表達醛糖-1-差向異構酶的微生物的制作方法

專利名稱：表達醛糖-1-差向異構酶的微生物的制作方法
技術領域：
本發明涉及微生物。特別地，本發明涉及經轉化微生物，其能夠(i)以比轉化前的等同微生物要更高 的速率將戊醛糖轉變成戊酮糖；和/或(ii)在戊醛糖存在下實現比轉化前的等同微生物要 更高的生長速率；和/或(iii)比轉化前的等同微生物要更高的戊醛糖代謝。本發明進一步涉及用于制備經轉化微生物的方法，所述經轉化微生物能夠(i) 生成戊糖衍生化合物；和/或(ii)以比轉化前的等同微生物要更高的速率將戊醛糖轉變成 戊酮糖；和/或(iii)在戊醛糖存在下實現比轉化前的等同微生物要更高的生長速率；和/ 或(iv)實現比轉化前的等同微生物要更高的戊醛糖代謝；所述方法包括用編碼醛糖-1-差 向異構酶的核苷酸序列轉化微生物的步驟，其中所述經轉化微生物能夠將戊醛糖轉變成戊 酮糖。另外，本發明涉及包含依照本發明的微生物或通過依照本發明的方法制備的微生 物的接種物和培養液(culture medium)。本發明另外涉及用于生成生物燃料和/或戊糖衍生化合物的方法，包括培養依照 本發明的微生物或通過依照本發明的方法制備的微生物。另外，本發明涉及通過本發明的方法獲得的生物燃料和/或戊糖衍生化合物。另外，本發明涉及依照本發明的或通過本發明的方法制備的微生物用于生成戊酮 糖和/或生物燃料和/或戊糖衍生化合物的用途。
背景技術：
作為用于運輸，加熱和能量供給的化石燃料的綠色的和可持續的替代品，正在開 發生物燃料。上漲中的石油價格使得生物燃料生產在經濟上更加可行，而且化石燃料的可 得性最終是有限的。生物乙醇，一種生物燃料，一般被認為是與基于石油的運輸燃料相比要 更(X)2中性得多。另外，有可能使用生物乙醇作為部分以及全部汽油替代品，而對發動機技 術沒有劇烈改變。典型地，通過自農業飼料-諸如甘蔗、甜菜、玉蜀黍和谷類(諸如小麥和玉米)-它 們是富含淀粉和富含糖的植物材料(這些植物材料的剩余物稱作農業廢物)衍生的糖的發 酵來生成生物乙醇。然而，與使用這些材料的工藝有關的一個問題在于它們利用在其它情 況中用于人的食物和動物飼料的材料。這樣做的一個后果在于可得的食物和動物飼料的量 減少，這繼而提高食品的價格。事實上，有預測說，即使將美國的全部玉蜀黍作物用于乙醇生產，它也不可能滿足 美國未來的需求。例如，在2008年春季，美國農業部估算，根據美國播種玉蜀黍的土地量， 2008年美國會收獲約120億蒲式耳的玉蜀黍。使用本領域當前可得的技術，自1蒲式耳玉 蜀黍平均生成2. 8加侖乙醇。如此，如果全部2008年美國玉蜀黍收獲制成乙醇，那么會獲 得330億加侖的乙醇。然而，根據美國內源信息管理局的統計，美國2007年有1420億加侖 的汽油用作客車和貨車的燃料。假設2008年美國的汽油需求沒有顯著下降，那么來自玉蜀 黍的汽油替代品乙醇的供給不能滿足需求。
如此，富含淀粉的和富含糖的植物材料的來源的可得性是生物燃料生產的限速因素。例如，甘蔗、甜菜、高粱、大豆、玉蜀黍、和谷類(諸如小麥和玉米)的所謂的農業廢 物材料主要包含木質纖維素材料。木質纖維素材料主要包含長鏈糖。一般地，這些長鏈糖 中約三分之二的糖是己糖(特別是葡萄糖)，它們主要是纖維素的形式，而且這些長鏈糖中 約三分之一的糖是戊糖(特別是木糖和阿拉伯糖)，它們主要以阿拉伯糖基木聚糖聚合物 的形式存在。纖維素水解后，能通過傳統的基于酵母的方法來發酵己糖。然而，纖維素是一 種結實的結構，其對提取和酶促水解的抗性很高。阿拉伯糖基木聚糖比較易于提取和水解 以大體釋放戊糖；但是所釋放的糖不能被已知的微生物以足夠高的濃度發酵成乙醇。自廢物植物材料高效生成乙醇的兩項障礙是與纖維素解聚有關的困難和能為大 規模生產將戊糖代謝成乙醇的合適微生物的缺乏。理論上，獲得此類合適生物體的一種方式是將代謝戊糖的能力自天然戊糖代謝生 物體轉移入已知的高效乙醇生成體。這已經成為最近15-20年期間多個研究小組的多項工 作的主題。但是憑借戊糖，不可能獲得與使用葡萄糖時獲得的速率相當的代謝速率。提高 這種低代謝速率已經成為且仍然是討論和正在進行的研究的主題，而且仍然是在自戊糖發 酵乙醇中使用例如工程化釀酒酵母的一項主要障礙。發明概述驚人地，我們發現，通過修飾微生物來表達和/或過表達醛糖-1-差向異構酶，戊 醛糖更快地轉變成戊酮糖得到推動(在與修飾前的等同微生物相比時)。那樣，能獲得如下 的微生物，其能夠在與修飾前的等同微生物相比時更快地將戊糖(優選戊醛糖)轉變成生 物燃料(優選包含乙醇的生物燃料)，這對于大規模工業生物燃料生產是特別有利的。木酮糖-5-磷酸是一種中間體(其可以自D-木糖、L-阿拉伯糖或甚至D-來蘇糖 衍生)，其進入戊糖磷酸途徑并在厭氧條件下被進一步代謝成乙醇。木糖變成乙醇的完整代 謝途徑顯示于圖4。核酮糖-5-磷酸是一種中間體(其可以自D-核糖衍生)，其進入戊糖磷酸途徑并 在厭氧條件下被進一步代謝成乙醇。一方面，本發明提供能夠以比轉化前的等同微生物要更高的速率將戊醛糖轉變成 戊酮糖的經轉化微生物。另一方面，本發明提供能夠在戊醛糖存在下實現比轉化前的等同微生物的要更高 的生長速率的經轉化微生物。本發明還提供能夠實現比轉化前的等同微生物要更高的戊醛糖代謝的經轉化微 生物。本發明進一步提供如下的微生物，其中所述微生物包含編碼外源醛糖-1-差向異 構酶的核苷酸序列。另一方面，本發明提供如下的微生物，其中所述微生物能夠表達外源醛糖-1-差 向異構酶。又一方面，本發明提供如下的微生物，其中所述微生物包含編碼外源醛糖-1-差 向異構酶的核苷酸序列，且其中所述微生物能夠表達所述外源醛糖-1-差向異構酶；且其 中所述微生物能夠將戊醛糖轉變成戊酮糖。
另外，本發明提供如下的微生物，其包含編碼醛糖-1-差向異構酶的表達載體，其 中所述微生物能夠將戊醛糖轉變成戊酮糖。另一方面，本發明提供如下的經轉化微生物，其中所述微生物能夠表達醛 糖-ι-差向異構酶且其中所述微生物能夠將戊醛糖轉變成戊酮糖。又一方面，本發明提供用于制備能夠生成戊酮糖的經轉化微生物的方法，所述方 法包括用編碼醛糖-1-差向異構酶的核苷酸序列轉化微生物的步驟，且其中所述經轉化微 生物能夠將戊醛糖轉變成戊酮糖。又一方面，本發明提供用于制備能夠生成戊糖衍生化合物的經轉化微生物的方 法，所述方法包括用編碼醛糖-1-差向異構酶的核苷酸序列轉化微生物的步驟，且其中所 述經轉化微生物能夠將戊醛糖轉變成戊酮糖。又一方面，本發明提供用于制備能夠以比轉化前的等同微生物要更高的速率產生 戊糖衍生化合物的經轉化微生物的方法，所述方法包括用編碼醛糖-1-差向異構酶的核苷 酸序列轉化微生物的步驟，其中所述經轉化微生物能夠將戊醛糖轉變成戊酮糖。另一方面，本發明提供用于制備能夠以比轉化前的等同微生物要更高的速率將戊 醛糖轉變成戊酮糖的經轉化微生物的方法，所述方法包括用編碼醛糖-1-差向異構酶的核 苷酸序列轉化微生物的步驟，其中所述經轉化微生物能夠將戊醛糖轉變成戊酮糖。又一方面，本發明提供用于制備能夠以比轉化前的等同微生物要更高的速率將戊 醛糖轉變成戊酮糖的經轉化微生物的方法，所述方法包括轉化微生物使得醛糖-ι-差向異 構酶的表達上調的步驟，其中所述經轉化微生物能夠將戊醛糖轉變成戊酮糖。另外，本發明提供用于制備能夠在戊醛糖存在下實現比轉化前的等同微生物要更 高的生長速率的經轉化微生物的方法，所述方法包括用編碼醛糖-ι-差向異構酶的核苷酸 序列轉化微生物的步驟，其中所述經轉化微生物能夠將戊醛糖轉變成戊酮糖。又一方面，本發明提供用于制備能夠在戊醛糖存在下實現比轉化前的等同微生物 要更高的生長速率的經轉化微生物的方法，所述方法包括轉化微生物使得醛糖-1-差向異 構酶的表達上調的步驟，其中所述經轉化微生物能夠將戊醛糖轉變成戊酮糖。本發明還提供用于制備能夠實現比轉化前的等同微生物要更高的戊醛糖代謝的 經轉化微生物的方法，所述方法包括用編碼醛糖-ι-差向異構酶的核苷酸序列轉化微生物 的步驟，其中所述經轉化微生物能夠將戊醛糖轉變成戊酮糖。又一方面，本發明提供用于制備能夠實現比轉化前的等同微生物要更高的戊醛糖 代謝的經轉化微生物的方法，所述方法包括轉化微生物使得醛糖-ι-差向異構酶的表達上 調的步驟，其中所述經轉化微生物能夠將戊醛糖轉變成戊酮糖。又一方面，本發明提供用于生成戊糖衍生化合物的方法，其中所述方法包括在培 養基中培養依照本發明的微生物或通過本發明的方法制備的微生物。又一方面，本發明提供用于生成戊糖衍生化合物的方法，其包括下述步驟(a)用編碼醛糖-1-差向異構酶的核苷酸序列轉化微生物，其中所述經轉化微生 物能夠將戊醛糖轉變成戊酮糖；并(b)在培養基中培養該經轉化微生物。又一方面，本發明提供用于生成戊酮糖的方法，其中所述方法包括在培養基中培 養依照本發明的微生物或通過本發明的方法制備的微生物。
又一方面，本發明提供用于生成戊酮糖的方法，其包括下述步驟(a)用編碼醛糖-1-差向異構酶的核苷酸序列轉化微生物，其中所述經轉化微生 物能夠將戊醛糖轉變成戊酮糖；并(b)在培養基中培養該經轉化微生物。本文所述戊酮糖可以在細胞內被進一步代謝，推動一系列產物的生成，包括但不 限于乙醇，乳酸，琥珀酸，乙酸，乙醛，衣康酸，甲酚，3-羥基丙酸，聚-3-羥基鏈烷酸鹽/ 酯，原兒茶酸，焦兒茶酚，愈創木酚，藜蘆醚，香草醛，香草酸，香草醇，己二烯二酸，己二酸， 4-羥基苯甲酸，4-羥基苯甲醛，4-甲氧基苯甲酸，4-氨基苯甲酸鹽/酯，4-羥基苯胺，4-甲 氧基苯胺，對苯二酚，苯甲醚，酚，鄰氨基苯甲酸，3-羥基鄰氨基苯甲酸鹽/酯，2，3- 二羥基 苯甲酸，2-氨基苯酚，1，4_環己二酮和芳香族氨基酸。另一方面，本發明提供用于生成生物燃料的方法，其中所述方法包括在培養基中 培養依照本發明的微生物或通過依照本發明的方法制備的微生物的步驟。另一方面，本發明提供用于制備能夠在培養基中以比轉化前的等同微生物要更高 的速率生成生物燃料的經轉化微生物的方法，所述方法包括用編碼醛糖-ι-差向異構酶的 核苷酸序列(優選在編碼它的表達載體中)轉化微生物的步驟，其中所述經轉化微生物能 夠將戊醛糖轉變成戊酮糖。另一方面，本發明提供用于生成生物燃料的方法，其包括下述步驟(a)用編碼醛糖-1-差向異構酶的核苷酸序列(優選在編碼它的表達載體中)轉 化微生物，其中所述經轉化微生物能夠將戊醛糖轉變成戊酮糖；并(b)在包含戊醛糖的培養基中培養該經轉化微生物。又一方面，本發明提供用于生成生物燃料的方法，其中所述方法包括在培養基中 培養微生物的步驟，其中所述微生物包含編碼醛糖-1-差向異構酶的核苷酸序列且其中所 述微生物能夠表達所述醛糖-1-差向異構酶；且其中所述微生物能夠將戊醛糖轉變成戊酮 糖。又一方面，本發明提供通過依照本發明的方法獲得的或可獲得的生物燃料。另一方面，本發明提供依照本發明的微生物或通過本發明的方法制備的微生物用 于生成戊酮糖的用途。另一方面，本發明提供依照本發明的微生物或通過本發明的方法制備的微生物用 于生成戊糖衍生化合物的用途。另外，本發明提供依照本發明的微生物或通過本發明的方法制備的微生物用于生 成生物燃料的用途。另一方面，本發明提供微生物用于生成生物燃料的用途，其中所述微生物包含編 碼醛糖-1-差向異構酶的核苷酸序列，且其中所述微生物能夠表達所述醛糖-1-差向異構 酶，且其中所述微生物能夠將戊醛糖轉變成戊酮糖。又一方面，本發明提供包含依照本發明的微生物或通過依照本發明的方法制備的 微生物的接種物。另外，本發明提供包含依照本發明的微生物或通過依照本發明的方法制備的微生 物的培養液。一些優點
有利地，通過使用依照本發明的微生物，能生成生物燃料(諸如乙醇)。另一個優點在于通過使用依照本發明的微生物，能有效使用戊糖生成生物燃料 (諸如乙醇)。不希望受理論束縛，修飾微生物以表達或過表達醛糖-1-差向異構酶容許提 高各戊醛糖異頭物之間的互相轉變和細胞內戊醛糖變成戊酮糖的轉變的速率-換言之，它 減輕限速約束-這繼而容許通過戊糖磷酸途徑比修飾前的等同微生物要更快且更有效地 生成乙醇。更有利地，通過使用依照本發明的微生物，能自廢物材料諸如農業廢物(包括谷 類稈-諸如小麥稈；甜菜漿；甘蔗渣；秣(stover)-諸如高粱、大豆、玉蜀黍或玉米秣；和木 屑)生成生物燃料。憑借本發明，不需要(或需要降低)使用在其它情況中能用作人的食 物來源和/或動物飼料的材料(諸如甘蔗提取物、甜菜提取物、高粱淀粉、玉蜀黍淀粉、小麥 淀粉或玉米淀粉)。最有利地，本發明提供能夠為大規模生產(諸如工業生產)將戊糖(諸如戊醛糖) 代謝成生物燃料(諸如包含乙醇的生物燃料)的微生物。有利地，依照本發明的微生物能夠通過戊糖發酵最佳地使用通過木質纖維素材料 水解而釋放的糖。本發明能夠生成與基于石油的運輸燃料相比要更(X)2中性的生物燃料。與生成典 型的基于石油的運輸燃料(化石燃料)相比，憑借本發明，在依照本發明生成生物燃料時 CO2排放會較低(甚至更低)。驚人地，本發明顯示轉化微生物以表達醛糖-1-差向異構酶導致戊糖變成生物燃 料的轉變速率升高。附圖簡述

