專利名稱：細胞和組織培養中的prf的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，更特別地涉及細胞和組織培養領域，更具體地涉及改 善細胞和組織培養條件及細胞分化的方法。
背景技術：
在過去的30年中，細胞和組織培養領域在生物技術中變得日益重要。植物組織培養涉及植物組織從取自源植物的植物材料的生長。已發現，當給予能 夠支持生長的營養介質和合適的激素控制時，植物可以從植物材料的片段再生整個植物。 對于植物，最初開發了體外技術以證實1902年Haberlandt所預測的植物細胞全能性。全 能性是植物細胞行使全部發育功能的能力，這是合子的特征，即發育成完整植物的能力。 Haberlandt于1902年報道了在用蔗糖富集的Knop氏鹽溶液中從葉分離的單個柵欄細胞的 培養。細胞存活了高達1個月，體積增大，累積了淀粉但是沒有分裂。證明全能性的嘗試使 得開發用于在限定條件下培養植物細胞的技術。在20世紀30和40年代，法國的RJ. Gautheret和美國的P. R. White的杰出貢獻 使得這成為可能。大部分現代組織培養基源自Skoog和合作者在20世紀50年代和60年 代的工作。第一種胚胎培養，盡管很粗糙，由Harming在1904年完成；他培養了某些十字花科 接近成熟的胚胎并且使它們生長至成熟。Laibach于1925年使用該技術從亞麻屬植物的種 間雜交恢復了雜交子代。隨后，若干研究者的貢獻改進了該技術。來自花粉粒的單倍體植物最初是由Mahestiwari和Guha于1964年通過培養曼陀 羅(Datura)的花藥來產生的。這標志著用于產生單倍體植物的花藥培養或花粉培養的開 始。該技術由許多研究人員進一步發展，更顯著的是JP. Nitch、C. Nitch及合作者。這些研 究人員證明分離的煙草小孢子產生完整的植物。植物原生質體是已移除細胞壁的裸細胞。1960年，Cocking通過利用細胞壁降解 酶產生了大量的原生質體。產生原生質體的技術目前已經相當完善。現在可以從原生質體 再生整個植物，并且還可以融合不同植物物種的原生質體。1972年，Carlson及合作者通過 融合粉藍煙草(Nicotiana glauca)與朗氏煙草(N. Iangsdorfii)的原生質體產生了第一 種體細胞雜種植物。從那時起產生了許多不同的體細胞雜種。愈傷組織培養物的成功建立依賴于在三十年代中期發現了內源性植物生長素 IAA (吲哚-3-乙酸)以及維生素B在植物生長和根培養中的作用。最早的持續生長愈傷組 織培養物是由GautheretJhite和Nobecourt于1939年獨立地從形成層組織建立的。隨后 由Miller及合作者于1955年發現的激動素(kinetin)使得能從分化的組織開始愈傷組織 培養。Skoog于1944年報道了從體外培養的煙草髓組織分化出枝芽，并且在1957年Skoog 和Miller提出該系統中根_芽的分化受植物生長素_激動素比調節。第一種來自于成熟植物細胞的植物是由Braun于1959年再生的。來自于胡蘿卜 組織的體細胞胚胎的發生最早是由Reinert和Meward于1958-1959獨立報道的。因此，在短期內組織培養技術取得了很大進展。從證實分化的植物細胞全能性的唯一目的，該技術目前在許多探索領域的基礎和應用研究中發現了用途。動物(包括人)組織培養的開端可以追溯到1880年，當時Arnold證實了白細胞 可以在體外分裂。后來，Jolly于1903年研究了浸沒于血清、淋巴或腹水中的動物組織外植 體的行為。1907年，Harrison在由蓋玻片懸掛至顯微鏡載玻片腔中的淋巴滴中培養了青蛙 蝌蚪脊髓；這被視為轉折點。