用于計數抗生素抗性微生物的方法和組合物的制作方法

專利名稱：用于計數抗生素抗性微生物的方法和組合物的制作方法
用于計數抗生素抗性微生物的方法和組合物相關專利申請的交叉引用本申請要求2008年8月21日提交的美國專利申請No. 61/090，761的優先權，該 專利申請以引用方式全文并入本文。
背景技術：
有大量文獻證明凝固酶陽性菌種金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus)是人 類機會性病原體(Murray 等人編輯，1999，Manual of Clinical Microbiology，第 7 版，ASM Press, Washington, D. C.)。由金黃色葡萄球菌引起的醫院感染是發病和死亡的主要原因。 由金黃色葡萄球菌引起的一些最普通的感染涉及皮膚，這些感染包括發生在各個部位的癤 子或疔瘡、蜂窩織炎、膿皰病以及手術后和慢性傷口感染。由金黃色葡萄球菌導致的一些更 嚴重的感染是菌血癥、肺炎、骨髓炎、急性心內膜炎、心肌炎、心包炎、大腦炎、腦膜炎、燙傷 樣皮膚綜合征和各種膿腫。由葡萄球菌腸毒素介導的食物中毒是另一種與金黃色葡萄球菌相關的重要綜合 征。中毒性休克綜合征是一種社區獲得性疾病，它也已被歸因于產毒素的金黃色葡萄球菌 的感染或定植。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)出現在二十世紀80年代，成為醫院中 的重大臨床和流行病學問題(Oliveira 等人，2002，Lancet Infect Dis. 2 :180-189)。MRSA 能耐受所有的內酰胺，包括青霉素、頭孢菌素、碳青霉烯類和單環內酰胺類，它們是治 療金黃色葡萄球菌感染的最常用抗生素。MRSA感染只能用毒性更高且更昂貴的抗生素治 療，這些抗生素通常作為最后一道防線來使用。由于MRSA能容易地通過醫護人員在患者間 傳播，全世界的醫院都面臨控制MRSA的問題。因此，需要開發出用于檢測和/或鑒定MRSA 的快速簡便的篩選或診斷試驗法，以減少它的擴散和改善對受感染患者的診斷和治療。金黃色葡萄球菌中的甲氧西林耐受性之所以獨特，是因為從其他凝固酶陰性葡萄 球菌(CNS)獲得了編碼耐β-內酰胺的青霉素結合蛋白(PBP)的DNA，該蛋白在細胞暴露于 β -內酰胺抗生素時會接管正常PBP的生物合成功能。金黃色葡萄球菌通常含有四種ΡΒΡ， 其中PBP 1、2和3是必需的。MRSA中的低親和力PBP被稱為PBP 2a(或ΡΒΡ2')，是由染 色體mecA基因編碼，起到耐β -內酰胺的轉肽酶的作用。mecA基因在甲氧西林敏感性金黃 色葡萄球菌中不存在，但廣泛分布于其他的葡萄球菌種類中，且高度保守⑴bukata等人， 1990, Antimicrob. Agents Chemother. 34 :170-172)。基于檢測mecA基因和金黃色葡萄球菌特異性染色體序列來檢測和鑒定MRSA的 方法已有描述。(Saito 等人，1995，J. Clin. Microbiol. 33 :2498-2500 ；Ubukata 等人， 1992，J. Clin. Microbiol. 30 :1728-1733 ；Murakami 等人，1991，J. Clin. Microbiol. 29 2240-2244 ；Hiramatsu等人，1992,Microbiol. Immunol. 36 :445-453)。但是，由于mecA基因 在金黃色葡萄球菌和凝固酶陰性葡萄球菌中都廣泛存在，這些方法并不總是能夠區別MRSA 與耐甲氧西林凝固酶陰性葡萄球菌(MRCNS)(參見Suzuki等人，1992，Antimicrob. Agents. Chemother. 36 :429-434)。為解決這個問題，Hiramatsu等人開發了對MRSA具有特異性的 基于PCR的測定法，該測定法利用能與3種類型的葡萄球菌染色體盒mec DNA(SCCmec DNA)的右末端雜交的引物，以及對金黃色葡萄球菌的對應于SCCmec整合位點的右側上的核苷 酸序列具有特異性的引物。(美國專利No. 6，156，507)。其他葡萄球菌種類(例如表皮葡 萄球菌(S^pidermidis)和溶血葡萄球菌(S. haemolyticus))中的SCCmec整合位點周圍 的核苷酸序列與金黃色葡萄球菌中存在的那些核苷酸序列不同，因此，這個PCR測定法能 特異性檢測MRSA。用于檢測MRSA和區分MRSA與MRCNS的遺傳測定法相對較昂貴。另外，這類試驗 法需要復雜的儀器和熟練的實驗人員才能進行。

發明內容
鑒于當前的試驗法要求復雜的儀器、不穩定的培養基和/或高度熟練的實驗人 員，因此需要更簡單的基于培養的試驗法來檢測和區分樣本中的MRSA和/或MRCNS微生 物。此外，目前的MRSA和MRCNS微生物的試驗法是定性的或者半定量的。本發明涉及用于 檢測和區分樣本中的抗生素抗性微生物的簡單物品和方法。有利地，本發明的某些實施例 提供抗生素抗性微生物的定量計數。本發明方法還提供對含有MRSA和MRCNS的樣本中的 這兩種微生物的差分計數。在一個方面，本發明提供用于檢測或計數抗生素抗性微生物的物品。該物品可包 括有效量的用于選擇抗生素抗性葡萄球菌微生物的生長的內酰胺抗生素，前提條件是 該內酰胺抗生素不是氨曲南。該物品還可包括營養培養基、用于指示微生物的存在的 指示劑系統和包含膠凝劑的干燥、可再水化的薄膜培養裝置。在另一個方面，本發明提供用于對抗生素抗性微生物進行差分計數的物品。該物 品可包括有效量的用于選擇抗生素抗性葡萄球菌微生物的生長的β-內酰胺抗生素，前提 條件是該β-內酰胺抗生素不是氨曲南。該物品還可包括營養培養基、用于指示微生物的 存在的第一指示劑系統、用于指示金黃色葡萄球菌的存在的第二指示劑系統和包含膠凝劑 的干燥、可再水化的薄膜培養裝置。在另一個方面，本發明提供用于檢測抗生素抗性微生物的方法。該方法可包括提 供懷疑含有抗生素抗性微生物的液體樣本；提供干燥的薄膜培養裝置；用該液體樣本接種 該培養裝置；將該接種的培養裝置溫育一段時間；和分析該培養裝置存在抗生素抗性微生 物。