專利名稱：質量控制測試含因子xiii樣品的方法
技術領域：
本發明涉及質量控制測試含因子XIII (FXIII)樣品的方法，這包括檢測所述樣品中預活化FXIII (FXIIIa°)的存在和/或測量所述樣品中預活化FXIII (FXIIIa°)的濃度的步驟，并且涉及用于測定含因子XIII (FXIII)樣品的質量的質量控制試劑盒。
背景技術：
血液凝固是由各種血液組分(或因子)的復雜相互作用組成的過程，所述復雜相互作用產生纖維蛋白凝塊。一般地，參與已被稱為凝固“級聯”的血液組分是酶促失活的蛋白質(前酶或酶原)，其通過活化物(其自身是活化凝固因子)的作用轉換為蛋白水解酶。已經歷此類轉換的凝固因子一般被稱為“活性因子”，并且通過向凝固因子名稱添加字母“a”命名(例如因子XIIla)。FXIIi 占優勢地以重組fxiii(fxiii-a2)、血漿Fxiii(Fxiii-A2B2)或細胞內 fxiii (FXIII-A2)的酶原形式發現。在血漿中，在血液凝固過程中，凝血酶活化途徑占優勢。凝血酶從每個FXIII-A亞基的N末端部分中切割37個氨基酸殘基的活化肽，并且在Ca2+的存在下生成活性形式FXIIIa*。相反，細胞內FXIII對于凝血酶是不易接近的，并且已觀察到非蛋白水解活化在特定條件下發生，以獲得活性FXIII種類(FXIIIa°)，其在每個FXIII-A亞基中含有所有1-731個氨基酸，并且因此不能通過活化凝血酶被切割(Polgar等人(1990) Biochem. J. 267，557-560)。對于具有嚴重血友病的患者，施用血液凝固因子例如FXIII以幫助血液凝固過程。FXIII以其失活/酶原形式施用，這首先在需要時例如當撕裂傷發生時在體內天然活化。作為產物的質量參數，需要測量預活化FXIII (FXIIIa°)的含量，并且保持最小值。然而，存在在藥物制劑內特定量的FXIII可以非蛋白水解活化成FXIIIa°的可能性，這將因此增加非特異性凝固的危險。因此非常需要測量含FXIII制劑的質量的方法，以確保FXIII產物的安全且確保血友病治療得到最佳化。發明概述
根據本發明的第一個方面，提供了質量控制測試含因子XIII (FXIII)樣品的方法，這包括檢測所述樣品中預活化FXIII (FXIIIa0)的存在和/或測量所述樣品中預活化FXIII (FXIIIa0)的濃度的步驟。根據本發明的第二個方面，提供了用于測定含因子XIII (FXIII)樣品的質量的質量控制試劑盒，這包含預活化FXIII (FXIIIa°)檢測和/或測量組分，和依照如本文定義的方法使用所述試劑盒的說明書。
圖1顯示了在各種量的Ca2+的存在下測量的FXIII效價和％ FXIIIa0o左圖顯示 T%FXIIIa°，右圖顯示了相對效價。上圖顯示了從0.05 mM到5 mM Ca2+，并且下圖顯示了從 1 mM 至Ij 50 mM Ca2+ ；
圖2顯示了在各種量的NaCl的存在下測量的FXIII效價和％ FXIIIa°。左圖顯示了 ％ FXIIIa°，右圖顯示了針對150 mM NaCl進行標準化的相對效價；
圖3顯示了根據pH測量的效價、FXIIIat^nw FXIIIa°。左上圖是以RFU/秒/nM的 FXIIIa°活性，左下圖是根據pH的相對效價，并且右下圖是所得到的％ FXIIIa°。相對效價針對pH 7. 4進行標準化；
圖4顯示了緩沖組分對效價、FXIIIa0和％ FXIIIa0的影響。左上圖證實了以RFU/秒 /nM的FXIIIa°活性，左下圖證實了根據緩沖劑和Ca2+的相對效價，并且右上圖證實了所得到的％FXIIIa°。如指示的，所有測定在緩沖劑組分和1或5 mM Ca2+中在pH 7. 4下執行。 相對效價針對具有1 mM CaCl2的!fepes進行標準化；
圖5顯示了用酶原FXIII-A2 (圖5A)和活化FXIIIa° (圖5B)的陰離子交換H PLC層析；和
圖6顯示了顯示來自FXIII+凝血酶和在不存在凝血酶的情況下的信號的測定原理。在不存在FXIII的情況下，隨著時間推移未檢測到熒光中的增加。發明詳述