圖1。代謝途徑的示意圖，詳繪了兩種最豐富的戊醛糖，D-木糖和L-阿拉伯糖的 代謝。這兩種戊醛糖被轉變成戊酮糖，并被進一步轉變成D-木酮糖5-磷酸。不希望受理論 束縛，如圖中所示，一種類型的途徑(醛糖還原酶型)見于真菌，而另一種類型的途徑(異 構酶型)見于細菌。在真菌途徑類型中，第一種酶可以稱作“D-木糖還原酶”和“L-阿拉伯 糖還原酶”，但是常常同一種酶能還原D-木糖和L-阿拉伯糖二者，而且可以然后服務于這 兩種途徑且稱作不太特異性的名稱“醛糖還原酶”。圖2。不希望受理論束縛，圖2顯示一些不太豐富的戊糖(D-和L-來蘇糖，D-核 糖)的真菌和細菌類型的代謝途徑的示意圖，詳繪了初始代謝直至進入戊糖磷酸途徑。圖3。戊糖磷酸途徑(PPP)的非氧化性部分的示意圖。圖4。戊糖磷酸途徑(PPP)的示意圖。在這里，可以自D-木糖或L-阿拉伯糖衍生 的戊酮糖木酮糖-5-磷酸在厭氧條件下被進一步代謝成乙醇。XI指木糖異構酶，而XK指木 酮糖激酶。顯示了進入該過程的木糖凈輸入和離開該過程的乙醇凈輸出(凈過程)。發明詳述如本文中使用的，短語“能夠以比轉化前的等同微生物要更高的速率將戊醛糖轉 變成戊酮糖的經轉化微生物”涵蓋經編碼醛糖-ι-差向異構酶的核苷酸序列諸如包含所述 核苷酸序列的表達載體轉化的微生物和經轉化以上調醛糖-ι-差向異構酶表達(換言之過 表達醛糖-1-差向異構酶)的微生物。在一個實施方案中，微生物已經用引起微生物過表達醛糖-1-差向異構酶的核苷酸序列轉化。例如，將啟動子插入微生物的基因組，這使得微生物能夠過表達編碼醛 糖-ι-差向異構酶的內源核苷酸序列。在另一個實施方案中，微生物已經用編碼醛糖-1-差向異構酶的核苷酸序列轉 化。例如，微生物用包含可操作連接至調節序列的，編碼醛糖-ι-差向異構酶的核苷酸序列 的表達載體轉化。優選地，本文所述編碼醛糖-1-差向異構酶的核苷酸序列在編碼它的表達載體 中。優選地，本文所述表達載體包含能夠過表達編碼醛糖-1-差向異構酶的核苷酸序 列的啟動子。此類啟動子的例子包括GPD啟動子、TEF啟動子和ADP啟動子。可用于過表 達醛糖-ι-差向異構酶的優選啟動子可以是任何控制編碼涉及糖酵解和葡萄糖發酵的蛋 白質的核苷酸序列表達的調節元件。如本文中使用的，短語“能夠以比轉化前的等同微生物要更高的速率將戊醛糖轉 變成戊酮糖的經轉化微生物”中的術語“更高的速率”指經轉化微生物能夠降低培養液中戊 醛糖的量，使得在相同培養條件下培養指數生長期內的給定時間段時，培養液中戊醛糖的 量的降低比轉化前的等同微生物要多至少5%UO^dOW或25%每細胞。術語“指數生長期”以本領域普通含義使用-例如微生物以恒定速率分裂，使得微 生物總數在每次分裂后加倍。技術人員能容易地為任何微生物為給定培養條件集確定延滯 期(細胞在指數生長開始前適應新環境的時段)、指數生長期、穩定期(細胞分裂速率等于 細胞死亡速率，因此存活細胞數保持恒定的時段)和死亡期(存活數下降的時段)。如本文中使用的，術語“轉化前的等同微生物”指用編碼醛糖-1-差向異構酶的核 苷酸序列轉化前的或用引起醛糖-1-差向異構酶上調(例如過表達)的核苷酸序列轉化前 的微生物。如本文中使用的，術語“戊醛糖轉變成戊酮糖”指例如戊醛糖木糖轉變成戊酮糖木 酮糖；戊醛糖阿拉伯糖轉變成戊酮糖木酮糖；戊醛糖阿拉伯糖轉變成戊酮糖核酮糖；戊醛 糖來蘇糖轉變成戊酮糖木酮糖；和戊醛糖核糖轉變成戊酮糖核酮糖。在一個優選的方面，戊酮糖是木酮糖。如本文中使用的，術語“能夠將戊醛糖轉變成戊酮糖的經轉化微生物”指包含編碼 涉及戊醛糖轉變成戊酮糖的一種或多種多肽的一種或多種多核苷酸序列的微生物。能夠將 戊醛糖轉變成戊酮糖的多肽的例子包括木糖異構酶、阿拉伯糖異構酶、D-來蘇糖異構酶、和 核糖異構酶；木糖還原酶和木酮糖還原酶的組合，阿拉伯糖還原酶、L-阿拉伯糖醇4-脫氫 酶、L-木酮糖還原酶和D-木酮糖還原酶的組合，及D-來蘇糖還原酶和D-阿拉伯糖醇脫氫 酶的組合。多肽對于所述微生物可以是內源的和/或外源的。多肽可以由一種或多種表達 載體來編碼。優選地，戊醛糖選自下組木糖，阿拉伯糖，核糖和來蘇糖。優選地，戊醛糖是木糖 或阿拉伯糖。更優選地，戊醛糖是木糖。微生物中α-戊醛糖和β-戊醛糖之間的自發轉變是緩慢的。例如，β-D-木糖 變成α -D-木糖的自發轉變在生理溫度具有約0. 094/min的一級K值(Bailey等，1969)。如本文中使用的，短語“引起微生物過表達醛糖-1-差向異構酶的核苷酸序列”和 “能夠過表達編碼醛糖-ι-差向異構酶的核苷酸序列的啟動子”中的術語“過表達”指在比較經轉化微生物與轉化前的等同微生物時，表達自零升高至某表達水平或自較低的表達水 平升高至較高的表達水平(例如上調)。過表達醛糖-ι-差向異構酶的微生物具有升高的 催化α-戊醛糖和β-戊醛糖之間的轉變的能力。優選地，所述過表達醛糖-1-差向異構酶的經轉化微生物能夠以比未轉化的微生 物要高至少10%、15%、20%或25%的速率催化α-戊醛糖轉變成β-戊醛糖，在如下的測 定法中測量，將Ig破碎的細胞量添加至50ml新鮮制備的含有IOOmM β-戊醛糖的緩沖中性 溶液，使用本文中稍后描述的互相轉變測定法。過表達醛糖-1-差向異構酶的微生物的例子包括⑴經編碼醛糖-1-差向異構 酶的表達載體轉化的微生物(在轉化之前，所述微生物不能夠表達醛糖-ι-差向異構酶)； 和(ii)經轉化以上調內源醛糖-1-差向異構酶表達的微生物(在轉化之前，所述微生物 能夠在指數生長期間對于給定的培養條件集表達所述醛糖-1-差向異構酶，但是在轉化之 后，所述微生物能夠在指數生長期間在相同培養條件中以更高的水平表達所述醛糖-1-差 向異構酶)。如本文中使用的，短語“能夠在戊醛糖存在下實現比轉化前的等同微生物要更高 的生長速率的經轉化微生物”中的術語“更高的生長速率”指經轉化微生物能夠實現升高的 生長速率，使得在相同培養條件下培養時指數生長期期間每ml微生物數加倍所花費的時 間比轉化前的等同微生物要少至少10^^15^^20%或25%。在一個優選的方面，微生物以 它們的最適生長溫度培養；且優選地，在最適量的鹽、維生素和微生物所必需的其它養分之 外，培養基包含介于和4%之間的戊醛糖。如本文中使用的，短語“能夠實現比轉化前的等同微生物要更高的戊醛糖代謝的 經轉化微生物”中的術語“更高的代謝”指經轉化微生物能夠代謝戊醛糖，使得在相同培養 條件下培養指數生長期內的給定時間段時，培養液中戊醛糖的消耗量比轉化前的等同微生 物高至少10^^20^^25%,30%或35%每細胞。在一個優選的方面，微生物以它們的最適 生長溫度培養；且優選地，在最適量的鹽、維生素和微生物所必需的其它養分之外，培養基 包含介于和4%之間的戊醛糖。優選地，依照本發明的經轉化微生物所具有的將戊醛糖轉變成戊酮糖的速率處于 比轉化前的等同微生物要更高的水平。此短語中使用的術語“更高的水平”指經轉化微生 物能夠轉變戊醛糖，使得在相同培養條件下培養指數生長期內的給定時間段時，培養液中 戊醛糖的量的降低比轉化前的等同微生物要多至少5110120%或25%每細胞。如本文中使用的，術語“編碼醛糖-1-差向異構酶的核苷酸序列”涵蓋包含調節 序列的核苷酸序列，調節序列使得編碼醛糖-1-差向異構酶的核苷酸序列能夠表達，諸如 啟動子和增強子，它們可以是與編碼醛糖-1-差向異構酶的核苷酸序列天然或非天然關聯 的。如本文中使用的，短語“能夠在培養基中以比轉化前的等同微生物要更高的速率 生成生物燃料的經轉化微生物”中的術語“更高的速率”指在相同培養條件下培養指數生 長期內的給定時間段時，經轉化微生物能夠生成比轉化前的等同微生物多至少10%、20%、 25%、30%或35%的生物燃料每細胞。優選地，微生物以它們的最適生產環境(例如最適 氧分壓和攪動速度)培養，且優選地，在最適量的鹽、維生素和微生物所必需的其它養分之 外，培養基包含介于2 %和6 %之間的戊醛糖。
優選地，用于生成生物燃料的方法進一步包括自培養液獲得生物燃料的步驟。經轉化微生物如本文所述，術語“經轉化微生物”指通過重組DNA技術已經遺傳改變的微生物。 如本文中使用的，術語“經轉化”與術語諸如“經轉染”、“重組”、“經遺傳工程改造”和“經遺 傳修飾”同義。涉及本發明的術語“經轉化微生物”包括任何包含如下的表達載體的微生物，所述 表達載體包含本文所述核苷酸序列和/或能夠容許本文所述核苷酸序列表達(特別是過表 達即上調)的啟動子。在一個實施方案中，將核苷酸序列摻入微生物的基因組。在另一個實 施方案中，將啟動子摻入微生物的基因組。這些特征使得經轉化微生物(在與轉化前的等 同微生物比較時)能夠⑴以更高的速率代謝戊醛糖；和/或(ii)具有更高的生長速率； 和/或(iii)以更高的速率生成戊酮糖；和/或(iv)以更高的速率生成戊糖衍生化合物； 和/或(ν)以更高的速率生成生物燃料。術語“經轉化微生物”不涵蓋在它們的天然啟動子(在其天然環境中的)控制下 的天然核苷酸編碼序列(在其天然環境中的)。因此，本發明的經轉化微生物包括包含下述任一項或其組合的微生物編碼本文 所述酶的核苷酸序列，包含所述核苷酸序列的構建物，包含所述核苷酸序列的載體，包含所 述核苷酸序列的質粒和包含所述核苷酸序列的表達載體。如此，本發明的又一個實施方案提供經表達本文所述酶的核苷酸序列轉化或轉染 的微生物。微生物會選擇成與載體相容，而且可以是例如細菌、真菌或酵母細胞。合適的細菌宿主生物體的例子是革蘭氏陽性或革蘭氏陰性細菌物種。根據編碼本文所述酶的核苷酸序列的性質，真核宿主諸如酵母或其它真菌可能是 優選的。一般地，優選酵母細胞勝過真菌細胞，因為它們易于操作。合適的微生物-諸如酵母和真菌宿主細胞-的使用可提供翻譯后修飾(例如肉豆 蔻酰化、糖基化、截短、脂化和酪氨酸、絲氨酸或蘇氨酸磷酸化)，因為它們可能是賦予本文 所述重組表達產物以最佳生物學活性所需要的。合適的微生物包括細菌、真菌和酵母。優選地，微生物是酵母或細菌。優選地，所述經轉化微生物是經轉化酵母。優選地，所述經轉化酵母衍生自糖酵母 屬/酵母屬(genus Saccharomyces)。更優選地，所述經轉化酵母是啤酒糖酵母/釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)0在另一個實施方案中，優選地，所述經轉化微生物是經轉化細菌。優選地，所述經 轉化細菌衍生自發酵單胞菌屬(genus Zymomonas)或發酵桿菌屬(genus Zymobacter) 0 更優選地，所述經轉化細菌是運動發酵單胞菌(Zymomonas mobilis)或棕櫚發酵桿菌 (Zymobacter palmae)0在一個實施方案中，本文所述經轉化微生物在包含戊醛糖的培養基中培養時以比 轉化前的等同微生物要更高的速率代謝戊醛糖。另一方面，本文所述經轉化微生物在包含戊醛糖的培養基中培養時的生長速率比 轉化前的等同微生物要更高。又一方面，本文所述經轉化微生物在包含戊醛糖的培養基中培養時能夠以比轉化 前的等同微生物要更高的速率生成戊酮糖。
