用于治療血管性血友病的fviii突變蛋白的制作方法

專利名稱：用于治療血管性血友病的fviii突變蛋白的制作方法
技術領域：
本發明涉及可用于治療血管性血友病(von Willebrand Disease, vffD)的因子 VIII (FVIII)突變蛋白及其衍生物。FVIII突變蛋白容許在限定位點處偶聯至一種或多種 生物相容性聚合物諸如聚乙二醇。另外，提供了用于治療目的的其相關配制劑、劑量、和施 用方法。這些經修飾的FVIII變體、及相關組合物和方法可用于為罹患血管性血友病的個 體提供具有降低的注射頻率和降低的免疫原性響應的治療選項。
背景技術：
vffD是一項描述各種病因學的一簇遺傳性或獲得性疾病的術語。許多類型的vWD 的基礎在于von Willebrand因子(vWF)的功能，所述von Willebrand因子(vWF)是一系 列多聚體血漿糖蛋白，其除其它特性外還結合促凝血性FVIII，而且延長天然FVIII在血液 循環中的半衰期(參見例如 Federici，Haemophilia 10(suppl 4) 169，2004 ;Denis 等， Thromb. Haemost. 99 =271,2008)。在正常人中，FVIII的半衰期是沒有vWF情況中的約8分 鐘和存在vWF情況中的8小時。在輕度形式(1型)中，vWD是非常常見的，影響著群體中100人中多至1名，而且 相等地影響著男性和女性。2型vWD可以是一種嚴重形式的vWD，而且已知處于5種亞型2A、2B、2C、2M和2N。 這些之中，2N型以缺乏FVIII對vWF的結合表征。如此，在2N型vWD患者中，FVIII被快速 降解，并且循環中的水平是低的。vWF 2N型是由損害對FVIII結合的純合的或復合雜合的 vWF突變引起的。因為不與vWF形成復合物的游離FVIII自循環快速清除，所以vWD 2N偽裝 為常染色體隱性形式的血友病A。然而，患者通常具有正常水平的vWF抗原和用于vWF-血 小板GPlb結合的瑞斯托菌素輔因子活性(vWF:RCo活性)，但降低的FVIII水平。3型vWD (即Eric von Willebrand最初在一個芬蘭人家庭中描述的形式)是vWF 的純合缺乏(缺陷)(deficiency)或雙雜合缺乏。vWD 3型是由無義突變或由于進入編碼 VffF的核酸中的小插入或缺失所致的移碼引起的，這導致vWF的完全或幾乎完全缺乏。在 大多數情況中，vWFRCo和vWFAg是檢測不到的，而FVIII水平是深深地降低的。3型vWD 患者可以具有關節血腫(hemarthroses)和出血入關節或間隙中，這很像血友病。獲得性vWD通常是由自身免疫清除(這是由于形成抗vWF抗體)、流體剪應力誘導 的蛋白酶解或升高的對血小板或其它細胞的結合引起的。獲得性vWD綜合征與那些vWD 3 型的相似，具有降低水平的vWF-Ag、vffF:Rco和FVIII。vffD 3型和獲得性vWD患者不僅患 有作為vWD特征的粘膜出血，而且還患有作為血友病A特征的軟組織、肌肉、和關節出血。血友病A是最常見的遺傳性凝固病癥，估計的發病率為每5000名男性1名。它是 由FVIII (即血液凝固的固有途徑的一種至關重要的成分)的缺乏或結構缺陷引起的。對血 友病A的目前治療牽涉靜脈內注射人FVIII。人FVIII已經作為約300kD的單鏈分子重組生成。它由結構域 A1-A2-B-A3-C1-C2 構成(Thompson, Semin. Hematol. 29 :11-22,2003) 前 體產物在高爾基體中被加工成200kD (重)和80kD (輕)的兩條多肽鏈，其中兩條鏈通過金 屬離子保持在一起(Kaufman 等，J. Biol. Chem. 263 :6352,1988 ；Andersson 等，Proc. Natl. Acad. Sci. 83 :2979,1986)。FVIII的B域似乎是不必要的，因為B域缺失型FVIII (BDD，90kD A1-A2重鏈和 SOkD輕鏈)也已經顯示了作為代替療法用于血友病A是有效的。B域缺失型FVIII序列含 有B域的幾乎(all but) 14個氨基酸的缺失。