幾年后，Carrel于1913年開發了用于保持培養物免受污染， 特別是細菌污染的復雜方法。1952年Gey獲得了稱為HeLa的第一種存活的(going)連續細胞系，其后來由Puck 利用X射線飼養層來克隆。Parker于1961年利用抗生素使得可以保持這些細胞系存活。 在50年代末和60年代初，確定成分培養基的開發使可以具有無血清培養基。20世紀60年代以來，植物和動物的組織和細胞培養都取得了許多進展，不僅在可 以用于培養的細胞和組織的來源方面，而且在組織和細胞培養的應用方面。植物組織培養 廣泛應用于植物科學；其也有許多商業應用。應用包括·微繁殖廣泛用于林業和花卉栽培殖。微繁殖也可以用于保存稀有或瀕危植物物種。·植物育種家可以利用組織培養來篩選細胞而不是植物以獲得諸如抗/耐除草劑 的有利性狀。·使遠緣物種異花傳粉然后組織培養產生的胚胎，否則其通常會死亡(胚胎拯 救)。 在育種計劃中為了更迅速地從單倍體培養物產生加倍的一倍體植物以獲得純合 系，通常用導致染色體數目加倍的秋水仙素來處理。·作為用于轉化的組織，隨后進行基因構建體的短期測試或者轉基因植物的再生。 可以使用諸如莖尖培養的某些技術，其用于從病毒感染的苗木產生干凈的植物 材料，如馬鈴薯和許多無核小果和觀賞植物物種。在動物細胞培養中，動物細胞系的大量培養對于病毒疫苗和許多生物技術產品是 重要的。在動物細胞培養中通過重組DNA(rDNA)技術制備的生物產品包括酶、激素、免疫生 物制品(單克隆抗體、白細胞介素、淋巴因子)和抗癌劑。組織工程的多學科領域的重要發 展獲得了一系列新的組織替代部分和執行策略。生物材料、干細胞、生長和分化因子以及生 物模擬環境的科學進步已經在實驗室中實現了從改造的細胞外基質(“支架”)、細胞和生 物學活性分子構建組織的獨特機會。在這一快速發展的領域還亟需改善組織和細胞培養的效力和速度的新技術。發明_既述本發明涉及脈沖射頻(Pulse Radio Frequency, PRF)用于刺激細胞和/或組織培 養物的用途。因此，本發明包括在細胞或組織培養物中體外增加生長或分化的方法，所述方 法包括培養所述細胞或組織并向所述細胞或組織施用PRF。在所述方法中，細胞或組織源自 植物或動物(包括人)，并且細胞優選為未分化的細胞。本發明的另一部分為本文所述的方 法，其中細胞或組織源自植物，并且其中分化表示根和/或枝或體細胞胚胎的長出。在該方法的另一實施方案中，PRF的參數如下a.頻率50，000-1，000，000Hz，優選 150，000-500，000Hzb.脈沖持續時間0. 1-lOOmsec，優選 5-20msec
c.脈沖頻率l-20/sec，優選 l-3/secd.電壓l-100V/cm電極間距e.暴露時間2-180分鐘在另一實施方案中，本發明包括PRF在體外細胞或組織培養物中用于增加生長或 分化的用途。仍然在另一實施方案中，本發明包括根據本發明的方法處理的細胞或組織培養 物。優選地，這樣的細胞或組織培養物源自植物。而且，仍然在另一實施方案中，本發明涉 及從這樣的細胞或組織培養物生長的植物。或者，本發明包括根據本發明的方法處理的細胞培養物，其中所述細胞源自動物， 優選人。
