程序為在95°C 進行ι個循環2分鐘；10個循環，每個在94°C進行30秒，53°C進行30秒，和72°C進行40 秒；和20個循環，每個在94°C進行30秒，53°C進行30秒，和72°C進行40秒，并在每個后續循環中另外加上10秒。將PCR產物使用MINELUTE PCRPurification Kit(QIAGEN Inc. ,Valencia, CA, USA)純化。將純化的PCR產物用Riie I消化并通過使用TAE緩沖液的瓊脂糖凝膠電泳分離。將大約0. 51Λ的片段從凝膠切出，并使用MINELUTE Gel Extraction Kit 進行瓊脂糖提取。將0. 51Λ片段使用QUICKLIGATION  Kit連接于經Riie I消化和小牛小腸磷酸酶處理的pJfyS1604-35-13。連接反應物在20 μ 1反應體積中含有50ng載體，20ng 插入物，IX QUICK LIGATION  Reaction Buffer (New England Biolabs Inc. ,Ipswich,MA, USA)，和10單位Quick T4DNALigase0將反應物在室溫溫育5分鐘并將2 μ 1連接物用于依照生產商的指示轉化大腸桿菌SURE 化學感受態細胞。使用序列分析鑒定以所需取向含有插入的轉化體，并確證無PCR錯誤。所得的質粒命名為pJfyS1604-55-13(圖18)并用作 pyrG基因缺失盒。實施例M  Δ tri5 Δ pyrG鑲片鐮孢株JfyS1643-18_2的生成將依照實施例20中所述的方法用經Not I消化和經凝膠純化的pJfyS1604-55_13 轉化的鑲片鐮孢JfyS1604-17-2(Atri5)的五十一個推定轉化體用滅菌牙簽從轉化板轉移至含有補充了每ml 125 μ g潮霉素B和IOmM尿苷的VNO3RLMT培養基的新板，并在 M-28°C生長7日。然后對轉化體通過將栓轉移至兩個VNO3RLMT(—個含有或且一個不含尿苷(IOmM))中的每一個進行表型分析。將九個在不含尿苷的板上呈現無生長或不良生長的轉化體通過Southern分析進行分析。將來自9個轉化體中的每一個的基因組DNA如實施例21所述進行提取，并將每個的2 μ g用觀單位Mfe I和14單位Dra I消化。依照實施例21中所述的方法使用下述正向和反向引物生成了針對pyrG基因3’側翼序列的PCR探針正向引物5’ -GGATCATCATGACAGCGTCCGCAAC-3，(SEQ ID NO 57)反向引物5' -GGCATAGAAATCTGCAGCGCTCTCT-3，(SEQ ID NO 58)Southern分析表明9個尿苷自養型中的2個以單一拷貝攜帶所述缺失盒，而其余維持該盒的異位整合(ectopic integration)。將一個轉化體，鑲片鐮孢JfyS1604_85_5， 如實施例5中所述在含有IOmM尿苷的RA培養基中進行孢子形成，并將IO5個孢子鋪板于含有補充了 50 μ M FdU和0. ImM尿苷的VNO3RLMT培養基的150mm板。將所得的孢子分離物亞培養至含有補充了 10 μ M FdU和0. ImM尿苷的VNO3RLMT培養基的新板上，并隨后通過 Southern分析進行分析以確保從基因組的正確切出。經分析的株均正確地切出了所述盒，并將一個株，鑲片鐮孢JfyS1643-10_3，如前述段落中所述進行孢子形成。使用血細胞計數器確定孢子濃度，并將儲液稀釋至40個孢子 /ml的濃度。將一 ml鋪板于含有補充了 IOmM尿苷的VNO3RLMT培養基的150mm板。將所得的孢子集落亞培養至含有補充了 IOmM尿苷的VNO3RLMT培養基的新板上，并將一個孢子分離物，鑲片鐮孢JfyS1643-18-2(Atri5ApyrG)用作供缺失鑲片鐮孢α-淀粉酶A基因 (amyA)的株。實施例25 :amyA缺失載體pJfyS1604-17_2的生成為了獲得上游和下游側翼序列的信息以供完全去除鑲片鐮孢amyA基因(DNA 序列為SEQ ID NO :59而推導的氨基酸序列間SEQ ID NO 60)，使用了 GENOME WALKER  Universal Kit (Clonetech, Palo Alto, CA, USA)  對每個用該試劑盒生成的鑲片鐮孢A3/5 基因組DNA文庫使用如下所示的5’基因特異性引物和5’嵌套引物進行兩輪針對5’側翼序列的PCR。3’側翼序列使用如下所示的3’基因特異性引物和3’嵌套引物獲得。5’基因特異性引物5，-GAGGAATTGGATTTGGATGTGTGTGGAATA-3，(SEQ ID NO 61)5’嵌套引物5，-GGAGTCTTTGTTCCAATGTGCTCGTTGA-3，(SEQ ID NO 62)3’基因特異性引物5，-CTACACTAACGGTGAACCCGAGGTTCT-3，(SEQ ID NO 63)3，嵌套引物5' -GCGGCAAACTAATGGGTGGTCGAGTTT-3‘ (SEQ ID NO 64)初級PCR反應物在50 μ 1的反應體積中含有IX HERCULASE  ReactionBuffer, 2 μ 1每種基因組DNA文庫(如試劑盒中所述生成)，200ηΜ試劑盒提供的APl(接頭引物1)，200ηΜ基因特異性引物(見上)，200μΜ dNIPs和2.5單位 HERCULASE  DNA 聚合酶。初級擴增在EPPENDORF  MASTERCYCLER 中實施，程序為7個循環，
            
每個在94°C進行25秒，72°C進行3分鐘，和32個循環，每個在94°C進行25秒，和67°C進行 3分鐘以及在67°C進行1個循環7分鐘。次級PCR反應物在50 μ 1的反應體積中含有IX HERCULASE ReactionBuffer, 1 μ 1各初級PCR反應物，200ηΜ試劑盒提供的ΑΡ2 (接頭引物2、，200ηΜ基因特異性嵌套引物(見上)，200 μ M dNTPs和2. 5單位HERCULASE  DNA聚合酶。次級擴增在EPPENDORF  MASTERCYCLER 中實施，程序為5個循環，
            
每個在94°C進行25秒，和72°C進行3分鐘，以及20個循環，每個在94°C進行25秒和67V 進行3分鐘，以及在67°C進行1個循環7分鐘。將PCR產物通過使用TAE緩沖液的1 %瓊脂糖凝膠電泳分離。將大約0. 7kb的片段從凝膠切出，并使用MINIELUTE Gel Extraction Kit依照生產商的指示純化。將 PCR產物使用如上所述相應的嵌套引物和試劑盒提供的引物2直接進行測序。將獲得的序列用于設計引物以擴增amyA基因5’側翼序列的11Λ區和3’側翼序列的0. 7kb區以供插入空的缺失載體pJfyS1579-41-ll。將amyA3’側翼序列從鑲片鐮孢A3/5基因組DNA使用如下所示的正向和反向引物進行PCR擴增。正向引物5，-AAAAAAcctgcaggTAATGGGTGGTCGAGTTTAAAAGTA-3，(SEQ ID NO :65)反向引物5，-AAAAAAcctgcagggcggccgcTTTAAGCATCATTTTTGACTACGCAC-3，(SEQ ID NO :66)下劃線字母代表用于之后去除β -內酰胺酶的Not I位點，而斜體字母代表用于載體克隆的SbfI位點。擴增反應物含有IX HERCULASE  Reaction Buffer, 120ng 基因組 DNA 模板， 400nm引物，200 μ M dNTPs和2. 5單位HERCULASE  DNA聚合酶。將擴增反應物在 EPPENDORF MASTERCYCLER 中溫育，程序為在95°C進行1個循環2分鐘；10 個循環，每個在94°c進行30秒，55°C進行30秒，和72°C進行1分鐘；和20個循環，每個在 94°C進行30秒，55°C進行30秒，和72°C進行1分10秒。將PCR產物通過使用TAE緩沖液的1 %瓊脂糖凝膠電泳分離。將大約0. 7kb的片段從凝膠切出，并使用MINIELUTE Gel Extraction Kit進行瓊脂糖提取。用SbfI消化PCR片段以產生粘性末端。將該片段插入經SbfI-線性化、小牛小腸磷酸酶處理的通用缺失載體pJfyS1579-41-ll。連接反應物在20 μ 1的反應體積中含有80ng載體，80ng插入物，IX QUICK LIGATI0N Reaction Buffer 和 10 單位 Quick T4DNALigase。將 1· 5 μ 1 體積的連接反應物用于依照生產商的指示轉化100 μ 1大腸桿菌SURE 化學感受態細胞。使用用Eco RI的限制性分析和序列分析就插入物取向篩選克隆，鑒定出不含PCR錯誤的克隆。 該質粒命名為pJfyS1579-93-l (圖19)并用作5’ amyA側翼序列插入物的受體。使用下示的正向和反向引物PCR擴增5’ amyA側翼序列。下劃線的堿基代表用于bla基因去除的Not I位點，而其它小寫字母代表Riie I位點以確保所述片段是平端的 (blunt)以克隆入平端的載體位點。正向引物5 ‘ -AAAAAAgtttaaacGCGGCCGCTTGATTATGGGATGACCCCAGACAAGTGGT-3‘ (SEQ IDNO  67)反向引物5，-AAAAAAgtttaaacCCGCACGAGCGTGTTTCCTTTTCATCTCG-3，(SEQ ID NO :68)
            