該培養裝置可包括營養培養基、有效量的用于選擇抗生素抗性微生物的生長的β-內 酰胺抗生素(前提條件是該β -內酰胺抗生素不是氨曲南)、用于指示微生物的存在的指示 劑系統和膠凝劑。在另一個方面，本發明提供用于檢測和區分抗生素抗性微生物的方法。該方法可 包括提供懷疑含有抗生素抗性微生物的液體樣本；提供干燥的薄膜培養裝置；用該液體樣 本接種該培養裝置；將該接種的培養裝置溫育一段時間；和分析該培養裝置存在抗生素抗 性微生物。該培養裝置可包括營養培養基、有效量的用于選擇抗生素抗性微生物的生長的 β-內酰胺抗生素(前提條件是該β-內酰胺抗生素不是氨曲南)、用于指示微生物的存在 的指示劑系統、用于指示金黃色葡萄球菌的存在的第二指示劑系統和膠凝劑。在另一個方面，本發明提供用于檢測和區分抗生素抗性微生物的方法。該方法可 包括提供懷疑含有抗生素抗性微生物的液體樣本和包含膠凝劑的干燥的薄膜培養裝置以 及以下成分中的任何一種或多種營養培養基、有效量的用于選擇抗生素抗性微生物的生長的內酰胺抗生素(前提條件是該內酰胺抗生素不是氨曲南)和用于指示微生 物的存在的指示劑系統。該方法還可包括向該培養裝置加入如果不是已經存在的營養培 養基、有效量的用于選擇抗生素抗性微生物的生長的內酰胺抗生素(前提條件是該 內酰胺抗生素不是氨曲南)和用于指示微生物的存在的指示劑系統。該方法還可包括 用該液體樣本接種該培養裝置，將該接種的培養裝置溫育一段時間，和分析該培養裝置存 在抗生素抗性微生物。在另一個方面，本發明提供用于檢測和區分抗生素抗性微生物的方法。該方法可 包括提供懷疑含有抗生素抗性微生物的液體樣本和包含膠凝劑的干燥的薄膜培養裝置以 及以下成分中的任何一種或多種營養培養基、有效量的用于選擇抗生素抗性微生物的生 長的β -內酰胺抗生素(前提條件是該β -內酰胺抗生素不是氨曲南)、用于指示微生物的 存在的第一指示劑系統和用于檢測金黃色葡萄球菌的存在的第二指示劑系統。該方法還可 包括向該培養裝置加入如果不是已經存在的營養培養基、有效量的用于選擇抗生素抗性微 生物的生長的β-內酰胺抗生素(前提條件是該β-內酰胺抗生素不是氨曲南)、用于指示 微生物的存在的第一指示劑系統和用于檢測金黃色葡萄球菌的存在的第二指示劑系統。該 方法還可包括用該液體樣本接種該培養裝置，將該接種的培養裝置溫育一段時間，和分析 該培養裝置存在抗生素抗性微生物。定義出于本發明的目的，“液體樣本”指其中可能含有各種微生物的含水混合物，包括食物樣本和臨床樣本 在內，包括那些均化、稀釋和/或懸浮在含水混合物中的樣本在內；“ β -內酰胺抗生素”指任何在其分子結構中包含β -內酰胺核心的抗生素。β -內 酰胺抗生素的非限制性例子包括青霉素、頭孢菌素、單菌胺環、卡巴培南和前述任一者的含 β-內酰胺的衍生物；“粉末”指具有適用于本發明薄膜培養板裝置的平均直徑的一種或多種膠凝劑的 顆粒狀材料，優選地直徑為約10-400微米，更優選地直徑為約30-90微米；“冷水可溶性粉末”指當與含水試驗樣本進行組合時在室溫水(例如約18°C至 24°C )中形成凝膠的粉末； “非抑制性乳化劑，，指適用于將水不溶性粘合劑分散在含水環境中，但不會實質上 抑制想要培養的微生物的生長的乳化劑，優選地為非離子型乳化劑；“復水的培養基”指用水或含水試驗樣本對冷水可溶性粉末進行復水所形成的溶 液和/或凝膠；“透氣的”指這樣的材料，它當在它的邊緣實質上暴露于空氣時，可在水平方向上 (即平行于它的上表面和下表面)充分地可透過空氣，以給上方的復水培養基提供充足的 空氣供應，從而支持復水培養基中的好氧微生物的生長；“水基粘合劑組合物”指水不溶性粘合劑分散于含水環境中所得的粘合劑組合物； 和“選擇劑”指任何起到抑制生長于本發明培養基裝置上的微生物的生長和/或促進 所述微生物的鑒定的作用的元素、化合物或組合物。詞語“優選的”和“優選地”指在某些情況下，可提供某些有益效果的本發明實施例。然而，在相同的情況或其它情況下，也可優選其它實施例。此外，對一個或多個優選實 施例的敘及并不暗示其它實施例是不可用的，且并無意于將其它實施例排除在本發明范圍 之外。當術語“包含”及其變型出現在具體實施方式
和權利要求中時不具有限制的意思。本文所用的“一種(個)”、“所述(該)”、“至少一種(個)”以及“一種或多種(一 個或多個)”可互換使用。因此，例如，懷疑含有“一種”微生物的樣本可被解釋為意指該液 體可包含“一種或多種”微生物。術語“和/或”意指所列要素的一個或全部，或所列要素的任何兩個或更多個的組合。本文以端點值敘及的數字范圍包括該范圍內的所有數字(比如，1到5包含1、 1. 5、2、2· 75,3,3. 80、4、5 等)。本發明的上述發明內容并非意圖描述本發明每一個公開的實施例或每種實施方 式。以下“具體實施方式
”更具體地舉例說明了示例性實施例。在本專利申請全文的幾處， 通過實例列表提供指導，可以不同組合使用這些實例。在每一種情況下，被引用的列表均僅 用作一個代表性的組，不應被理解為是排他性列表。


本發明將結合下面所列的附圖進行進一步的闡述，其中在幾個視圖中相同的結構 由相同的數字指代。圖1是包括隔片的薄膜培養裝置的一個實施例的頂部透視圖(局部剖視)。圖2是包括網格圖案的自支撐基材的一個實施例的頂視圖。圖3是薄膜培養裝置的一個實施例的頂部透視圖(局部剖視)。圖4是包括隔片和捕獲元件的表面菌落計數薄膜培養裝置的一個實施例的頂部 透視圖(局部剖視)。