圖1.用于植物的PRF處理的發生器和容器。圖2.用具有可加壓加熱電極的PRF處理的花楸(Sorbus terminalis)的外植體。圖3.在電極之間處理的無菌外植體(左圖面)和PRF處理后組織培養的榲梓 (Cydonia oblonga)植物(右圖面)。圖4.用PRF處理的歐亞械(Acer pseudoplatanus)外植體莖位于兩個電極之 間。圖5.三色堇(Viola wittrockiana)組織培養植物的評價=PRF處理后(1和3)， 它們看起來比對照更均一(前排K)。不同的顏色用于不同植物大小。圖6.上圖面用PRF處理Q2V或45V)的組織培養翠雀(Delphinium)植物顯示出 更多的根，并且比對照未處理植物(右)更強壯且質量更好。底部圖面PRF處理的(右) 和未處理(左)的植物的高度差異。圖7.在可加壓加熱電極中用PRF處理的花楸外植體。圖8.左圖面用針進行的PRF處理。右圖面植物細胞用PRF處理后3周枝和根 的再生。培養皿中處理的細胞標記為(+)，未處理的細胞標記為(_)。圖9.歐亞槭中的根形成。左對照未處理的植物(10個植物中僅3個存活)五 PRF處理的植物(20V)的根形成(10個植物中的5個)。圖10. PRF處理(+)后和未處理對照(_)的不定根和枝形成。圖11. PRF處理后，無激素培養基上體細胞胚胎形成和根形成。圖12.榲梓中的根發育。右PRF處理的植物，左未處理的對照。圖13.處理和未處理的(Kontrole)翠雀植物的根形成。發明詳述PRF(脈沖射頻)在醫療中用作臨床上證實的方法以減輕以下情況中的疼痛痛覺 是由于外周神經或通過外周神經轉移(如在由脊柱椎間盤突出壓迫神經所導致的疼痛、面 神經痛、外傷等的情況下)。PRF，正如同RF，通過向神經附近施用AC電流來發揮作用。通 常，使用400. 000-500. OOOHz的頻率，但是范圍可以從50. 000至1. 000. OOOHz變化。使用 PRF，以由約0. 1至Isec的靜息時間段隔開的短持續時間(1-lOOmsec)的脈沖來遞送電流。 在PRF中，與連續的RF相反，在工作周期的活躍期于電極尖端所產生的熱量在0或很低電壓的靜息期期間消散。在工作周期的活躍期(所謂的熱峰(heat spike))期間，可以允許 溫度短暫地上升高達5°C，盡管溫度的這些超短和適度上升的生物學效果是未知的。而且， 預期熱峰期間熱量的擴散最小(人組織中小于0.2mm)，從而實際上排除熱效應的發生。目 前為止，尚沒有解釋和支持所觀察到的PRF的臨床效果的確定結論。如Cleary, S. F. et al.，1996，FASEB J.，10 :913-919 所述，連續射頻(RF)電場 已經應用于細胞培養，并且如WO 02/39786所述，已經應用于植物上的病原微生物。盡管 在許多條件下表明，通過應用電場而產生的熱量以及因此而增加的環境溫度是處理的基 本特征，但是還表明射頻處理可以影響膜信號轉導。Cahana A. et al. (J. Pain, 2003,4 197-202)將海馬切片培養物在42°C下暴露于連續的RF和暴露于PRF。他們發現PRF對引 發突觸活動具有短暫效果，而RF具有持久效果。此外，在非常短的距離上存在距離依賴性 組織破壞，并且這在連續RF組中更明顯。因此，他們強調了 PRF各種參數的重要性。在過去幾十年中，已經對移動電話產生的脈沖射頻和/或電磁射頻領域的影響進 行了許多研究。然而，盡管在某些研究中已經報道了輻射的少量影響，但是總體上已經得出 移動電話產生的輻射對人體細胞沒有明顯影響的結論。因此，本發明人驚奇地發現PRF在體外培養中影響細胞和組織的細胞生長和/或 分化。不被理論所束縛，假定PRF處理引起越過細胞膜的流動或變化，這可以進一步影響負 責信號轉導的信號分子(如植物細胞中的激素信號轉導)。實際上，射頻已經用于電穿孔技 術中，其中該處理已經用于短暫地使細胞膜可滲透以允許在細胞中引入核酸(參見，例如 He，H. et al.，2006，Bioelectrochem. 