PCR擴增與上述相似，只是循環參數不同。將擴增反應物在 EPPENDORF  MASTERCYCLER 中溫育，程序為在95°C進行1個循環2分鐘；10 個循環，每個在94°C進行30秒，55°C進行30秒，和72°C進行1分15秒；和20個循環，每個在94°C進行30秒，55°C進行30秒，和72°C進行1分15秒，并在每個后續的循環額外進行 10秒。PCR產物通過使用TAE緩沖液的瓊脂糖凝膠電泳分離。將大約11Λ的片段從凝膠切出，并使用MINIELUTE Gel Extraction Kit從凝膠純化。用Rne I消化該11Λ片段以產生平端，并將該插入物克隆入經Riie I-消化、經小牛小腸磷酸酶脫磷酸的 pJfyS1579-93-l。連接反應物在20 μ 1反應體積中含有75ng載體，IOOng插入物，1XQUICK LIGATION  Reaction Buffer 和 10 單位 Quick T4DNA Ligase0 在 5 分鐘的溫育之后， 將2μ 1連接反應物用于依照生產商的指示轉化100 μ 1大腸桿菌SURE 化學感受態細胞。使用序列分析確證插入物為正確的取向并不含PCR錯誤。鑒定所得的載體命名為 pJfyS1604-17-2(圖 20)。實施例洸Δ tri5 Δ pyrG Δ amyA鑲片鐮孢株JfyS1643-95_04的生成將依照實施例20中所述方法用經Not I消化和凝膠純化的pJfyS1604-17_02轉化的鑲片鐮孢JfyS1643-18-02(Atri5ApyrG)的五個推定的轉化體用滅菌牙簽從轉化板轉移至含有補充了每ml 125 μ g潮霉素B和IOmM尿苷的VNO3RLMT培養基的新板，并在 2448°C溫育7日。對于Southern分析，將2 μ g基因組DNA用25單位kp I消化。依照實施例21中所述方法使用如下所示的正向和反向引物生成針對amyA基因5’側翼序列的 DIG探針。正向引物5，-GGATCATCATGACAGCGTCCGCAAC-3，(SEQ ID NO 69)反向引物5' -GGCATAGAAATCTGCAGCGCTCTCT-3，(SEQ ID NO 70)Southern分析如實施例21中所述加以實施，其結果表明五個轉化體中的兩個用缺失盒的單獨整合物替代了編碼序列。將命名為鑲片鐮孢JfyS1643-73-02的初級轉化體如實施例5中所述進行孢子形成，并將IO5個孢子鋪板于含有補充了 50 μ M FdU和0. ImM尿苷的VNO3RLMT培養基的150mm直徑板。將獲得的孢子分離物亞培養至補充了 10 μ M FdU和 0. ImM尿苷的VNO3RLMT培養基的新板。對兩個鑲片鐮孢孢子分離物(JfyS1643-83_02和JfyS1643-83_04)進行一次孢子純化，得到株 JfyS1643-95-l 和 JfyS1643_95_2 (來自 JfyS1643-83_02)和 Jfys 1643-95-04(來自JfyS1643-83_04)。將從FdU板挑取的起始孢子分離物，以及其相應的一次孢子純化分離物通過Southern分析進行分析以確保從基因組的正確切出。所有分析的株正確地切出了該盒。將鑲片鐮孢JfyS1643-95-04(Atri5ApyrG Δ amyA)用作用于缺失鑲片鐮孢堿性蛋白酶A基因(alpA)的株。實施例27 構建質粒pEJG69將Microdochium nivale 乳糖氧化酶(LOx)基因(DNA 序列為 SEQ ID NO 71 而推導的氨基酸序列為 SEQ ID NO  72)從 pEJG33 (Xu 等，2001，European Journal ofBiochemistry 268 :1136-1142)使用如下所示的正向和反向引物進行PCR擴增。正向引物5' -CCCGCATGCGTTCTGCATTTATCTTG-3‘ (SEQ ID NO 73)反向引物5' -GGGTTAATTAATTATTTGACAGGGCG-3‘ (SEQ ID NO 74)下劃線部分代表引入用于克隆的sphl (正向)或I^c 1(反向)位點。PCR 在 50μ 1 的終體積中含有 200μΜ dNTPs，1 μ M 每種引物，50ngpEJG33，IX Pwo 緩沖液(Promega, Madison, WI, USA)禾口 1 μ 1 的 Pwo Hot StartPolymerase (Promega, Madison, WI, USA)。將擴增反應物在ROBOCYCLER 中溫育，程序為在95°C進行1個循環2分鐘； 10個循環，每個在95°C進行30秒，55°C進行45秒，和72°C進行1分鐘；20個循環，每個在 95°C進行30秒，55°C進行45秒，和72°C進行1分鐘，在每個后續循環中另外進行20秒延伸；和在50°C進行1個循環10分鐘。將PCR產物通過使用TAE緩沖液的1 %瓊脂糖凝膠電泳分離。將大約1. 5kb的片段從凝膠切出，并使用QIAQUICK Gel Extraction Kit進行瓊脂糖提取。使用相同的條件重新擴增乳糖氧化酶基因，并如上所述進行純化，只是將聚合酶和緩沖液分別用iTaq DNA聚合酶和I1aq DNA Polymerase Buffer替代，并用經凝膠純化的上述PCR產物作為模板。將PCR產物使用TOPO  TACloning Kit克隆入pCR  2. 1以確保無PCR錯誤。將所得的無錯誤質粒用SphI消化，用T4DNA聚合酶(New England Biolabs Inc. ,Ipswich，MA，USA)處理，使用QIAQUICK Nucleotide Removal Kit(QIAGEN Inc., Valencia, CA, USA)純化，并用I^c I消化。將該片段在TAE緩沖液中通過瓊脂糖凝膠電泳純化，并將大約1. 5kb的片段從凝膠切出，并使用QIAQUICK  Gel ExtractionKit 進行瓊脂糖提取。將質粒pEJG61用Bsp LUllI消化，依照生產商的指示用Klenow DNA聚合酶(New England Biolabs Inc.，Ipswich, MA, USA)處理，然后用Pac I消化。將消化的質粒在 TAE緩沖液中通過1 %瓊脂糖凝膠電泳純化，并將81Λ片段切出，并使用QIAQUICK  Gel Extraction Kit將其進行瓊脂糖提取。將Lox編碼序列使用T4DNA Ligase依照生產商的指示連接于Bsp LUllI-和Pac I-消化的PEJG61。通過序列分析篩選質粒以確保不含PCR錯誤，并鑒定了一個所得的質粒， 將其命名為pEJG69(圖21)。實施例28 構建質粒pEJG65將質粒pEJG61 (實施例4)用Bsp LUllI消化，用Klenow DNA聚合酶處理并用Pac I消化。將消化的質粒在TAE緩沖液中通過1 %瓊脂糖凝膠電泳分離，并將8. Ikb片段切出， 并使用QIAQUICK Gel Extraction Kit從瓊脂糖純化。將南極假絲酵母(Candida antarctica)脂肪酶編碼序列(DNA序列為SEQID NO  75而推導的氨基酸序列為SEQ ID NO 76)從pMT12^(W0 94/01541)使用如下所示的正向和反向引物進行PCR擴增。正向引物5' -GCATGCGAGTGTCCTTGCGC-3，(SEQ ID NO 77)
            
反向引物5，-TTAATTAACTAAGGTGGTGTGATG-3，(SEQ ID NO 78)PCR 反應物含有 200 μ M dNTPs, 1 μ M 每種弓| 物，20ng pMT1229, IXPwo 緩沖液 (Promega, Madison, WI, USA),禾口 1 μ 1 Pwo Hot Start Polymerase (Promega, Madison, WI, USA)。將擴增反應物在ROBOCYCLER 中溫育，其程序為在94°C進行1個循環2分鐘；10個循環，每個在94°c進行30秒，55°C進行45秒，和72°C進行1分鐘；17個循環，每個在94°C進行30秒，55°C進行45秒，和72°C進行1分鐘，在每個后續循環中另行進行20秒的延伸；以及在72°C進行1個循環10分鐘。將PCR產物在TAE緩沖液中通過1 %瓊脂糖凝膠電泳分離，并將1. 4kb片段接觸， 并使用QIAQUICK Gel Extraction Kit進行瓊脂糖提取。將PCR片段使用TOPO  TA Cloning Kit克隆入pCR  2. 1以驗證不含PCR錯誤。由于該基因編碼序列中內部Sph I位點的存在，將南極假絲酵母脂肪酶A編碼序列從pCR 2. 1作為兩個不同的片段通過分別消化來釋放。為了釋放第一片段(11Λ)，將質粒用Sph I消化并用T4DNA聚合酶處理。將該聚合酶在75°C熱失活10分鐘，并用Nhe I消化質粒。將第二片段(0. 4kb)用Nhel/Pac I消化從質粒釋放。對兩個消化物進行TAE緩沖液中的瓊脂糖凝膠電泳并將來自Sph I/Nhe I消化的11Λ片段和來自Nhe I/Pac I消化的0.41Λ片段切出，并使用QIAQUICK (}el Extraction Kit進行瓊脂糖純化。將兩個片段使用jM DNA連接酶連接于消化的pEJG61。連接反應物含有IX LigationBuffer (New England Biolabs Inc.，Ipswich，MA，USA)，IOOng 上述 Ikb 片段，50ng 0. 4kb 片段，50ng 消化的PEJG61和10單位T4DNA連接酶。將反應物在室溫溫育16小時，并用其依照生產商的指示轉化大腸桿菌XLIO-GOLD  Ultra-感受態細胞。通過序列分析篩選轉化體，并鑒定了一個含有具有所需無錯誤編碼序列的質粒的克隆，并命名為PEJG65(圖22)。實施例29 構建質粒pMStrl9通過將來自pA2W!lO(WO 1998Λ6057)的尖鐮孢磷脂酶基因克隆入鑲片鐮孢表達載體pDM181(W0 2000/56900)來構建質粒pMStrl9。使用PCR擴增來分離方便DNA片段上
            