目前，通過在需要時靜脈內施用FVIII或作為一周數次施用的預防性療法來治療 血友病A患者。對于預防性處理，一周三次給予15-25IU/kg體重的FVIII。它是患者中不斷 需要的。由于其在人中的短半衰期，必須頻繁施用FVIII。盡管對于全長蛋白質大于300kD 的其較大大小，FVIII具有僅約11小時的人中半衰期(Ewenstein等，Semin. Hematol. 41 1-16，2004)。對頻繁靜脈內注射的需要對患者順從性產生巨大的障礙。對于患者而言會更 方便的是，若可以開發出如下的FVIII產品，其具有較長的半衰期，因此需要頻率較少的施 用。此外，若增加半衰期，則可以降低治療成本，這是因為那樣可以需要更少的劑量。目前療法的別的缺點是約25-30%的患者形成抑制FVIII活性的抗體(Menko等， Haemophilia 8 =1-11,2002) 抑制性抗體的主要表位位于A2域內殘基484-508處、A3域 內殘基1811-1818處、和C2域內。抗體形成阻止FVIII作為代替療法使用，迫使這組患者 尋找用高劑量重組因子VIIa和免疫耐受性療法進行的甚至更昂貴的治療。以下研究鑒定了抑制性抗體的FVIII表位。在25份抑制性血漿樣品的研究中， 發現11份結合凝血酶生成的73kD輕鏈片段A3C1C2，4份結合A2域，而10份結合這兩者 (Fulcher 等，Proc. Natl. Acad. Sci. 2 :7728-32,1985)。在另一項研究中，通過重組 A2 多肽 中和來自患者的8種A2域抑制劑之6種Gcandella等，Blood 82 1767-75,1993) 將來 自患者的9種抑制劑之6種的表位定位于A2殘基379-538 (kandella等，Proc. Natl. Acad. Sci. 85 :6152-6,1988) ο將18種重鏈抑制劑的表位定位至A2域的相同的N端18. 3kD區 (Scandella 等，Blood74 :1618-26,1989)。一種活性的、重組雜合人/豬FVIII分子(其通過用同源豬序列替換人A2域殘基 387-604 來生成)對患者 A2 抑制劑有抗性(Lubin 等，J. Biol. Chem. 269 :8639-41，1994)， 而且對與患者A2抑制劑競爭對A2結合的鼠單克隆抗體mAB 413 IgG有抗性(Scandella 等，Thromb Haemost. 67 :665-71，1992)。當實驗顯示了 mAB 413 IgG和4種患者抑制劑不 抑制A2域殘基484-508用豬的殘基替換的雜合人/豬FVIII時，將此A2域表位進一步定 位至 A2 域殘基 484-508 (Healey 等，J. Biol. Chem. 270 :14505-14509,1995)。此雜合 FVIII 對所篩選23份患者血漿的至少一半還更有抗性(Barrow等，Blood 95 =564-568, 2000) 0 丙氨酸掃描誘變將殘基487鑒定為對于結合所測試的所有5種患者抑制劑是至關重要的， 而殘基484、487、489、和492對于與mAB 413 IgG的相互作用都是重要的(Lub in, J.Biol. Chem. 272 :30191-30195,1997)。接受R484A/R489A/P492A突變體，而非R484A/R489A突變體 的小鼠中的抑制性抗體效價顯著低于接受對照人BDD FVIII的小鼠中的(Parker等，Blood 104 =704-710,2004)。總之，A2域的484-508區似乎是FVIII活性的抑制劑的結合位點。在形成對FVIII的免疫響應外，關于常規療法的另一個問題在于它需要頻繁的劑 量給藥，這是由于FVIII在體內的短半衰期。自循環清除FVIII的機制已經進行了研究。