68 :89-97)。然而，與其它電和射頻刺激相反，PRF 的 應用不導致或幾乎不導致對處理的細胞的任何高溫相關影響。在本發明中，植物細胞和組織培養物被視為包括未分化以及分化的細胞等單個 細胞、分生組織、原生質體、愈傷組織細胞、細胞懸浮液、體細胞胚胎、體外繁殖的外植體，枝 和根培養物、花藥、小孢子、卵細胞、花和絨氈層細胞。動物細胞和細胞培養物包括分化和未分化的細胞，如胚胎或臍帶干細胞或其它全 能或多能細胞；永生細胞系，如雜交瘤；以及徹1^、313、幾計站、冊1( ^3、CH0或其它細胞的 細胞培養物，如 http://www. biotech. ist. uniRe. it/cldb/cname-lc. html 所列，大部分這 些都可從商業供應商獲得，如Sigma Aldrich 和Promega .⑧。在本文中已經表明，PRF處理在植物組織培養中增強細胞生長，并且還在這樣的培 養中誘導或增強細胞分化以形成分化的組織，如體細胞胚胎、根和/或枝。已經觀察到，增 強了不定根形成，從而增加植株的根系統并使植物能夠更好且更快的生長。這些改變的繼 發效應在于從PRF處理的細胞和/或組織發育而來的植物比對照植物更有活力。在應激條 件下這特別明顯，如病原體感染或干旱脅迫。PRF處理另外的繼發效應在于增加了同時處理 的植物之間的均一性。這表現為更協同的生長和此后的較不分散的開花時間。諸如外植體和愈傷組織的起始材料上不定器官(根或枝)的再生以及植物從用作 起始材料的細胞或原生質體(甚至單個細胞或原生質體)懸浮液的再生是常用于無種繁殖 的技術。對于轉化的植物或轉基因植物的產生，體外繁殖甚至被認為是先決條件，因為正是 個體植物細胞的全能性成為大部分植物轉化系統的基礎。為了在體外從起始材料繁殖植物，原則上需要起始原料中有至少一個能夠再生的 細胞。再生能力例如通過基因型、環境條件(營養供應、調節劑和物理條件)或植物的發育階段或者這些條件的組合來確定。公知某些科和屬具有高再生能力茄科(Solanacea) (茄(Solanum)、煙草(Nicotiana)、牽牛(Petunia)、曼陀羅和番茄(Lycopersion))、十 字花科(Crucifera)(蕨(Lunaria)、蕓苔(Brassica)、擬南芥(Arabidopsis))、苦苣苔科 (Generiaceae)(長筒花(Achimenes)、非洲堇(Saintpaulia)、堇蘭(Streptocarpus))、 菊禾斗(Compositae)(菊苣(Chicorium)、萵苣(Lactuca)、菊花(Chrysantemum))、百合禾斗 (Liliaceae)(百合(Lilium)、瓦蘋(Haworthia)、韭(Allium)、萬年青(Ornithogalum))， 但是其它植物是非常困難的，甚至在使用體外技術的情況下也是如此，如許多裝飾植 物、木質物種如灌木、針葉樹或樹，特別是果樹和堅果樹，玫瑰水母(Rosacea)、六出花 (Alstroemeria)、大戟(Euphorbia)以及球莖植物，如郁金香(Tulipa)和其它植物。植物再生包括從單獨細胞或細胞群形成含有根和枝分生組織的新組織、分離的 枝或根分生組織、植物器官或器官原基。再生通常模擬植物發育期間發生的正常細胞和 器官分化并導致形成不同的植物器官。在正常發育中，在個體發生的早期，共同譜系的細 胞和組織由于對發育信號應答而分歧成通常差異大的發育途徑。這種對特定信號應答而 發育的能力又稱為細胞感受性(cellular competence)或細胞潛能。由于感受的細胞定 向于特定的分化途徑，所以它們不容易轉為其它途徑；這種細胞發育潛能的限制稱為決定 (determination) 。