的磷脂酶基因。尖鐮孢磷脂酶基因具體是使用標準擴增條件用Pwo DNA聚合酶(Roche Molecular Biochemicals,Basel, Switzerland)和45°C的退火溫度用如下所示的引物從pA2PhlO擴增的。PLMStrlO 5，-TCAGATTTAAATATGCTTCTTCTACCACTCC-3‘ (SEQ ID NO 79)SwaIPLMStrll 5，-AGTCTTAATTAAAGCTAGTGAATGAAAT-3，(SEQ ID NO 80)將所得的DNA片段凝膠純化，并用Swa I消化。還用Swa I消化質粒pDM181，并將其脫磷酸。然后將DNA片段連接在一起以產生質粒pMMrlS。將在兩個使用連接混合物生成的單獨的大腸桿菌pMStrlS轉化體，#4和#17中的磷脂酶基因使用標準引物步移方法測序。兩者都在基因中的不同位置獲得了單一的點突變。突變由Nar I位點分隔，所述Nar I切割pMMrlS兩次。因此通過如下將不含錯誤的磷脂酶基因裝配在鐮孢屬表達載體PDM181中用Nar I消化pMMrl8#4和pMMrl8#17，分離不含錯誤的片段，并將其連接在一起以產生PMMr 19 (圖23)。使用標準方法確證了 pMStrl9 中的磷脂酶序列。 實施例30 構建質粒pEJG49鑲片鐮孢表達載體pEJG49是通過修飾pSheBl (W0 2000/56900)生成的。所述修飾包括(a)通過定點誘變去除一個pSheBl序列內的Bsp LUllI位點；(b)去除850bp的尖鐮孢胰蛋白酶啟動子；(c)通過接頭連接引入Bsp LUllI位點以助于插入21Λ鑲片鐮孢葡糖淀粉酶啟動子；和(d)引入尖鐮孢磷脂酶基因。pSheBl 序列之內 Bsp LUllI 位點的去除是使用 QUIKCHANGE Site-Directed Mutagenesis Kit依照生產商的指示用下述誘變引物對完成的。5' -GCAGGAAAGAACAAGTGAGCAAAAGGC-3‘ (SEQ ID NO 81)5' -GCCTTTTGCTCACTTGTTCTTTCCTGC-3‘ (SEQ ID NO 82)這產生了 pSheBl中間物1。930bp的尖鐮孢胰蛋白酶啟動子的去除是通過如下完成的用Mu I和I^cI消化pSheBl中間物1 (6，971bp)，對消化物進行使用TBE緩沖液的1 %瓊脂糖凝膠電泳，切出 6，040bp的載體片段，并用QIAQUICK Gel Extraction Kit純化切出的片段。為了引入新的Bsp LUllI位點，使用下述引物產生了接頭5' -dCCTACATGTTTAAT-3’ (SEQ ID NO :83)Bsp LullI5' -dTAAACATGTAGG-3' (SEQ ID NO :84)將每個引物(每個2 μ g)在70°C加熱10分鐘，然后經過1小時冷卻至室溫。將該接頭連接入經Mu I-Pac I-消化的pSheBl中間物1載體片段，產生pSheBl中間物2。然后將載體PSheBI中間物2用Bsp LullI和I^c I消化。將消化的載體在TBE緩沖液中通過瓊脂糖凝膠電泳純化，從凝膠切出，并使用QIAQUICK Gel Extraction Kit進行瓊脂糖提取。尖鐮孢磷脂酶基因片段還通過PCR使用pMSTR19作為模板來生成。使用下述PCR 引物在該基因的5’端引入Sph I位點而在3’端引入I^c I位點5' -GGGGGCATGCTTCTTCTACCACTCC-3‘ (SEQ ID NO 85)Sph I5' -GGGGTTAATTAAGAGCGGGCCTGGTTA-3‘ (SEQ ID NO 86)Pac I實施PCR和純化的條件如上所述。將磷脂酶基因片段依照生產商的指示克隆入 pCR -TOPO 。然后將pCR -TOPO ·磷脂酶克隆用Sph I消化并用T4DNA聚合酶處理以去除突出的3'端。使用QIAQUICK NuCle0tideRem0Val Kit純化片段，并用I3ac I 消化。將消化物在TBE緩沖液中通過1 %瓊脂糖凝膠電泳純化，并將11Λ條帶從凝膠切出并使用QIAQUICK  GelExtraction Kit 純化。將質粒pShebl中間物2 (見上)用Mu I和Bsp LullI消化，并使用QIAQUICK  Nucleotide Removal Kit純化。然后將片段連接于2kb Stu I-BspLullI鑲片鐮孢葡糖淀粉酶啟動子片段(W0 2000/056900)。該載體，稱作pShebl中間物3，用Bsp LullI消化，用Klenow片段處理以填充5 ‘懸突(overhang)，用I^ac I消化，并使用QIAQUICK  Nucleotide Removal Kit純化。然后將該片段連接于Sph I，平端I^ac I尖鐮孢磷脂酶片段(如上所述)。所得的質粒，命名為PEJG49(圖，攜帶在鑲片鐮孢葡糖淀粉酶啟動子的轉錄調控之下的磷脂酶報道基因。實施例31 構建質粒pEmY15使用定點誘變從表達質粒pEJG49去除Eco RI和Not I限制位點各一個，并使得這些在雙丙氨膦(bialaphos)抗性標記(bar基因)側翼的限制位點唯一。誘變是使用如下所示的正向和反向引物和QUIKCHANGE  Site-DirectedMutagenesis Kit來完成的。正向引物5' -cctgcatggccgcCgccgcCaattcttacaaaccttcaacagtgg-3‘ (SEQ ID NO 87)反向引物5' -ccactgttgaaggtttgtaagaattGgcggcGgcggccatgcagg-3‘ (SEQ ID NO 88)大寫字母表示所需的變化，而所得的質粒命名為pEmY15(圖25)。實施例32 構建質粒pEmYM為了用鑲片鐮孢pyrG基因替代表達質粒pEmY15中的bar基因，進行了下述實驗方案。將質粒pEmY15用Eco RI和Not I消化，并在TAE緩沖液中通過1 %瓊脂糖凝膠電泳純化。將7. 11Λ片段切出，并使用QIAQUICK GelEXtracti0n Kit進行瓊脂糖提取。將pyrG基因的2. 3kb片段從pDM156. 2使用如下所示的正向和反向引物進行PCR 擴增。正向引物5，-ATAAGAATgcggccgcTCCAAGGAATAGAATCACT-3，(SEQ ID NO :89)反向引物5，-CGgaattcTGTCGTCGAATACTAAC-3，(SEQ ID NO :90)粗體序列對應于引入分別用于正向和反向引物的Not I位點和Eco RI位點。擴增反應物由在50 μ 1 的終體積中的 IX ThermoPol Buffer, 200 μ M dNTPs, 31ng PDM156. 2，1 μ M每種引物和1單位VENT  DNA聚合酶組成。將反應物在EPPENDORF MASTERCYCLER 中溫育，其程序為在95°C進行ι個循環3分鐘；30個循環，每個在95°C進行30秒，55 °C進行1分鐘；和72°C進行3分鐘；并在72°C進行1個循環7分鐘。將PCR產物在TAE緩沖液中通過1 %瓊脂糖凝膠電泳分離，并將2. 3kb片段切出并使用MINELUTE Gel Extraction Kit進行瓊脂糖提取。然后將該片段用Eco RI和 Not I消化，并將消化反應物使用MINELUTE Reacti0nCleanup Kit純化。將片段使用 T4DNA連接酶依照生產商的指示連接于經Not I/Eco RI消化的pEmY15。將連接混合物依照生產商的指示轉化入大腸桿菌XLl-Blue亞克隆級感受態細胞(Stratagene，La Jolla, CA, USA)。對轉化體進行測序以確保不含PCR錯誤，并鑒定了含有無錯誤pyrG片段的質粒。 所得的質粒命名為PEmYM (圖26)。實施例33 構建質粒pDM257將質粒pEmYM (實施例32)用Af 1 II和Sna BI消化。將6. 5kb片段在TAE緩沖液中通過瓊脂糖凝膠電泳純化，從凝膠切出，并使用QIAQUICK Gel Extraction Kit進行瓊脂糖提取。將質粒PEJG65用Afl II和Sna BI消化。將3. 3kb片段在TAE緩沖液中通過1 %瓊脂糖凝膠電泳純化，從凝膠切出，并使用QIAQUICK  Gel Extraction Kit進行瓊脂糖提取。將兩個片段使用T4DNA連接酶依照生產商的指示連接在一起。將連接混合物依照生產商的指示轉化入大腸桿菌XLl-Blue亞克隆級感受態細胞。通過序列分析篩選轉化體， 并鑒定了含有具有所需片段的質粒的克隆。將所得的質粒命名為pDM257(圖27)。實施例34 構建質粒pDM258將質粒pDM257用ka I and Afl II消化并在TAE緩沖液中通過瓊脂糖凝膠電泳純化，并將4. Ikb片段從凝膠切出，并使用QIAQUICK  GelExtraction Kit進行瓊脂糖提取。還將質粒pEJG69用 a I和Afl II消化，并在TAE緩沖液中通過瓊脂糖凝膠電泳純化，并將5. Skb片段從凝膠切出，并如上所述進行瓊脂糖提取。將兩個片段使用T4DNA連接酶依照生產商的指示連接在一起。將連接混合物依照生產商的指示轉化入大腸桿菌XLl-Blue亞克隆級感受態細胞。通過序列分析篩選轉化體， 并鑒定了所需的質粒，并命名為pDM258(圖28)。實施例35 在鑲片鐮孢株JfyS1643-95_04中表達乳糖氧化酶。鑲片鐮孢JfyS1643-95_04 ( Δ tri5 Δ pyrG Δ amyA)的原生質體如實施例5中所述生成。然后將該原生質體依照實施例20中所述的方法用攜帶Microdochium nivale乳糖氧化酶表達載體的PDM258轉化，以評價鑲片鐮孢JfyS1643-95-04株的表達潛力。將轉化體如實施例21中所述在搖瓶中生長，只是所述燒瓶在以200rpm振蕩溫育5日。使用與BIOMEK 3000 (Beckman Coulter, Inc, Fullerton, CA, USA) 一同的活性測定法對搖瓶培養液測定乳糖氧化酶活性。該乳糖氧化酶測定法是Glucose Oxidase Assay Procedure (K-Glox) (Megazyme，Wicklow，Ireland)的修飾版本。將培養上清適當地在0. IM MOPS緩沖液pH 7.0(樣品緩沖液)中稀釋，然后對稀釋樣品進行從0倍至1/3倍至1/9倍的系列稀釋。將乳糖氧化酶標樣(Novozymes A/S,Bagsvaerd,Denmark)使用兩倍逐步稀釋，在樣品緩沖液中的濃度以0. 056mg/ml開始以0. 007mg/ml結束。將包括標樣的總共20 μ 1的每個稀釋物轉移至96孔平底板。將一百微升POD溶液(Peroxidase，4ΑΑ，在磷酸鉀緩沖液PH 7加對羥基苯甲酸和疊氮化鈉中的穩定劑)添加至每孔然后添加100 μ 1 葡萄糖底物(樣品緩沖液中0. 5Μ葡萄糖)。反應速率在環境溫度(大約)在510nm 測量總共10分鐘。樣品濃度通過從使用乳糖氧化酶作為標樣生成的標準曲線外推來確定。 選擇產量最高的乳糖氧化酶轉化體在2升發酵罐中進行生長和分析。發酵培養基(pH 6)由每升20g大豆粉，20g蔗糖，2. Og MgSO4 · 7H20, 2. Og無水 KH2PO4, 2. Og K2SO4, 5. Og (NH4) 2S04，1. Og 檸檬酸，0. 5ml 的 200X AMG 痕量金屬溶液(不含鎳) 和0. 5ml ^pluronic acid及20%麥芽糖補料(feed)組成。發酵在四.0+/-1. 0°C,1200rpm 和l.Ovvm通氣下進行，其中％ DO維持在30%以上。對發酵液使用 Alpha-Amylase Assay Kit (Megazyme International Ireland Ltd. ,fficklow, Ireland)連同BIOMEK  3000 和BIOMEK  NX (Beckman Coulter, Inc, Fullerton CA,USA)進行α -淀粉酶活性的測定。如上所述對發酵液測定乳糖氧化酶活性。所得的轉化體鑲片鐮孢JfyS1643-95_04，在2升發酵罐中具有與無缺失的其它鑲片鐮孢轉化體等同的乳糖氧化酶產生水平(圖四)，表明amyA基因的缺失并不對異源蛋白質產生具有不利作用。然而該缺失確實消除了該株和該種系所有后續株在培養液中的 α-淀粉酶活性(圖30)。由于該轉化體與現有的生產株具有等同的外源蛋白質產生能力， 并在發酵過程中減少了 α -淀粉酶水平，選取鑲片鐮孢JfyS1643-95-04宿主株用于缺失堿性蛋白酶A基因(alpA)。實施例36 鑲片鐮孢堿性蛋白酶A(alpA)缺失載體pJfyS1698-72_10的生成用于完全去除鑲片鐮孢A3/5堿性蛋白酶A(alpA)基因的上游側翼序列(DNA序列為 SEQ ID NO :91 而推導的氨基酸序列為 SEQ ID NO 92)使用 GENOME WALKER  Universal Kit獲得。將每個用該試劑盒生成的文庫使用如下所示的5’基因特異性引物和5’嵌套引物進行針對5’側翼序列的兩輪PCR。5’基因特異性引物5，-GAGGAATTGGATTTGGATGTGTGTGGAATA-3，(SEQ ID NO 93)5’嵌套引物5，-GGAGTCTTTGTTCCAATGTGCTCGTTGA-3，(SEQ ID NO 94)序列信息是從從PCR產物使用BD GENOME WALKER  Universal Kit中提供的 Nested Adaptor I^rimer和上述5’嵌套引物獲得的。將獲得的序列用于設計引物以擴增 5’ alpA側翼序列的11Λ區域以供插入空的缺失載體pJfyS1579-41_ll。將alpA 5’側翼序列從鑲片鐮孢A3/5基因組DNA使用如下所示的區域特異性正向和反向引物進行PCR擴增。下劃線字母代表用于之后去除載體的pCR  2. 1部分的Not I位點，而斜體字母代表用于載體克隆的Asc I位點。正向引物5，-aaaaaaggcgcgccKCKgccKcGTTACGGTGTTCAAGTACATCTTACA-S' (SEQ ID NO :95)反向引物5' -aaaaaaggcgcgccATTGCTATCATCAACTGCCTTTCTT-3，(SEQ ID NO :96)擴增反應物含有IX HERCULASE  Reaction Buffer, 120ng 基因組 DNA，400nm 引物，200 μ M dNTPs 和 2. 5 單位HERCULASE  DNA 聚合酶。將擴增反應物在EPPENDORF  MASTERCYCLER 中溫育，程序為在95°C 進行ι個循環2分鐘；20個循環，每個在94°C進行30秒，56°C進行30秒，和72°C進行1分 10秒；和在72°C進行1個循環7分鐘。將擴增反應物的5μ 1部分通過使用TAE緩沖液的瓊脂糖凝膠電泳顯影以確保該反應產生了所需的11Λ條帶。然后將該插入物從所述擴增反應物依照生產商的指示使用TOPO TA Cloning Kit直接克隆入pCR 2.1 TOPO 。通過用Eco RI的限制性分析篩選轉化體以確保插入物的存在，并合并了 5個正確的制備物。通過用Asc I消化將該插入物從pCR 2.1釋放，并如上所述通過瓊脂糖凝膠電泳純化片段。將該插入物使用QUICK LIGATION  Kit克隆入經Asc I-線性化的pJfyS1579-41_ll，并使用連接混合物依照生產商的實驗方案轉化大腸桿菌SURE 化學感受態細胞。通過序列分析篩選轉化體以確保不含PCR錯誤。一個含有側翼序列而無錯誤的質粒命名為pJfyS1698-65-15(圖31)并用于插入3’側翼序列。將alpA基因的3’側翼序列從鑲片鐮孢A3/5基因組DNA使用如下所示的區域特異性正向和反向引物進行擴增。下劃線字母代表供之后去除β內酰胺酶的Not I位點，而斜體字母代表用于載體克隆的Sbf I位點。正向引物5，-aaaaacctgcaggGGATGTGTGTGGAATAGGATATG-3，(SEQ ID NO :97)反向引物5，-aaaaacctgcagggcggccgcCCTCAAGGTGGAGAAATAATCTGT-3，(SEQ ID NO :98)PCR 反應物含有 IX HERCULASE  Reaction Buffer, 120ng 基因組 DNA 模板， 400nm 引物，200 μ M dNTPs 和 2. 5 單位HERCULASE  DNA 聚合酶。將擴增反應物在EPPENDORF  MASTERCYCLER 中溫育，程序為在95°C 進行ι個循環2分鐘；20個循環，每個在94°C進行30秒，56°C進行30秒，和72°C進行1分 10秒；和在72°C進行1個循環7分鐘。將擴增反應物的5 μ 1部分通過使用TAE緩沖液的1 %瓊脂糖凝膠電泳顯影以確保該反應產生了所需的11Λ條帶。然后將該直接來自PCR反應的插入從所述擴增反應物使用 TOPO TA Cloning Kit克隆入pCR 2.1 TOPO 。對所得的質粒進行測序以鑒定含有正確序列的菌落。然后通過Sbf I消化將該片段從該質粒釋放，并在TAE緩沖液中通過瓊脂糖凝膠電泳純化。將11Λ條帶切出并使用MINELUTE Gel Extraction Kit進行瓊脂糖提取。然后將該片段使用QUICK LIGATION  Kit連接于經Sbf I線性化的 pJfyS1698-65-15(經小牛小腸磷酸酶處理)，并使用該連接混合物依照生產商的指示轉化大腸桿菌SURE 化學感受態細胞。通過用Not I的限制性分析篩選轉化體以確保片段以正確的取向插入，并進行測序以確保沒有偏離預計的序列。將所得的質粒 pJfyS1698-72-10(圖 32)用于缺失 alpA 基因。實施例37  Atri5ApyrG Δ amyA Δ alpA 鑲片鐮孢株 JfyS1763-ll_01 的生成將依照實施例20中所述方法用經Not I-消化和凝膠純化的pJfyS1698-72_10轉化的鑲片鐮孢JfyS1643-95_04 ( Δ tri5 Δ pyrG Δ amyA)(實施例26)的三個轉化體用滅菌牙簽從轉化板轉移至含有補充了每ml 125 μ g潮霉素B和IOmM尿苷的VNO3RLMT培養基的新板，并在室溫溫育7日。對于Southern分析，將來自3個轉化體每一個的2 μ g鑲片鐮孢基因組DNA用34單位Sph I消化。根據實施例21中所述方法使用如下所示的正向和反向引物生成針對apl4基因5’側翼序列的DIG探針。正向引物5' -GCACGTTAGGCTCAAGCCAGCAAGG-3‘ (SEQ ID NO 99)反向引物5' -GAGGCTCATGGATGTGGCGTTAATG-3‘ (SEQIDN0:100)如實施例21中所述實施的Southern分析表明三個轉化體之一含有缺失盒在alpA 基因位點的單一拷貝，并將該轉化體命名為JfyS1698-83-2。將鑲片鐮孢JfyS1698-83_2如實施例5所述進行孢子形成，并將IO5個孢子鋪板于含有補充了 50 μ M FdU和0. ImM尿苷的VNO3RLMT培養基的150mm直徑板。將所得的孢子分離物亞培養至含有補充了 10 μ M FdU和0. ImM尿苷的VNO3RLMT培養基的新板。將所得的孢子分離物如實施例21中所述通過Southern分析進行分析，并鑒定了一個正確地切出盒
            