已經將FVIII自循環清除部分歸因于對低密度脂蛋白受體相關蛋白(LRP)(即 一種具有廣泛配體特異性的肝清除受體)的特異性結合(Oldenburg等，Haemophilia 10 Suppl 4:133-139,2004)。最近，還顯示了低密度脂蛋白(LDL)受體在FVIII清除 中起作用，諸如通過在調節FVIII的血漿水平上與LRP協作(Bovenschen等，Blood 106 :906-910,200 。這兩種相互作用通過結合細胞表面硫酸肝素蛋白聚糖(HSPG)來 促進。小鼠中的血漿半衰期可以在封閉LRP時延長3. 3倍或在封閉LRP和細胞表面 HSPG 兩者時延長 5. 5 倍(Sarafanov 等，J. Biol. Chem. 276 :11970-11979，2001)。假 設HSPG濃縮細胞表面上的FVIII，而且將其呈遞至LRP。已經將FVIII上的LRP結合 位點定位至 A2 殘基 484-509 (Saenko 等，J. Biol. Chem. 274 :37685-37692,1999)、A3 殘 基 1811-1818 (Bovenschen 等，J. Biol. Chem. 278 :9370-9377,2003),和 C2 域中的表位 (Lenting 等，J. Biol. Chem. 274 :23734-23739,1999)。還通過蛋白酶作用自循環清除FVIII。為了了解此效果，必須了解FVIII牽涉血 液凝固的機制。FVIII作為結合vWF的重鏈和輕鏈異二聚體循環。vWF結合牽涉FVIII殘 基 1649-1689 (Foster 等，J. Biol. Chem. 263 :5230-5234,1998)、和 Cl (Jacquemin 等，Blood 96 :958-965, 2000)和 C2 域(Spiegel 等，J. Biol. Chem. 279 :53691-53698, 2004)的一部 分。FVIII是由凝血酶激活的，所述凝血酶切割殘基372、740、和1689后的肽鍵以生成 Al、A2、和 A3-C1-C2 域的異三聚體(Pittman 等，Proc. Natl. Acad. Sci. 276 :12434-12439,
2001)。激活后，FVIII與vWF解離，并通過結合磷脂來濃縮至血小板的細胞表面。磷脂結 合牽涉 FVIII 殘基 2199、2200、2251、和 2252 (Gilbert 等，J. Biol. Chem. 277 :6374-6381,
2002)。在那里它經由與FVIII 殘基 558-565 (Fay 等，J. Biol. Chem. 269 :20522-20527, 1994)和 1811-1818 (Lenting 等，J. Biol. Chem. 271 1935-1940，1996)的相互作用而結合 FIX,并經由與FVIII殘基349-372的相互作用而結合FX(Nogami等，J. Biol. Chem. 279 15763-15771，2004)，而且充當FIX激活FX (即固有凝固途徑的一種重要成分)的輔因子。 激活的FVIII (FVIIIa)是由蛋白酶激活蛋白C(APC)經由FVIII殘基336和562后的切割 部分失活的(Regan等，J. Biol. Chem. 271 :3982-3987,1996)。然而，失活的主要決定因素是 A2 域與 Al 和 A3-C1-C2 的解離(Fay 等，J. Biol. Chem. 266 :8957-8962,1991)。一種已經表明增加蛋白質的體內半衰期的方法是PEG化。PEG化是將長鏈的聚 乙二醇(PEG)分子共價附接于蛋白質或其它分子。PEG可以處于線性形式或處于分支形 式以產生具有不同特征的不同分子。在增加肽或蛋白質的半衰期外，已經使用PEG化來簡 化抗體開發，保護蛋白質免于蛋白酶消化，并將材料保持在腎濾液外(Harris等，Clinical Pharmacokinetics 40 :539_551，2001)。另外，PEG化還能增加蛋白質的總體穩定性和溶解 度。最后，PEG化的蛋白質的持續血漿濃度可以如下降低不利副作用的程度，即降低藥物的 谷至峰水平，如此消除需要在早期時間點時引入超生理學水平的蛋白質。已經嘗試了通過用大的聚合物諸如PEG和右旋糖苷靶向伯胺(N端和賴氨酸) 來隨機修飾FVIII，獲得了不同程度的成功(W094/15625、美國專利4970300、美國專利 6048720)。1994專利申請(W094/15625)中公布的最顯著改善顯示了將全長FVIII與50倍 摩爾過量的PEG起反應后的4倍半衰期改善，但是以損失2倍活性為代價。W02004/075923 披露了經由隨機修飾創建的FVIII和聚乙二醇的偶聯物。在過去，隨機PEG化的蛋白質諸 如干擾素alpha(Kozlowski等，BioDrugs 15 =419-429,2001)已經批準作為治療劑。