具體實施例方式本發明涉及用于檢測樣本中的耐抗生素(例如耐β -內酰胺抗生素)微生物的物 品和方法。本發明還提供用于區分樣本中的抗生素抗性微生物的物品和方法。具體地講， 本發明涉及抗生素抗性葡萄球菌的檢測。在一些實施例中，可將耐抗生素金黃色葡萄球菌 與耐抗生素凝固酶陰性葡萄球菌區分開來。與常規的測試抗生素抗性微生物存在與否的試 驗法形成對照的是，本發明方法提供對樣本中活的抗生素抗性微生物的定量。本發明方法 還提供對樣本中不同種類和/或類群的抗生素抗性微生物的定量。常規的基于瓊脂的抗生素抗性微生物檢測試驗法需要費力地制備瓊脂平板，且通 常平板必須在相對較短的時間內使用，以避免脫水和/或抗生素功效的損失。相比之下，本 發明的干的薄膜培養裝置現成可用于樣本，能保藏相對較長時間，且任選地可在使用過程 中加入抗生素，從而確保抗生素選擇的完全功效。常規的檢測抗生素抗性微生物的方法通常涉及純化微生物菌落并將菌落轉移到 含抗生素的瓊脂平板，以確定它們是否能在抗生素存在下生長。在這些方法中，首先對抗生 素抗性微生物的存在進行定性檢測(即在劃線平板上的菌落或者在用于對存在與否進行定性的肉湯培養中的生長)，隨后對檢測到的微生物的耐抗生素純菌落進行表征(即通過 產生抗菌譜或者通過進行最小抑菌濃度(MIC)或最小殺菌濃度(MBC)測定來表征)。常規 方法可包括區分性試驗(例如凝集測定)，以使得能夠對抗生素抗性微生物進行推測性鑒 定。但是，常規的方法不能提供對原始樣本中的抗生素抗性微生物的直接、定量的計數。此 外，常規的方法不能提供對原始樣本中存在的微生物混合群體的區分性定量。本發明方法 可提供對原始樣本中或原始樣本的稀釋部分中的抗生素抗性微生物的計數。本發明方法還 可提供對樣本中的抗生素抗性微生物的混合群體的差分計數。
薄膜培養裝置 本發明的物品包括薄膜培養裝置，如美國專利No. 4，476，226、5，089，413和 5，232，838中公開的那些薄膜培養裝置，這些專利以引用方式全文并入本文。圖1示出根據 本發明的薄膜培養裝置的一個實施例。培養裝置110包括主體構件，該主體構件包括具有 上下表面(分別為11 和112b)的自支撐防水基材112。基材112可為相對堅硬的膜(例 如聚酯、聚丙烯或聚苯乙烯)，該膜不會吸水或者以別的方式被水影響。基材112可為透明 的或不透明的，這取決于是否想要通過該基材觀察細菌菌落。為促進細菌菌落的計數，基材 212可在其上印刷有網格圖案(例如方格)，如圖2中所示。再參見圖1，基材112可在其上表面11 上涂覆有一層粘合劑114，該層粘合劑起 到將干燥的膠凝劑和/或營養物保持在均勻的單層中以便水化的作用。粘合劑114應以優 選地小于粉末化膠凝劑和/或營養物的顆粒直徑的厚度涂覆到基材112上。目的是施加足 夠的粘合劑以將顆粒粘附到基材，但又不太多而造成顆粒完全嵌在粘合劑中。冷水可溶性 粉末的均勻單層116是所期望的，其表面積充分暴露以便水化。圖1中還示出在覆蓋片122 上的任選的粘合劑層114’和冷水可溶性粉末層116’。在一些實施例中，粘合劑114可包含水基粘合劑組合物。優選地，水基粘合劑層 114當被含水試驗樣本濕潤時充分透明，以使得能夠觀察微生物菌落。水基粘合劑組合物可 摻入一種或多種親水劑，包括營養物，選擇劑、指示劑(例如酶底物、染料)或它們的組合。 本領域技術人員參考本說明書，根據所要生長和/或選擇性檢測(例如染色)或抑制的具 體微生物，將顯而易見地知道水基粘合劑組合物中使用的具體營養物和/或選擇劑。示例性的一類有用的親水性選擇劑包括這樣的染料，其被生長中的微生物代謝或 者以別的方式與生長中的微生物反應，由此造成微生物菌落被染色或者發熒光，以便技術 人員或自動讀數器進行檢測和/或定量。這種染料的非限制性例子包括氯化三苯基四唑、 對甲苯基四唑紅、四唑紫、藜蘆基四唑藍、中性紅、酚紅、氯酚紅和5-溴-4-氯-3-吲哚基磷 酸二鈉鹽。本發明的特別優選的染料包括中性紅和5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸二鈉鹽。但 是應認識到，取決于所要鑒定的具體微生物，也可使用其他合適的染料。在本發明的另一個實施例中，粉末116可包含營養物但無膠凝劑。如果想要顯現 和/或分離分立的細菌菌落，則膠凝劑可以是合乎需要的。在許多微生物學試驗中，如用于 細菌鑒定或抗生素易感性的試驗中，使用到肉湯培養基，可不需要粘稠的凝膠。在進行這種 試驗的裝置中，可省去膠凝劑。可采用緩沖試劑如碳酸鈉來提供顯示中性pH的培養基，并可采用“Cab-0-Sil M-5”作為加工助劑，如美國專利No. 4，565，783中所描述，該專利以引用方式全文并入本 文。當然，可根據所要生長的微生物的類型，對用于粉末116的具體的包覆混合物(例如營養物、指示劑和/或膠凝劑)加以調整。用于支持各種葡萄球菌的生長的非限制性示例性粉末混合物如下15克膠(M150瓜爾豆膠和黃原膠(Rhodia，Cranbury, NJ)的1 1混合物)5克蛋白胨2. 5克酵母膏1克右旋糖0. 06克碳酸鈉0. 12 克“Cab-0-Sil M-5”(熱解法二氧化硅，可從 Cabot Corporation 市售獲得)設想到，本發明的物品可包括區分性指示劑。本文所用的“區分性指示劑”指添加 到培養基中的、會指示某些微生物的存在而不會指示其他微生物的存在的試劑。區分性指 示劑的非限制性例子包括染料(例如著色劑、PH指示劑、氧化還原指示劑)、酶底物(例如 磷酸酶、糖苷酶、肽酶、核酸酶、脂肪酶等的發色底物或熒光底物)以及當被某些微生物代 謝時會產生可檢測的反應(例如與菌落相關的PH變化)的特定營養物(例如可發酵碳水 化合物、氨基酸)。在一些實施例中，可將一種或多種區分性指示劑加在涂覆到基材上的水基組合物 中以加到薄膜培養裝置。在一些實施例中，可將一種或多種區分性指示劑加到液體樣本，然 后液體樣本加到培養裝置。在一些實施例中，可在培養裝置進行水化后，將一種或多種區分 性指示劑加到培養裝置。涉及到使用加到水化后的培養裝置的區分性指示劑的方法的一 個例子，是其中將用于檢測耐熱核酸酶的物品加到溫育后的培養裝置的方法，如美國專利 No. 6，022，682中所述，該專利以引用方式全文并入本文。在本發明范圍內還設想到，粉末116可任選包括為執行某些用于微生物鑒定的生 化試驗所必需的試劑。這種在特定類型的微生物存在下發生顏色變化的試劑(例如酶底 物)可包括在粉末116或粘合劑114中。在本發明的另一個實施例中，粉末116可包含這樣的涂層，其包括膠凝劑和營養 物的混合物、選擇劑和/或指示劑，且已被溶解或懸浮于溶液中涂覆并干燥到基材112上。 在這個實施例中，涂層實質上是無水的(即涂層一旦被允許與周圍環境平衡，其水分含量 不超過大約脫水涂層的水分含量)。如圖1所示，主體構件可包括施加到基材112的上表面的隔片118，該隔片118包 括在中部切穿以暴露基材112上的粉末116的圓形孔120。