55的孢子分離物。該分離物命名為鑲片鐮孢JfyS1698-94-04。將鑲片鐮孢JfyS1698-94_04 如實施例21中所述進行一次孢子純化，并挑取一個孢子分離物，并命名為鑲片鐮孢 JfyS1763-ll-01 ( Δ tri5 Δ pyrG AamyAAalpA)。如實施例5和20中所述生成并用pDM258轉化鑲片鐮孢JfyS1763-ll_01的原生質體。將轉化體如實施例35中所述進行分析，并測定發酵液的堿性蛋白酶活性。將 PROTAZYME AK 片(Megazyme，Wicklow，Ireland)通過輕柔地攪拌懸于 2. Oml 0. 01% TRITON  X-100中。將五百微升該懸液和500 μ 1補充了PROTAZYME  AK片的測定緩沖液在EPPENDORF 管中混合并置于冰上。添加了二十微克的蛋白酶樣品(稀釋于0. 01%TRITON X-100)。該測定通過將該EPPENDORF 管轉移至設定為測定溫度 EPPENDORF 熱混合器而起始。將管在EPPENDORF 熱混合器上以1300rpm溫育 15分鐘。該溫育通過將管轉移回冰浴而停止。然后將管在冰冷的離心機中以16，OOOxg離心幾分鐘，并將200 μ 1上清轉移至微滴定板。讀取在650nm的吸光度作為蛋白酶活性的量度。如amyA缺失，alpA基因的缺失不對乳糖氧化酶表達具有有利影響。然而，在發酵上清中堿性蛋白酶的副活性減少了 10倍(圖33)。實施例38 :dpsl缺失載體pJfySlll的生成將鑲片鐮孢縮酚酸肽(cbpsip印tide)合酶(dpsl)基因的3’側翼序列(DNA序列為SEQ ID NO :101而推導的氨基酸序列為SEQ ID NO :102)從鑲片鐮孢JfyS1763-ll_01基因組DNA使用如下所示的正向和反向引物進行PCR擴增。引物中的下劃線部分代表引入用于克隆的Sbf I位點，而斜體部分對應于引入用于之后去除β-內酰胺酶的Not I位點。使用DNEASY  Plant Maxi Kit 提取基因組 DNA。正向引物5' -GACTAAGCCCTGCAGGTTGGTCTCAATCGTCGCGACAG-3' (SEQ ID NO :103)反向引物5' -AGTCTACCCCTGCAGGCGGCCGCTGGCATCGGTGGACGTAACACGC-3' (SEQ ID NO  104)擴增反應物以50 μ 1 的終體積含有 IX HERCULASE  Reaction Buffer, 400nM 每種引物，200μΜ dNTP，IOOng基因組DNA和1. 5單位HERCULASE  DNA聚合酶。將擴增反應物在EPPENDORF MASTERCYCLER 中溫育，程序為在95°C進行1個循環2分鐘；25個循環，每個在95°C進行30秒，57°C進行30秒，和72°C進行1分20秒；和在 72 °C進行1個循環7分鐘。擴增反應物使用MINELUTE PCR Purification Kit純化。然后用^f I消化純化的反應物并對其進行使用TAE緩沖液的1 %瓊脂糖凝膠電泳。將11Λ條帶從凝膠切出， 并使用MINELUTE Gel Extraction Kit進行瓊脂糖提取。然后將消化的載體依照生產商建議的實驗方案使用QUICK LIGATION  Kit連接于經SbfI-消化的pJfyS1579-41_ll (實施例2  (其經小牛小腸磷酸酶脫磷酸)。通過用Eco RI的限制分析(以檢查插入的存在和取向)和序列分析(以確保不含PCR錯誤)分析所得的克隆，并將所得質粒命名為 pJfyS1879-32-2(圖 34)。為了獲得dpsl基因5’端的側翼序列，如實施例36中所述使用GEN0MEWALKER  Universal Kit及如下所示的基因特異性引物和基因特異性嵌套引物。
            
基因特異性引物5' -GCTATTGAGGGGACTATCTCCATGACTACA-3，(SEQ ID NO :105)基因特異性嵌套引物5' -GCCTACCATCGACAGCAGTAAGATATTCC-3，(SEQ ID NO :106)將5’ dpsl側翼序列從鑲片鐮孢JfyS1763-ll_l基因組DNA使用如下所示的正向和反向引物進行擴增。正向引物中的下劃線部分代表引入用于克隆的Asc I位點而斜體部分對應于引入用于之后β-內酰胺酶去除的Not I位點。擴增反應和循環參數與上述的那些相同，只是使用的引物是下述那些，所用的退火溫度是53°C，而延伸時間為1分15秒。正向引物5，-ATGTGCTACAGGCGCGCC GCGGCCGCGAGTTCCAACATGTCTTATTATCC-3，(SEQ ID NO  107)反向引物5，-TACTGTACCGGCGCGCCATCTGAGCCAAGAGACTCATTCAT-3，(SEQ ID NO :108)PCR 反應物使用MINELUTE PCR Purification Kit 純化。用 Asc I 消化純化的反應物，并對其進行使用TAE緩沖液的1 %瓊脂糖凝膠電泳。將0. 7kb條帶從凝膠切出，并如上所述進行瓊脂糖提取。將0.71Λ條帶使用QUICKLIGATION  Kit連接于 pJfyS1879-32-2(經Asc I消化而經小牛小腸磷酸酶脫磷酸)。對所得的克隆通過序列分析加以分析以確保不含PCR錯誤，并將所得的質粒命名為pJfySlll (圖35)并用于缺失鑲片鐮孢dpsl基因。實施例39  Δ tri5 Δ pyrG Δ amyA Δ alpA Δ dpsl 鑲片鐮孢株 JfyS1879-57-01 的生成當依照實施例20中所述的方法用經Not I消化的和凝膠純化的pJfySl 11轉化鑲片鐮孢JfyS1763-ll-01原生質體時，獲得了 77個轉化體。將其中48個用滅菌牙簽從轉化板轉移至含有補充了每ml 125 μ g潮霉素B和IOmM尿苷的VNO3RLMT培養基的新板，并在
            
室溫溫育7日。真菌生物質是通過用如實施例21中所述獲得的來自7日轉化體的四個瓊脂栓接種25ml補充了 IOmM尿苷的M400培養基來產生的。將培養物在以150rpm振蕩溫育3 日。去除瓊脂栓，并將培養物經過MIRACL0TH 過濾。將收獲的生物質用液氮凍結，并使用研缽和杵磨碎菌絲體。使用DNEASY  Plant Maxi Kit依照生產商的指示分離基因組DNA，只是在 65°C的裂解溫育期從10分鐘延伸至1. 5小時。將兩μ g基因組DNA用Nco I和Spe I各28單位在50 μ 1反應體積中在37°C消化22小時。在TAE緩沖液中對消化物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳。在凝膠中將DNA通過用 0. 25M HCl 處理進行片段化，用 1. 5M NaCl-O. 5MNa0H 變性，用 1. 5M NaCl-IM Tris pH 8 中和，然后在 20X SSC 中使用 TURBOBLOTTER  Kit 轉移至NYTRAN  Supercharge 尼龍膜。 將DNA使用UV STRATALINKER  UV交聯至膜，并在42°C在20mlDIG Easy Hyb中預雜交1小時。依照實施例21中所述的方法使用如下所示的正向和反向引物生成針對dpsl基因 3’側翼序列的DIG探針。
            