正常條件下的植物細胞或細胞群不能開始形成某些植物器官，分生組織或器官原 基通常可以由修飾細胞分化階段的細胞外刺激來刺激。細胞外擴散因子被證實對植物細胞 的細胞再分化是重要的(Siegel and Verbeke, 1989 Science 244,580-582) 細胞表面這 些信號的察覺和最終導致轉錄調節改變的細胞內信號轉導為細胞提供應答這樣的細胞外 刺激的能力。再生可以導致形成單獨的枝或單獨的根或這兩者。只有在細胞或組織再分化 后，再生才是可能的，其形成分化的組織，這些分化的組織再次包含出現的植物所必需的三 維結構、成熟的期望植物可以從其發育的頂端-基部或枝-根體平面。無種繁殖的體外技術的核心是添加至培養基中模擬這些細胞外刺激的植物激素 和其它因子。對于在再次形成完全分化的植物的細胞、組織或外植體培養物中，體外構成體 細胞胚胎形成或器官形成的基礎并在此之前的原始起始細胞再生為多細胞全能性組織的 過程，通常需要向培養物種添加良好平衡的植物激素(并且每個植物物種是通常不同的)。 總之，需要一方面的生長素和另一方面的細胞分裂素間的平衡。外源暴露于生長素(如2， 4-二氯苯氧基乙酸0，4-D)、草滅平(chloramben)或麥草畏(dicamba))或細胞分裂素(如 6-芐基氨基嘌呤或玉米素(zeatine))或這兩者后，細胞或組織通過枝-根體平面的發育進 行反應，例如通過形成枝和/或根，有時候容易，有時候不規律，特別是當未合適地選擇激 素之間的適當平衡時。因此，體外再生并且特別是體外培養的可操縱特性主要取決于這兩種類型激素的 應用，并且還取決于組織對培養期間植物激素變化的應答能力。通常，再生的三個階段是可 識別的。在第一階段，培養中的細胞獲得“感受性”，其定義為對器官誘導的激素信號應答 的能力(非容量)。所述器官性感受性獲得的過程通常指分化的細胞獲得器官性感受性的 “去分化”。在第二階段，在植物激素平衡的影響下，將培養中的感受細胞引向并確定為特定 組織和器官形成以使休眠細胞再進入細胞周期，并且細胞分裂的結構沿著枝-根體平面以 形成特定的原基和分生組織。特別地，生長素被認為涉及不定根起始的特異性再生信號轉導途徑，而細胞分裂素則被認為涉及不定枝起始的特異性再生信號轉導途徑。然后，在第三階段，形態發生，即植物生長為其完全分化的狀態獨立于外源提供的 激素進行。盡管通過添加外源植物激素而控制再生的一般原則由此是相當清楚的，但是對于 許多單獨的物種而言，得到所述激素的恰當平衡、給予的合適時間或者合適的類型或亞類 的設計體外培養方法操作仍然或多或少是反復試驗的過程。然而，如上文所指出的，對許 多植物物種的體外再生或無種繁殖是極為關注的，特別是對于通常難以繁殖的那些植物物 種。本發明促進了這一方法，因為-如實驗部分所證明的-通過PRF處理增強了組織 培養的生長和分化。特別地，本發明提供了培養方法，其中起始材料可以包括單獨的植物細 胞或原生質體或外植體或植物組織，植物激素的添加被認為是自明的體外培養方法中常用 的材料。現在，這樣的添加不再是必需的或者是可以減少的，這提供了較為容易的體外培養 方法，其中不需要尋求添加的各種激素之間如此復雜的平衡。而且，如上文所述，PRF處理 獲得了更有活力的植物。還觀察到較大的均一性，這在觀賞植物和農作物植物培養中具有 大的商業優勢，因為可以更好地確定收獲時間。對于動物細胞培養，在人干細胞上進行了初步研究，其表明在分化中起作用的幾 個基因的基因表達是增加的。因此，認為PRF處理也會在動物細胞培養中刺激生長和/或 分化。