另一方面，本文所述經轉化微生物在包含戊醛糖的培養基中培養時能夠以比轉化 前的等同微生物要更高的速率生成生物燃料。微生物可以使用本領域例行的技術諸如電穿孔(Sambrook等，1989)來轉化。另 外，經轉化微生物中序列的存在可以通過合適培養基上的生長選擇來確定，所述合適培養 基選擇經轉化微生物的生長。或者/另外，插入的異源DNA序列的存在可以通過使用為插 入的序列專門設計的引物進行的直接菌落PCR來確定。此類技術是本領域公知的且例行的 (參見例如 Sambrook 等，1989 和 Ausubel 等，1995)。依照本發明的經轉化微生物可以與一種或多種依照本發明的經轉化微生物組合使用。例如，一種或多種能夠將D-木糖轉變成D-木酮糖的依照本發明的經轉化微生物 可以與選自下組的一種或多種微生物組合使用能夠將L-阿拉伯糖轉變成D-木酮糖的依 照本發明的經轉化微生物；能夠將L-阿拉伯糖轉變成L-核酮糖的依照本發明的經轉化微 生物；能夠將D-來蘇糖轉變成D-木酮糖的依照本發明的經轉化微生物；和能夠將D-核糖 轉變成D-核酮糖的依照本發明的經轉化微生物。又例如，一種或多種能夠將L-阿拉伯糖轉變成D-木酮糖的依照本發明的經轉化 微生物可以與選自下組的一種或多種微生物組合使用能夠將D-木糖轉變成D-木酮糖的 依照本發明的經轉化微生物；能夠將L-阿拉伯糖轉變成L-核酮糖的依照本發明的經轉化 微生物；能夠將D-來蘇糖轉變成D-木酮糖的依照本發明的經轉化微生物；和能夠將D-核 糖轉變成D-核酮糖的依照本發明的經轉化微生物。又例如，一種或多種能夠將L-阿拉伯糖轉變成L-核酮糖的依照本發明的經轉化 微生物可以與選自下組的一種或多種微生物組合使用能夠將D-木糖轉變成D-木酮糖的 依照本發明的經轉化微生物；能夠將L-阿拉伯糖轉變成D-木酮糖的依照本發明的經轉化 微生物；能夠將D-來蘇糖轉變成D-木酮糖的依照本發明的經轉化微生物；和能夠將D-核 糖轉變成D-核酮糖的依照本發明的經轉化微生物。又例如，一種或多種能夠將D-來蘇糖轉變成D-木酮糖的依照本發明的經轉化微 生物可以與選自下組的一種或多種微生物組合使用能夠將L-阿拉伯糖轉變成D-木酮糖 的依照本發明的經轉化微生物；能夠將L-阿拉伯糖轉變成L-核酮糖的依照本發明的經轉 化微生物；能夠將D-木糖轉變成D-木酮糖的依照本發明的經轉化微生物；和能夠將D-核 糖轉變成D-核酮糖的依照本發明的經轉化微生物。又例如，一種或多種能夠將D-核糖轉變成D-核酮糖的依照本發明的經轉化微生 物可以與選自下組的一種或多種微生物組合使用能夠將L-阿拉伯糖轉變成D-木酮糖的 依照本發明的經轉化微生物；能夠將L-阿拉伯糖轉變成L-核酮糖的依照本發明的經轉化 微生物；能夠將D-來蘇糖轉變成D-木酮糖的依照本發明的經轉化微生物；和能夠將D-木 糖轉變成D-木酮糖的依照本發明的經轉化微生物。依照本發明的經轉化微生物可以與一種或多種別的微生物組合使用。例如，一種 或多種依照本發明的經轉化微生物可以與能夠在某些培養條件下生成選自下列的多種成 分之一的至少一種微生物組合培養乙醇，乳酸，琥珀酸，乙酸，乙醛，衣康酸，甲酚，3-羥基 丙酸，聚-3-羥基鏈烷酸鹽/酯，原兒茶酸，焦兒茶酚，愈創木酚，藜蘆醚，香草醛，香草酸，香 草醇，己二烯二酸，己二酸，4-羥基苯甲酸，4-羥基苯甲醛，4-甲氧基苯甲酸，4-氨基苯甲酸鹽/酯，4-羥基苯胺，4-甲氧基苯胺，對苯二酚，苯甲醚，酚，鄰氨基苯甲酸，3-羥基鄰氨基苯 甲酸鹽/酯，2，3- 二羥基苯甲酸，2-氨基苯酚，1,4-環己二酮和芳香族氨基酸。又一方面，提供下述各項的組合(i) 一種或多種依照本發明的經轉化微生物和 (ii)至少一種能夠在某些培養條件下生成選自下列的多種成分之一的別的微生物乙醇， 乳酸，琥珀酸，乙酸，乙醛，衣康酸，甲酚，3-羥基丙酸，聚-3-羥基鏈烷酸鹽/酯，原兒茶酸， 焦兒茶酚，愈創木酚，藜蘆醚，香草醛，香草酸，香草醇，己二烯二酸，己二酸，4-羥基苯甲酸， 4-羥基苯甲醛，4-甲氧基苯甲酸，4-氨基苯甲酸鹽/酯，4-羥基苯胺，4-甲氧基苯胺，對苯 二酚，苯甲醚，酚，鄰氨基苯甲酸，3-羥基鄰氨基苯甲酸鹽/酯，2，3- 二羥基苯甲酸，2-氨基 苯酚，1,4-環己二酮和芳香族氨基酸。另外，本發明提供包含上述組合之一的接種物。另外，提供包含上述組合之一的培養液。另外，本發明提供包含下述各項的試劑盒(i)包含一種或多種依照本發明的微 生物的接種物和(ii)包含一種或多種本文所述別的微生物的接種物。表達載體術語“表達載體”指能夠在體內或在體外表達的構建物。一方面，將表達載體摻入合適微生物的基因組。術語“摻入”優選涵蓋穩定摻入基 因組。本文所述核苷酸序列可以存在于載體中，其中核苷酸序列可操作連接至調節序 列，其能夠提供合適宿主微生物對核苷酸序列的表達。將載體轉化入本文所述合適宿主微生物。載體的選擇(例如質粒、粘粒、或噬菌體載體)常常會取決于它要導入的微生物。供本文中使用的載體可以含有一種或多種選擇標志核苷酸序列-諸如賦予抗生 素抗性的核苷酸序列，例如氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素或四環素抗性。或者，可以通過共 轉化來實現選擇(如W091/17243中記載的)。載體可以在體外使用，例如轉染、轉化、轉導或感染宿主微生物。載體可以進一步包含使得載體能夠在所討論的宿主微生物中復制的核苷酸序列。 此類序列的例子是質粒pUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMBl和pIJ702的復制起點。在一個優選的方面，如本文所述能夠將戊醛糖轉變成戊酮糖的微生物包含編碼醛 糖-1-差向異構酶的核苷酸序列。優選地，如本文所述的表達載體包含編碼醛糖-1-差向異構酶的核苷酸序列。優選地，如本文所述能夠將戊醛糖轉變成戊酮糖的微生物包含至少一種編碼木糖 還原酶和/或D-木酮糖還原酶的表達載體。在另一個優選的方面，如本文所述能夠將戊醛糖轉變成戊酮糖的微生物包含編碼 木糖還原酶的表達載體和編碼D-木酮糖還原酶的表達載體。又一方面，優選地，如本文所述能夠將戊醛糖轉變成戊酮糖的微生物包含至少一 種編碼木糖異構酶的表達載體。另一方面，優選地，如本文所述能夠將戊醛糖轉變成戊酮糖的微生物包含至少一 種編碼阿拉伯糖還原酶和/或L-阿拉伯糖醇4-脫氫酶和/或L-木酮糖還原酶和/或D-木 酮糖還原酶的表達載體。
在又一個優選的方面，如本文所述能夠將戊醛糖轉變成戊酮糖的微生物包含編碼 阿拉伯糖還原酶的表達載體、編碼L-阿拉伯糖醇4-脫氫酶的表達載體、編碼L-木酮糖還 原酶的表達載體、和編碼D-木酮糖還原酶的表達載體。在又一個優選的方面，如本文所述能夠將戊醛糖轉變成戊酮糖的微生物包含編碼 L-阿拉伯糖異構酶的表達載體。優選地，另一方面，如本文所述能夠將戊醛糖轉變成戊酮糖的微生物包含至少一 種編碼L-阿拉伯糖異構酶和/或核酮糖激酶和/或核酮糖磷酸4-差向異構酶的表達載體。在又一個優選的方面，如本文所述能夠將戊醛糖轉變成戊酮糖的微生物包含編碼 L-阿拉伯糖異構酶的表達載體、編碼核酮糖激酶的表達載體、和編碼核酮糖磷酸4-差向異 構酶的表達載體。在另一個優選的方面，如本文所述能夠將戊醛糖轉變成戊酮糖的微生物包含至少 一種編碼D-來蘇糖異構酶的表達載體。在又一個優選的方面，如本文所述能夠將戊醛糖轉變成戊酮糖的微生物包含編碼 D-核糖異構酶的表達載體。優選地，另一方面，如本文所述能夠將戊醛糖轉變成戊酮糖的微生物可進一步包 含至少一種編碼選自下組的一種或多種酶的表達載體木酮糖激酶，D-核酮糖激酶，核 糖-5-磷酸異構酶，核酮糖-5-磷酸差向異構酶，轉醛醇酶，轉酮醇酶和戊糖磷酸途徑的任 何其它酶。優選地，所述如本文所述能夠將戊醛糖轉變成戊酮糖的微生物進一步包含至少 一種編碼木酮糖激酶和/或D-核酮糖激酶的表達載體。更優選地，所述如本文所述能夠將 戊醛糖轉變成戊酮糖的微生物進一步包含至少一種編碼木酮糖激酶的表達載體。在另一個 實施方案中，優選地，如本文所述能夠將戊醛糖轉變成戊酮糖的微生物進一步包含至少一 種編碼核酮糖-5-磷酸差向異構酶和/或核糖-5-磷酸異構酶和/或轉醛醇酶和/或轉酮 醇酶的表達載體。一方面，如本文所述的表達載體可進一步編碼選自下組的一種或多種酶醛 糖-1-差向異構酶，木糖還原酶，D-木酮糖還原酶，木糖異構酶，阿拉伯糖還原酶，L-阿拉伯 糖醇4-脫氫酶，L-木酮糖還原酶，L-阿拉伯糖異構酶，核酮糖激酶，核酮糖磷酸4-差向異 構酶，D-來蘇糖異構酶，D-核糖異構酶，木酮糖激酶，D-核酮糖激酶，核酮糖-5-磷酸差向 異構酶，核糖-5-磷酸異構酶，轉醛醇酶，和轉酮醇酶。一方面，如本文所述的表達載體可進一步編碼選自下組的一種或多種酶木酮糖 激酶，D-核酮糖激酶，核糖-5-磷酸異構酶，D-核酮糖-5-磷酸差向異構酶，轉醛醇酶，轉酮 醇酶和戊糖磷酸途徑的任何其它酶。在一個優選的方面，如本文所述的表達載體進一步編 碼木酮糖激酶和/或D-核酮糖激酶。更優選地，所述如本文所述的表達載體進一步編碼木 酮糖激酶。在另一個實施方案中，優選地，如本文所述的表達載體進一步編碼核酮糖-5-磷 酸差向異構酶和/或核糖-5-磷酸異構酶和/或轉醛醇酶和/或轉酮醇酶。在另一個更優 選的實施方案中，優選地，如本文所述的表達載體進一步編碼核糖-5-磷酸異構酶和/或轉 醛醇酶和/或轉酮醇酶。在一個優選的方面，如本文所述能夠將戊醛糖轉變成戊酮糖的微生物進一步包含 至少一種編碼醛糖-ι-差向異構酶的表達載體。優選地，如本文所述的表達載體進一步包含編碼醛糖-1-差向異構酶的核苷酸序列。調節序列在一些應用中，將本文所述核苷酸序列可操作連接至調節序列，其能夠提供核苷 酸序列的表達，諸如由所選擇的微生物進行。舉例而言，本發明涵蓋使用如下的載體，其包 含可操作連接至此類調節序列的本文所述核苷酸序列，即所述載體是表達載體。術語“可操作連接”指如下的并置，其中所述成分的關系容許它們以它們的預定方 式發揮功能。“可操作連接”至編碼序列的調節序列以如下方式連接，即在與控制序列相容 的條件下實現編碼序列的表達。術語“調節序列”包括啟動子和增強子和其它表達調節信號。術語“啟動子”以本領域普通含義使用，例如RNA聚合酶結合位點。編碼本文所述酶的核苷酸序列的增強的表達還可以通過選擇異源調節區來實現， 例如啟動子、分泌前導序列和終止子區。優選地，將本文所述核苷酸序列可操作連接至至少一種啟動子。其它啟動子可同樣用于指導本文所述多肽的表達。用于在細菌、真菌或酵母細胞中指導核苷酸序列轉錄的合適啟動子的例子是本領 域公知的。啟動子可另外包括特征以確保或提高合適宿主中的表達。例如，所述特征可以是 保守區，諸如I^ribnow框或TATA框。構建物術語“構建物”-其與術語諸如“綴合物”、“盒”和“雜合物”同義-包括直接或間 接附著至啟動子的本文所述核苷酸序列。間接附著的一個例子是在啟動子和本文所述核苷酸序列中間提供合適的間隔物 基團，諸如內含子序列，諸如Shl內含子或ADH內含子。涉及本發明的術語“融合”也是如 此，其包括直接或間接附著。在一些情況中，這些術語不覆蓋天然組合的編碼通常與野生型 基因啟動子有關的蛋白質且它們都處于天然環境中時的核苷酸序列。構建物甚至可以含有或表達標志物，其容許選擇遺傳構建物。對于一些應用，優選地，構建物至少包含可操作連接至啟動子的本文所述核苷酸 序列。啟動子如本文所述，一方面，本發明涉及已經用引起微生物過表達醛糖-1-差向異構酶 的核苷酸序列，諸如啟動子轉化的微生物。例如，將啟動子插入微生物的基因組，這使得微生物能夠過表達(例如上調)編碼 醛糖-1-差向異構酶的內源核苷酸序列。另一方面，將啟動子可操作連接至例如表達載體中的核苷酸序列。另一方面，啟動子不受葡萄糖的存在遏制。能在依照本發明的微生物，諸如釀酒酵母中使用的合適啟動子的例子包括甘油 醛-3-磷酸脫氫酶(GPD)基因的啟動子；醇脫氫酶(ADH)基因的啟動子；促甲狀腺胚胎因子 (TEF)基因的啟動子。能在運動發酵單胞菌中和在棕櫚發酵桿菌中使用的合適啟動子的例 子包括發酵單胞菌甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動子(Conway等，1987)和發酵單胞菌烯醇化酶啟動子(Burnett 等，1992)。 可用于過表達醛糖-1-差向異構酶的優選啟動子可以是控制編碼涉及糖酵解和 葡萄糖發酵的蛋白質的核苷酸序列表達的任何調節元件。例子包括但不限于