孔120的壁提供預定大小和形 狀的槽以限定水化后的培養基。隔片118應足夠厚以形成所需體積的槽，例如1、2或3毫 升。聚乙烯閉孔泡沫塑料是隔片118的優選材料，但也可使用任何疏水性(非濕潤性)、對 微生物惰性且能夠承受滅菌的材料。在一些實施例中(未顯示)，隔片118可包括多個孔 20(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15或20個孔)，每個孔可接種上不同的液體樣本。隔片118可包括相對較厚的設計，如美國專利No. 5，681，712中所述的那些設計， 該專利以引用方式全文并入本文。較厚的帶孔隔片118的一個目的是對放置在隔片118的 孔120中的膜進行定位和保護(例如微孔過濾膜)(未顯示)。較厚的隔片118的另一個目 的是減少或防止覆蓋片122與生長中的微生物菌落的接觸(即提供生長表面和覆蓋片122 之間的“頂部空間”，這還可使得對生長中的微生物菌落的通氣增加)。隔片118的厚度應足以圍住當對培養裝置接種時加到裝置的液體體積。取決于膜(當使用時)的厚度，隔片可為至少約0.5mm厚、約Imm厚、約1. 5mm厚和約2mm厚。圖3顯示薄膜培養裝置310的另一個實施例。這個實施例包括基材312、粘合劑 314、冷水可溶性粉末316和覆蓋片322，如圖1所示。與圖1的培養裝置110相反，圖3的 裝置310不包括用于在接種過程中限定樣本的隔片。可將模板例如加重環(未顯示)臨時 施加到覆蓋片322的外面，該模板在閉合后用以在冷水可溶性粉末316形成凝膠的時候將 樣本限定到特定區域。在一些實施例中，裝置310可接種上多個(例如2、3、4、5、6、7、8、9、 10、12、15或20個)不同的液體樣本，采用適當的隔片和模板來將各個樣本限定于培養裝置 310的粉末316的不同部分。圖4示出根據本發明的薄膜培養裝置的另一個實施例410。培養裝置410包括主 體構件411，該主體構件包括具有上下表面41 和412b的自支撐基材412。基材412在其 上表面41 上包覆有一層粘合劑414。包含一種或多種膠凝劑的冷水可溶性粉末416以薄 的、相對均勻的層粘附到粘合劑414。一旦接種上含水試驗樣本(未顯示)，冷水可溶性粉 末層416立即水化而形成復水的培養基(未顯示)，該培養基進而能夠培育存在于液體接種 物中或存在于膜(如試驗樣本微生物過濾膜)(未顯示)的表面上的微生物。隔片418部 分地覆蓋基材412和覆蓋粉末416的表面，具有孔420。另外，薄膜培養裝置410任選包括 覆蓋片422，以覆蓋在加入含水試驗樣本后形成的復水培養基。圖4還顯示捕獲元件似6和 在其上生長的微生物菌落428。在該圖示的實施例中，捕獲元件似6是微孔濾膜，已將液體 樣本過濾通過該膜，以在其上截留樣本中可能存在的任何細菌。雖然圖1-4所示的實施例具有連接到裝置的覆蓋片，但在本發明范圍內還設想 到，含粉末的實施例可以在保藏和溫育過程中不進行覆蓋，而是僅僅放在無菌環境中。還可以在本發明的裝置中使用透氣的膜層，如美國專利No. 5，232，838中所描述。 可將透氣的層“夾”在基材和冷水可溶性粉末之間，在該透氣的膜層的兩側上具有粘合劑涂 層(未顯示)。抗生素本發明包括利用抗生素來選擇抗生素抗性微生物的生長的物品和方法。對某些 從臨床感染分離到的微生物(例如金黃色葡萄球菌)日常篩選它們對某些抗生素(例如
內酰胺抗生素)的耐藥性。用于篩選過程的抗生素的選擇可取決于操作者想要進行抗 生素耐藥性測試的微生物。在一些實施例中，可在薄膜培養裝置的制造過程中將抗生素摻入到該裝置 中。在一些實施例中，可將抗生素摻入到薄膜培養裝置的粘合劑涂層中，如美國專利 No. 5，089，413的實例1中所描述。除此之外，或者作為另外一種選擇，可在薄膜培養裝置的 制備過程中將抗生素摻入到涂覆在基材上的混合物中(如美國專利No. 7，087，401的實例 1和2中所描述)。美國專利No. 7，087，401 (其以引用方式全文并入本文)描述了將抗生 素摻入到含水混合物中，隨后將混合物涂覆并干燥到基材上。在一些實施例中，可將抗生素 加到粉末(例如粉末化營養物和/或膠凝劑)的混合物，然后可用粉末涂覆方法將該混合 物涂覆到基材上的粘合劑層上。在一些實施例中，可在薄膜培養裝置的使用過程中將抗生素加到該裝置。例如，可 在將樣本接種到培養裝置中之前將抗生素加到樣本。或者，可在將樣本接種到培養裝置中 之前將含抗生素的溶液加到培養裝置。例如，在一個實施例中，用含抗生素的溶液水化該裝置的膠凝劑，并通過例如將含有樣本的過濾器放在水化凝膠的表面上來將樣本接種到水化 凝膠上。在一些實施例中，在就要將樣本加到薄膜培養裝置之前將先抗生素的濃縮溶液加 到該裝置，然后在接種過程中將兩種溶液混合。設想到，可使用任何與薄膜培養裝置材料相容的抗生素來檢測和/或計數根據本 發明的抗生素抗性微生物。本文所用的“相容的”意指該抗生素與薄膜培養裝置中的其他 材料發生相互作用，不至于實質上改變抗生素的功效或者會不利地影響培育和檢測耐該抗 生素的微生物的能力。優選的一組用于檢測抗生素抗性微生物的抗生素是內酰胺抗生 素組別，它們常常是用于治療臨床感染的主要類型的抗生素。在一些實施例中，可將內 酰胺抗生素用于培養裝置中以檢測抗生素抗性微生物。在某些實施例中，內酰胺抗生 素屬于內酰胺抗生素中的頭孢菌素組別。抗生素的頭孢菌素組別包括“第一代頭孢菌 素”(例如頭孢唑林)。抗生素的頭孢菌素組別還包括“第二代頭孢菌素”(例如頭孢西丁 和頭孢呋辛)。在一些實施例中，頭孢唑林可用于根據本發明的薄膜培養裝置中。可將頭孢唑林 以會在水化的培養基中產生約1 μ g/mL至約5 μ g/mL濃度的量加到上述的裝置。在一些實 施例中，頭孢唑林在接種的樣本中的最終濃度可為約1 μ g/mL、約3 μ g/mL、約4 μ g/mL或約 5 μ g/mL。在一些實施例中，頭孢呋辛可用于根據本發明的薄膜培養裝置中。可將頭孢呋辛 以會在水化的培養基中產生約3 μ g/mL至約5 μ g/mL濃度的量加到上述的裝置。在一些實 施例中，頭孢呋辛在接種的樣本中的最終濃度可為約3 μ g/mL、約4 μ g/mL或約5 μ g/mL。