然而，此隨機辦法對于異二聚體FVIII而言是更加成問題的。FVIII具有數百個潛 在的PEG化位點，包括158個賴氨酸、兩個N端、和多個組氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、和酪氨酸， 它們都可以用主要靶向伯胺的試劑潛在地PEG化。例如，顯示了 PEG化的干擾素Alpha-2b 的主要位置異構體是組氨酸(Wang等，Biochemistry 39 :106；34-10640，2000)。此外，對全 長FVIII的異質加工可以導致起始材料的混合物，這導致PEG化產物中的進一步復雜性。不 控制FVIII上的PEG化位點的別的缺點是潛在的活性降低，若要在重要的活性位點處或附 近附接PEG的話，尤其若將超過一個PEG或單個大的PEG偶聯至FVIII的話。由于隨機PEG 化總會生成大量的多PEG化產物，用于僅獲得單PEG化產物的純化會劇烈降低總體產量。最 后，產物譜中的巨大異質性會使每批次的一致合成和表征變為幾乎不可能。因為良好制造 要求一致的、充分表征的產品，產品異質性是商品化的一項障礙。出于所有這些原因，想要 用于使FVIIIPEG化的更特異性方法。已經在最近的綜述中匯總了各種定點蛋白質PEG化策略(Kochendoerfer等， Curr. Opin. Chem. Biol. 9 =555-560, 2005)。一種辦法牽涉通過化學合成或重組表達將非天 然氨基酸摻入蛋白質中，接著添加PEG衍生物，其會特異性與非天然氨基酸起反應。例如， 非天然氨基酸可以是含有天然蛋白質中沒有找到的酮基的。然而，蛋白質的化學合成對于 與FVIII—樣大的蛋白質而言是不可行的。肽合成的目前限度是約50個殘基。可以連接 數個肽以形成較大片段的多肽，但是為了生成即使B域缺失型FVIII也會要求大于20次連 接，其即使在理想的反應條件下也會導致小于回收。迄今為止，具有非天然氨基酸的蛋 白質的重組表達主要限于非哺乳動物表達系統。預期此辦法對于需要在哺乳動物系統中表 達的大的且復雜的蛋白質諸如FVIII是成問題的。另一種用于蛋白質的位點特異性PEG化的辦法是通過用PEG-醛靶向N端主鏈胺。 然而，相對于其它胺基在此方法下實現特異性所需要的低PH與FVIII穩定性所需要的窄的 近中性 pH 范圍不相容(Wang 等，Intl. J. Pharmaceutics 259，第 1 頁-第 15 頁，2003)。此 外，FVIII的N端PEG化不可導致改善的血漿半衰期，若此區域不牽涉血漿清除的話。W090/12874披露了如下位點特異性修飾人IL_3、粒細胞集落刺激因子和紅細胞 生成素多肽，即插入半胱氨酸或用半胱氨酸取代另一種氨基酸，然后添加具有巰基反應性 基團的配體。配體選擇性偶聯半胱氨酸殘基。沒有披露對FVIII或其任何變體的修飾。EP 0 319 315披露了具有導致vWF結合降低的vWF結合位點缺失或改變的FVIII 突變蛋白。EP 0 319 315進一步披露了通過施用此類突變蛋白質來緩解源自vWF抑制性活 性的 FVIII 缺陷(deficiency)。Rottensteiner等披露了對FVIII中的賴氨酸殘基的隨機化學修飾以與聚乙二醇 或聚唾液酸形成偶聯物。Blood 110(11)，3150A0007)。Rottensteiner等進一步提示了經 隨機修飾的FVIII在vWD 2N型中可以是有用的。出于上文所陳述的原因，需要如下的改善的FVIII變體，其擁有較大的體內作用 持續時間和降低的免疫原性，同時保留功能活性。此外，想要的是，此類蛋白質以一致的方 式作為同質產物生成。發明概述本發明的目標是提供一種治療vWD的方法，包括施用偶聯有生物相容性聚合物的 功能性FVIII多肽，其具有改善的藥動學特征和治療特征。