如實施例所示，最優的參數，其中之一是PRF處理時間，對各種處理的細胞或組織 培養是不同的。常用的值是，約400，OOOHz的頻率，IOmsec的脈沖持續時間以及2/sec的脈 沖頻率。然而，可以使用的參數有寬變化范圍頻率50，000-1，000，000Hz，優選150，000-500，OOOHz，更優選 300，000-450, OOOHz脈沖持續時間0.1-lOOmsec，優選 5_20msec·脈沖頻率l-20/sec，優選l-3/sec電壓l-100V/cm電極間距暴露時間2-180分鐘特別地，施用的電壓和處理時間是應當調整的參數以實現最優處理。電壓優選為 約5至約50V/cm，更優選約10至約40V/cm。處理時間優選為約5至約60分鐘，更優選約 10至約30分鐘。如實施例所示，我們發現，最優處理參數(關于電壓和處理時間)在各種 物種的細胞或組織培養和其中維持這些細胞或組織培養物的培養基間是不同的。此外，PRF處理的工作周期可以是不規律的，具有變化的脈沖持續時間和脈沖頻 率，以及電壓在休止期期間可以不回到零。如果電路的阻抗大于500hm，可商購的射頻消融發生器(RF Lesion Generator)只 適合于進行本操作方法(例如，這樣的發生器可得自Neurotherm Inc,Middleton MAjUSA ； Valleylab, Boulder, Colorado, US 或 Traatek, Fort Lauerdale, Florida, USA)。不可商購 的 Radionics 3C plus 發生器(Radionics, Burlington, MA)不存在這一限制。所用的電極可以是任何大小的板電極或針電極。實驗部分示出了不同的類型。將 電極置于細胞或組織培養中或靠近細胞或組織培養的方式也可以變化，并且也取決于培養物的大小和維持細胞或組織培養的容器和培養基。在實驗部分給出了實施例，但是本領域 技術人員能夠確定何種電極最適合于特定的實驗設定并如何最好地放置它們。
實施例實施例1通過PRF處理誘導組織培養植物生根的方法的描述使開花植物(如風鈴草(Campanula carpatia)、三色堇和穗花翠雀(Delphinium elatum))或果樹(榲梓)禾口樹(歐亞槭(Acer pseudoplatanus)，花楸(Sorbus torminalis))生長于無菌容器中的普通組織培養繁殖培養基上。在該培養基中，植物一般不產生任何根。在PRF處理前，從無菌容器中取出植物，并切下較低的莖部分以形成新鮮傷口部 位。我們使用連接至容器的RFG-3C plus型發生器(圖1)，其具有以下設定脈沖為 2Hz，脈沖射頻為420. 000至450. 000Hz，脈沖持續時間為10ms，電壓設定在15_60V/cm變 化，并且PRF處理持續時間可變(在10-30分鐘變化)。發現所用的液體組織培養基的阻抗 為約15-600hm(取決于化學組成)，對于固體瓊脂培養基的阻抗則高達3800hm。對于木質 物種，我們用較高的電壓設定(15-40V/cm)將植物處理較長的時間(15-30分鐘)。在具有電極板的塑料容器中進行PRF處理，在上下電極間留下1. 5cm的空間。小容器含有150ml液體組織培養基，較大的容器含有250ml液體組織培養基(參 見圖1)。或者，將裝入培養皿的可加壓加熱電極用于在無菌條件下用PRF處理組織培養植 物(圖2和圖3)。對于PRF處理，將植物以完整植物放入較小容器的電極間的空間，或者在 第二方法中，將它們垂直地放在較大容器的孔中，使得枝突出在上方，而莖則恰好位于電極 板之間(圖4)。對于每個處理，使用至少10個組織培養來源的植物。