在一些實施例中，頭孢西丁可用于根據本發明的薄膜培養裝置中。可將頭孢西丁 以會在水化的培養基中產生約3 μ g/mL至約5 μ g/mL濃度的量加到上述的裝置。在一些實 施例中，頭孢西丁在接種的樣本中的最終濃度可為約3 μ g/mL、約4 μ g/mL或約5 μ g/mL。在本發明范圍內設想到，物品或方法可包括使用兩種或更多種抗生素以檢測和/ 或計數抗生素抗性微生物。捕獲元件本發明的培養裝置可與捕獲元件一起使用以檢測液體懸浮液中或者表面上的抗 生素抗性微生物。本文所用的“捕獲元件”指用于捕集和保持樣本中存在的微生物的物品。 優選地，將捕獲元件的尺寸確定成能讓它們放入本發明的薄膜培養裝置中并在溫育期間保 持在薄膜培養裝置中，保持的時間足以讓靶標微生物進行至少一次細胞分裂。將捕獲元件 放入培養裝置中可使捕獲元件與培養裝置中的膠凝劑和/或營養培養基(如果存在的話)， 從而讓微生物生長和/或增殖。在一些實施例中，在將捕獲元件放入培養裝置中之前將培 養裝置水化(例如用無菌液體或未知的液體樣本接種)。在一些實施例中，在將捕獲元件放 入培養裝置中之后將培養裝置水化。可對捕集裝置加以選擇非，確定它們與某些類型的樣本的適合性。例如，可將微 孔過濾器用作捕獲元件以截留液體樣本中存在的微生物。可使液體樣本通過過濾器，從而 微生物可被截留在其上。微生物可通過例如物理俘獲或者特異性(例如抗原-抗體或受 體-配體相互作用)或非特異性(疏水吸附)化學相互作用進行截留。參考圖4所示的實施例，試驗樣本可包含液體接種物和/或捕獲元件4 如微孔 過濾器(例如過濾膜)或擦拭裝置。捕獲元件4 可從各種膜(membrane)和薄膜(film)構造而成，且可用于捕集微生物。在一些實施例中，捕獲元件似6可提供表面，微生物菌落 可在該表面上通過本發明的方法和裝置進行培育、檢測和/或計數。特別合適的是已通常 用于從大的流體樣本分離小的微生物群體(如細菌)的已知微孔過濾器。已知這種過濾 器被放在瓊脂培養基的表面上并進行溫育，以便對被過濾的微生物進行計數和評估。合適 的過濾器包括可獲自Millipore公司(Marlborough，ΜΑ)的HAWG系列過濾器，例如HAWG 04750型的HA過濾器，和可獲自Gelman公司(Ann Arbor, MI)的Metricel型的膜，例如 GN-6 Metricel膜。其他合適的膜包括通過在各種由乙烯醇的均聚物或共聚物構成的聚合 物上提供涂層而制備的親水性膜，如PCT國際公開文本WO 92/07899中所描述。由該國際 公開文本的實例5中所述的方法制備的乙烯醇涂層微孔聚丙烯，是本發明中優選的微生物 過濾器ο上述的微生物過濾器的薄膜通常相對較薄，厚度約為0.01_2mm，優選 0.05-1. 0mm，且可以任何所需的二維形狀提供，例如以矩形、盤形(包括部分的盤形)等提{共。取決于膜中的孔隙的大小，這種過濾器以不同的效率分離微生物。細菌容易分離， 而酵母和霉菌也會被這種過濾器分離。過濾是用合適大小的漏斗和隔膜(disc)按常規方 法進行。隔膜優選用鑷子在無菌條件下操作。隔膜可由使用者從可市售獲得的材料制作， 或者在無菌包裝中作為單獨的實體或作為本發明的套件的部件提供。擦拭裝置可作為捕獲元件用于本發明的培養裝置。本文所用的“擦拭裝置”是被 構造成用于接觸表面以獲取分布在該表面上的微生物樣本的物品。擦拭裝置可包括多孔無 紡材料。擦拭材料的非限制性例子包括紙(例如濾紙、纖維素膜過濾器)、合成的無紡材料 (例如尼龍或聚酯無紡材料)、聚合物膜或陶瓷膜(例如聚碳酸酯膜、氧化鋯膜)、微結構化 薄膜(例如含微通道的薄膜，如美國專利No. 7，223，364中描述的那些，該專利以引用方式 全文并入本文)。在一些實施例中，含微通道的薄膜具有讓流體(和溶質或小顆粒)從薄膜 的一個主表面通向另一個主表面的通孔。擦拭裝置可包括用于改善濕潤性的化學物質(例 如表面活性劑)或者試劑(例如區分性著色劑)。擦拭裝置所包含的化學物質的數量一般 而言不會實質上抑制抗生素抗性微生物在本文所述的接種和溫育條件下的生長。在一些實 施例中，捕獲元件實質上是透明的，或者當濕潤時變得實質上是透明度，從而使得區分性反 應(如溶血)可以透過捕獲元件顯現出來。 合適的捕獲元件包括一個顆粒或多個顆粒。捕獲元件包括用于將捕獲元件結合到 微生物的手段。顆粒的非限制性例子包括微球體、微珠等。這種顆粒可為樹脂顆粒，例如瓊 脂糖、乳膠、聚苯乙烯、尼龍、聚丙烯酰胺、纖維素、多糖或它們的組合，或者為無機顆粒，例 如二氧化硅、氧化鋁或它們的組合。這種顆粒可以是磁性的、順磁性的、超順磁性或非磁性 的。這種顆粒可為膠體大小，例如約IOOnm至約10微米(μ m)。這種顆粒的非限制性例子 包括以商品名 DYNABEADS(Invitrogen，Inc.，Carlsbad, CA)和 BIO-ADEMBEADS(Ademtech， Pessac，法國)出售的超順磁性聚合物顆粒。可將顆粒捕獲元件摻入到其他結構如微孔膜 中。 有多種手段用于將捕獲元件(例如顆粒)結合到微生物。在一些實施例中，用于 將捕獲元件結合到微生物的手段可包括表面分子或者能促進非特異性吸附的性質。例如， 捕獲元件的至少一部分在其表面上可具有這樣的分子，它們在適當的條件(例如高PH或低PH)下變得帶正電荷或帶負電荷，且非特異性地吸附到與微生物表面締合的帶互補電荷的 分子。除此之外，或者作為另外一種選擇，捕獲元件(例如聚苯乙烯顆粒)的至少一部分 可具有非特異性吸附到與微生物表面締合的疏水分子的疏水表面。在一些實施例中，用于 將捕獲元件結合到微生物的手段可包括能通過受體-配體相互作用特異性結合微生物的 分子。這種特異性的受體-配體相互作用是本領域公知的，包括例如抗體和它們的相應抗 原之間的相互作用、凝集素和它們的相應碳水化合物結合伴侶之間的相互作用、噬菌體蛋 白和它們的相應噬菌體受體之間的相互作用，等等。應理解，用于將顆粒結合到微生物的手 段也可與薄膜或非織造物(例如過濾器)以及顆粒狀捕獲元件捕獲元件聯用。樣本可在可衍自任何來源的試驗樣本中分析所關注的耐抗生素種類，所述來源例如生 理流體，如血液、唾液、眼晶狀體液、滑液、腦脊髓液、膿液、汗液、滲出液、尿液、黏液、糞便、 乳液等。