正向引物5' -CTTGACTATTATCTCACGTTGTCAG-3‘ (SEQ ID NO :109)反向引物5' -TCAAGTGTTGTGTAATGTTGGAACA-3‘ (SEQ ID NO 110)如實施例21中所述實施的Southern分析表明獲得的8個轉化體中的三個在dpsl 位點含有單一拷貝的缺失片段。將一個命名為鑲片鐮孢JfyS1879-43-05。將鑲片鐮孢JfyS1879-43_05如實施例5所述進行孢子形成，并將IO5個孢子鋪板于含有補充了 50 μ M FdU和0. ImM尿苷的VNO3RLMT培養基的150mm直徑板。將所得的孢子分離物亞培養至含有補充了 50 μ M FdU和0. ImM尿苷的VNO3RLMT培養基的新板。將所得的孢子分離物如實施例21中所述通過Southern分析進行分析，并鑒定了一個正確地切出盒的孢子分離物。該分離物命名為鑲片鐮孢JfyS1879-52-3。將鑲片鐮孢JfyS1879-52_03 如實施例21中所述進行一次孢子純化，并挑取一個孢子分離物，并命名為鑲片鐮孢JfySlS 79-57-01(Δtri5ΔpyrGΔamyAΔalpAΔdpsl)。實施例40 構建里氏木霉hemA缺失載體pJfyS120為了缺失里氏木霉氨基-Y -酮戊酸合酶基因，將3’ hemA側翼序列從里氏木霉 RutC30基因組DNA使用如下所示的正向和反向引物進行PCR擴增。引物中的下劃線部分代表引入用于克隆的Sbf I位點而粗體部分對應于引入用于之后去除β-內酰胺酶的Not I 位點。正向引物(#064877)5' -TATAGCGTACCTGCAGGTGTCATGCCCGCGGCTTTGCCTTGA-3' (SEQIDN0:111)反向引物(#064878)5 ‘ -ATGCTGTACCTGCAGGCGGCCGCCGCTCCCGATCATCATCCCTCCGAG-3 ‘ (SEQ ID NO  112)擴增反應物由IX HERCULASE  Reaction Buffer，400nM 每種引物，200 μ M dNTP，125ng基因組DNA和1. 5單位HERCULASE  DNA聚合酶組成。將反應物在 EPPENDORF MASTERCYCLER 中溫育，程序為在95°C進行1個循環2分鐘；25個循環，每個在95°C進行30秒，57°C進行30秒，和72°C進行1分45秒；和在72°C進行1個循環7分鐘。將PCR產物通過使用TAE緩沖液的1 %瓊脂糖凝膠電泳分離。將大約1. 5kb的片段從凝膠切出，并使用MINIELUTE Gel Extraction Kit進行瓊脂糖提取。將1. 5kb片段使用TOPO -TA Cloning Kit依照生產商的指示克隆入 pCR 2.1，并測序以確保不含PCR錯誤。將片段從pCR2. 1通過SbfI消化來釋放，并在TAE 緩沖液中通過瓊脂糖凝膠電泳來純化。將1. 5kb條帶切出，并使用MINELUTE  Gel Extraction Kit進行瓊脂糖提取。將消化的片段使用QUICK LIGATION  Kit依照生產商的指示連接于通用缺失載體pJfyS1579-41-l 1 (實施例22)，其之前經SbfI消化和小牛小腸磷酸酶脫磷酸。將所得的克隆通過序列分析來進行分析以檢查插入物的存在和取向以確保不含PCR錯誤。將所得的質粒命名為pJfyS2010-13-5(圖36)。將5，hemA側翼序列從里氏木霉RutC30基因組DNA使用如下所示的正向和反向引物進行PCR擴增。引物中的下劃線部分代表引入用于克隆的AscI位點而粗體部分對應于引入用于之后去除β-內酰胺酶的Not I位點。
            
正向引物(#065245)5， -CATGGTTTAAACGGCGGCGCGCCGCGGCCGCAATTCAGAGCATCACGGTTGAGGGA-3’ (SEQID NO 113)反向引物(#065246)5 ’ -CTTGTTTTGTCGGGCGCGCCACATGGCCTTGGATTGACGCAGGAC-3’ (SEQ ID NO :114)對擴增反應物實施與上述3’側翼序列進行的相同方法。將反應物在 EPPENDORF  MASTERCYCLER 中溫育，其程序為在95°C進行1個循環2分鐘； 25個循環，每個在95°C進行30秒，53°C進行30秒，和72°C進行1分15秒；和在72°C進行 1個循環7分鐘。將PCR產物通過使用TAE緩沖液的1 %瓊脂糖凝膠電泳分離。將大約11Λ的片段從凝膠切出，并使用MINIELUTE Gel Extraction Kit進行瓊脂糖提取。隨后將11Λ片段用Asc I消化，并如上所述凝膠純化。將消化的片段使用QUICK LIGATION  Kit依照生產商連接于pJfyS2010-13-5，其之前經SbfI消化，并經小牛小腸磷酸酶脫磷酸。將所得的克隆通過序列分析加以分析以確保不含PCR錯誤，并將所得的質粒命名為pJfyS120(圖37)。將質粒pJfyS120用于缺失里氏木霉hemA基因。實施例41 里氏木霉株RutC30的原生質體的生成為了生成里氏木霉株RutC30的新鮮培養物，將栓從含有浸于10%甘油的菌株栓的儲備物轉移至新鮮的PDA板，并在溫育7日。將孢子在細10.01 % Tween  20中使用滅菌的涂布器收集，并將350μ 1孢子用于接種帶擋板的搖瓶中的 25ml YPG2并在以90rpm振蕩溫育16小時。通過如下收集菌絲體將培養物經過 MILLIPORE  STERICUP  250ml 0. 2ym過濾器單元過濾并收集在過濾器上的種系 (gremlin)。將菌絲體用大約IOOml 1. 2M山梨醇洗滌。將菌絲體重懸于20ml由IM MgSO4中的 5mg/mlGLUCANEX (Novozymes，Bagsvaerd，DK)和 0· 36 單位/ml 甲殼酶(Sigma Aldrich, St Louis, MO, USA)組成的原生質體化溶液。將原生質體化溶液在125ml搖瓶中在34°C以 90rpm振蕩溫育25分鐘。通過在冰上溫育燒瓶來停止反應。將原生質體轉移至50ml錐底管 (conical bottomed tube)，并添加30ml冰冷的1. 2M山梨醇。將管在室溫(大約24-28°C ) 以 377xg 在 Sorvall RT6000B 浮筒式離心機(Thermo-Fischer Scientific, ffaltham, ΜΑ, USA)中離心10分鐘。棄去上清并用30ml 1. 2M山梨醇洗滌原生質體。重復管離心，并棄去上清。將沉淀重懸于1.2M山梨醇并移出10 μ 1樣品以使用血細胞計數器(VWR，ffest Chester, PA)確定原生質體的濃度。將含有原生質體的管以377xg離心，并將原生質體重懸于TrSTC至終濃度為hlO8個原生質體/ml。實施例42 里氏木霉氨基-Y -酮戊酸合酶(hemA)基因的缺失將里氏木霉RutC30原生質體如實施例20中所述用經Not I消化和凝膠純化的缺失載體pjfysi20轉化，但具有下述指出的不同之處。將一百y 1原生質體轉移至添加了 2 μ g凝膠純化的pJfyS120的Hml聚丙烯管。添加兩百五十微升聚乙二醇4000并將管通過顛倒6次輕柔地混合。將管在34°C溫育30分鐘，之后添加:3ml TrSTC0將管內含物鋪板于兩個含有IM蔗糖和5mM氨基-γ -酮戊酸(ALA)的150mm PDA板，將其在溫育16小時。將冷卻至50°C，含有PDA、100 μ g/ml潮霉素B和5mM ALA的覆層(overlay)傾至板頂部，并使其在室溫冷卻30分鐘。然后將板在溫育5日。
            
該轉化產生134個轉化體。將每個轉化體轉移至含有5ml具有5mMALA和25 μ g/ ml潮霉素B的6孔細胞培養板的一個孔，并在溫育5日。通過將少量來自轉化體的孢子刮至含有未補充ALA的TrMM培養基的不同的6孔板來測試轉化體的ALA營養缺陷型。然后將三個呈現營養缺陷型的轉化體亞培養至含有5mM ALA的PDA板，并在溫育5日。 為了生成用于Southern分析的基因組DNA，將5日轉化體的四個Icm2栓接種至125ml燒瓶中25ml含有5mMALA的丫 62%培養基，并在28°C以150rpm生長48小時。使用實施例8中所述的相同方法從培養物分離基因組DNA。對于Southern分析，將2 μ g基因組DNA用33單位Nco I在50 μ 1反應體積中進行消化，并對其在TAE緩沖液中進行瓊脂糖電泳。將凝膠中的DNA脫嘌呤、變性并中和，然后如實施例8中所述轉移至NYTRAN  Supercharge膜。將DNA使用UV STRATALINKER  UV交聯至膜，并在42°C在20ml DIG Easy Hyb中預雜交1小時。使用PCR Dig Probe Synthesis Kit依照生產商的指示用如下所示正向和反向引物生成針對hemA基因3’側翼的探針。正向(#065764)5' -GACGCATACAATACAAGCATATGCTGTTGGTGTCT-3' (SEQ ID NO :115)反向(#065765)5' -AAGGCGTCTGGAAACAGAAGCTGCT-3‘ (SEQ ID NO :116)擴增反應物由組成 IX HERCULASE  Reaction Buffer, 400nM 每種引物， 200 μ M DIG-標記的含dUTP-的dNTPs，125ng里氏木霉RutC30基因組DNA和1. 5單位 HERCULASE  DNA 聚合酶。將反應物在EPPENDORF MASTERCYCLER 中溫
            
育，其程序為在95°C進行1個循環2分鐘；25個循環，每個在95°C進行30秒，58°C進行30 秒，和72°C進行45秒；和在72°C進行1個循環7分鐘。將探針通過TAE緩沖液中的1 %瓊脂糖凝膠電泳純化，并將對應于探針的條帶切出，并使用MINELUTE Gel Extraction Kit進行瓊脂糖提取。將探針煮沸5分鐘，并添加至10ml DIG Easy Hyb以產生雜交溶液。雜交在42°C實施15-17小時。然后將膜在高嚴格條件下在室溫在2X SSC加0. SDS中洗滌5分鐘，然后在0. IX SSC加0. 1 % SDS中洗滌兩次，每次在65V洗洚15分鐘。通過化學發光測定法(Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA)依照生產商的指示檢測探針-靶雜交體。三個轉化體的Southern分析表明所有三個ALA營養缺陷型轉化體在hemA位點含有單一拷貝的缺失盒。將一個轉化體JfyS2010-52-65用于消除hpt和tk標記。一個新鮮板的孢子通過將7日培養物的栓轉移至含有5mMALA板的PDA板并在溫育7日來生成。 將孢子在IOml 0. 01%TWEEN 20中使用滅菌的涂布器來收集。孢子濃度使用血細胞計數器確定，并將106個孢子鋪板至含有TrMM-G培養基的150mm板，所述培養基含有ImMALA 禾口 1 μ M FdU0獲得了十六個FdU抗性孢子分離物，并如上所述從10個這樣的孢子分離物提取 DNA。將分離物如上所述通過Southern分析進行分析，而結果顯示所有10個孢子分離物在缺失盒的重復之間切出了 htp/tk區。挑取一個鑲片鐮孢菌株JfyS2010-52-65-02(AhemA， hpt-, tk-)并將其歸檔(archived)。本發明進一步由下述編號的段落描述
            
[1] 一種用于在絲狀真菌細胞基因組中缺失基因或其部分的方法，包括(a)將核酸構建體引入絲狀真菌細胞，所述核酸構建體包含(i)第一多核苷酸，包含顯性陽性選擇性標記編碼序列，當其表達時，賦予所述絲狀真菌細胞顯性陽性選擇性表型；(ii)第二多核苷酸，包含陰性選擇性標記編碼序列，當其表達時，賦予所述絲狀真菌細胞陰性選擇性表型；(iii)第一重復序列，位于第一和第二多核苷酸的5’，以及第二重復序列，位于第一和第二多核苷酸的3’，其中所述第一和第二重復序列包含相同序列；和(iv)第一側翼序列，其位于組分⑴、( )和(iii)的5’，以及第二側翼序列，位于組分(i)、( )和(iii)的3’，其中第一側翼序列與所述絲狀真菌細胞基因組的第一區域相同而第二側翼序列與所述絲狀真菌細胞基因組的第二區域相同，其中(1)所述第一區域位于絲狀真菌細胞基因或其部分的5’而所述第二區域位于絲狀真菌細胞基因或其部分的3’，( 所述第一和第二區域兩者均位于絲狀真菌細胞基因之內，或C3)所述第一和第二區域中的一個位于絲狀真菌細胞基因之內而所述第一和第二區域中的另一個位于絲狀真菌細胞基因的5’或3’ ；其中所述第一和第二側翼序列分別與所述絲狀真菌細胞的第一和第二區域發生分子間同源重組，以缺失基因或其部分并用核酸構建體替代基因或其部分；(b)通過施以陽性選擇來選擇具有來自步驟(a)的顯性陽性選擇性表型的細胞； 和(c)通過施以陰性選擇來從具有步驟(b)的顯性陽性選擇性表型的所選細胞選擇具有陰性選擇性表型的細胞以迫使第一和第二重復序列發生分子內同源重組以缺失第一和第二多核苷酸。[2]段落1的方法，其中所述顯性陽性選擇性標記由選自下組的基因的編碼序列所編碼潮霉素磷酸轉移酶基因(hpt)、草胺膦乙酰轉移酶基因(pat)、博來霉素、zeocin和腐草霉素(phleomycin)抗性基因(ble)、乙酰胺酶基因(amdS)、吡啶硫胺抗性基因(ptrA)、 嘌呤霉素-N-乙酰-轉移酶基因(pac)、新霉素-卡那霉素磷酸轉移酶基因(neo)、乙酰CoA 合酶基因(acuA)、D-絲氨酸脫水酶基因(dsdA)、ATP硫酰酶基因(sC)、線粒體ATP合酶亞基9基因(oliC)、氨基糖苷磷酸轉移酶3' (I) (aph(3' ) I)基因，和氨基糖苷磷酸轉移酶 3' (II) (aph(3' )II)基因。[3]段落1的方法，其中所述陰性選擇性標記由選自下組的基因的編碼序列所編碼胸苷激酶基因(tk)、乳清苷-5’-磷酸脫羧酶基因(pyrG)和胞嘧啶脫氨酶基因(codA)。[4]段落1的方法，其中所述顯性陽性選擇性標記是由潮霉素磷酸轉移酶基因 (hpt)的編碼序列所編碼的。[5]段落4的方法，其中所述hpt編碼序列是從大腸桿菌潮霉素磷酸轉移酶基因獲得的。[6]段落1的方法，其中所述陰性選擇性標記是由胸苷激酶基因(tk)的編碼序列所編碼的。[7]段落6的方法，其中所述tk編碼序列是從單純皰疹病毒1型基因獲得的。[8]段落1的方法，其中所述顯性陽性選擇性標記是由潮霉素磷酸轉移酶基因
            