根據本發明的第一個方面，提供了質量控制測試含因子XIII (FXIII)樣品的方法，這包括檢測所述樣品中預活化FXIII (FXIIIa0)的存在和/或測量所述樣品中預活化FXIII (FXIIIa0)的濃度的步驟。本發明提供了用于測量在不存在凝血酶的情況下的FXIII活性的方法，從而樣品中的FXIIIa°和已形成的FXIIIa*將產生信號。這種活性被稱為FXIIIa，因為活化機制不將其區分。實際上，通過標準HPLC和MS方法容易地檢測出FXIIIa*，因為它具有與FXIII 不同的質量。此外，在藥物FXIII制劑中容易地避免FXIIIa*的生成。相比之下，FXIIIaa 具有與FXIII等同的質量，并且因此更難以通過標準方法檢測。在樣品中不存在FXIIIa* 的情況下，酶促測定方法測定FXIIIa°的水平。本發明提供了就準確和靈敏測定預活化FXIII而言的顯著優點，已發現這是對于評估且確保含FXIII樣品的質量必需的。特別地，已發現本發明的方法能夠檢測在酶原 FXIII中的痕量預活化FXIII，其靈敏度為約0. 1 %。本發明因此提供了給定含FXIII制劑的質量和有效性的準確測定，這與制劑內存在的預活化FXIII量直接相關。例如，可以設想如果來自制劑的樣品含有超過特定百分比的預活化FXIII (例如超過0.3、0.6、1或2%)， 那么應棄去含FXIII制劑的批次。本文提及“預活化FXIII”或“FXIIIa°”各自指在不存在凝血酶的情況下已被非蛋白水解活化的FXIII。本文提及“活化FXIII”指在凝血酶的存在下已被蛋白水解活化的 FXIIIo在一個實施方案中，通過層析分離檢測在所述樣品中FXIIIa°的存在。根據本發明的一個進一步方面，提供了檢測預活化FXIII (FXIIIa°)的存在和/或測量預活化FXIII (FXIIIa0)的濃度的方法，這包括層析分離步驟。在一個實施方案中，層析分離包含陰離子交換HPLC。已發現酶原FXIII和FXIIIa°具有不同的洗脫譜和保留時間。例如，在圖5中可以看出酶原FXIII具有7. 1分鐘的保留時間(圖5A)，并且FXIIIa0具有10. 4分鐘的保留時間(圖5B)。陰離子交換方法能夠檢測作為2個基線分離峰的FXIII和FXIIIa°。收集得自圖 5B中顯示的峰的洗脫餾分，并且依照本文描述的測定就FXIIIa°S性進行測試，并且發現含有100% FXIIIa0o FXIIIa°檢測極限已有利地證實為少至0. 1-0. 2% FXIIIaa，這指出層析分離技術是靈敏且快速的質量控制方法。此外，層析檢測方法也能夠測量FXIIIa°而無來自任何測定組分的干擾，從而消除在分析過程中原位活化的可能性。在層析分離的一個實施方案中，陰離子交換HPLC包含陰離子交換柱例如DEAE-陰離子或Q-陰離子柱的使用。在一個進一步的實施方案中，陰離子交換柱包含DEAE-陰離子柱(例如 TSKgel DEAE-NPR (Tosoh Bioscience LLC))。對于技術人員顯而易見的是，層析分離步驟將依照已知程序執行，例如使用平衡和洗脫緩沖劑。應當理解平衡和洗脫緩沖劑將希望地基于無法形成不溶性鹽例如鈣而選擇。因此，在層析分離的一個實施方案中，平衡和洗脫緩沖劑包含以20 - IOOmM (例如50mM)濃度的 iTris15在層析分離的一個實施方案中，平衡和洗脫緩沖劑緩沖至pH 7 - 8 (例如7. 5)。在層析分離的一個實施方案中，平衡和洗脫緩沖劑含有至少2mM Ca2+。在一個進一步的實施方案中，平衡和洗脫緩沖劑含有3mM - 5mM Ca2+。在層析分離的一個實施方案中，洗脫步驟通過增加離子強度執行，這可以通過增加所選擇鹽的濃度來獲得，例如200mM - 700mM (例如500mM)NaCl。在一個實施方案中，該方法另外包括檢測所述樣品中預活化FXIII (FXIIIa0)的存在和測量所述樣品中預活化FXIII (FXIIIa0)的濃度的步驟。在一個實施方案中，測量預活化FXIII (FXIIIa0)的濃度的步驟包括測量在凝血酶的存在和不存在下的FXIII活性。根據本發明的一個進一步方面，提供了測量預活化FXIII (FXIIIa0)的濃度的步驟，這包括測量在凝血酶的存在和不存在下的FXIII活性。本發明的這個方面允許將預活化FXIII百分比計算為總FXIII活性百分比。在加入凝血酶后測量的總活性包含通過經由凝血酶活化加上樣品中已存在的預活化(如果存在)生成的活性。例如