能夠表達PGI1基因的P-Pgi啟動子，所述啟動子包含此基因和可讀框YBR197C之 間的核苷酸序列；能夠表達TPIl基因的P-tpi啟動子，所述啟動子包含此基因和可讀框YDR051C之 間的核苷酸序列；能夠表達HXK2基因的P-hxk啟動子，所述啟動子包含此基因和基因FZFl之間的 核苷酸序列；能夠表達PHQ基因的ρ-pfk啟動子，所述啟動子包含此基因和基因YAP1802之間 的核苷酸序列；能夠表達ΕΝ02基因的P-eno啟動子，所述啟動子包含此基因和基因SPC97之間的 核苷酸序列；能夠表達TDH3基因的P-tdh啟動子，所述啟動子包含此基因和基因PDXl之間的 核苷酸序列；能夠表達FBAl基因的P-fba啟動子，所述啟動子包含此基因和基因MPEl之間的 核苷酸序列；能夠表達GPMl基因的P-gpm啟動子，所述啟動子包含此基因和可讀框IL151C之 間的核苷酸序列；能夠表達PDCl基因的P-pdc啟動子，所述啟動子包含此基因和基因STU2之間的 核苷酸序列；和，能夠表達PGM2基因的P-pgm啟動子，所述啟動子包含此基因和基因YKU80之間的 核苷酸序列。生物燃料如本文中使用的，術語“生物燃料”指適合于在(例如)內燃機中使用的燃料(例 如液體燃料)。所述生物燃料衍生自包含戊糖和/或通過酶手段和/或通過酸處理的水解 能衍生戊糖的生物學物質。優選地，所述戊糖是戊醛糖。植物材料-包括包含木質纖維素材料的植物廢物(例如谷類稈，諸如小麥稈；甜 菜漿；甘蔗渣；高粱秣；大豆秣；玉蜀黍秣；玉米秣；木屑；和紙漿)和完整植株(諸如那些 為能量目的而種植的，例如柳枝稷)_是用于本發明的戊糖，特別是戊醛糖的合適來源。植 物材料的其它合適來源包括非廢物產品(換言之，食物和飼料來源)諸如甘蔗提取物、甜菜 提取物、高粱、大豆、小麥淀粉和玉米淀粉。優選地，本文所述生物燃料包含至少一種醇。在一個優選的方面，醇選自下組甲醇，乙醇，丙醇和丁醇。更優選地，生物燃料包
含乙醇。優選地，所述生物燃料是自依照本發明的經轉化微生物已經在合適條件下培養的 培養液獲得的(或可獲得的)一換言之，提取(或可提取的)。所述生物燃料可以是使用本 領域常規技術自培養液獲得的(或可獲得的)，諸如通過離心除去微生物、分離上清液接著 蒸餾、和進一步的脫水步驟以產生99. 5%純的乙醇。
生物燃料可包含一種或多種別的生物燃料成分，諸如丁醇。可以在自培養物獲得或提取(可獲得的或可提取的)生物燃料之前和/或之后將 一種或多種別的生物燃料成分與生物燃料混合。或者/另外，可以在在培養基中培養依照本發明的經轉化微生物以生成生物燃料 之前和/或之后和/或同時通過在培養基中培養微生物來生成一種或多種別的生物燃料成 分。本發明還提供包含使用依照本發明的微生物生成的生物燃料的運輸燃料。用作運輸燃料的乙醇可用于兩種不同目的(i)它能起氧化添加劑(oxygenated additive)的作用以提高辛烷值和降低新配 方汽油(RFG)(四乙鉛或MTBE替代物)排放。(ii)它能起常規汽油(RG)部分或完全替代品的作用以降低對汽油供給的依賴性。無水乙醇具有130的辛烷值，而且能以5-10%的濃度(取決于季節)添加至直接 自精煉廠獲得的常規汽油。傳統上，將四乙鉛用于提高辛烷，然而，由于健康問題，幾乎全世 界都禁止使用鉛。向常規汽油添加氧化劑(oxygenate)降低一氧化碳排放以及造成空氣 污染的其它顆粒。甲基叔丁基醚(MTBE)最初用作氧化添加劑，然而，飲用水含水層中MTBE 污染的發生促使一些州禁止使用這種氧化劑。乙醇在全世界日益用作MTBE的替代物，作為 RFG制造的氧化添加劑。在充當新配方汽油生產中的氧化添加劑之外，乙醇可用作常規汽油的一般替代 品。在發動機沒有任何改變的情況中，汽車能使用ElO混合物(添加10%乙醇)。另外，已經制造了能以100%乙醇運行的交通工具-換言之，不需要基于化石的燃 料。依照本發明的經轉化微生物或通過依照本發明的方法制備的微生物能夠以比轉 化前的等同微生物要更高的速率生成生物燃料。如本文中使用的，術語“更高的速率”指在 相同培養條件下培養指數生長期內的給定時間段時，經轉化微生物能夠在培養液中生成比 轉化前的等同微生物多至少5 %、10 %、20 %、25 %、30 %或35 %的生物燃料(諸如生物乙 醇)每細胞。戊糖衍生化合物如本文中使用的，術語“戊糖衍生化合物”指任何自戊糖衍生的化合物。戊糖衍生 化合物可以是自戊醛糖衍生的。戊糖衍生化合物可以是自戊酮糖衍生的。戊糖衍生化合物的例子包括但不限于乙醇，芳香族氨基酸，甲酚，衣康酸，乳酸， 琥珀酸，乙酸，乙醛，聚-3-羥基鏈烷酸鹽/酯，和3-羥基丙酸。圖1顯示其它戊糖衍生化 合物，諸如自戊醛糖衍生的戊酮糖。可以將戊糖衍生產物轉變成其它產物。例如，可以經戊 糖磷酸途徑將自戊醛糖D-木糖衍生的戊酮糖D-木酮糖轉變成乙醇。優選地，所述戊糖衍生化合物是乙醇、乳酸、琥珀酸、乙酸、乙醛、衣康酸、甲酚、 3-羥基丙酸、聚-3-羥基鏈烷酸鹽/酯、原兒茶酸、焦兒茶酚、愈創木酚、藜蘆醚、香草醛、香 草酸、香草醇、己二烯二酸、己二酸、4-羥基苯甲酸、4-羥基苯甲醛、4-甲氧基苯甲酸、4-氨 基苯甲酸鹽/酯、4-羥基苯胺、4-甲氧基苯胺、對苯二酚、苯甲醚、酚、鄰氨基苯甲酸、3-羥基 鄰氨基苯甲酸鹽/酯、2，3_ 二羥基苯甲酸、2-氨基苯酚、1，4_環己二酮和芳香族氨基酸。
優選地，所述戊糖衍生化合物是乙醇、甲酚、衣康酸、乳酸、琥珀酸、和3-羥基丙酸。更優選地，所述戊糖衍生化合物是乙醇。培養基培養基包含至少一種戊糖。在一個優選的方面，培養基包含至少一種戊醛糖。優選地，經轉化微生物在所述微生物的最適培養基中培養。使用常規技術，可以確 定最適培養基；另外，可以確定最適生長條件。一方面，所述培養基在接種微生物(即在時間零)之前包含約1 %、約2%、約4%、 約8%、約15%或約25%戊醛糖。優選地，所述培養基包含最適量的鹽、維生素和微生物所必需的其它養分。微生物優選于它們的最適生長溫度培養。技術人員會容易地能夠確定培養本文所 述微生物的最適溫度。在一個實施方案中，微生物于約201、251、301、351、或371培養。在一個實施方案中，微生物于約35 °C至39 °C、優選約36 °C至38 V、更優選約 35. 5°C 至 37. 5°C 培養。優選地，微生物培養約3小時、約6小時、約15小時、約M小時、約48小時或約96 小時。一方面，微生物，特別是經轉化微生物，是醇耐受的和/或酸耐受的。涉及本發明的術語“醇耐受的”指微生物能夠在包含至少2^^5^^10%或15%醇 的培養基中生長。如本文所述，術語“酸耐受的”指微生物能夠在pH等于或小于6. 5,6. 0,5. 0、4. 0或
3.0的培養基中生長。在一個優選的方面，給培養基接種至少切107至^clO11個細胞每kg培養基，優選 5xl08至^cIOiq個細胞每kg培養基，優選IxlO9至IXIOiq個細胞每kg培養基和更優選約 5xl09個細胞每kg培養基。術語“接種物”和“起始培養物”可互換使用。戊糖的來源戊糖(特別是戊醛糖)衍生或可衍生自植物。戊糖(特別是戊醛糖)可衍生自通常用作食物或飼料來源的植物材料(諸如甘 蔗、甜菜、高粱、小麥和玉米-它們是富含淀粉和富含糖的植物材料)；完整植株(諸如那些 為能量目的而種植的，例如柳枝稷)；和，特別地，廢物農業(植物)材料(諸如谷類稈，例 如小麥稈；甜菜漿；渣，例如甘蔗渣；秣，例如高粱、大豆、玉蜀黍或玉米秣；和木屑)。用于本文所述培養基的戊糖的來源包括通常視為農業廢物材料的木質纖維素材 料。莖/干、柄梗和葉含有木質纖維素材料。甘蔗渣、玉米秣和木屑(只有半纖維素)是三 種最容易獲得的木質纖維素材料來源，因為這些在各個季節易于大量收集或儲存。木質纖維素材料主要由長鏈糖組成。平均而言，三分之二的這些糖是己糖，它們主 要以纖維素存在，而且三分之一的糖是戊糖，主要以阿拉伯糖基木聚糖聚合物存在。顯著量的半纖維素衍生戊糖是木糖。可以水解木質纖維素材料以釋放纖維素、半纖維素和木質素的長鏈糖中的己糖和/或戊糖。木質纖維素材料的水解可以通過升高的溫度的酸處理來進行。然而，這種處理可 生成糖衍生副產物，它們對大多數微生物有毒，而且阻止糖轉變成乙醇。可以除去此類有毒 副產物(如果生成的話)，但是這一般是不經濟的。或者，可以使用纖維素和半纖維素水解酶來水解木質纖維素材料。有利地，這種工 藝避免有毒副產物的生成。在一個優選的方面，培養基包含自一種或多種經處理以釋放己糖和/或戊糖的木 質纖維素材料(此類處理技術的例子包括蒸氣處理、蒸氣爆發、濕氧化、酸水解、堿性濕氧 化和氨纖維膨脹)衍生的材料。優選地，通過酶促水解工藝來處理木質纖維素材料。可以 進一步處理所述經水解的木質纖維素材料以提取糖，之后在培養基中使用所述提取物。木質纖維素材料的水解初步機械處理根據需要及在認為需要時，將木質纖維素材料砍成小片。例如，將小麥稈切成長度 為大約5cm的段。后續濕熱預處理木質纖維素材料的濕熱預處理可以以蒸汽預處理接著清洗步驟來進行，由此生成 纖維級分和液體級分。纖維級分含有超過90%的纖維素、最初存在于纖維素材料中的木質 素、和一些半纖維素。液體級分含有來自半纖維素的糖(C5糖)、超過90%的包含在木質纖 維素生物質中的堿金屬氯化物、和大部分自木質纖維素原料預處理產生的發酵抑制劑。典型地，通過蒸汽將小麥稈加熱至介于180和200°C之間的溫度，停留時間5_15分 鐘。自壓力反應器卸下經預處理的生物質，并清洗和擠壓。收集釋放的蒸汽，并再次用于液 體級分蒸發以進料糖蜜。酶促水解糖聚合物的后續水解可以通過添加纖維素酶和半纖維素酶來進行，或是在發酵之 前或是在發酵期間或是二者，就像同步糖化和發酵工藝等。己糖己糖具有6個碳原子。己醛糖在1位具有醛，而己酮糖在2位具有酮。葡萄糖是 己醛糖的例子。果糖是己酮糖的例子。戊糖戊糖具有5個碳原子。戊糖或是具有1位醛官能團(戊醛糖)或是具有2位酮官 能團(戊酮糖)。戊醛糖優選地，所述戊醛糖選自下組木糖，阿拉伯糖，核糖和來蘇糖。更優選地，戊醛糖 是木糖或阿拉伯糖。在一個優選的方面，所述戊醛糖是木糖。更優選地，所述戊醛糖是D-木糖。戊酮糖優選地，所述戊酮糖是木酮糖或核酮糖。在一個優選的方面，所述戊酮糖是木酮糖。更優選地，所述戊酮糖是D-木酮糖。在一個優選的方面，所述戊酮糖是核酮糖。更優選地，所述核酮糖是D-核酮糖。
戊醛糖轉變成戊酮糖戊醛糖轉變成戊酮糖的例子包括但不限于木糖轉變成木酮糖；阿拉伯糖轉變成 木酮糖；阿拉伯糖轉變成核酮糖；來蘇糖轉變成木酮糖；核糖轉變成核酮糖；D-木糖轉變成 D-木酮糖；L-阿拉伯糖轉變成L-木酮糖或D-木酮糖；L-阿拉伯糖轉變成L-核酮糖；D-來 蘇糖轉變成D-木酮糖；和D-核糖轉變成D-核酮糖。不希望受理論束縛，典型地，真菌中涉及D-木糖轉變成D-木酮糖的酶是木糖還原 酶和D-木酮糖還原酶。在細菌中，不希望受理論束縛，通常涉及D-木糖轉變成D-木酮糖的酶是木糖異構酶。不希望受理論束縛，真菌中一般涉及L-阿拉伯糖轉變成L-木酮糖的酶是阿拉伯 糖還原酶、L-阿拉伯糖醇4-脫氫酶、L-木酮糖還原酶和D-木酮糖還原酶。在細菌中，不希望受理論束縛，典型地，涉及L-阿拉伯糖轉變成L-核酮糖的酶是 L-阿拉伯糖異構酶。不希望受理論束縛，細菌中可涉及D-來蘇糖轉變成D-木酮糖的酶是來蘇糖異構酶。不希望受理論束縛，可涉及D-核糖轉變成D-核酮糖的酶是D-核糖異構酶。酶本文所述酶命名法編號(EC編號)指1992年出版的國際生物化學和分子生物學 聯合會命名委員會關于酶命名和分類的推薦。本文所述酶可以由自極其多種來源衍生的核苷酸序列生成。一方面，編碼本 文所述酶的核苷酸序列可以衍生或可衍生自乳酸乳球菌乳亞種(Lactococcus Iactis subsp. Iactis)、嗜熱月旨肪地芽孢桿菌(Geobaci 1 lusstearothermophilus),糞腸球菌 (Enterococcus faecalis) > Piromyces sp>lif (Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus)、樹干畢赤氏酵母(Pichia stipitis)、或釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)。醛糖-1-差向異構酶(EC 5. 1. 3. 3)本文所述醛糖-1-差向異構酶能夠作用于戊醛糖。醛糖-1-差向異構酶具有EC命名法編號5. 1. 3. 3。醛糖差向異構酶可稱作變 旋酶或醛糖變旋酶。術語醛糖-1-差向異構酶指能夠將α-戊醛糖轉變成戊醛糖和反之亦然的酶。