專利名稱：病毒純化的制作方法
技術領域：
本發明涉及反轉錄病毒載體生產和純化的改進方法。
背景技術：
基因治療技術的成功有賴于能夠以對人體安全的方式實現轉移的基因的充分表 達。反轉錄病毒常常用作遞送系統(或者稱為遞送介質或遞送載體)，用來(尤其是)將某 種目的核苷酸(NOI)或多種目的核苷酸轉移到一個或多個目的位點。人們對慢病毒載體系 統的開發也表現出極大的興趣，因為慢病毒能夠感染非分裂細胞(Lewis & Emerman(1993) J. Virol. 68 510) 0另外，慢病毒載體使得目的基因能夠得到非常穩定的長期表達。對 于體內轉導的大鼠神經元細胞來說，這已證實為至少一年(Bienemarm等人.Q003)Mol. Ther. 5 :588)。載體純化過程是臨床基因轉移治療中的一個重要步驟，就純度和滴度而言與安全 性和功效直接相關。在大多數小規模的實驗應用中，可采用離心技術通過相對簡單的方法 來濃縮和純化載體。但是，將純化方法進行放大以便為臨床使用進行大規模生產，這是一個 重大挑戰。具體地講，當考慮生產人用載體時，必須采取諸如過濾除菌的額外步驟來確保載 體制品的純度和安全性。載體制備方法一般包括從穩定或短暫產生載體的細胞獲取載體和使用例如色譜 法純化病毒載體。在工業過程中，最后一個步驟是滅菌步驟，并且在滅菌步驟之前通常使用 至少一個超濾步驟以濃縮病毒載體和/或交換保持病毒載體的緩沖液。有幾個出版物描述了從細胞純化病毒，其中大多數討論了使用特異性色譜基質來 從細胞裂解物純化病毒。例如，美國專利No. 6，261，823和美國專利No. 5，661，023公開了 包括使用單獨的陰離子交換樹脂的方法，而美國專利5，837，520公開了陰離子交換接著是 親和色譜的這樣一種相續組合。Yamada等人證實用陰離子交換HPLC純化慢病毒載體能使 基因轉移得到改善(Yamada 等人.(2003) Biotechniques34 (5) 1074-8，1080)。仍需要能產出純產品而又能保持高滴度的大規模反轉錄病毒載體純化方法。本發 明解決了這個需求。發明概述我們證明了，出乎意料的是，當過濾除菌步驟不是生產過程中的最后步驟時，可實 現生產反轉錄病毒和慢病毒載體制劑的改進方法。具體地講，我們發現了在濃縮步驟(例 如通過超濾)之后進行過濾除菌步驟會導致病毒載體滴度相當大的損失。這是出乎預料 的，因為反轉錄病毒顆粒的直徑在80-120nm的范圍內，因此它們應當容易通過除菌過濾器 的孔道；對于含有載體的細胞培養物上清液來說這的確如此，這種上清液進行常規過濾沒 有觀察到功能滴度的損失。因此不清楚為什么一旦載體制品經過了加工就不再可能做到對 制品進行過濾除菌而又不損失回收率。此外，我們出乎預料地發現，如果在過濾除菌步驟之后進行最后的濃縮步驟，可獲 得載體顆粒收率的增加。這與確立的病毒生產方法是相反的，在這些生產方法中濃縮步驟 傳統上是在過濾除菌步驟之前進行的。我們還發現了，在過濾除菌之前例如通過稀釋載體
4顆粒制品來維持合適的載體顆粒濃度，也能改進載體顆粒收率。出乎預料的是，在該方法中 的一些階段中降低載體顆粒濃度可實際上最終導致產品收率提高。應理解，可通過無菌稀釋由本發明方法生產的制劑來生產較低劑量的制劑。本發 明的生產方法優選是用于生產適合作為治療劑給予人體的臨床級制劑的大規模方法。本文所述的反轉錄病毒和慢病毒載體制劑優選適合作為治療劑給予人體。本發明的第一方面提供包括過濾除菌步驟的反轉錄病毒或慢病毒載體制劑生產 方法，其中該過濾除菌步驟不是該生產方法中的最后步驟。優選地，反轉錄病毒載體是慢病毒載體。優選地，過濾除菌步驟在濃縮步驟之前進行。優選地，濃縮步驟是該方法中的最后步驟，而過濾除菌步驟是該方法中的倒數第 二個步驟。優選地，濃縮步驟用超濾、優選切向流過濾、更優選中空纖維超濾來進行。優選地，過濾除菌步驟用最大孔徑大小為約0. 22 μ m的除菌過濾器進行。在另一 個優選的實施方案中，最大孔徑大小為0. 