此外，試驗樣本可衍自身體部位，例如傷口、皮膚、鼻孔、頭皮、指甲等。特別值得關注的樣本包括含黏液的樣本，如鼻樣本(來自例如前鼻孔、鼻咽腔、鼻 腔、鼻前庭等)以及來自外耳、中耳、口、直腸、陰道或其他類似組織的樣本。具體的粘膜組 織的例子包括口腔、齒齦、鼻、眼、氣管、支氣管、胃腸、直腸、尿道、輸尿管、陰道、子宮頸和子 宮的粘膜。除了生理流體外，其他試驗樣品可包括其他液體以及溶于液體介質的固體。所關 注的樣本可包括工藝流、水、土壤、莊稼或其他植物、空氣、表面(例如受污染的表面、地面、 墻壁、儀器、被褥)等。樣本還可包括經培養的細胞。各種用于檢測表面上的微生物如金黃色葡萄球菌的患者采樣技術是已知的。這些 取樣技術也適用于本發明方法。例如，常常擦拭患者的鼻孔以獲取樣本。特別優選的采樣 技術包括用無菌拭子或采樣裝置拭抹受試者(例如患者)的前鼻孔。例如，一個拭子用于 對一名受試者取樣，即一個拭子用于兩個鼻孔。例如可這樣進行采樣將干燥的或用適當的 溶液預濕潤的拭子插入到受試者鼻孔的前末端，并將拭子沿著鼻孔的粘膜表面完整地旋轉 一圈或多圈。有多種拭子或其他樣本收集裝置可市售獲得，例如以商品名PURE-WRAPS獲自 Puritan Medical Products Co. LLC (Guilford, ME)，或者以商品名 ESWAB 獲自 Copan Diagnostics, Inc. (Corona, CA)，或者以商品名 FL0CKEDSWAB 獲自 microRheologics， S. r. 1.(意大利布雷西亞)。如果需要也可使用例如美國專利No. 5，879，635 (Nason)中公 開的樣品采集裝置。拭子可為包括棉花、人造絲、藻酸鈣、滌綸、聚酯、尼龍、聚氨酯等在內的 各種材料。然后可將樣品采集裝置(例如拭子)直接培養、直接分析或用適當的溶液提取 (例如，通過洗滌，經渦旋洗脫)。這些提取(即洗脫)溶液通常包括水并可任選包括緩沖 液和至少一種表面活性劑。洗脫緩沖液的例子包括例如磷酸緩沖鹽水(PBS)，其可例如與 TffEEN 20或PLUR0NIC L64組合使用。試驗樣本(例如液體)可先進行處理再作進一步的 分析。這可包括濃縮、沉淀、過濾、離心、透析、稀釋、天然成分的滅活、試劑的加入、化學處理寸。其他的樣本收集裝置(也稱“捕獲元件”)可用來從表面或者從液體流收集樣本。在一些實施例中，捕獲元件可用于擦拭表面以從表面收集微生物的代表性樣本。隨后，可將 捕獲元件轉移到培養裝置中，并在微生物的溫育和生長過程中保留在該裝置中。在一些實 施例中，捕獲元件可用于將微生物過濾出液體樣本。在過濾步驟后，可將捕獲元件轉移到培 養裝置中，并在微生物的溫育和生長過程中保留在該裝置中。檢測和區分耐甲氧西林微牛物的方法薄膜裝置可用于檢測和區分耐抗生素(例如耐甲氧西林)微生物的方法中。裝置 可進行接種，干燥的營養物和/或膠凝劑可通過幾種不同的程序進行水化。在一些實施例 中，可將液體樣本接種到薄膜裝置中，從而基本上形成“傾注板”。在一些實施例中，可將不 含目標菌群和可為無菌的含水液體(例如水、緩沖液、營養培養基)加到薄膜裝置，并讓凝 膠固化。凝膠固化后，可打開覆蓋片，并可使凝膠接觸表面(例如墻壁、地面、儀器、皮膚、粘 膜)以使裝置接種。隨后可將覆蓋片關閉以進行溫育。在一些實施例中，如上所述將含水 溶液加到裝置，隨后可將捕集裝置(例如膜過濾器或擦拭物)放到薄膜裝置中，從而使裝置 接種。或者，可用捕獲元件所具有的水分溶解薄膜中的營養物和膠凝劑。在一些實施例中， 可在捕獲元件已放在裝置中之后，將含水溶液加到裝置以溶解營養物和膠凝劑。在一些實 施例中，可將樣本溶液分布(例如沉積、涂布或劃線)到裝置中，然后再加入含水溶液以溶 解營養物和膠凝劑。可將加重的板或者專門設計的涂布器放在覆蓋片的頂部上，以完全涂 布樣本。薄膜裝置還可用于計數抗生素抗性微生物的方法中。在接種后，接著將培養裝置 溫育預定的一段時間。可透過覆蓋片計數在培養基或捕獲元件中或者在培養基或捕獲元件 上生長的細菌菌落。可將至少一種親水劑如營養物、指示劑或選擇劑(例如抗生素)在接種時隨樣本 一起加到培養裝置。可將該至少一種親水劑(優選為無菌的)溶解、懸浮或稀釋到液體樣本 中，然后再將樣本加到培養裝置。在一些實施例中，可將該至少一種親水劑緊接在液體樣本 之前或之后單獨加到培養裝置(例如作為粉末、干燥薄膜、基材上的涂層或者溶液加入)， 并任選可在關閉和/或溫育培養裝置之前在培養裝置中與樣本一起混合(例如用移液管頭 混合)。可通過在培養裝置已接種后使液體、半固體溶液或脫水物品(例如經涂覆的干燥 的基材)與培養裝置中的水化營養培養基接觸，來將親水劑(例如營養物、抗生素和指示 劑)加到接種的/水化的培養裝置。該脫水物品可為部分脫水的物品。基材可包括塑料薄 膜、微孔膜、纖維素材料或無紡材料。區分性指示劑(如果存在的話)可用于區分不同類群或種類的微生物并提供差分 計數。例如，酶底物可用于區分含葡萄球菌的菌落和含芽孢桿菌屬種類或其他微生物的菌 落。美國專利No. 5，837，482(其以引用方式全文并入本文)描述了使用“吲哚基_吡喃葡 萄糖苷”酶底物以檢測非葡萄球菌微生物和Baird-Parker區分性試劑(例如蛋黃_亞碲酸 鹽懸浮液)以檢測葡萄球菌微生物的指示劑系統。美國專利No. 5，635，367(其以引用方式 全文并入本文)描述了使用“吲哚基-吡喃葡萄糖苷”酶底物以檢測非葡萄球菌微生物和 “吲哚基-磷酸鹽”酶底物以檢測葡萄球菌微生物的指示劑系統。可從培養裝置挑取菌落以進行區分性試驗。可將各個菌落分別進行試驗，或者可 將它們進行集合或“匯集”以進行區分性試驗。可例如通過從裝置挑取兩個或多個菌落來“匯集”菌落，將它們混合在一起，然后對來自該兩個或多個菌落的微生物同時進行區分性 試驗。區分性試驗可包括例如染色試驗(例如革蘭氏染色、孢子染色、免疫化學染色)、酶 促試驗(例如DNA酶試驗、TNA酶試驗)、表面受體識別試驗(例如凝固酶試驗或聚集因子 試驗)、遺傳試驗(例如擴增試驗，如PCR和rtPCR ；核酸測序；或雜交測定(例如FISH測 定))、免疫測定試驗(例如ELISA、免疫擴散、免疫層析)或生化試驗(例如凝固酶試驗、過 氧化氫酶試驗、碳水化合物發酵(例如甘露糖醇發酵)、脂質分析)。