在一個實施方案中，測量活化/預活化FXIII的步驟包括在FXIII底物的存在下的分析，即熒光或非熒光(即光吸收)分析。在一個實施方案中，測量活化/預活化FXIII的步驟包括在熒光底物的存在下的熒光測定分析。在一個進一步的實施方案中，熒光底物是可以通過轉谷氨酰胺酶切割的底物。在一個再進一步的實施方案中，熒光底物是Abz-NE (Cad-Dnp)EQVSPLTLLK (ZEDIRA GmbH, Roesslerstrasse 83，D_64293 Darmstadt, Germany -產品編號 AlOl )。根據本發明的一個進一步方面，提供了 Abz-NE (Cad-Dnp)EQVSPLTLLK在預活化FXIII (FXIIIa°)測量中的用途。
不受理論束縛，認為在甘氨酸-乙酯的存在下，FXIII切割來自Abz-NE (Cad-Dnp) EQVSPLTLLK側鏈的猝滅劑(Cad-Dnp)且摻入所述酯基團。在一個進一步的實施方案中，依照WO 2006/018164 (N-Zyme Biotec GmBH)中描述的方法測量活化/預活化FXIII，所述測量方法引入本文作為參考。在一個實施方案中，活化/預活化FXIII在0.5_10mM Ca2+的存在下進行測量。在一個進一步的實施方案中，活化/預活化FXIII在l-2mM Ca2+的存在下進行測量。已發現希望維持鈣濃度低于2mM，因為％ FXIIIa0的測定依賴于鈣濃度(這可以從圖1中顯示的分析中看出)。在一個進一步的實施方案中，活化/預活化FXIII在2mM Ca2+的存在下進行測量。選擇2mM Ca2+的好處是這個值接近于生理學值，并且因此最佳模擬體內情況。在一個實施方案中，Ca2+將作為原子吸收標準Ca2+ (這可以購自Fluka或 Sigma-Aldrich)存在。使用原子吸收標準Ca2+的優點是Ca2+的濃度已得到精確監控且在酸性條件下保持在控制下。相比之下，堿性條件不希望地引起不溶性氫氧化鈣和氧化鈣的形成。此外，原子吸收標準Ca2+不具有由氯化鈣粉末證實的缺點。例如，氯化鈣粉末一般將捕獲來自環境的水份，并且在氯化鈣鹽的水合水平下快速變得不準確，從而妨礙Ca2+給定摩爾量的準確稱重。應當理解在樣品與測定組分溫育和活化/預活化FXIII測量之間的時間長度應降到最低，以便使FXIII的非蛋白水解活化危險降到最低。因此，在一個實施方案中，在樣品與測定組分溫育和活化/預活化FXIII測量之間的時間長度小于1小時。在一個實施方案中，活化/預活化FXIII在50_500mM NaCl的存在下進行測量。 在一個進一步的實施方案中，活化/預活化FXIII在100-200mM NaCl的存在下進行測量。 已發現希望控制測定中的NaCl濃度，因為％ FXIIIa0受波動的NaCl濃度影響(這可以從圖 2中顯示的分析中看出)。在一個再進一步的實施方案中，FXIII濃度在150mM NaCl的存在下進行測量。選擇150mM NaCl的好處是這個值接近于生理學值，并且因此最佳模擬體內情況。在一個實施方案中，活化/預活化FXIII在pH 6.5 - 10下進行測量。在一個進一步的實施方案中，活化/預活化FXIII在pH 7 - 8下進行測量。已發現希望控制測定中的pH，因為已發現pH影響效價和％ FXIIIa° (這可以從圖3中顯示的分析中看出)。例如， 已發現FXIII*的活性位點受pH影響。在一個再進一步的實施方案中，活化/預活化FXIII 在pH 7. 4下進行測量。選擇pH 7. 4的好處是這個值接近于生理學值，并且因此最佳模擬體內情況。應當理解活化/預活化FXIII —般在緩沖劑的存在下進行測量，所述緩沖劑能夠緩沖至PH 7 - 8 (例如7. 4)。在一個實施方案中，活化/預活化FXIII在H印es緩沖劑的存在下進行測量。關于Abz-NE (Cad-Dnp) EQVSPLTLLK的推薦緩沖劑是使用鹽酸調整至 PH 7. 5的50mM Tris0然而，已發現緩沖劑的選擇對效價和％ FXIIIa°具有很大影響。例如，對于Ifepes令人驚訝地測量到較低％ FXIIIa°值，這暗示Tris可能誘導新原位FXIIIa° (參見圖4)。這在質量測試過程中是明顯有害的，因為假值可能導致含FXIII制劑的批次的不必要棄去。在一個進一步的實施方案中，活化/預活化FXIII在50-200mM !fepes緩沖劑 (例如IOOmM)的存在下進行測量。在一個實施方案中，活化/預活化FXIII在表面活性劑的存在下下進行測量。在一個進一步的實施方案中，表面活性劑是聚乙二醇表面活性劑(例如PEG 8000)。