61(hpt)的編碼序列所編碼的而所述陰性選擇性標記是由胸苷激酶基因(tk)的編碼序列所編碼的。[9]段落1-8任一項的方法，其中所述絲狀真菌細胞選自下組枝頂孢霉屬(Acremonium)、曲霉屬(Aspergillus)、短梗霉屬(Aureobasidium)、煙管霉屬 (Bjerkandera)、擬賭菌屬(Ceriporiopsis)、金抱子菌屬(Chrysosporium)、鬼傘屬 (Coprinus)、革蓋菌屬(Coriolus)、隱球菌屬(Cryptococcus)、Filibasidium、鍵抱屬(Fusarium)、腐質霉屬(Humicola)、梨孢屬(Magnaporthe)、毛霉屬(Mucor)、毀絲霉屬(Myceliophthora)、新考瑪脂霉屬(Neocallimastix)、脈孢菌屬(Neurospora)、擬青霉屬(Paecilomyces)、青霉屬(Penicillium)、平革菌屬(Phanerochaete)、身寸脈菌屬 (Phlebia)、瘤胃壺菌屬(Piromyces)、側耳屬(Pleurotus)、裂褶菌屬(Schizophyllum)Jf 節菌屬(Talaromyces)、嗜熱子囊菌屬(Thermoascus)、梭孢殼屬(Thielavia)、彎頸霉屬 (Tolypocladium)、栓菌屬(Trametes)或木霉屬(Trichoderma)細胞。[10]段落1-8任一項的方法，其中所述絲狀真菌細胞是pyrG營養缺陷型。[11]段落1-10任一項的方法，還包括(d)將編碼目標多肽的多核苷酸引入步驟 (c)的分離細胞。[12]段落1-11任一項的方法，其中所述核酸構建體包含于線性化的重組載體中。[13]段落1-12任一項的方法，其中所述第一區域位于絲狀真菌細胞基因或其部分的5’而第二區域位于絲狀真菌細胞基因或其部分的3’。[14]段落1-12任一項的方法，其中第一和第二區域兩者均位于絲狀真菌細胞的基因內。[15]段落1-12任一項的方法，所述第一和第二區域的一個位于絲狀真菌細胞基因之內，而所述第一和第二區域的另一個位于絲狀真菌細胞基因的5’或3’。[16]段落1-15任一項的方法，其中所述第一和第二重復序列與第一側翼序列或第二側翼序列相同。[17]段落1的方法，其中整個基因完全缺失，不留下外源DNA。[18] 一種用于缺失絲狀真菌細胞基因組中一個基因或其部分的核酸構建體，包含(i)第一多核苷酸，包含顯性陽性選擇性標記編碼序列，當其表達時，賦予所述絲狀真菌細胞顯性陽性選擇性表型；(ii)第二多核苷酸，包含陰性選擇性標記編碼序列，當其表達時，賦予所述絲狀真菌細胞陰性選擇性表型；(iii)第一重復序列，位于第一和第二多核苷酸的5’，以及第二重復序列，位于第一和第二多核苷酸的3’，其中所述第一和第二重復序列包含相同序列；和(iv)第一側翼序列，其位于組分⑴、( )和(iii)的5’，以及第二側翼序列，位于組分(i)、( )和(iii)的3’，其中第一側翼序列與所述絲狀真菌細胞基因組的第一區域相同而第二側翼序列與所述絲狀真菌細胞基因組的第二區域相同，其中(1)所述第一區域位于絲狀真菌細胞基因或其部分的5’而所述第二區域位于絲狀真菌細胞基因或其部分的3’，( 所述第一和第二區域兩者均位于絲狀真菌細胞基因之內，或C3)所述第一和第二區域中的一個位于絲狀真菌細胞基因之內而所述第一和第二區域中的另一個位于絲狀真菌細胞基因的5’或3’ ；其中所述第一和第二側翼序列分別與所述絲狀真菌細胞的第一和第二區域發生分子間同源重組以缺失基因或其部分并用核酸構建體替代基因或其部分；且所述第一和第二重復序列發生分子內同源重組以缺失所述第一和第二多核苷酸。[19]段落18的核酸構建體，其中所述顯性陽性選擇性標記由選自下組的基因的編碼序列所編碼潮霉素磷酸轉移酶基因(hpt)、草胺膦乙酰轉移酶基因(pat)、博來霉素、 zeocin和腐草霉素(phleomycin)抗性基因(ble)、乙酰胺酶基因(amdS)、吡啶硫胺抗性基因(PtrA)、嘌呤霉素-N-乙酰-轉移酶基因(pac)、新霉素-卡那霉素磷酸轉移酶基因 (neo)、乙酰CoA合酶基因(acuA)、D-絲氨酸脫水酶基因(dsdA)、ATP硫酰酶基因(sC)、線粒體ATP合酶亞基9基因(oliC)、氨基糖苷磷酸轉移酶3' (I) (aph(3' )1)基因，和氨基糖苷磷酸轉移酶3' (II) (aph(3' )II)基因。[20]段落18的核酸構建體，其中所述陰性選擇性標記由選自下組的基因的編碼序列所編碼胸苷激酶基因(tk)、乳清苷-5’ -磷酸脫羧酶基因(pyrG)和胞嘧啶脫氨酶基因(codA)。[21]段落18的核酸構建體，其中所述顯性陽性選擇性標記是由潮霉素磷酸轉移酶基因(hpt)的編碼序列所編碼的。[22]段落21的核酸構建體，其中所述hpt編碼序列是從大腸桿菌潮霉素磷酸轉移酶基因獲得的。[23]段落18的核酸構建體，其中所述陰性選擇性標記是由胸苷激酶基因(tk)的編碼序列所編碼的。[24]段落23的核酸構建體，其中所述tk編碼序列是從單純皰疹病毒1型基因獲得的。[25]段落18的核酸構建體，其中所述顯性陽性選擇性標記是由潮霉素磷酸轉移酶基因(hpt)的編碼序列所編碼的而所述陰性選擇性標記是由胸苷激酶基因(tk)的編碼序列所編碼的。[26]段落18-25任一項的核酸構建體，其中所述第一區域位于絲狀真菌細胞基因或其部分的5’而第二區域位于絲狀真菌細胞基因或其部分的3’。[27]段落18-25任一項的核酸構建體，其中第一和第二區域兩者均位于絲狀真菌細胞的基因內。[28]段落18-25任一項的核酸構建體，所述第一和第二區域的一個位于絲狀真菌細胞基因之內，而所述第一和第二區域的另一個位于絲狀真菌細胞基因的5’或3’。[29]段落18- 任一項的核酸構建體，其中所述第一和第二重復序列與第一側翼序列或第二側翼序列相同。[30] 一種重組載體，包含段落18- 任一項的核酸構建體。[31] 一種重組絲狀真菌細胞，包含段落18- 任一項的核酸構建體。[32] 一種用于將多核苷酸引入絲狀真菌細胞基因組的方法，包括(a)將核酸構建體引入絲狀真菌細胞，所述核酸構建體包含(i)目標第一多核苷酸；(ii)第二多核苷酸，包含顯性陽性選擇性標記編碼序列，當其表達時，賦予所述絲狀真菌細胞顯性陽性選擇性表型；(iii)第三多核苷酸，包含陰性選擇性標記編碼序列，當其表達時，賦予所述絲狀真菌細胞陰性選擇性表型；(iv)第一重復序列，位于第二和第三多核苷酸的5’，以及第二重復序列，位于第二和第三多核苷酸的3’，其中所述第一和第二重復序列包含相同序列，而目標第一多核苷酸位于第一重復的5’或第二重復的3’ ；和(ν)第一側翼序列，其位于組分⑴、(ii)、(iii)和(iv)的5’，以及第二側翼序列，位于組分⑴、(ii)、(iii)和(iv)的3’，其中第一側翼序列與所述絲狀真菌細胞基因組的第一區域相同而第二側翼序列與所述絲狀真菌細胞基因組的第二區域相同；其中所述第一和第二側翼序列分別與所述絲狀真菌細胞基因組的第一和第二區域發生分子間同源重組，以將所述核酸構建體引入所述絲狀真菌細胞的基因組；(b)通過施以陽性選擇來選擇具有來自步驟(a)的顯性陽性選擇性表型的細胞； 和(c)通過施以陰性選擇來從具有步驟(b)的顯性陽性選擇性表型的所選細胞選擇并分離具有陰性選擇性表型的細胞以迫使第一和第二重復序列發生分子內同源重組以缺失第二和第三多核苷酸。[33]段落32的方法，其中所述顯性陽性選擇性標記由選自下組的基因的編碼序列所編碼潮霉素磷酸轉移酶基因(hpt)、草胺膦乙酰轉移酶基因(pat)、博來霉素、zeocin 和腐草霉素(phleomycin)抗性基因(ble)、乙酰胺酶基因(amdS)、吡啶硫胺抗性基因 (PtrA)、嘌呤霉素-N-乙酰-轉移酶基因(pac)、新霉素-卡那霉素磷酸轉移酶基因(neo)、 乙酰CoA合酶基因(acuA)、D-絲氨酸脫水酶基因(dsdA)、ATP硫酰酶基因(sC)、線粒體ATP 合酶亞基9基因(oliC)、氨基糖苷磷酸轉移酶3' (I) (aph(3' ) I)基因，和氨基糖苷磷酸轉移酶 3' (II) (aph(3' ) II)基因。[34]段落32的方法，其中所述陰性選擇性標記由選自下組的基因的編碼序列所編碼胸苷激酶基因(tk)、乳清苷-5’ -磷酸脫羧酶基因(pyrG)和胞嘧啶脫氨酶基因 (codA)ο[35]段落32的方法，其中所述顯性陽性選擇性標記是由潮霉素磷酸轉移酶基因 (hpt)的編碼序列所編碼的。[36]段落35的方法，其中所述hpt編碼序列是從大腸桿菌潮霉素磷酸轉移酶基因獲得的。[37]段落32的方法，其中所述陰性選擇性標記是由胸苷激酶基因(tk)的編碼序列所編碼的。[38]段落37的方法，其中所述tk編碼序列是從單純皰疹病毒1型基因獲得的。[39]段落32的方法，其中所述顯性陽性選擇性標記是由潮霉素磷酸轉移酶基因 (hpt)的編碼序列所編碼的而所述陰性選擇性標記是由胸苷激酶基因(tk)的編碼序列所編碼的。[40]段落32-39任一項的方法，其中所述絲狀真菌細胞選自下組枝頂孢霉屬、曲霉屬、短梗霉屬、煙管霉屬、擬蠟菌屬、金孢子菌屬、鬼傘屬、革蓋菌屬、隱球菌屬、 Filikisidium、鐮孢屬、腐質霉屬、梨孢屬、毛霉屬、毀絲霉屬、新考瑪脂霉屬、脈孢菌屬、擬青霉屬、青霉屬、平革菌屬、射脈菌屬、瘤胃壺菌屬、側耳屬、裂褶菌屬、踝節菌屬、嗜熱子囊菌屬、梭孢殼屬、彎頸霉屬、栓菌屬或木霉屬細胞。[41]段落32-39任一項的方法，其中所述絲狀真菌細胞是pyrG營養缺陷型。[42]段落32-41任一項的方法，其中所述核酸構建體包含于線性化的重組載體中。[43]段落32-42任一項的方法，其中所述第一區域位于絲狀真菌細胞基因或其部分的5’而第二區域位于絲狀真菌細胞基因或其部分的3’。[44]段落32-42任一項的方法，其中第一和第二區域兩者均位于絲狀真菌細胞的基因內。[45]段落32-42任一項的方法，所述第一和第二區域的一個位于絲狀真菌細胞基因之內，而所述第一和第二區域的另一個位于絲狀真菌細胞基因的5’或3’。[46]段落32-45任一項的方法，其中所述第一和第二重復序列與第一側翼序列或第二側翼序列相同。[47] 一種用于將多核苷酸引入絲狀真菌細胞基因組中的核酸構建體，其包含(i)目標第一多核苷酸；(ii)第二多核苷酸，包含顯性陽性選擇性標記編碼序列，當其表達時，賦予所述絲狀真菌細胞顯性陽性選擇性表型；(iii)第三多核苷酸，包含陰性選擇性標記編碼序列，當其表達時，賦予所述絲狀真菌細胞陰性選擇性表型；(iv)第一重復序列，位于第一和第二多核苷酸的5’，以及第二重復序列，位于第一和第二多核苷酸的3’，其中所述第一和第二重復序列包含相同序列，而編碼目標多肽的第一多核苷酸位于第一重復的5’或第二重復的3’ ；和(ν)第一側翼序列，其位于組分⑴、(ii)、(iii)和(iv)的5’，以及第二側翼序列，位于組分⑴、(ii)、(iii)和(iv)的3’，其中第一側翼序列與所述絲狀真菌細胞基因組的第一區域相同而第二側翼序列與所述絲狀真菌細胞基因組的第二區域相同；其中所述第一和第二側翼序列分別與所述絲狀真菌細胞基因組的第一和第二區域發生分子間同源重組以將所述核酸構建體引入所述絲狀真菌細胞的基因組；且所述第一和第二重復序列可發生分子內同源重組以缺失所述第二和第三多核苷酸。[48]段落47的核酸構建體，其中所述顯性陽性選擇性標記由選自下組的基因的編碼序列所編碼潮霉素磷酸轉移酶基因(hpt)、草胺膦乙酰轉移酶基因(pat)、博來霉素、 zeocin和腐草霉素(phleomycin)抗性基因(ble)、乙酰胺酶基因(amdS)、吡啶硫胺抗性基因(PtrA)、嘌呤霉素-N-乙酰-轉移酶基因(pac)、新霉素-卡那霉素磷酸轉移酶基因 (neo)、乙酰CoA合酶基因(acuA)、D-絲氨酸脫水酶基因(dsdA)、ATP硫酰酶基因(sC)、線粒體ATP合酶亞基9基因(oliC)、氨基糖苷磷酸轉移酶3' (I) (aph(3' )1)基因，和氨基糖苷磷酸轉移酶3' (II) (aph(3' )II)基因。[49]段落47的核酸構建體，其中所述陰性選擇性標記由選自下組的基因的編碼序列所編碼胸苷激酶基因(tk)、乳清苷-5’ -磷酸脫羧酶基因(pyrG)和胞嘧啶脫氨酶基因(codA)。[50]段落47的核酸構建體，其中所述顯性陽性選擇性標記是由潮霉素磷酸轉移酶基因(hpt)的編碼序列所編碼的。[51]段落47的核酸構建體，其中所述陰性選擇性標記是由胸苷激酶基因(tk)的編碼序列所編碼的。[52]段落47的核酸構建體，其中所述顯性陽性選擇性標記是由潮霉素磷酸轉移酶基因(hpt)的編碼序列所編碼的而所述陰性選擇性標記是由胸苷激酶基因(tk)的編碼序列所編碼的。[53]段落47的核酸構建體，其中所述hpt編碼序列是從大腸桿菌潮霉素磷酸轉移酶基因獲得的。[54]段落47的核酸構建體，其中所述tk編碼序列是從單純皰疹病毒1型基因獲得的。[55]段落47巧4任一項的核酸構建體，其中所述第一區域位于絲狀真菌細胞基因或其部分的5’而第二區域位于絲狀真菌細胞基因或其部分的3’。[56]段落47巧4任一項的核酸構建體，其中第一和第二區域兩者均位于絲狀真菌細胞的基因內。[57]段落47巧4任一項的核酸構建體，所述第一和第二區域的一個位于絲狀真菌細胞基因之內，而所述第一和第二區域的另一個位于絲狀真菌細胞基因的5’或3’。[58]段落47-57任一項的核酸構建體，其中所述第一和第二重復序列與第一側翼序列或第二側翼序列相同。[59] 一種重組載體，包含段落47-58任一項的核酸構建體。[60] 一種重組絲狀真菌細胞，包含段落47-58任一項的核酸構建體。[61] 一種產生多肽的方法，包括(a)在有助于產生多肽的條件下，培養依照段落 1-17任一項獲得的絲狀真菌細胞；和(b)回收所述多肽。[62]段落61的方法，其中所述多肽對于絲狀真菌細胞是內源的。[63]段落61的方法，其中所述多肽是由引入所述絲狀真菌細胞的多核苷酸編碼的外源(異源)多肽。[64] 一種產生多肽的方法，包括(a)在有助于產生多肽的條件下，培養依照段落 32-46任一項獲得的絲狀真菌細胞；和(b)回所述收多肽。[65]段落65的方法，其中所述多肽對于所述絲狀真菌細胞是內源的。[66]段落65的方法，其中所述多肽是由引入所述絲狀真菌細胞的多核苷酸編碼的外源(異源)多肽。[67] 一種分離的乳清苷_5’ -磷酸脫羧酶，選自下組(a)乳清苷_5’ -磷酸脫羧酶，其包含與SEQ ID NO :52的成熟多肽具有優選至少70%，更優選至少75%，更優選至少 80 %，更優選至少85 %，甚至更優選至少90 %，甚至更優選至少95 %同一性，且最優選至少 96 %，至少97%，至少98%，或至少99%同一性的氨基酸序列；(b)乳清苷_5，-磷酸脫羧酶，其由在優選至少中等嚴格條件下，更優選至少中高嚴格條件下，甚至更優選至少高嚴格條件下且最優選非常高嚴格條件下與SEQ ID NO 51的成熟多肽編碼序列或其全長互補鏈雜交的多核苷酸編碼；和(c)乳清苷_5’ -磷酸脫羧酶，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸具有與SEQ ID NO :51的成熟多肽編碼序列具有優選至少80%，更優選至少85%，甚至更優選至少90 %，甚至更優選至少95 %同一性，且最優選地，至少96 %，至少97 %，至少98 %，或
            