2 μ m。在優選的實施方案中，為使EIAV顆粒的回收率達到最佳，在過濾除菌之前載體濃 度應小于或等于約4. 6x10"個RNA基因組拷貝/ml制品。該適當濃度水平可通過使用例如 稀釋步驟(如果適當的話)控制載體濃度來實現。因此，在一個實施方案中，在過濾除菌之 前將反轉錄病毒載體制品進行稀釋。因此，如果技術人員碰到載體顆粒回收率低于預期的 情況，他應考慮在過濾除菌之前先降低載體顆粒的濃度。實現最佳回收率的適當滴度水平 可用下文(具體而言實施例部分)描述的技術來確定。本發明的第二方面提供生產反轉錄病毒載體制劑的方法，該方法按時間順序包括 以下步驟⑴至(vi)(i)培養能產生反轉錄病毒載體的細胞；(ii)收獲含有反轉錄病毒載體的上清液；(iii)任選澄清上清液；(iv)純化反轉錄病毒載體以得到反轉錄病毒載體制品；(ν)對反轉錄病毒載體制品進行過濾除菌；和(vi)濃縮反轉錄病毒載體制品以生產出最終的批量產品。在一個實施方案中，該方法不包括澄清步驟(iii)。在另一個實施方案中，該方法確實包括澄清步驟(iii)。優選地，步驟(vi)用超濾、或切向流過濾、更優選中空纖維超濾來進行。優選地，步驟(iv)中的純化方法是離子交換色譜，更優選是陰離子交換色譜。優選地，步驟(ν)中的過濾除菌用0. 22 μ m或0. 2 μ m除菌過濾器進行。優選地，步驟(iii)通過過濾澄清來進行。優選地，步驟(iv)用選自色譜、超濾/滲濾或離心的方法或這些方法的組合來進 行。優選地，色譜方法或方法組合選自離子交換色譜、疏水相互作用色譜、尺寸排阻色 譜、親和色譜、反相色譜和固定化金屬離子親和色譜。優選地，離心方法選自區帶離心、等密度離心和粒化離心(pelletingcentrifugation)。優選地，超濾/滲濾方法選自切向流滲濾、攪拌池滲濾(stirred cell diafiltration)禾口優選地，在本發明方法中包括至少一個用以降解核酸以改善純化的步驟。優選地，所述步驟是核酸酶處理。優選地，所述核酸酶是Benzonase 核酸酶。優選地，(一個或多個)核酸降解步驟在本發明方法中的到步驟(iv)為止(包括 步驟(iv)在內)的任何(一個或多個)時間點進行。優選地，該方法的純化步驟(iv)包括緩沖液交換步驟。優選地，該方法的純化步驟(Vi)用超濾進行。優選地，超濾包括切向流過濾。優選地，超濾包括中空纖維超濾。優選地，該方法的步驟(ν)中的過濾除菌用最大孔徑大小為約0. 22 μ m的除菌過
濾器進行。優選地，緩沖液交換包括以制劑緩沖液交換前面的步驟所用的緩沖液。優選地，制劑緩沖液是含有糖類的pH緩沖的鹽溶液。優選地，緩沖液是基于TRIS的緩沖液。在一個實施方案中，在進行過濾除菌之前先稀釋載體顆粒濃度。優選地，反轉錄病毒載體是慢病毒載體。更優選地，慢病毒載體是非靈長類動物慢病毒載體。更優選地，慢病毒載體衍自EIAV。當慢病毒載體衍自EIAV時，過濾除菌之前載體 顆粒制品中的EIAV顆粒的載體濃度小于或等于4. 6x10"個RNA基因組拷貝/ml。優選地，反轉錄病毒載體包含目的核苷酸。優選地，本發明的生產方法用于生產反轉錄病毒載體制劑，其中該反轉錄病毒載 體制劑適合給予患者。患者可以是人或動物。在一個實施方案中，反轉錄病毒載體制劑適 合給予患者的眼睛。在另一個實施方案中，反轉錄病毒載體制劑適合給予患者的大腦。在一些實施方案中，所述生產方法用于生產反轉錄病毒載體制劑，其中該反轉錄 病毒載體制劑適合通過注射給予患者。在一個實施方案中，反轉錄病毒載體制劑適合直接 注射到視網膜下，任選在人或動物的眼睛的玻璃體切除術之后注射。在另一個實施方案中， 反轉錄病毒載體制劑適合直接注射到人或動物的大腦的紋狀體中。在一些實施方案中，所述生產方法用于生產反轉錄病毒載體制劑，其中該反轉錄 病毒載體制劑適合離體給予。在其他實施方案中，所述生產方法用于生產反轉錄病毒載體制劑，其中該反轉錄 病毒載體制劑適合給予可從患者獲取的細胞。本發明的第四方面提供可通過本發明的方法獲得的反轉錄病毒載體制劑。在一些 實施方案中，反轉錄病毒載體制劑供用于基因治療。還提供了反轉錄病毒載體制劑在制備 基因治療用藥物中的用途。附圖簡述