當存在時， 表面活性劑一般將以0. 05 - 0. 5% (例如0. 1%)的量存在。根據本發明的第二個方面，提供了用于測定含因子XIII (FXIII)樣品的質量的質量控制試劑盒，這包含預活化FXIII (FXIIIa°)檢測和/或測量組分，和依照如本文定義的方法使用所述試劑盒的說明書。在一個實施方案中，檢測組分包含陰離子交換HPLC柱，例如DEAE-陰離子柱(例如 TSKgel DEAE-NPR)。在一個進一步的實施方案中，檢測組分另外包含如上文定義的平衡和洗脫緩沖劑。在一個實施方案中，測量組分包含如上文定義的熒光底物(例如Abz-NE(Cad-Dnp) EQVSPLTLLK)。在一個進一步的實施方案中，測量組分另外包含Ca2+ (例如2mM原子吸收標準Ca2+)。在一個再進一步的實施方案中，測量組分另外包含100-200mM NaCl (例如150mM NaCl).在一個再進一步的實施方案中，測量組分另外包含緩沖至pH 6.5-10 (例如7. 4) 的50-200mM Hepes緩沖劑(例如100mM)。在一個再進一步的實施方案中，測量組分另外包含0. 05 - 0. 5% (例如0. 1%)表面活性劑(例如PEG 8000)。本發明現在將參考下述非限制性實施例進行描述。
實施例實施例權利要求
1.一種質量控制測試含FXIII樣品的方法，其包括檢測所述樣品中預活化FXIII (FXIIIa0)的存在和/或測量所述樣品中預活化FXIII (FXIIIa0)的濃度的步驟。
2.如權利要求1中限定的方法，其中所述樣品中的FXIIIa°存在通過層析分離進行檢測。
3.如權利要求2中限定的方法，其中所述層析分離包含陰離子交換HPLC。
4.如權利要求3中限定的方法，其中所述陰離子交換HPLC包含DEAE-陰離子例如 TSKgel DEAE-NPR。
5.如權利要求2- 4中任一項中限定的方法，其中所述平衡和洗脫緩沖劑包含以20 -IOOmM (例如 50mM)濃度的 Tris。
6.如權利要求2- 5中任一項中限定的方法，其中所述平衡和洗脫緩沖劑緩沖至pH 7 - 8 例如 7. 5。
7.如權利要求1中限定的方法，其包括檢測所述樣品中預活化FXIII(FXIIIa°)的存在和測量所述樣品中預活化FXIII (FXIIIa0)的濃度的步驟。
8.如權利要求7中限定的方法，其中所述測量預活化FXIII(FXIIIa°)的濃度的步驟包括測量在凝血酶的存在(活化FXIII)和不存在(預活化FXIII)下的FXIII活性。
9.如權利要求8中限定的方法，其中所述測量活化/預活化FXIII的步驟包括在熒光或非熒光FXIII底物的存在下的熒光測定分析。
10.如權利要求9中限定的方法，其中所述熒光底物是AbZ-NE(Cad-Dnp)EQVSPLTLLK。
11.如權利要求7- 10中任一項中限定的方法，其中所述FXIII的濃度在表面活性劑的存在下進行測量。
12.一種用于測定含因子XIII (FXIII)樣品的質量的質量控制試劑盒，其包含預活化 FXIII (FXIIIa°)檢測和/或測量組分，和依照如任何前述權利要求中限定的方法使用所述試劑盒的說明書。
13.Abz-NE (Cad-Dnp)EQVSPLTLLK 在測量預活化 FXIII (FXIIIa°)中的用途。
14.一種檢測預活化FXIII (FXIIIa0)的存在和/或測量預活化FXIII (FXIIIa0)的濃度的方法，其包括層析分離步驟。
15.一種測量預活化FXIII (FXIIIa°)的濃度的方法，其包括測量在凝血酶的存在和不存在下的FXIII活性。
全文摘要
本發明涉及質量控制測試含因子XIII(FXIII)樣品的方法，這包括檢測所述樣品中預活化FXIII(FXIIIaO)的存在和/或測量所述樣品中預活化FXIII(FXIIIaO)的濃度的步驟，并且涉及用于測定含因子XIII(FXIII)樣品的質量的質量控制試劑盒。優選地，使用陰離子交換層析柱以及熒光底物Abz-NE(Cad-Dnp)EQVSPLTLLK-OH。
文檔編號C12Q1/56GK102197142SQ200980142104
公開日2011年9月21日 申請日期2009年10月23日 優先權日2008年10月24日
發明者G·K·克里斯琴森, L·霍利克, M·D·安德森, M·施羅德, P·C·斯瓦尼 申請人:諾沃—諾迪斯克保健股份有限公司