在一個優選的實施方案中，醛糖-1-差向異構酶由選自下組的核苷酸序列編碼 AAD20257 版本 1，ΑΒΧ75760 版本 1，ΑΑΚ05605 版本 1，AAD20245 版本 1，AAD20251 版本 1， ABJ73095版本1，ΑΒΙ49935版本1和ΑΑ080762版本1 (NCBI登錄號)。更優選地，醛糖差 向異構酶選自下組AAD20257版本1，ABX75760版本1，AAK05605版本1，AAD20245版本1 和 AAD2(^51 版本 1。適合于如本文所述使用的醛糖-1-差向異構酶的例子包括由下述各項編碼的 醛糖-1-差向異構酶乳酸乳球菌醛糖-1-差向異構酶基因的核苷酸序列(NCBI登錄號 AAD20245)；釀酒酵母GALlO基因的核苷酸序列(特別地，編碼具有變旋酶活性的氨基酸序列的部分)；和釀酒酵母菌株D0002 GALlO基因的核苷酸序列(特別地，編碼具有變旋酶活 性的氨基酸序列的部分)。醛糖還原酶(EC1. 1. 1. 21)醛糖還原酶具有EC命名法編號1. 1. 1. 21。醛糖還原酶可稱作多元醇脫氫酶，醛 還原酶，ALR2，NADPH-戊醛糖還原酶，NADPH-醛糖還原酶，醛醇NADP氧化還原酶或醛醇 NADP+I-氧化還原酶。術語醛糖還原酶指能夠將醛醇轉變成醛糖和反之亦然的酶。醛糖還原酶可還原超過一種類型的醛糖。例如，同一種酶可以能夠還原D-木糖和 L-阿拉伯糖二者，此類酶因此可稱作醛糖還原酶，或者，它可以更特異性地以底物之一命 名，例如木糖還原酶。木糖還原酶(EC1. 1. 1. 21)在一個實施方案中，醛糖還原酶是木糖還原酶。木糖還原酶具有EC命名法編號 1. 1. 1. 21。術語木糖還原酶指能夠將D-木糖轉變成木糖醇和反之亦然的酶。本文所述木糖還原酶能夠作用于D-木糖。適合于如本文所述使用的木糖還原酶的例子包括由下述各項編碼的木糖還原酶 樹干畢赤氏酵母木糖還原酶基因(PsXR)的核苷酸序列；樹干畢赤氏酵母菌株DSM3651木 糖還原酶基因(PsXR)的核苷酸序列-NCBI登錄號)(59465版本1 ；纖細假絲酵母(Candida tenuis)的核苷酸序列(所述編碼木糖還原酶的核苷酸序列可以如Kavanagh等，2003所述 來獲得)；和粗糙脈孢霉(Neurospora crassa)的核苷酸序列(所述編碼木糖還原酶的核 苷酸序列可以如Woodyer等，2005所述來獲得)。阿拉伯糖還原酶(EC 1. 1. 1. 21)在另一個實施方案中，醛糖還原酶是阿拉伯糖還原酶。阿拉伯糖還原酶具有EC命 名法編號1. 1. 1.21。術語阿拉伯糖還原酶指能夠將L-阿拉伯糖轉變成L-阿拉伯糖醇和反之亦然的酶。本文所述阿拉伯糖還原酶能夠作用于L-阿拉伯糖。本領域當前已知的D-木糖還原酶也可以相似活性作用于作為底物的L-阿拉伯 糖。因此，術語L-阿拉伯糖還原酶也可指歸類為D-木糖還原酶的酶，而且適合于引入木糖 代謝的本文所述木糖還原酶類似地適合用于將阿拉伯糖代謝引入微生物。在又一個實施方案中，醛糖還原酶可以能夠將L-來蘇糖轉變成L-阿拉伯糖醇和 反之亦然。在另一個實施方案中，醛糖還原酶可以能夠將D-來蘇糖轉變成D-阿拉伯糖醇 和反之亦然。在另一個實施方案中，醛糖還原酶可以能夠將核糖轉變成核糖醇(特別所將D-核 糖轉變成D-核糖醇)和反之亦然。木酮糖還原酶(EC1. 1. 1. 9 和 EC 1. 1. 1. 10)術語木酮糖還原酶涵蓋D-木酮糖還原酶和L-木酮糖還原酶。D-木酮糖還原酶(EC 1. 1. 1. 9)D-木酮糖還原酶具有EC命名法編號1. 1.1.9。D-木酮糖還原酶可稱作木糖醇脫氫酶、木糖醇-2-脫氫酶、2，3-順式-多元醇(DPN)脫氫酶(C34)、NAD依賴性木糖醇脫氫 酶、赤蘚糖醇脫氫酶或戊糖醇-DPN脫氫酶。術語D-木酮糖還原酶指能夠將木糖醇轉變成D-木酮糖和反之亦然的酶。本文所述D-木酮糖還原酶能夠作用于木糖醇。適合于如本文所述使用的D-木酮糖還原酶的例子包括由下述各項編碼的D-木酮 糖還原酶樹干畢赤氏酵母D-木酮糖基因(I5s)(DH)的核苷酸序列；和樹干畢赤氏酵母菌株 DSM3651D-木酮糖還原酶基因(I3s)(DH)的核苷酸序列-NCBI登錄號)(55392版本1。L-木酮糖還原酶(EC 1. 1. 1. 10)L-木酮糖還原酶具有EC命名法編號1. 1. 1. 10。L-木酮糖還原酶可稱作L-木糖
醇脫氫酶。術語L-木酮糖還原酶指能夠將L-木酮糖轉變成木糖醇和反之亦然的酶。本文所述L-木酮糖還原酶能夠作用于L-木酮糖。編碼L-木酮糖還原酶的核苷酸序列可以自黑曲霉(Aspergillus niger)(如 Witteveen 等，1994 所述)或自酵母單孢神食酵母(Ambrosiozymamonospora) (Verho 等， 2004)獲得。木酮糖激酶(EC2. 7. 1. 17)木酮糖激酶具有EC命名法編號2. 7. 1. 17。木酮糖激酶可稱作D-木酮糖激酶。術語木酮糖激酶指能夠將D-木酮糖轉變成D-木酮糖5-磷酸和反之亦然的酶。本文所述木酮糖激酶能夠作用于D-木酮糖。適合于如本文所述使用的木酮糖激酶的例子包括由下述各項編碼的木酮糖激酶: 樹干畢赤氏酵母木酮糖激酶基因O3SXKQ的核苷酸序列；樹干畢赤氏酵母菌株DSM3651木 酮糖激酶基因O3SXKS)的核苷酸序列-NCBI登錄號AF127802版本1 ；釀酒酵母木酮糖激酶 基因GcXKQ的核苷酸序列；和釀酒酵母菌株D0002木酮糖激酶基因GcXKQ的核苷酸序 列-NCBI登錄號X61377版本1。木糖異構酶(EC5. 3. 1. 5)木糖異構酶具有EC命名法編號EC 5. 3. 1. 5。木糖異構酶可稱作D-木糖異構酶、 D-木糖酮異構酶、或D-木糖酮醇異構酶。術語木糖異構酶指能夠將D-木糖轉變成D-木酮糖和反之亦然的酶。本文所述木糖異構酶能夠作用于D-木糖。適合于如本文所述使用的木糖異構酶的例子包括由下述各項編碼的木糖異構 酶Piromyces木糖異構酶基因(PmXI)的核苷酸序列；Piromyces sp E2木糖異構酶基因 (PmXI)的核苷酸序列-NCBI登錄號AJM9909版本1 ；和熱硫化氫高溫厭氧桿菌木糖異構酶 基因(ThXI)的核苷酸序列-NCBI登錄號D00756版本1 ；SEQ ID No 2和SEQ ID No 3。D-阿拉伯糖醇4-脫氫酶(EC 1. 1. 1. 11)D-阿拉伯糖醇4-脫氫酶具有EC命名法編號1. 1. 1. 11。D-阿拉伯糖醇4_脫氫酶 可稱作D-阿拉伯糖醇脫氫酶或阿拉伯糖醇脫氫酶。術語D-阿拉伯糖醇4-脫氫酶指能夠將D-阿拉伯糖醇轉變成D-木酮糖和反之亦 然的酶。本文所述D-阿拉伯糖醇4-脫氫酶能夠作用于D-阿拉伯糖醇。
一種合適的D-阿拉伯糖醇4-脫氫酶和相應的基因記載于Cheng等，2005。L-阿拉伯糖醇4-脫氫酶(EC 1. 1. 1. 12)L-阿拉伯糖醇4-脫氫酶具有EC命名法編號1. 1. 1. 12。L-阿拉伯糖醇4_脫氫酶 可稱作L-阿拉伯糖醇4-脫氫酶或戊糖醇-DPN脫氫酶。術語L-阿拉伯糖醇4-脫氫酶指能夠將L-阿拉伯糖醇轉變成L-木酮糖和反之亦 然的酶。本文所述L-阿拉伯糖醇4-脫氫酶能夠作用于L-阿拉伯糖醇。一種合適的L-阿拉伯糖醇4-脫氫酶和相應的基因記載于Richard等，2001。L-阿拉伯糖異構酶(EC 5. 3. 1. 4)L-阿拉伯糖異構酶具有EC命名法編號5. 3. 1. 4。L-阿拉伯糖異構酶可稱作L-阿 拉伯糖酮醇異構酶。術語L-阿拉伯糖異構酶指能夠將L-阿拉伯糖轉變成L-核酮糖和反之亦然的酶。本文所述L-阿拉伯糖異構酶能夠作用于L-阿拉伯糖。編碼L-阿拉伯糖異構酶的核苷酸序列的一個例子是可以自植物乳桿菌 (Lactobacillus plantarum)菌株 NCIMB8^6 (ATCC 14917)獲得的核苷酸序列(NCBI 登錄 碼NC_004567版本1中記載的基因)。核酮糖激酶(EC2. 7. 1. 16)核酮糖激酶具有EC命名法編號2. 7. 1. 16。核酮糖激酶可稱作L-核酮糖激酶。術語核酮糖激酶指能夠(i)將L-核酮糖轉變成L-核酮糖5-磷酸和反之亦然；和 /或(ii)將D-核酮糖轉變成D-核酮糖5-磷酸和反之亦然的酶。本文所述核酮糖激酶能夠作用于L-核酮糖和/或D-核酮糖。一種合適的編碼核酮糖激酶的核苷酸序列可以自植物乳桿菌菌株 NCIMB8826 (ATCC 14917)獲得(NCBI登錄碼NC_004567版本1中記載的基因)。L-核酮糖磷酸4-差向異構酶(EC 5. 1. 3. 4)L-核酮糖磷酸4-差向異構酶具有EC命名法編號5. 1. 3. 4。L-核酮糖磷酸4_差 向異構酶可稱作核酮糖磷酸4-差向異構酶、磷酸核酮糖異構酶、L-核酮糖5-磷酸4-差向 異構酶、AraD或L-Ru5P。術語L-核酮糖磷酸4-差向異構酶指能夠將L-核酮糖5-磷酸轉變成D-木酮糖 5-磷酸和反之亦然的酶。本文所述L-核酮糖磷酸4-差向異構酶能夠作用于L-核酮糖5-磷酸。一種合適的編碼L-核酮糖磷酸4-差向異構酶的核苷酸序列可以自植物乳桿菌菌 株NCIMB8^6 (ATCC 14917)獲得(NCBI登錄碼NC_004567中記載的基因)。D-核糖醇4-脫氫酶D-核糖醇4-脫氫酶具有EC命名法編號1. 1. 1. 56。這種酶也可稱作核糖醇2-脫氫酶、福壽糖醇脫氫酶或核糖醇脫氫酶。術語D-核糖醇4-脫氫酶指能夠將核糖醇轉變成D-核酮糖和反之亦然的酶。
本文所述D-核糖醇4-脫氫酶能夠作用于D-核糖醇。一種合適的D-核糖醇4-脫氫酶和相應的基因記載于Dothie等，1985。D-來蘇糖異構酶(EC 5. 3. 1. 15)
D-來蘇糖異構酶具有EC命名法編號5. 3. 1. 15。這種酶也可稱作D-來蘇糖酮醇 異構酶。術語D-來蘇糖異構酶指能夠將D-來蘇糖轉變成D-木酮糖和反之亦然的酶。本文所述D-來蘇糖異構酶能夠作用于D-來蘇糖。編碼D-來蘇糖/L-核糖異構酶的核苷酸序列可以自生物體不動桿菌 (Acinetobacter sp.)菌株 DL—28 (Shimonishi 禾口 Izumori, 1996)或產氣氣桿菌 (Aerobacter aerogenes) (Anderson 禾口 Allison, 1965)克隆。核糖異構酶(EC5. 3. 1. 20)核糖異構酶具有EC命名法編號5. 3. 1. 20。這種酶也可稱作D-核糖異構酶或D-核 糖酮醇異構酶。術語核糖異構酶指能夠將D-核糖轉變成D-核酮糖和反之亦然的酶。本文所述核糖異構酶能夠作用于D-核糖。已經在生物體恥垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatis) (Izumori φ, 1975)中 找到D-核糖異構酶，可以自該生物體克隆D-核糖異構酶。核酮糖-5-磷酸3-差向異構酶(EC 5. 1. 3. 1)核酮糖-5-磷酸3-差向異構酶具有EC命名法編號5. 1.3. 1。這種酶也可稱作 戊糖-5-磷酸3-差向異構酶，磷酸戊酮糖3-差向異構酶，磷酸戊酮糖差向異構酶，磷酸核 酮糖差向異構酶，核酮糖-磷酸3-差向異構酶；D-核酮糖5-磷酸差向異構酶；D-核酮糖磷 酸-3-差向異構酶；D-核酮糖-5-P3-差向異構酶；D-木酮糖-5-磷酸3-差向異構酶；赤 蘚糖-4-磷酸異構酶；核酮糖5-磷酸3-差向異構酶；和木酮糖磷酸3-差向異構酶。術語核酮糖-5-磷酸3-差向異構酶指能夠將D-核酮糖5-磷酸轉變成D-木酮糖 5-磷酸和反之亦然的酶。適合于如本文所述使用的核酮糖-5-磷酸3-差向異構酶的例子包括由下述各項 編碼的核酮糖-5-磷酸3-差向異構酶釀酒酵母RPEl基因的核苷酸序列；釀酒酵母菌株 D0002RPE1基因的核苷酸序列；NCBI登錄碼NP_01M14版本1的核苷酸序列；和能在NCBI 登錄碼NP_012414版本1中找到的來自樹干畢赤氏酵母的核酮糖-5-磷酸異構酶。核糖-5-磷酸異構酶(EC 5. 3. 1. 6)核糖-5-磷酸異構酶具有EC命名法編號5. 3. 1.6。這種酶也可稱作磷酸戊糖異構 酶、磷酸戊糖異構酶、磷酸戊糖異構酶、磷酸核糖異構酶、核糖5-磷酸差向異構酶、核糖磷 酸異構酶、5-磷酸核糖異構酶、或D-核糖-5-磷酸酮醇異構酶。術語核糖-5-磷酸異構酶指能夠將D-核糖5-磷酸轉變成D-核酮糖5_磷酸和反 之亦然的酶。適合于如本文所述使用的核糖-5-磷酸異構酶的例子包括由下述各項編碼的核 糖-5-磷酸酮醇異構酶釀酒酵母RKIl基因的核苷酸序列；釀酒酵母菌株D0002 RKIl基因 的核苷酸序列；NCBI登錄碼X94335版本1的核苷酸序列；NCBI登錄碼ΝΡ_014738版本1的 核苷酸序列，和能在登錄號NC_009043版本1中找到的來自樹干畢赤氏酵母的核糖-5-磷 酸異構酶。轉酮醇酶(EC2. 2. 1. 1)轉酮醇酶具有EC命名法編號2. 2. 1. 1。這種酶也可稱作羥乙醛轉移酶。