本發明的套件本發明提供的套件包括兩個或多個部件。一個部件包括本文所述的薄膜培養板裝 置。每個套件的第二個部件可選自如下附件膜過濾器、移液管、涂布器、手套、樣本獲取裝 置、捕獲元件、樣品懸浮介質、試劑和前述附件中的任何兩者或多者。膜過濾器的形狀和大小應適合于裝配到套件的培養板裝置的隔片的孔中。不同種 類的過濾器可與套件一起提供，或者多個套件可包含各種過濾器。過濾器是任選的，且優選 地在無菌條件中提供，如已通過Y輻射、環氧乙烷或其他滅菌方式滅菌的涂聚乙烯的紙包 裝。或者，過濾器可為將由使用者進行滅菌的非無菌組件。合適的移液管和涂布器可由例如塑料或玻璃制作。移液管和涂布器可在預滅菌條 件中提供，或者可在非無菌條件中提供。移液管和涂布器可在單次使用后丟棄，或者可再滅 菌以供多次使用。本文所用的“移液管”包括具有至少一個對應于已知體積的刻度標志和 具有移液管頭的容量移液管，其可用于容量移液裝置。套件可包含親水劑的包裝。親水劑 優選地包含在無菌包裝中，例如箔包裝，如制藥行業常規使用的那些包裝。這種包裝的一個 例子是用于 NITR0-BID 軟膏劑(Marlon Laboratories, Inc.，Kansas City, Mo.)。套件中所包括的營養物和/或選擇劑可如上所述摻入到粘合劑和/或粉末組合物 中。套件中有用和必需的親水劑的選擇取決于所要評估的微生物。選擇套件組分的另一個 標準將是親水劑的短期和長期化學相容性。現將參考以下非限制性實例對本發明作進一步說明。所有的份數和百分數均以 重量份表示，除非另有指明。除非另有說明，否則所有的試劑均獲自Sigma Chemical公司 (St. Louis) ο^M實例1.在含有頭孢西丁或苯嗶西林的薄膜培養裝置中檢測和計數葡萄球菌試劑和培養基的制備PETRIFILM好氧微生物計數板獲自3M公司(St. Paul, MN)。DIFCO脫水胰酶大豆 瓊月旨(TSA)獲自 BD Diagnostics (Sparks，MD)。除纖維蛋白羊血獲自 RemelJnc. (Lenexa, KS)。磷酸緩沖鹽溶液(PBS，pH 7. 5)從10X濃縮液(OmniPur 6505緩沖鹽水；EMD Chemicals, Inc. ；Gibbstown,NJ)制備，并進行高壓滅菌。抗生素儲備溶液在去離子水中制 備，并通過使其經過0. 22 μ m過濾器進行除菌。制備含有頭孢西丁(SBA-Cf)的羊血瓊脂，以將抗生素抗性微生物在瓊脂培養基 上的回收率與抗生素抗性微生物在薄膜培養裝置中的回收率進行比較。將20克的脫水TSA 與475mL的去離子水混合并進行高壓滅菌。將熔融的瓊脂在50°C下回火(temper)。將25 毫升的除纖維蛋白羊血加到瓊脂(以產生5%羊血終濃度)并漩渦攪拌以混合。將頭孢西丁儲備溶液(0. 5mL,4mg/mL)加到瓊脂并漩渦攪拌以混合。將瓊脂倒入無菌培養皿中，讓瓊 脂在室溫下固化。將板倒置并在4°C下保藏。制備PBS稀釋溶液以稀釋細菌培養物。這些稀釋溶液分別含有3 μ g/mL、4 μ g/mL 和5 μ g/mL的頭孢西丁，或者4 μ g/mL,5 μ g/mL和6 μ g/mL的苯唑西林。稀釋溶液在制備 后八小時內使用。不含抗生素的PBS用作PETRIFILM和SBA對照板的稀釋液。細菌懸浮液的制備試驗了八個葡萄球菌微生物菌株。甲氧西林敏感性表皮葡萄球菌(96號菌株)、耐 甲氧西林表皮葡萄球菌G71號和472號菌株)和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(560號和907 號菌株)獲自人臨床分離物。甲氧西林敏感性金黃色葡萄球菌(ATCC25923和ATCC27664 菌株)和甲氧西林敏感性表皮葡萄球菌ATCC122^獲自美國模式培養物保藏所(Manassas， VA)。接種、溫育和菌落計數將各個細菌菌株接種到胰酶大豆肉湯并在37°C下溫育過夜。將細菌懸浮液在上述 的每個PBS稀釋液中稀釋。取1毫升樣本按照廠商說明書接種到PETRIFILM板上。通過用 無菌涂布器將0. 1毫升的細菌懸浮液涂布在含有頭孢西丁的血液瓊脂板的表面上，對板進 行接種。所有的板都在35°C下溫育，并在對士2小時和48士4小時計數每個板上的菌落。 菌落計數(CFU)在表1和2中顯示。數據表明，在溫育后M小時和48小時，在兩種類型的 平板培養基(瓊脂和PETRIFILM板)中都可檢測到耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和表皮葡萄 球菌。數據顯示，第560號菌株對頭孢西丁敏感卻耐苯唑西林。表1.在M小時時在含有頭孢西丁或苯唑西林的PETRIFILM板和血液瓊脂板上觀 察到的菌落形成單位(CFU)。表中所示的稀釋系數是最終稀釋系數，其計入了接種到各個 板類型中的樣本的體積的差異。PF-C = PETRIFILM板對照，PF-Cf(n)=具有指定微克數/ mL的頭孢西丁的Petrifilm板，PF-Ox (n)=具有指定微克數/mL的苯唑西林的Petrif ilm， SBA-Cf =含有頭孢西丁的羊血瓊脂，SBA-C =羊血瓊脂對照
權利要求
1.一種用于檢測或計數抗生素抗性微生物的物品，所述物品包括有效量的用于選擇抗生素抗性葡萄球菌微生物的生長的內酰胺抗生素，前提條件 是β-內酰胺抗生素不是氨曲南；營養培養基；用于指示微生物的存在的指示劑系統；和 包含膠凝劑的干燥、可再水化的薄膜培養裝置。
2.一種用于對抗生素抗性微生物進行差分計數的物品，所述物品包括有效量的用于選擇抗生素抗性葡萄球菌微生物的生長的內酰胺抗生素，前提條件 是β-內酰胺抗生素不是氨曲南； 營養培養基；用于指示微生物的存在的第一指示劑系統； 用于指示金黃色葡萄球菌的存在的第二指示劑系統；和 包含膠凝劑的干燥、可再水化的薄膜培養裝置。
3.權利要求1或權利要求2的物品，其中所述抗生素包含甲氧西林。
4.權利要求1或權利要求2的物品，其中所述抗生素包含苯唑西林。
5.權利要求1或權利要求2的物品，其中所述β-內酰胺抗生素包含頭孢菌素抗生素。