PRF處理后，將組織培養植物轉移至含土的盤中，并在最初的2周用塑料罩覆蓋以 避免過量的水分損失。這一脫離階段后，將已經生長出根的植物轉移至溫室或分別盆栽。每 周評價兩次，進行6周。給予不同發育階段的植物特定顏色標記(圖5)。結果用PRF處理的植物通常更為均一(大小和發育階段)，它們比未處理的植物更大且 更有活力(圖5)。PRF處理的植物發育根較快，并且與未處理的對照相比，根更豐富(不定的)且發 育更好，從而它們能夠在土中更容易地存活(圖6、圖12、圖13)。完全未形成根的植物在4周后衰落。每種植物物種的最優PRF處理是不同的。對于開花植物，通常以15V/cm處理10 分鐘是最好的，而高于30V/cm時植物質量下降。第一處理后2小時，使用最低劑量(15V處理10分鐘)進行的第二 PRF處理不影 響植物的質量，但是未明顯地改善結果。據發現，開花植物的均一性在PRF處理后增加，并且在以15V/cm處理10分鐘時最 優，當用高于23V/cm的電壓處理10分鐘時均一性則下降。
表1.用PRF處理的槭屬(Acer)植物中根形成的結果。用20V/cm或40V/cm處理 明顯地導致改善的根形成
權利要求
1.在細胞或組織培養物中體外增加生長或分化的方法，包括培養所述細胞或組織并向 所述細胞或組織施用PRF。
2.如權利要求1所述的方法，其中所述細胞或組織源自植物或動物。
3.如權利要求1或2所述的方法，其中所述細胞是未分化的細胞。
4.如前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述細胞或組織源自植物，并且其中分 化表示根和/或枝或體細胞胚胎的長出。
5.如前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述PRF的參數如下a.頻率50，000-1，000，000Hz，優選150，000-500，OOOHzb.脈沖持續時間0.1-lOOmsec，優選5-20msecc.脈沖頻率l_20/sec，優選l-3/secd.電壓每厘米電極間距1-100Ve.暴露時間2-180分鐘。
6.PRF在體外細胞或組織培養物中用于增加生長或分化的用途。
7.根據權利要求1-5中任一項的方法處理的細胞或組織培養物。
8.如權利要求7所述的細胞或組織培養物，其源自植物。
9.植物，其從權利要求8所述的細胞或組織培養物生長。
10.如權利要求7所述的細胞培養物，其中所述細胞源自動物。
11.如權利要求10所述的細胞培養物，其中所述動物是人。
全文摘要
本發明涉及在細胞或組織培養物中體外增加生長或分化的方法，所述方法包括培養所述細胞或組織并向所述細胞或組織施用脈沖射頻(PRF)。在所述方法中，細胞或組織源自植物或動物(包括人)，并且細胞優選為未分化的細胞。本發明的一部分還是本文所述的方法，其中細胞或組織源自植物，并且其中分化表示根和/或枝或體細胞胚胎的長出。本發明還包括PRF在體外細胞或組織培養中用于增加生長或分化的用途。本發明還包括根據本發明的方法處理的細胞或組織培養物。優選地，這樣的細胞或組織培養物源自植物。仍然在另一實施方案中，本發明涉及從這樣的細胞或組織培養物生長的植物。或者，本發明包括根據本發明的方法處理的細胞培養物，其中所述細胞源自動物，優選人。
文檔編號C12N5/00GK102149815SQ200980136020
公開日2011年8月10日 申請日期2009年8月6日 優先權日2008年8月6日
發明者亞歷山德雷·宙斯·列奧納多·特謝拉, 梅·雷·瑪麗亞·康斯坦斯·譚, 麥諾·伊曼紐爾·斯路杰特 申請人:UToC有限公司