術語轉酮醇酶指能夠將景天庚酮糖7-磷酸+D-甘油醛3-磷酸轉變成D-核糖 5-磷酸+D-木酮糖5-磷酸和反之亦然的酶。適合于如本文所述使用的轉酮醇酶的例子包括由下述各項編碼的轉酮醇酶釀酒 酵母TKLl基因的核苷酸序列；釀酒酵母菌株D0002 TKLl基因的核苷酸序列；NCBI登錄碼 X73224版本1的核苷酸序列；NCBI登錄碼NP_015399版本1的核苷酸序列和能在登錄碼 CP000496版本1中找到的來自樹干畢赤氏酵母的轉酮醇酶。轉醛醇酶(EC2. 2. 1. 2)轉醛醇酶具有EC命名法編號2. 2.1.2.這種酶也可稱作二羥基丙酮轉移酶、二羥 基丙酮合酶、甲醛轉酮醇酶或甘油酮轉移酶。術語轉醛醇酶指能夠將景天庚酮糖7-磷酸+D-甘油醛3-磷酸轉變成D-赤蘚糖 4-磷酸+D-果糖6-磷酸和反之亦然的酶。適合于如本文所述使用的轉醛醇酶的例子包括由下述各項編碼的轉醛醇酶釀酒 酵母TALl基因的核苷酸序列；釀酒酵母菌株D0002 TALl基因的核苷酸序列；NCBI登錄碼 X15953版本1的核苷酸序列；NCBI登錄碼NP_013458版本1的核苷酸序列，和能在登錄碼 CP000502中找到的來自樹干畢赤氏酵母的轉醛醇酶。戊醛糖測定法溶液(諸如培養液)中戊醛糖的量可以通過如m^ert等(A Simplified, Colorimetric Micromethod for Xylose in Serum or Urine,with Phloroglucinol, 1979, Clin. Chem. 25，no. 8，pp. 1440-1443)記載的根皮酚法來比色測定。顯色試劑由0.5g根皮酚(1，3，5-三羥基苯)、IOOml冰乙酸和IOml濃HCl組成。 將50 μ 1樣品添加至950 μ 1顯色試劑。將混合物加熱至100°C達4分鐘，并于554nm讀取 混合物的吸光度。依據用同一種戊醛糖作為標準品繪制的標準曲線確定樣品中戊醛糖的 量。這種方法可用于測定培養液中木糖、阿拉伯糖、來蘇糖和核糖的量。互相轉變測定法微生物催化α -戊醛糖和β -戊醛糖之間轉變的能力可以通過多種方法來測定。 例如，醛糖的α和β-異頭物之間的互相轉變可以通過NMR來跟蹤(例如如Ryu等，2004 解釋的)，或通過偶聯測定法來跟蹤(其中跟蹤對異頭物之一特異性的酶的活性，如Brahma 禾口 Bhattacharyya，2004 記載的)。戊酮糖測定法溶液(諸如培養液)中戊酮糖的量可以通過如^icharias Dische和 EllenBorenffeund(1951 J. Biol. Chem. 192(2) :583)記載的半胱氨酸-咔唑法來比色測定。乙醇測定法溶液(諸如培養液)中生物燃料像乙醇的量可以通過使用由 Megazymelnternational, Bray Business Park, Bray, Co. Wicklow, Ireland 制造禾口銷售的 商品化乙醇測定法K-ETOH試劑盒來測定；或者它可以通過例如使用氣相層析來測定。戊糖磷酸途徑戊酮糖經戊糖磷酸途徑被轉變成乙醇。這樣的一個例子顯示于圖4。涉及戊糖磷酸途徑的酶的例子包括轉酮醇酶，轉醛醇酶，核糖-5-磷酸酮醇異構酶和核酮糖-5-磷酸3-差向異構酶。在一個實施方案中，依照本發明的微生物還已經轉化以表達或過表達一種或多種 涉及戊糖磷酸途徑的酶。在一個實施方案中，依照本發明的微生物還已經用引起微生物過表達一種或多種 涉及戊糖磷酸途徑的酶的一種或多種核苷酸序列轉化。例如，將啟動子插入微生物的基因 組，使得微生物能夠過表達編碼涉及戊糖磷酸途徑的酶的內源核苷酸序列。在另一個實施方案中，微生物已經用編碼一種或多種涉及戊糖磷酸途徑的酶的一 種或多種核苷酸序列轉化。例如，微生物用表達載體轉化，該表達載體包含編碼一種或多種 涉及戊糖磷酸途徑的酶的核苷酸序列。優選地，本文所述表達載體包含一種或多種啟動子，其能夠過表達編碼一種或多 種涉及戊糖磷酸途徑的酶的一種或多種核苷酸序列。此類啟動子的例子包括GPD啟動子、 TEF啟動子和ADP啟動子。可用于過表達編碼一種或多種涉及戊糖磷酸途徑的酶的一種或 多種核苷酸序列的優選啟動子可以是任何控制編碼涉及糖酵解和葡萄糖發酵的蛋白質的 核苷酸序列表達的調節元件。如本文中使用的，短語“引起微生物過表達一種或多種涉及戊糖磷酸途徑的酶的 一種或多種核苷酸序列”和“能夠過表達編碼一種或多種涉及戊糖磷酸途徑的酶的一種或 多種核苷酸序列的一種或多種啟動子”中的術語“過表達”指在比較經轉化微生物與轉化前 的等同微生物時，表達自零升高至某表達水平或自較低的表達水平升高至較高的表達水平 (例如上調)。過表達一種或多種涉及戊糖磷酸途徑的酶的微生物具有升高的催化戊酮糖 (諸如木酮糖5-磷酸)轉變成生物燃料(諸如乙醇)的能力。優選地，所述過表達一種或多種涉及戊糖磷酸途徑的酶的經轉化微生物能夠以比 未轉化的微生物要高至少10 %、15 %、20 %或25 %的速率催化戊酮糖(諸如木酮糖5-磷 酸)轉變成生物燃料(諸如乙醇)。表達一種或多種涉及戊糖磷酸途徑的酶的微生物的例子包括(i)經編碼一種或 多種轉酮醇酶、轉醛醇酶、核糖-5-磷酸酮醇異構酶和核酮糖-5-磷酸3-差向異構酶的一 種或多種表達載體轉化的微生物；和(ii)經轉化以上調編碼一種或多種轉酮醇酶、轉醛醇 酶、核糖-5-磷酸酮醇異構酶和核酮糖-5-磷酸3-差向異構酶的一種或多種內源核苷酸序 列表達的微生物(在轉化之前，所述微生物能夠在指數生長期間對于給定的培養條件集表 達一種或多種這些酶，但是在轉化之后，所述微生物能夠在指數生長期間在相同培養條件 中以更高的水平表達一種或多種這些酶)。現在會借助實施例進一步描述本發明，實施例意圖用來幫助本領域技術人員實施 本發明而非意圖以任何方式限制本發明的范圍。
實施例一般重組DNA方法學技術除非另外指明，本發明采用化學、分子生物學、微生物學、重組DNA和免疫學的 常規技術，它們在本領域普通技術人員的能力之內。文獻中解釋了此類技術。參見例 如 Sambrook 等，1989 ；Ausubel, F. M.等，1995 ；Roe 等，1996 ；Gait, 1984 ；及 Lilley 和 Dahlberg, 1992。通過述及將每一篇這些通用教科書收入本文。
除非另外指明，本發明采用化學、分子生物學、微生物學、重組DNA和免疫學的 常規技術，它們在本領域普通技術人員的能力之內。文獻中解釋了此類技術。參見例 如 J. B. Roe, J. Crabtree,禾口 k. Kahn,1996, DNA Isolationand Sequencing :Essential Techniques, John Wiley & Sons ;Μ· J. Gait (編)，1984, Oligonucleotide Synthesis :A Practical Approach, Irl Press ；及 D. M. J. Lilley 禾口 J. E. Dahlberg,1992, Methods of Enzymology :DNA Structure Part A :Synthesisand Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Press0通過述及將每一篇這些通用教科書收入本文。實施例Ia-基于NCBI登錄碼AAD20245版本1的乳酸乳球菌的合成變旋酶基因 (醛糖-1-差向異構酶)的構建。由GeneartAG (Regensburg，Germany)合成和裝配完整乳酸乳球菌醛糖差向異 構酶基因(L1MI )。序列中的密碼子選擇是基于來自Kazusa密碼子選擇數據庫(Nakamura 等，2000)的酵母密碼子選擇表而優化的。在合成的構建物中在可讀框的側翼包括靠近ATG 起始密碼子的NheI限制性位點和遠離終止密碼子的BioI限制性位點。通過對兩條鏈的測 序來確定LlMR合成基因的完整性。包括側翼限制性位點的LlMR的核苷酸序列鑒定為SEQ ID NO 1(即AAD20245)，而由此核苷酸序列編碼的氨基酸序列鑒定為SEQ ID No 47。包含 的質粒命名為0717050pGA14。實施例Ib-基于NCBI登錄碼AJM9909版本1的Piromyces sp. E2的合成木糖異 構酶基因的構建。由 Geneart AG(Regensburg，Germany)合成禾口裝配完整 Piromyces 木糖異構醇 基因(PmXI)。序列中的密碼子選擇是基于來自Kazusa密碼子選擇數據庫(Nakamura等， 2000)的酵母密碼子選擇表而優化的。在合成的構建物中在可讀框的側翼包括靠近ATG起 始密碼子的NheI限制性位點和遠離終止密碼子的BioI限制性位點。通過對兩條鏈的測 序來確定PmXI合成基因的完整性。包括側翼限制性位點的PmXI的核苷酸序列鑒定為SEQ ID NO 2，而由此核苷酸序列編碼的氨基酸序列鑒定為SEQ ID No 48。包含的質粒命名為 0717049pGA15。實施例Ic-基于NCBI登錄碼D00756版本1的熱硫化氫高溫厭氧桿菌的合成木糖 異構酶(XylA)基因的構建。由Geneart AG (Regensburg，Germany)合成和裝配完整熱硫化氫高溫厭氧桿菌 木糖異構酶基因(ThXI)。序列中的密碼子選擇是基于來自Kazusa密碼子選擇數據庫 (Nakamura等，2000)的酵母密碼子選擇表而優化的。在合成的構建物中在可讀框的側翼包 括靠近ATG起始密碼子的NheI限制性位點和遠離終止密碼子的BioI限制性位點。通過對 兩條鏈的測序來確定ThXI合成基因的完整性。包括側翼限制性位點的ThXI的核苷酸序列 鑒定為SEQ ID NO 3，而由此核苷酸序列編碼的氨基酸序列鑒定為SEQ ID No 49。包含的 質粒命名為0717046pGA14。實施例基于NCBI登錄碼AF127802版本1的來自樹干畢赤氏酵母菌株DSM3651 的D-木酮糖激酶基因的Τ0Ρ0克隆。使用由SEQ ID NO 4禾口 SEQ ID NO 5鑒定的引物自得自菌株DSM3651的DNAPCR 擴增完整樹干畢赤氏酵母D-木酮糖激酶基因O^XKQ。在I5sXKS基因側翼導入靠近ATG起 始密碼子的NheI限制性位點和遠離終止密碼子的BioI限制性位點。作為模板，以0. 2ng/μ 1 PCR反應的濃度使用來自樹干畢赤氏酵母菌株的DNA。使用Wrnsion高保真DNA聚合 酶(Finnzymes 0y, Finland)實施 PCR，30 個循環的 30 秒 96°C >30 秒 50°C、和 150 秒 72°C, 接著是最終溫育10分鐘72°C。通過電泳將PCR產物在1 %低熔點瓊脂糖凝膠上分開，并 分離1891bp片段。依照制造商的用法說明將DNA片段TOPO克隆入pCR-Blimtll-TOPO載 體(Invitrogen，USA)，并將所得質粒用于轉化大腸桿菌T0P10。質粒命名為pCR-Blunt 2 P.stip XKS0實施例2b-基于NCBI登錄碼)(59465版本1的來自樹干畢赤氏酵母菌株DSM3651 的D-木糖還原酶基因的TOPO克隆。使用由SEQ ID NO 6和SEQ ID NO 7鑒定的引物自得自菌株DSM3651的DNA PCR 擴增完整樹干畢赤氏酵母木糖還原酶基因(PsXR)。在基因側翼導入靠近ATG起始 密碼子的NheI限制性位點和遠離終止密碼子的BioI限制性位點。作為模板，以0. 2ng/ μ 1 PCR反應的濃度使用來自樹干畢赤氏酵母菌株的DNA。使用Wrnsion高保真DNA聚合 酶(Finnzymes 0y, Finland)實施 PCR，30 個循環的 30 秒 96°C >30 秒 50°C、和 150 秒 72°C, 接著是最終溫育10分鐘72°C。