圖1是反轉錄病毒載體生產方法的示意圖。
發明詳述現將通過非限制性的例子描述本發明的各個優選特征和實施方案。除非另有指明，否則本發明的實施將采用到化學、分子生物學、微生物學、重組DNA 和免疫學的常規技術，這些技術在本領域普通技術人員的能力范圍內。這些技術在文獻中 有說明。參見例如 J. Sambrook，Ε. F. Fritsch 和 Τ· Maniatis (1989)Molecular Cloning :A Laboratory Manual,第二版，第 1-3冊，Cold Spring Harbor Laboratory Press ；Ausubel, F. Μ.等人·(1995 年和定期增補本)Current Protocols in Molecular Biology，第 9、 13 禾口 16 章，John Wiley & Sons，紐約，紐約州；B. Roe, J. Crabtree 和 A. Kahn(1996)DNA Isolation and Sequencing :Essential Techniques, John Wiley & Sons ;J. Μ· Polak 禾口 James 0' D. McGee(1990)In Situ Hybridization :Principles and Practice, Oxford University Press ;M. J. Gait (編輯)(1984) Oligonucleotide Synthesis :A Practical Approach, IRL Press5H^sD-Mj-LilleyiPj-E-Dahlberg(IggZ)Methods of Enzymology DNA Structure Part A :Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Press. Roe, Simon (編輯)，Protein Purification Techniques. 第 2版·牛津0xford University Press, 2001 ;Sofer, Gail 禾口 Hagel, Lars. Handbook of Process Chromatography :A Guide to Optimization, Scale-up, and Validation.倫敦 禾口圣迭哥:Academic Press, 1997 ；Janson, Jan-Christer 禾口 Ryden, Lars (編輯).Protein Purification Principles, High Resolution Methods, and Applications.第 2 版·紐 約 John Wiley & Sons， Inc. , 1998 ；Masters, John R. W. ( ). Animal Cell Culture A Practical Approach.第 3 版.牛津0xford University Press，2000。這些通用教科 書的每一個都通過弓I用并入本文。多核苷酸用于本發明的多核苷酸可包含DNA或RNA序列。它們可以是單鏈的或雙鏈的。技 術人員會理解，由于遺傳密碼的簡并性，有許多不同的多核苷酸可編碼同一多肽。另外，應 理解，技術人員可使用常規技術作出不會影響用于本發明的多核苷酸所編碼的多肽序列的 核苷酸取代，以反映要在其中表達多肽的任何具體宿主生物的密碼子用法。多核苷酸可通 過本領域可獲得的任何方法進行修飾。可進行這類修飾以提高本發明的多核苷酸的體內活 性或壽命。