66至少99%同一性的核苷酸序列。[68]段落67的分離的乳清苷_5，-磷酸脫羧酶，其包含SEQ ID NO 52或其具有乳清苷_5’ -磷酸脫羧酶活性的片段，或由SEQ ID NO 52或其具有乳清苷_5’ -磷酸脫羧酶活性的片段組成。[69] 一種分離的多核苷酸，其編碼段落67或68的乳清苷_5’ -磷酸脫羧酶。[70]段落69的分離的多核苷酸，其包含SEQ ID NO :51或其編碼具有乳清苷-5’-磷酸脫羧酶活性的片段的亞序列，或由SEQ ID NO :51或其編碼具有乳清苷-5’-磷酸脫羧酶活性的片段的亞序列組成。[71] 一種核酸構建體，其包含段落69或70的多核苷酸。[72] 一種重組表達載體，其包含段落69或70的多核苷酸。[73] 一種重組絲狀真菌細胞，其包含段落69或70的多核苷酸。[74] 一種產生段落67或68的乳清苷_5’_磷酸脫羧酶的方法，包括在有助于產生乳清苷-5’ -磷酸脫羧酶的條件下培養包含核酸構建體的宿主細胞，所述構建體包含編碼乳清苷-5’ -磷酸脫羧酶的核苷酸序列。本文中描述和要求保護的本發明并不受限于本文中公開的具體方面的范圍，因為這些方面意欲說明本發明的幾個方面。任何等同的方面意欲在本發明的保護范圍之內。事實上，除了本文中顯示和描述的之外，本發明的多種修飾對于本領域技術人員從前述描述而言是顯而易見的。此類修飾也意欲落入所附權利要求的范圍之內。在沖突的情況下，應以包括定義的本公開為準。
            
權利要求
            
1.一種用于在絲狀真菌細胞基因組中缺失基因或其部分的方法，包括(a)將核酸構建體引入絲狀真菌細胞，所述核酸構建體包含(i)第一多核苷酸，其包含顯性陽性選擇性標記編碼序列，當其表達時，賦予所述絲狀真菌細胞顯性陽性選擇性表型；( )第二多核苷酸，其包含陰性選擇性標記編碼序列，當其表達時，賦予所述絲狀真菌細胞陰性選擇性表型；(iii)第一重復序列，其位于第一和第二多核苷酸的5’，以及第二重復序列，其位于第一和第二多核苷酸的3’，其中所述第一和第二重復序列包含相同序列；和(iv)第一側翼序列，其位于組分(i)、(ii)和(iii)的5’，以及第二側翼序列，其位于組分(i)、( )和(iii)的3’，其中第一側翼序列與所述絲狀真菌細胞基因組的第一區域相同而第二側翼序列與所述絲狀真菌細胞基因組的第二區域相同，其中(1)所述第一區域位于絲狀真菌細胞基因或其部分的5’而所述第二區域位于絲狀真菌細胞基因或其部分的 3', (2)所述第一和第二區域兩者均位于絲狀真菌細胞基因之內，或C3)所述第一和第二區域中的一個位于絲狀真菌細胞基因之內而所述第一和第二區域中的另一個位于絲狀真菌細胞基因的5’或3’ ；其中所述第一和第二側翼序列分別與所述絲狀真菌細胞的第一和第二區域發生分子間同源重組以缺失所述基因或其部分并用核酸構建體替代所述基因或其部分；(b)通過施以陽性選擇來選擇并分離具有來自步驟(a)的顯性陽性選擇性表型的細胞；和(c)通過施以陰性選擇來從具有步驟(b)的顯性陽性選擇性表型的所選細胞選擇并分離具有陰性選擇性表型的細胞以迫使第一和第二重復序列發生分子內同源重組從而缺失第一和第二多核苷酸。
            
2.權利要求1的方法，其中所述顯性陽性選擇性標記由選自下組的基因的編碼序列所編碼潮霉素磷酸轉移酶基因(hpt)、草胺膦乙酰轉移酶基因(pat)、博來霉素、zeocin和腐草霉素(phleomycin)抗性基因(ble)、乙酰胺酶基因(amdS)、吡啶硫胺抗性基因(ptrA)、嘌呤霉素-N-乙酰-轉移酶基因(pac)、新霉素-卡那霉素磷酸轉移酶基因(neo)、乙酰CoA 合酶基因(acuA)、D-絲氨酸脫水酶基因(dsdA)、ATP硫酰酶基因(sC)、線粒體ATP合酶亞基9基因(oliC)、氨基糖苷磷酸轉移酶3' (I) (aph(3' ) I)基因，和氨基糖苷磷酸轉移酶 3' (II) (aph(3' )II)基因。
            