通過電泳將PCR產物在低熔點瓊脂糖凝膠上分開，并 分離976bp片段。依照制造商的用法說明將DNA片段TOPO克隆入pCR-Blunt II-TOPO載 體(Invitrogen，USA)，并將所得質粒用于轉化大腸桿菌T0P10。質粒命名為pCR-Blunt 2 P.stip XR0實施例2c-基于NCBI登錄碼)(55392版本1的來自樹干畢赤氏酵母菌株DSM3651 的木糖醇脫氫酶(D-木酮糖還原酶)基因的TOPO克隆。使用由SEQ ID NO 8和SEQ ID NO 9鑒定的引物自得自菌株DSM3651的DNA PCR 擴增完整樹干畢赤氏酵母木糖醇脫氫酶基因(I3s)(DH)。在基因側翼導入靠近ATG起 始密碼子的NheI限制性位點和遠離終止密碼子的BioI限制性位點。作為模板，以0. 2ng/ μ 1 PCR反應的濃度使用來自樹干畢赤氏酵母菌株的DNA。使用Wrnsion高保真DNA聚合 酶(Finnzymes 0y, Finland)實施 PCR，30 個循環的 30 秒 96°C >30 秒 50°C、和 150 秒 72°C, 接著是最終溫育10分鐘72V。通過電泳將PCR產物在低熔點瓊脂糖凝膠上分開，并 分離IlOSbp片段。依照制造商的用法說明將DNA片段TOPO克隆入pCR-Blimtll-TOPO載 體(Invitrogen，USA)，并將所得質粒用于轉化大腸桿菌T0P10。質粒命名為pCR-Blunt 2P.stip XDH0實施例2d-基于NCBI登錄碼NC_004567版本1的來自植物乳桿菌菌株 NCIMB8826 (ATCC 14917)的L-阿拉伯糖異構酶基因(EC 5.3.1.4)的Τ0Ρ0克隆。使用由SEQ ID NO 10和SEQ ID NO 11鑒定的引物自得自菌株ATCC14917的DNA PCR擴增完整植物乳桿菌L-阿拉伯糖異構酶基因(LpAraA)。在LpAraA基因側翼導入靠近 ATG起始密碼子的NheI限制性位點和遠離終止密碼子的BioI限制性位點。作為模板，以 0. 2ng/ μ 1 PCR反應的濃度使用來自植物乳桿菌菌株的DNA。使用Wmsion高保真DNA聚 合酶(FinnzymesOy，Finland)實施 PCR, 30 個循環的 30 秒 96°C >30 秒 55°C、和 60 秒 72°C， 接著是最終溫育10分鐘72°C。通過電泳將PCR產物在0. 7%低熔點瓊脂糖凝膠上分開，并 分離1444bp片段。依照制造商的用法說明將DNA片段Τ0Ρ0克隆入pCR-Blunt ΙΙ-Τ0Ρ0載 體(Invitrogen，USA)，并將所得質粒用于轉化大腸桿菌T0P10。實施例2e_基于NCBI登錄碼NC_004567版本1的來自植物乳桿菌菌株NCIMB8826 (ATCC 14917)的 L-核酮糖激酶基因(EC 2.7.1.16)的 TOPO 克隆。使用由SEQ ID NO 12和SEQ ID NO 13鑒定的引物自得自菌株ATCC14917的 DNAPCR擴增完整植物乳桿菌L-核酮糖激酶基因(LpAraB)。在LpAraB基因側翼導入靠近 ATG起始密碼子的NheI限制性位點和遠離終止密碼子的BioI限制性位點。作為模板，以 0. 2ng/ μ 1 PCR反應的濃度使用來自植物乳桿菌菌株的DNA。使用Wm si on高保真DNA聚合 酶(Finnzymes 0y, Finland)實施 PCR, 30 個循環的 30 秒 96°C、30 秒 55°C、和 60 秒 72°C， 接著是最終溫育10分鐘72°C。通過電泳將PCR產物在0. 7%低熔點瓊脂糖凝膠上分開，并 分離1618bp片段。依照制造商的用法說明將DNA片段TOPO克隆入pCR-Blunt II-TOPO載 體(Invitrogen，USA)，并將所得質粒用于轉化大腸桿菌T0P10。實施例2f_基于NCBI登錄碼NC_004567版本1的來自植物乳桿菌菌株 NCIMB8826 (ATCC 14917)的L-核酮糖-5-磷酸4-差向異構酶基因(EC 5.1.3.4)的TOPO克隆。使用由SEQ ID NO 14和SEQ ID NO 15鑒定的引物自得自菌株ATCC14917的DNA PCR擴增完整植物乳桿菌L-核酮糖-5-磷酸4-差向異構酶基因(LpAraD)。在LpAraD基因 側翼導入靠近ATG起始密碼子的NheI限制性位點和遠離終止密碼子的BioI限制性位點。 作為模板，以0. 2ng/ μ 1 PCR反應的濃度使用來自植物乳桿菌菌株的DNA。使用Wmsion高 保真 DNA 聚合酶(Finnzymes 0y, Finland)實施 PCR，30 個循環的 30 秒 96°C、30 秒 55°C、和 60秒72°C，接著是最終溫育10分鐘72°C。通過電泳將PCR產物在0. 7%低熔點瓊脂糖凝 膠上分開，并分離745bp片段。依照制造商的用法說明將DNA片段TOPO克隆入pCR-Blunt II-TOPO載體(Invitrogen，USA)，并將所得質粒用于轉化大腸桿菌T0P10。實施例2g-基于NCBI登錄號碼D5888版本1的來自釀酒酵母菌株D0002的GALlO 基因的TOPO克隆。使用由SEQ ID NO 16和SEQ ID NO 17鑒定的引物自得自釀酒酵母菌株D0002的 DNA PCR擴增完整釀酒酵母GALlO基因(&GAL10)。在&GAL10基因側翼導入靠近ATG起始 密碼子的NheI限制性位點和遠離終止密碼子的BioI限制性位點。作為模板，以0. 2ng/yl PCR反應的濃度使用來自釀酒酵母菌株的DNA。使用Wiusion高保真DNA聚合酶(Finnzymes 0y, Finland)實施PCR，35個循環的30秒96°C、30秒57°C、和120秒72°C，接著是最終溫育 10分鐘72°C。通過電泳將PCR產物在0. 7%低熔點瓊脂糖凝膠上分開，并分離2116bp片 段。依照制造商的用法說明將DNA片段TOPO克隆入pCR-Bluntll-TOPO載體(Invitrogen， USA)，并將所得質粒用于轉化大腸桿菌T0P10。質粒命名為kGAL-a23a。實施例2h_基于NCBI登錄碼D5888版本1的來自釀酒酵母菌株D0002的截短型 GAL10基因[核苷酸1084-2100]的Τ0Ρ0克隆。使用由SEQ ID NO 18和SEQ ID NO 17鑒定的引物自得自釀酒酵母菌株D0002的 DNAPCR擴增完整N端截短型釀酒酵母GAL10基因(&GAL10 Δ )。在&GAL10 Δ基因側翼導入 靠近ATG起始密碼子的NheI限制性位點和遠離終止密碼子的BioI限制性位點。作為模板， 以0. 2ng/ μ 1 PCR反應的濃度使用來自釀酒酵母菌株的DNA。使用Wmsion高保真DNA聚合 酶(Finnzymes 0y, Finland)實施 PCR，35 個循環的 30 秒 96°C >30 秒 57°C、和 120 秒 72°C, 接著是最終溫育10分鐘72°C。通過電泳將PCR產物在0. 7%低熔點瓊脂糖凝膠上分開，并 分離1036bp片段。依照制造商的用法說明將DNA片段Τ0Ρ0克隆入pCR-Blunt ΙΙ-Τ0Ρ0載體anvitrogen，USA)，并將所得質粒用于轉化大腸桿菌T0P10。質粒命名為&GALA-aMa。實施例3a_在來自釀酒酵母的GPD啟動子和CYCl終止子控制下含有Piromyces 木糖異構酶(PmXI)基因的質粒PmXI-8a的構建。用SpeI和BioI消化大腸桿菌/釀酒酵母高拷貝穿梭載體P似6-GPD (Mumberg等， 1995)，并用堿性磷酸酶將所得末端去磷酸化。類似地，通過用NheI和B10I消化來自載體 0717049pGA15(實施例Ib中描述的)釋放編碼Piromyces木糖異構酶基因的DNA片段。通 過電泳將所得線性化質粒P^6-GPD和編碼PmXI的DNA片段在1 %低熔點瓊脂糖凝膠上分 開，并分離。將兩個DNA片段連接到一起，產生命名為PmXI-Sa的質粒。實施例3b_在來自釀酒酵母的GPD啟動子和CYCl終止子控制下含有熱硫化氫高 溫厭氧桿菌木糖異構酶(ThXI)基因的質粒ThXI_5a的構建。用SpeI和BioI消化大腸桿菌/釀酒酵母高拷貝穿梭載體P似6-GPD (Mumberg等， 1995)，并用堿性磷酸酶將所得末端去磷酸化。類似地，通過用NheI和B10I消化來自載體 0717046pGA14(實施例Ic中描述的)釋放編碼熱硫化氫高溫厭氧桿菌木糖異構酶基因的 DNA片段。通過電泳將所得線性化質粒P^6-GPD和編碼ThXI的DNA片段在1 %低熔點瓊 脂糖凝膠上分開，并分離。將兩個DNA片段連接到一起，產生命名為ThXI_5a的質粒。實施例3c-在來自釀酒酵母的GPD啟動子和CYCl終止子控制下含有樹干畢赤氏 酵母D-木酮糖激酶O3SXKQ基因的質粒I^sXKS-Ha的構建。用SpeI和BioI消化大腸桿菌/釀酒酵母高拷貝穿梭載體P^6_GPD (Mumberg等， 1995)，并用堿性磷酸酶將所得末端去磷酸化。類似地，通過用NheI和B10I消化來自載體 pCR-Blunt 2 P. stip XKS (實施例加中描述的)釋放編碼樹干畢赤氏酵母木酮糖激酶基因 的DNA片段。通過電泳將所得線性化質粒P^6-GPD和編碼I^sXKS的DNA片段在1 %低熔點 瓊脂糖凝膠上分開，并分離。將兩個DNA片段連接到一起，產生命名為I^sXKS-Ha的質粒。實施例3d-在來自釀酒酵母的GPD啟動子和CYCl終止子控制下含有樹干畢赤氏 酵母木糖還原酶(PsXR)基因的質粒和PsXR-25的構建。 用SpeI和BioI消化大腸桿菌/釀酒酵母高拷貝穿梭載體P似6_GPD (Mumberg等， 1995)，并用堿性磷酸酶將所得末端去磷酸化。類似地，通過用NheI和B10I消化來自載體 pCR-Blunt 2 P. stip XR(實施例2b中描述的)釋放編碼樹干畢赤氏酵母木糖還原酶基因 的DNA片段。通過電泳將所得線性化質粒P4M-GPD和P414-GPD和編碼的DNA片段 在1 %低熔點瓊脂糖凝膠上分開，并分離。將線性化質粒P4M-GPD與片段連接到一 起，產生命名為PsXR-Ma的質粒。同樣地，將線性化質粒P414-GPD與片段連接到一 起，產生命名為PsXR-25a的質粒。實施例3e_在來自釀酒酵母的GPD啟動子和CYCl終止子控制下含有樹干畢赤氏 酵母木糖醇脫氫酶(I3S)(DH)基因(木酮糖還原酶)的質粒I^)(DH-lla的構建。用SpeI和BioI消化大腸桿菌/釀酒酵母高拷貝穿梭載體P似6_GPD (Mumberg等， 1995)，并用堿性磷酸酶將所得末端去磷酸化。類似地，通過用NheI和B10I消化來自載體 pCR-Blunt 2 P. stip )(DH(實施例2c中描述的)釋放編碼樹干畢赤氏酵母木酮糖脫氫酶基 因的DNA片段。通過電泳將所得線性化質粒P^6-GPD和編碼的DNA片段在1 %低 熔點瓊脂糖凝膠上分開，并分離。將兩個DNA片段連接到一起，產生命名為I^CDH-Ila的質 粒。