6.權利要求5的物品，其中所述頭孢菌素抗生素包含頭孢西丁。
7.權利要求6的物品，其中頭孢西丁在所述培養裝置的再水化營養培養基中的濃度為 約 0. 5 μ g/mL 至約 4 μ g/mL0
8.權利要求7的物品，其中頭孢西丁在所述培養裝置的再水化營養培養基中的濃度為 約 1 μ g/mL 至約 4 μ g/mL ο
9.權利要求8的物品，其中頭孢西丁在所述培養裝置的再水化營養培養基中的濃度為 約 2 μ g/mL 至約 4 μ g/mL ο
10.權利要求9的物品，其中頭孢西丁在所述培養裝置的再水化營養培養基中的濃度 為約 3 μ g/mL 至約 4 μ g/mL ο
11.前述權利要求中任一項的物品，其還包含亞碲酸鉀。
12.權利要求1-10中任一項的物品，其還包含氯化鋰。
13.前述權利要求中任一項的物品，其還包含第二抗生素。
14.權利要求13的物品，其中所述第二抗生素不是內酰胺抗生素。
15.前述權利要求中任一項的物品，其中所述薄膜培養裝置包括表面菌落計數薄膜培 養裝置。
16.一種檢測抗生素抗性微生物的方法，其包括提供懷疑含有抗生素抗性微生物的液體樣本；和干燥的薄膜培養裝置，所述干燥的薄 膜培養裝置包含營養培養基、有效量的用于選擇抗生素抗性微生物的生長的內酰胺抗 生素、用于指示微生物的存在的指示劑系統和膠凝劑，前提條件是所述內酰胺抗生素 不是氨曲南；用所述液體樣本接種所述培養裝置； 將所述接種的培養裝置溫育一段時間；和 分析所述培養裝置存在抗生素抗性微生物。
17.一種檢測和區分抗生素抗性微生物的方法，其包括提供懷疑含有抗生素抗性微生物的液體樣本；和干燥的薄膜培養裝置，所述干燥的薄 膜培養裝置包含營養培養基、有效量的用于選擇抗生素抗性微生物的生長的內酰胺抗 生素、用于指示微生物的存在的第一指示劑系統、用于指示金黃色葡萄球菌的存在的第二 指示劑系統和膠凝劑，前提條件是所述內酰胺抗生素不是氨曲南； 用所述液體樣本接種所述培養裝置； 將所述接種的培養裝置溫育一段時間；和 分析所述培養裝置存在抗生素抗性微生物。
18.一種檢測和區分抗生素抗性微生物的方法，其包括提供懷疑含有抗生素抗性微生物的液體樣本；和干燥的薄膜培養裝置，所述干燥的薄 膜培養裝置包含膠凝劑和以下成分中的任一種或多種營養培養基、有效量的用于選擇抗 生素抗性微生物的生長的內酰胺抗生素、或者用于指示微生物的存在的指示劑系統， 前提條件是所述β-內酰胺抗生素不是氨曲南；向所述培養裝置加入如果不是已經存在的營養培養基、有效量的用于選擇抗生素抗性 微生物的生長的內酰胺抗生素和用于指示微生物的存在的指示劑系統，前提條件是所 述β-內酰胺抗生素不是氨曲南；用所述液體樣本接種所述培養裝置； 將所述接種的培養裝置溫育一段時間；和 分析所述培養裝置存在抗生素抗性微生物。
19.一種檢測和區分抗生素抗性微生物的方法，其包括提供懷疑含有抗生素抗性微生物的液體樣本；和干燥的薄膜培養裝置，所述干燥的薄 膜培養裝置包含膠凝劑和以下成分中的任一種或多種營養培養基、有效量的用于選擇抗 生素抗性微生物的生長的內酰胺抗生素、用于指示微生物的存在的第一指示劑系統、 或者用于指示金黃色葡萄球菌的存在的第二指示劑系統，前提條件是所述內酰胺抗生 素不是氨曲南；向所述培養裝置加入如果不是已經存在的營養培養基、有效量的用于選擇抗生素抗性 微生物的生長的內酰胺抗生素、用于指示微生物的存在的第一指示劑系統和用于指示 金黃色葡萄球菌的存在的第二指示劑系統，前提條件是所述-內酰胺抗生素不是氨曲南； 用所述液體樣本接種所述培養裝置； 將所述接種的培養裝置溫育一段時間；和 分析所述培養裝置存在抗生素抗性微生物。
20.權利要求16-19中任一項的方法，其中所述液體樣本進行稀釋且所述培養裝置接 種上所述稀釋的液體樣本。
21.權利要求16-19中任一項的方法，其還包括以下步驟i)稀釋所述液體樣本以產生 兩個或更多個不同濃度的液體樣本，和ii)將兩個或更多個不同濃度的樣本接種到分別的培養裝置中。
22.權利要求16-21中任一項的方法，其還包括以下步驟i)提供捕獲元件，和ii)使 所述膠凝劑與所述捕獲元件接觸。
23.權利要求22的方法，其中在將所述捕獲元件與所述膠凝劑接觸之前使所述膠凝劑水化。
24.權利要求16-23中任一項的方法，其中所述β-內酰胺抗生素包含頭孢西丁。
25.權利要求16-24中任一項的方法，其中分析培養基存在抗生素抗性微生物包括對 菌落進行計數。
26.權利要求16-25中任一項的方法，其還包括對來自一個或多個菌落的微生物進行 差分試驗的步驟。
27.權利要求沈的方法，其中從所述培養裝置移取來自一個或多個菌落的微生物以進 行差分試驗。
28.權利要求27的方法，其中從所述培養裝置移取來自兩個或更多個菌落的微生物并 混合一起以進行差分試驗。
29.權利要求沈-28中任一項的方法，其中所述差分試驗包括生化試驗。
30.權利要求四的方法，其中所述生化試驗包括對過氧化氫酶活性的試驗。
31.權利要求四的方法，其中所述生化試驗包括對凝固酶活性的試驗。
32.權利要求四的方法，其中所述生化試驗包括革蘭氏染色。
33.權利要求四的方法，其中所述差分試驗包括免疫測定。
34.權利要求四的方法，其中所述菌落差分試驗包括遺傳試驗。
35.權利要求16-34中任一項的方法，其中在所述培養裝置接種之后使親水劑與所述 培養裝置中的水化營養培養基接觸。
36.權利要求35的方法，其中所述親水劑包含基材。
37.權利要求36的方法，其中所述親水劑涂覆在基材上。
38.權利要求37的方法，其中所述基材包括塑料膜、微孔膜、纖維素材料或無紡材料。
全文摘要
本發明提供一種用于檢測抗生素抗性微生物的薄膜培養裝置。該裝置可包括用于區分葡萄球菌微生物與非葡萄球菌微生物的指示劑。使用方法包括檢測或計數抗生素抗性微生物。所述方法還包括獲得葡萄球菌微生物與非葡萄球菌微生物的差分計數。
文檔編號C12N1/00GK102131915SQ200980132608
公開日2011年7月20日 申請日期2009年8月19日 優先權日2008年8月21日
發明者帕特里克·A·馬赫, 米歇爾·L·羅索爾 申請人:3M創新有限公司