多核苷酸如DNA多核苷酸可用重組法產生、合成法產生或本領域技術人員可獲得 的任何方法產生。它們還可通過標準的技術進行克隆。通常將使用重組方法來產生較長的多核苷酸，例如使用PCR (聚合酶鏈反應)克隆 技術。這將涉及到制備一對能側接于需要克隆的序列區域的引物(例如約15至30個核苷 酸)，使引物與從動物細胞或人細胞獲得的mRNA或cDNA接觸，在能引起該需要的區域的擴 增的條件下進行聚合酶鏈反應，分離擴增的片段(例如通過在瓊脂糖凝膠上純化反應混合 物)和回收擴增的DNA。可將引物設計成含有合適的限制性內切核酸酶識別位點，使得擴增 的DNA可被克隆到合適的克隆載體中。蛋白質本文所用的術語“蛋白質”包括單鏈多肽分子以及多個多肽的復合物，在所述復合 物中各個組成多肽通過共價方式或非共價方式連接。本文所用的術語“多肽”和“肽”指其
7中單體為氨基酸并通過肽鍵或二硫鍵連接在一起的聚合物。變體、衍牛物、類似物、同源物和片段除了本文提到的具體蛋白質和核苷酸之外，本發明還涵蓋變體、衍生物、類似物、 同源物和它們的片段的使用。在本發明的情況中，任何給定序列的變體是這樣的序列，其中各殘基(無論是氨 基酸殘基還是核酸殘基)的具體序列已在所涉及的多肽或多核苷酸能保持其內源功能中 的至少一種的前提下進行過改變。可通過對天然蛋白質中存在的至少一個殘基進行添加、 缺失、取代、修飾、替代和/或變異，來獲得變體序列。與本發明的蛋白質或多肽相關的本文所用術語“衍生物”包括對序列的一個(或 多個)氨基酸殘基進行的任何取代、變異、修飾、替代、缺失和/或添加，只要所產生的蛋白 質或多肽能保持其內源功能中的至少一種。與多肽或多核苷酸相關的本文所用術語“類似物”包括任何模擬物，即這樣的化合 物，它具有其所模擬的多肽或多核苷酸的內源功能中的至少一種。通常，可例如從1、2或3至10或20個取代作出氨基酸取代，只要被修飾的序列能 保持所需的活性或能力。氨基酸取代可包括非天然類似物的使用。用于本發明的蛋白質還可具有這樣的氨基酸殘基缺失、插入或取代，即缺失、插入 或取代能產生不活躍的變化而導致功能上等同的蛋白質。還可在殘基的極性、電荷、溶解 性、疏水性、親水性和/或兩親特性的相似性的基礎上作出謹慎的氨基酸取代，只要轉運或 調控功能得以保持。例如，帶負電荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；帶正電荷的氨基酸包 括賴氨酸和精氨酸；含具有相似親水性值的無電荷極性頭部基團的氨基酸包括亮氨酸、異 亮氨酸、纈氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。保守取代可例如按下表作出。第二列同一格中的氨基酸、優選地第三列同一行中 的氨基酸可互相取代
權利要求
1.一種生產反轉錄病毒載體制劑的方法，所述方法包括過濾除菌步驟，其中所述過濾 除菌步驟不是該生產方法中的最終步驟。
2.權利要求1的方法，其中所述過濾除菌步驟在濃縮步驟之前進行。
3.權利要求1或2的方法，其中所述濃縮步驟是該方法中的最后步驟，所述過濾除菌步 驟是該方法中的倒數第二個步驟。
4.權利要求2或3的方法，其中所述濃縮步驟用超濾來進行。
5.權利要求4的方法，其中所述超濾包括切向流過濾。
6.權利要求4或5的方法，其中所述超濾包括中空纖維超濾。
7.前述權利要求中任一項的方法，其中所述過濾除菌步驟用最大孔徑大小最多為或等 于約0. 22 μ m的除菌過濾器進行。
8.前述權利要求中任一項的方法，其中將包含反轉錄病毒載體的制品先稀釋再進行過 濾除菌步驟。
9.一種用于生產反轉錄病毒載體制劑的方法，該方法按時間順序包括以下步驟(i)至 (vi)(i)培養能產生反轉錄病毒載體的細胞； ( )收獲含有反轉錄病毒載體的上清液；(iii)任選澄清上清液；(iv)純化反轉錄病毒載體以得到反轉錄病毒載體制品； (ν)對反轉錄病毒載體制品進行過濾除菌；和(Vi)濃縮反轉錄病毒載體制品以生產出最終的批量產品。