實施例3f_在來自釀酒酵母的各種啟動子和CYCl終止子控制下含有乳酸乳球菌 變旋酶基因(LlMR)基因(醛糖-1-差向異構酶)的質粒LlMR-36a、LlMR-38a和LlMR-40a 的構建。用SpeI和BioI消化大腸桿菌/釀酒酵母低拷貝穿梭載體P413-GPD、P413-ADH 和P413-TEF (Mumberg等，1995)，并用堿性磷酸酶將所得末端去磷酸化。類似地，通過用 NheI和BioI消化來自載體0717050pGA14(實施例Ia中描述的)釋放編碼乳酸乳球菌醛 糖-1-差向異構酶基因(L1MI )基因的DNA片段。通過電泳將所得線性化質粒P413-GPD、 P413-ADH和P413-TEF和編碼LlMR的DNA片段在1 %低熔點瓊脂糖凝膠上分開，并分離。將 線性化質粒P413-GPD與LlMR片段連接到一起，產生命名為LlMR_36a的質粒。同樣地，將 線性化質粒P413-ADH與LlMR片段連接到一起，產生命名為LlMR_38a的質粒。最后，將線 性化質粒P413-TEF與LlMR片段連接到一起，產生命名為LlMR_40a的質粒。P413-GPD包含來自編碼甘油醛_3_磷酸脫氫酶(也稱作GAPDH)同工酶3的基因 TDH3的啟動子；P413-ADH包含來自編碼醇脫氫酶I的基因ADHl的啟動子；而P413-TEF包 含來自編碼翻譯延伸因子EF-I α的基因TEF2的啟動子。實施例3g_在來自釀酒酵母的GPD啟動子和CYCl終止子控制下含有植物乳桿菌 L-阿拉伯糖異構酶基因(LpAraA)基因的酵母表達質粒的構建。用SpeI和BioI消化大腸桿菌/釀酒酵母高拷貝穿梭載體P似6_GPD (Mumberg等， 1995)，并用堿性磷酸酶將所得末端去磷酸化。類似地，通過用NheI和B10I消化來自實施 例2d中描述的載體釋放編碼植物乳桿菌L-阿拉伯糖異構酶基因(LpAraA)的DNA片段。通 過電泳將所得線性化質粒P^6-GPD和編碼LpAraA的DNA片段在0. 7%低熔點瓊脂糖凝膠 上分開，并分離。將兩個DNA片段連接到一起并將所得質粒用于轉化大腸桿菌T0P10。實施例3h_在來自釀酒酵母的ADH啟動子和CYCl終止子控制下含有植物乳桿菌 L-核酮糖激酶基因(LpAraB)基因的酵母表達質粒的構建。用SpeI和BioI消化大腸桿菌/釀酒酵母高拷貝穿梭載體P425-ADH(Mumberg等， 1995)，并用堿性磷酸酶將所得末端去磷酸化。類似地，通過用NheI和B10I消化來自實施 例加中描述的載體釋放編碼植物乳桿菌L-核酮糖激酶基因(LpAraB)的DNA片段。通過 電泳將所得線性化質粒P425-ADH和編碼LpAraB的DNA片段在0. 7%低熔點瓊脂糖凝膠上 分開，并分離。將兩個DNA片段連接到一起并將所得質粒用于轉化大腸桿菌T0P10。實施例3i_在來自釀酒酵母的GPD啟動子和CYCl終止子控制下含有植物乳桿菌 L-核酮糖-5-磷酸4-差向異構酶基因(LpAraD)基因的酵母表達質粒的構建。用SpeI和BioI消化大腸桿菌/釀酒酵母高拷貝穿梭載體P4M-GPD (Mumberg等.， 1995)，并用堿性磷酸酶將所得末端去磷酸化。類似地，通過用NheI和B10I消化來自實施 例2f中描述的載體釋放編碼植物乳桿菌L-核酮糖-5-磷酸4-差向異構酶基因(LpAraD) 的DNA片段。通過電泳將所得線性化質粒P4M-GPD和編碼LpAraD的DNA片段在0. 7%低 熔點瓊脂糖凝膠上分開，并分離。將兩個DNA片段連接到一起并將所得質粒用于轉化大腸 桿菌TOPlO。實施例3j_用于醛糖-1-差向異構酶過表達的在來自釀酒酵母的ADH啟動子和 CYCl終止子控制下含有釀酒酵母雙功能醛糖-1-差向異構酶/UDP半乳糖4-差向異構酶基 因(&GAL10)基因的酵母表達質粒的構建。
用SpeI和BioI消化大腸桿菌/釀酒酵母低拷貝穿梭載體P413-ADH(Mumberg等 (1995) Gene 156，p. 119-122)，并隨后用堿性磷酸酶將所得末端去磷酸化。類似地，通過用 NheI和BioI消化自載體kGAL-a23a(實施例2g中描述的)釋放編碼釀酒酵母雙功能醛 糖-1-差向異構酶/UDP半乳糖4-差向異構酶基因(&GAL10)的DNA片段。通過電泳將所 得線性化質粒P413-ADH和編碼&GAL10的DNA片段在0. 7%低熔點瓊脂糖凝膠上分開，并 在此后分離。將線性化質粒P413-ADH與&GAL10片段連接到一起，產生酵母表達質粒。實施例3k_用于醛糖-1-差向異構酶過表達的在來自釀酒酵母的ADH啟動子和 CYCl終止子控制下含有釀酒酵母醛糖-1-差向異構酶/UDP-半乳糖4-差向異構酶基因之 變旋酶部分(&GAL10 Δ )基因的酵母表達質粒的構建。已知基因GALlO是一種雙功能酶，含有催化UDP-半乳糖轉變成UDP-葡萄糖的差 向異構酶部分以及催化α-半乳糖轉變成β-半乳糖和反之亦然的變旋酶部分Majumdar 等，2004。用SpeI和BioI消化大腸桿菌/釀酒酵母低拷貝穿梭載體P413-ADH(Mumberg等 (1995) Gene 156，p. 119-122)，并隨后用堿性磷酸酶將所得末端去磷酸化。類似地，通過用 NheI和BioI消化自載體&GAL Δ -a24a (實施例池中描述的)釋放編碼釀酒酵母雙功能醛 糖-1-差向異構酶/UDP-半乳糖4-差向異構酶基因之變旋酶部分(&GAL10 Δ )的DNA片 段。通過電泳將所得線性化質粒P413-ADH和編碼&GAL10 Δ的DNA片段在0. 7%低熔點瓊 脂糖凝膠上分開，并在此后分離。將線性化質粒？41340!1與^^41^10八片段連接到一起， 產生酵母表達質粒。實施例4a_ 連同 LlMR-36a、LlMR-38a、LlMR_40a 或空 P413-CYC 質粒(Mumberg 等， 1995)任一含有PmXI-8a和I^sXKS-Ha質粒的釀酒酵母菌株的構建。將200ng每一種質粒組合并使用Biorad Gene Pulser II系統(Biorad，USA)依照 制造商的用法說明依靠電穿孔用于轉化釀酒酵母酵母菌株BY4741 (Euroscarf，Germany)。 依照標準方案(Becker，D. Μ.和Guarente，1991)將酵母細胞制成感受態。在遺漏尿嘧啶、 組氨酸和亮氨酸且補充有2% D-葡萄糖的固體合成完全失落培養基(solid synthetic complete dropout media) (SC-Ura，His, Leu) (Rose 等，1990)上進行對經所有三種質粒轉 化的克隆的選擇。將中等大小的原代克隆在SC-Ura，His，LeU上再劃線，并分離下述每一項 的一個菌落經質粒LlMR-36a、PmXI-8a和PsXKS_14a轉化的菌株T0062 ；經質粒LlMR_38a、 PmXI-8a 和 PsXKS_14a 轉化的菌株 T0063 ；經質粒 LlMR_40a、PmXI_8a 和 PsXKS_14a 轉化的 菌株T0065 ；和最終經質粒P413-CYC、PmXI_8a和I^sXKS-Ha轉化的菌株T0067 (這些質粒 在實施例3中有描述；P413-CYC是Mumberg等，1995中描述的空質粒)。實施例4b-通過酵母菌株T0062、T0063、T0065和T0067的生長曲線對D-木糖代 謝的測量。作為木糖代謝性酵母菌株的生長速率的變化來測量D-木糖代謝速率的變化。首 先使四種菌株適應D-木糖代謝。在遺漏尿嘧啶、組氨酸和亮氨酸且補充有2% D-木糖和 0.2% D-葡萄糖的液體合成完全失落培養基(SCX(+0. 2% D-glc)-Ura,His,Leu)中分別接 種每一種菌株。將培養物在以225RPM運行的搖床中于30°C溫育1周。1周后，用遺漏尿嘧 啶、組氨酸和亮氨酸且補充有2% D-木糖和0. 02% D-葡萄糖的液體合成完全失落培養基 (SCX(+0. 02% D-glc)-Ura,His,Leu)將每一種培養物用于再接種新的培養物。將這些培養
32物如上所述再溫育1周。通過以初始細胞滴度0D600 = 0. 006/ml接種補充有2% D-木糖 的SCX-Ura，His，Leu來啟動生長實驗。將這些培養物如上所述溫育。對于四種菌株每一 種，間隔M小時四次采樣等分試樣，測量光密度0D600并確定生長曲線。使用初始延滯期 后M-96小時時間間隔確定倍增時間(即指數生長期期間每ml的微生物數目倍增所花去 的時間)。可以為四種菌株確定下面的生長數據
權利要求
1.能夠以比轉化前的等同微生物要更高的速率將戊醛糖轉變成戊酮糖的經轉化微生物。
2.依照權利要求1的微生物，其中所述微生物已經用引起微生物過表達醛糖-1-差向 異構酶的核苷酸序列轉化。
3.依照權利要求1或權利要求2的微生物，其中所述微生物已經用編碼醛糖-1-差向 異構酶的核苷酸序列轉化。
4.依照權利要求1-3任一項的微生物，其中所述微生物是經轉化酵母。
5.依照前述權利要求任一項的微生物，其中所述戊醛糖選自下組木糖，阿拉伯糖，核 糖和來蘇糖。
6.依照前述權利要求任一項的微生物，其中所述戊酮糖是木酮糖。
7.包含依照權利要求1-6任一項的微生物的接種物。
8.包含依照權利要求1-6任一項的微生物的培養液。
9.用于制備能夠生成戊糖衍生化合物的經轉化微生物的方法，所述方法包括用編碼醛 糖-ι-差向異構酶的核苷酸序列轉化微生物的步驟，且其中所述經轉化微生物能夠將戊醛 糖轉變成戊糖衍生化合物。
10.依照權利要求9的方法，其中所述編碼醛糖-1-差向異構酶的核苷酸序列在編碼它 的表達載體中。
11.用于生成戊糖衍生化合物的方法，其中所述方法包括在培養基中培養依照權利要 求1-8任一項的微生物或通過權利要求9或權利要求10的方法制備的微生物。
12.用于生成生物燃料的方法，其中所述方法包括在培養基中培養依照權利要求1-8 任一項的微生物或通過權利要求9或權利要求10的方法制備的微生物的步驟。
13.依照權利要求12的方法，其中所述方法進一步包括自培養液獲得生物燃料的步馬聚ο
14.通過依照權利要求12或權利要求13的方法獲得的生物燃料。
15.依照權利要求1-8任一項的微生物或通過權利要求9或權利要求10的方法制備的 微生物用于生成戊糖衍生產物的用途。
16.依照權利要求1-8任一項的微生物或通過權利要求9或權利要求10的方法制備的 微生物用于生成生物燃料的用途。
17.能夠在戊醛糖存在下實現比轉化前的等同微生物要更高的生長速率的經轉化微生物。
18.能夠實現比轉化前的等同微生物要更高的戊醛糖代謝的經轉化微生物。
19.依照權利要求17或權利要求18的微生物，其中所述微生物已經用引起微生物過表 達醛糖-ι-差向異構酶的核苷酸序列轉化。
20.依照權利要求17-19任一項的微生物，其中所述微生物已經用編碼醛糖-1-差向異 構酶的核苷酸序列轉化。
21.依照權利要求17-20任一項的微生物，其中所述微生物是經轉化酵母。
22.依照權利要求17-20任一項的微生物，其中所述戊醛糖選自下組木糖，阿拉伯糖， 核糖和來蘇糖。
23.依照前述權利要求任一項的微生物，其中所述戊酮糖是木酮糖。
24.包含依照權利要求17-23任一項的微生物的接種物。
25.包含依照權利要求17- 任一項的微生物的培養液。
26.用于制備能夠以比轉化前的等同微生物要更高的速率將戊醛糖轉變成戊酮糖的經 轉化微生物的方法，所述方法包括用編碼醛糖-ι-差向異構酶的核苷酸序列轉化微生物的 步驟，其中所述經轉化微生物能夠將戊醛糖轉變成戊酮糖。
27.用于制備能夠在戊醛糖存在下實現比轉化前的等同微生物要更高的生長速率的經 轉化微生物的方法，所述方法包括用編碼醛糖-ι-差向異構酶的核苷酸序列轉化微生物的 步驟，其中所述經轉化微生物能夠將戊醛糖轉變成戊酮糖。
28.用于制備能夠實現比轉化前的等同微生物要更高的戊醛糖代謝的經轉化微生物的 方法，所述方法包括用編碼醛糖-1-差向異構酶的核苷酸序列轉化微生物的步驟，其中所 述經轉化微生物能夠將戊醛糖轉變成戊酮糖。
29.依照權利要求沈-觀任一項的方法，其中所述微生物已經用引起微生物過表達醛 糖-ι-差向異構酶的核苷酸序列轉化。
30.依照權利要求沈-四任一項的方法，其中所述微生物已經用編碼醛糖-1-差向異構 酶的核苷酸序列轉化。
31.依照權利要求沈-30任一項的方法，其中所述微生物是經轉化酵母。
32.依照權利要求沈-31任一項的方法，其中所述戊醛糖選自下組木糖，阿拉伯糖，核 糖和來蘇糖。
33.依照權利要求沈-32任一項的方法，其中所述戊酮糖是木酮糖。
34.基本上如本文所述的經轉化微生物。
35.基本上如本文所述的接種物。
36.基本上如本文所述的培養液。
37.基本上如本文所述的生物燃料。
38.基本上如本文所述的用于制備經轉化微生物的方法。
39.基本上如本文所述的用于生成戊糖衍生化合物的方法。
40.基本上如本文所述的用于生成生物燃料的方法。
全文摘要
能夠以比轉化前的等同微生物要更高的速率將戊醛糖轉變成戊酮糖的經轉化微生物。
文檔編號C12R1/865GK102144029SQ200980134462
公開日2011年8月3日 申請日期2009年7月3日 優先權日2008年7月4日
發明者伯吉特.龍諾, 奧利.西貝森, 托馬斯.H.安德森 申請人:特拉諾爾股份公司