3.權利要求1的方法，其中所述陰性選擇性標記由選自下組的基因的編碼序列所編碼胸苷激酶基因(tk)、乳清苷-5’-磷酸脫羧酶基因(pyrG)和胞嘧啶脫氨酶基因(codA)。
            
4.權利要求1-3任一項的方法，還包括(d)將編碼目標多肽的多核苷酸引入步驟(c) 的分離的細胞。
            
5.權利要求1-4任一項的方法，其中所述第一和第二重復序列與第一側翼序列或第二側翼序列相同。
            
6.權利要求1的方法，其中整個基因完全缺失，不留下外源DNA。
            
7.一種用于缺失絲狀真菌細胞基因組中的基因或其部分的核酸構建體，包含(i)第一多核苷酸，其包含顯性陽性選擇性標記編碼序列，當其表達時，賦予所述絲狀真菌細胞顯性陽性選擇性表型；(ii)第二多核苷酸，其包含陰性選擇性標記編碼序列，當其表達時，賦予所述絲狀真菌細胞陰性選擇性表型；(iii)第一重復序列，其位于第一和第二多核苷酸的5’，以及第二重復序列，其位于第一和第二多核苷酸的3’，其中所述第一和第二重復序列包含相同序列；和(iv)第一側翼序列，其位于組分(i)、(ii)和(iii)的5’，以及第二側翼序列，位于組分(i)、( )和(iii)的3’，其中第一側翼序列與所述絲狀真菌細胞基因組的第一區域相同而第二側翼序列與所述絲狀真菌細胞基因組的第二區域相同，其中(1)所述第一區域位于絲狀真菌細胞基因或其部分的5’而所述第二區域位于絲狀真菌細胞基因或其部分的3’， (2)所述第一和第二區域兩者均位于絲狀真菌細胞基因之內，或C3)所述第一和第二區域中的一個位于絲狀真菌細胞基因之內而所述第一和第二區域中的另一個位于絲狀真菌細胞基因的5’或3’ ；其中所述第一和第二側翼序列分別與所述絲狀真菌細胞的第一和第二區域發生分子間同源重組以缺失基因或其部分并用核酸構建體替代基因或其部分；且所述第一和第二重復序列發生分子內同源重組以缺失所述第一和第二多核苷酸。
            
8.權利要求7的核酸構建體，其中所述顯性陽性選擇性標記由選自下組的基因的編碼序列所編碼潮霉素磷酸轉移酶基因(hpt)、草胺膦乙酰轉移酶基因(pat)、博來霉素、 zeocin和腐草霉素(phleomycin)抗性基因(ble)、乙酰胺酶基因(amdS)、吡啶硫胺抗性基因(PtrA)、嘌呤霉素-N-乙酰-轉移酶基因(pac)、新霉素-卡那霉素磷酸轉移酶基因 (neo)、乙酰CoA合酶基因(acuA)、D-絲氨酸脫水酶基因(dsdA)、ATP硫酰酶基因(sC)、線粒體ATP合酶亞基9基因(oliC)、氨基糖苷磷酸轉移酶3' (I) (aph(3' )1)基因，和氨基糖苷磷酸轉移酶3' (II) (aph(3' )II)基因。
            
9.權利要求7的核酸構建體，其中所述陰性選擇性標記由選自下組的基因的編碼序列所編碼胸苷激酶基因(tk)、乳清苷-5’ -磷酸脫羧酶基因(pyrG)和胞嘧啶脫氨酶基因 (codA)ο
            
10.權利要求7-9任一項所述的核酸構建體，其中所述第一和第二重復序列與第一側翼序列或第二側翼序列相同。
            
11.一種重組絲狀真菌細胞，包含權利要求7-10任一項所述的核酸構建體。
            
12.一種用于將多核苷酸引入絲狀真菌細胞基因組的方法，包括(a)將核酸構建體引入絲狀真菌細胞，所述核酸構建體包含(i)目標第一多核苷酸；(ii)第二多核苷酸，包含顯性陽性選擇性標記編碼序列，當其表達時，賦予所述絲狀真菌細胞顯性陽性選擇性表型；(iii)第三多核苷酸，包含陰性選擇性標記編碼序列，當其表達時，賦予所述絲狀真菌細胞陰性選擇性表型；(iv)第一重復序列，其位于第二和第三多核苷酸的5’，以及第二重復序列，其位于第二和第三多核苷酸的3’，其中所述第一和第二重復序列包含相同序列，而目標第一多核苷酸位于第一重復的5’或第二重復的3’ ；和(ν)第一側翼序列，其位于組分⑴、(ii)、(iii)和(iv)的5’，以及第二側翼序列，其位于組分(i)、(ii)、(iii)和(iv)的3’，其中第一側翼序列與所述絲狀真菌細胞基因組的第一區域相同而第二側翼序列與所述絲狀真菌細胞基因組的第二區域相同；其中所述第一和第二側翼序列分別與所述絲狀真菌細胞基因組的第一和第二區域發生分子間同源重組以將所述核酸構建體引入所述絲狀真菌細胞的基因組；(b)通過施以陽性選擇來選擇具有來自步驟(a)的顯性陽性選擇性表型的細胞；和(c)通過施以陰性選擇來從具有步驟(b)的顯性陽性選擇性表型的所選細胞選擇并分離具有陰性選擇性表型的細胞以迫使第一和第二重復序列發生分子內同源重組從而缺失第二和第三多核苷酸。
            
13.權利要求12的方法，其中所述顯性陽性選擇性標記由選自下組的基因的編碼序列所編碼潮霉素磷酸轉移酶基因(hpt)、草胺膦乙酰轉移酶基因(pat)、博來霉素、zeocin和腐草霉素(phleomycin)抗性基因(ble)、乙酰胺酶基因(amdS)、吡啶硫胺抗性基因(ptrA)、 嘌呤霉素-N-乙酰-轉移酶基因(pac)、新霉素-卡那霉素磷酸轉移酶基因(neo)、乙酰CoA 合酶基因(acuA)、D-絲氨酸脫水酶基因(dsdA)、ATP硫酰酶基因(sC)、線粒體ATP合酶亞基9基因(oliC)、氨基糖苷磷酸轉移酶3' (I) (aph(3' ) I)基因，和氨基糖苷磷酸轉移酶 3' (II) (aph(3' )II)基因。
            
14.權利要求12的方法，其中所述陰性選擇性標記由選自下組的基因的編碼序列所編碼胸苷激酶基因(tk)、乳清苷-5’-磷酸脫羧酶基因(pyrG)和胞嘧啶脫氨酶基因(codA)。
            
15.權利要求12-14中任一項的方法，其中所述第一和第二重復序列與第一側翼序列或第二側翼序列相同。
            
16.一種用于將多核苷酸引入絲狀真菌細胞基因組中的核酸構建體，其包含(i)目標第一多核苷酸；( )第二多核苷酸，其包含顯性陽性選擇性標記編碼序列，當其表達時，賦予所述絲狀真菌細胞顯性陽性選擇性表型；(iii)第三多核苷酸，其包含陰性選擇性標記編碼序列，當其表達時，賦予所述絲狀真菌細胞陰性選擇性表型；(iv)第一重復序列，其位于第一和第二多核苷酸的5’，以及第二重復序列，其位于第一和第二多核苷酸的3’，其中所述第一和第二重復序列包含相同序列，而編碼目標多肽的第一多核苷酸位于第一重復的5’或第二重復的3’ ；和(ν)第一側翼序列，其位于組分(i)、(ii)、(iii)和(iv)的5’，以及第二側翼序列，其位于組分(i)、(ii)、(iii)和(iv)的3’，其中第一側翼序列與所述絲狀真菌細胞基因組的第一區域相同而第二側翼序列與所述絲狀真菌細胞基因組的第二區域相同；其中所述第一和第二側翼序列分別與所述絲狀真菌細胞基因組的第一和第二區域發生分子間同源重組以將所述核酸構建體引入所述絲狀真菌細胞的基因組；而且所述第一和第二重復序列可發生分子內同源重組以缺失第二和第三多核苷酸。
            
17.權利要求16的核酸構建體，其中所述顯性陽性選擇性標記由選自下組的基因的編碼序列所編碼潮霉素磷酸轉移酶基因(hpt)、草胺膦乙酰轉移酶基因(pat)、博來霉素、 zeocin和腐草霉素(phleomycin)抗性基因(ble)、乙酰胺酶基因(amdS)、吡啶硫胺抗性基因(PtrA)、嘌呤霉素-N-乙酰-轉移酶基因(pac)、新霉素-卡那霉素磷酸轉移酶基因 (neo)、乙酰CoA合酶基因(acuA)、D-絲氨酸脫水酶基因(dsdA)、ATP硫酰酶基因(sC)、線粒體ATP合酶亞基9基因(oliC)、氨基糖苷磷酸轉移酶3' (I) (aph(3' )1)基因，和氨基糖苷磷酸轉移酶3' (II) (aph(3' )II)基因。
            
18.權利要求16的核酸構建體，其中所述陰性選擇性標記由選自下組的基因的編碼序列所編碼胸苷激酶基因(tk)、乳清苷-5’ -磷酸脫羧酶基因(pyrG)和胞嘧啶脫氨酶基因 (codA)。
            
19.權利要求16-18任一項所述的核酸構建體，其中所述第一和第二重復序列與第一側翼序列或第二側翼序列相同。
            
20.一種重組絲狀真菌細胞，包含權利要求16-19任一項所述的核酸構建體。
            
21.—種產生多肽的方法，包括(a)在有助于產生多肽的條件下，培養依照權利要求 1-6任一項獲得的絲狀真菌細胞；和(b)回收所述多肽。
            
22.—種產生多肽的方法，包括(a)在有助于產生多肽的條件下，培養依照權利要求 12-15任一項獲得的絲狀真菌細胞；和(b)回收所述多肽。
            
23.一種分離的乳清苷_5’ -磷酸脫羧酶，選自下組(a)乳清苷_5’ -磷酸脫羧酶，其包含與SEQ ID NO 52的成熟多肽具有優選至少70%，更優選至少75%，更優選至少80%， 更優選至少85 %，甚至更優選至少90 %，甚至更優選至少95 %同一性，且最優選至少95 %， 至少97%，至少98%，或至少99%同一性的氨基酸序列；(b)乳清苷_5，-磷酸脫羧酶，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在優選至少中等嚴格條件下，更優選至少中等嚴格條件下， 甚至更優選至少高嚴格條件下且最優選非常高嚴格條件下與SEQ ID NO 51的成熟多肽編碼序列或其全長互補鏈雜交；和(c)乳清苷_5’ -磷酸脫羧酶，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含與SEQ ID NO :51的成熟多肽編碼序列具有優選至少80%，更優選至少85%，甚至更優選至少90%，甚至更優選至少95%同一性，且最優選地，至少96%，至少97%，至少 98%，或至少99%同一性的核苷酸序列。
            
24.權利要求23的分離的乳清苷-5，-磷酸脫羧酶，其包含SEQID NO :52或其具有乳清苷-5’-磷酸脫羧酶活性的片段，或由SEQ ID NO :52或其具有乳清苷-5’ -磷酸脫羧酶活性的片段組成。
            
25.一種分離的多核苷酸，其編碼權利要求23或M的乳清苷-5’ -磷酸脫羧酶。
            
26.—種產生權利要求23或M的乳清苷-5’ -磷酸脫羧酶的方法，包括在有助于產生乳清苷-5’ -磷酸脫羧酶的條件下培養包含核酸構建體的宿主細胞，所述構建體包含編碼乳清苷_5’ -磷酸脫羧酶的核苷酸序列。
            
全文摘要
            
本發明涉及在絲狀真菌細胞中使用陽性和陰性選擇性基因缺失、破壞或插入絲狀真菌細胞基因的方法。
            
文檔編號C12N15/80GK102224245SQ200980146945 
            
公開日2011年10月19日 申請日期2009年9月30日 優先權日2008年9月30日
            
發明者杰弗里.沙斯基, 溫迪.約德 申請人:諾維信股份有限公司
            
                        
            
                        
            
                        
            
                            
                        
            

                        
                            
                    
            
                    
                    


                     
                        
                        
                    

                
            

                
                
            
                    
            
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