10.權利要求9的方法，其中步驟(iv)用選自色譜法、超濾/滲濾或離心的方法或方法 組合來進行。
11.權利要求10的方法，其中所述色譜方法選自離子交換色譜、疏水相互作用色譜、尺 寸排阻色譜、親和色譜和反相色譜、固定化金屬離子親和色譜。
12.權利要求10的方法，其中所述離心方法選自區帶離心、等密度離心和粒化離心。
13.權利要求10的方法，其中所述超濾/滲濾方法選自切向流滲濾、攪拌池滲濾和透析。
14.權利要求9-13中任一項的方法，其中包括至少一個降解核酸以改善純化的步驟。
15.權利要求14的方法，其中所述步驟是核酸酶處理。
16.權利要求15的方法，其中所述核酸酶是Benzonase⑧核酸酶。
17.權利要求14和15中任一項的方法，其中在直到步驟(iv)為止并包括步驟(iv)的 任何時間點進行核酸降解步驟。
18.權利要求14-16中任一項的方法，其中所述純化步驟(iv)包括一個或多個緩沖液 交換步驟。
19.權利要求9的方法，其中步驟(vi)用超濾來進行。
20.權利要求19的方法，其中所述超濾包括切向流過濾。
21.權利要求19或20的方法，其中所述超濾包括中空纖維超濾。
22.權利要求9-21中任一項的方法，其中步驟(ν)中的所述過濾除菌用最大孔徑大小 最多為或等于約0. 22 μ m的除菌過濾器進行。
23.權利要求9-22中任一項的方法，其中步驟(iii)通過過濾器澄清來進行。
24.權利要求18的方法，其中所述緩沖液交換包括將超濾/滲濾截留液用制劑緩沖液 交換。
25.權利要求M的方法，其中所述制劑緩沖液是含有糖類的PH緩沖鹽溶液。
26.權利要求25的方法，其中所述緩沖液是TRIS。
27.權利要求916中任一項的方法，其中將反轉錄病毒載體制品先稀釋再進行過濾除菌。
28.前述權利要求中任一項的方法，其中所述反轉錄病毒載體衍自慢病毒。
29.前述權利要求中任一項的方法，其中所述反轉錄病毒載體衍自HIV。
30.前述權利要求中任一項的方法，其中所述反轉錄病毒載體衍自EIAV。
31.權利要求30的方法，其中所述反轉錄病毒載體在過濾除菌之前的濃度小于或等于 約4. 6x10"個RNA基因組拷貝/ml反轉錄病毒載體制品。
32.前述權利要求中任一項的方法，其中所述反轉錄病毒載體包含目的核苷酸(NOI)。
33.前述權利要求中任一項的方法，其中所述反轉錄病毒載體制劑適合于給予患者。
34.權利要求33的方法，其中所述反轉錄病毒載體制劑適合于給予患者的眼睛。
35.權利要求33的方法，其中所述反轉錄病毒載體制劑適合于給予患者的大腦。
36.權利要求33-35的方法，其中所述反轉錄病毒載體制劑適合于通過注射給予。
37.權利要求36的方法，其中所述反轉錄病毒載體制劑適合于任選在人或動物眼睛的 玻璃體切除術后進行直接視網膜下注射。
38.權利要求36的方法，其中所述反轉錄病毒載體制劑適合于直接注射到人或動物大 腦的紋狀體中。
39.權利要求1-32中任一項的方法，其中所述反轉錄病毒載體制劑適合于離體給予。
40.權利要求1-32中任一項的方法，其中所述反轉錄病毒載體制劑適合于給予可從患 者獲得的細胞。
41.可通過前述權利要求中任一項所定義的方法獲得的反轉錄病毒載體制劑。
42.權利要求41的反轉錄病毒載體制劑，其中所述反轉錄病毒載體制劑供用于基因治療。
43.權利要求41的反轉錄病毒載體制劑在制備供基因治療的藥物中的用途。
全文摘要
本發明公開了用于生產反轉錄病毒或慢病毒載體制劑的方法，該方法包括過濾除菌步驟，其中該過濾除菌步驟不是純化方法中的最后步驟。
文檔編號C12N15/867GK102124115SQ200980132555
公開日2011年7月13日 申請日期2009年6月18日 優先權日2008年6月18日
發明者J·米斯金, K·米特羅法諾斯, P·拉德克利夫, R·巴克利, R·特魯蘭 申請人:牛津生物醫學(英國)有限公司