還有，本發明的目標是提供一種用于治療vWD的方法，包括對有所需要的受試者 施用治療有效量的具有FVIII促凝血活性而且能夠改正人FVIII缺陷的偶聯物，所述偶聯 物包含在所述多肽上的一個或多個預定位點處共價附接于一種或多種生物相容性聚合物 的功能性FVIII多肽，其中所述預定位點是通過所述多肽的氨基酸序列中的數字位置鑒定 的特定氨基酸殘基，而且不是N端胺。血管性血友病可以以von Willebrand因子的缺乏和 /或異常表征。本發明的另一個目標是提供一種制備用于治療vWD的藥物的方法，包括生成具有 FVIII促凝血活性而且能夠改正人FVIII缺陷的偶聯物，所述偶聯物包含在所述多肽上的 一個或多個預定位點處共價附接于一種或多種生物相容性聚合物的功能性FVIII多肽，其 中所述預定位點是通過所述多肽的氨基酸序列中的數字位置鑒定的特定氨基酸殘基，而且 不是N端胺。本發明的又一個目標是提供一種用于治療vWD的方法，包括對有所需要的受試者 施用治療有效量的半胱氨酸取代的FVIII變體，其具有FVIII促凝血活性，而且能夠改正人 FVIII缺陷，所述變體特征在于FVIII序列中具有取代氨基酸的半胱氨酸殘基，其中所述取 代在半胱氨酸殘基不存在于FVIII中的氨基酸位置處引起半胱氨酸殘基，所述氨基酸位置 參照成熟的、全長人FVIII氨基酸序列SEQ ID NO :1，所述半胱氨酸添加的變體的進一步特 征在于具有共價附接于所述取代半胱氨酸殘基的生物相容性聚合物。本發明的另一個目標是提供一種用于治療vWD的方法，包括對有所需要的受試者 施用具有改善的藥動學特性的偶聯有生物相容性聚合物的B域缺失型FVIII蛋白。本發明的又一個目標是提供一種用于治療vWD的方法，包括對有所需要的受試者 施用偶聯有生物相容性聚合物的功能性FVIII多肽，其具有降低的對低密度脂蛋白受體相 關蛋白(LRP)、低密度脂蛋白(LDL)受體、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPGs)和/或針對FVIII 的抑制性抗體的結合。本發明的又一個目標是提供一種用于治療vWD的方法，包括對有所需要的受試者 施用治療有效量的擁有較大的體內作用持續時間和降低的免疫原性的改善的FVIII變體， 其能夠以一致的方式作為同質產物生成。在本發明的一方面，提供了一種用于治療vWD的方法，包括對有所需要的受試者 施用治療有效量的具有FVIII促凝血活性的偶聯物，其包含在所述多肽上的一個或多個預 定位點處共價附接于一種或多種生物相容性聚合物的功能性FVIII多肽，其中所述預定位 點不是N端胺。在本發明的另一方面，提供了一種用于在手術前預防性處理的方法，包括在手術 前對受試者施用治療有效量的具有FVIII促凝血活性而且能夠改正人FVIII缺陷的偶聯 物，由此減弱發作性出血(印isodic bleeding)，所述偶聯物包含在所述多肽上的一個或多 個預定位點處共價附接于一種或多種生物相容性聚合物的功能性FVIII多肽，其中所述預 定位點是通過所述多肽的氨基酸序列中的數字位置鑒定的特定氨基酸殘基，而且不是N端 胺。所述受試者可以患有vWD，例如3型vWD。有利地，在手術前M小時內、優選地8小時 內、最優選地手術前0. 5-2小時施用偶聯物。在本發明的又一方面，提供了一種用于治療外傷的方法，包括對有所需要的受試 者施用治療有效量的具有FVIII促凝血活性而且能夠改正人FVIII缺陷的偶聯物，由此減弱發作性出血，所述偶聯物包含在所述多肽上的一個或多個預定位點處共價附接于一種或 多種生物相容性聚合物的功能性FVIII多肽，其中所述預定位點是通過所述多肽的氨基酸 序列中的數字位置鑒定的特定氨基酸殘基，而且不是N端胺。所述受試者可以患有vWD，例 如3型vWD。附圖簡述

圖1 :PEG化的FVIII在vWD敲除(KO)小鼠中將FVIII半衰期恢復至正常的效 果。該圖顯示了 i)對vWF KO小鼠施用rFVIII (實心圓圈)，ii)對FVIII KO小鼠施用 rFVI 11 (空心圓圈)，i i i)對vWF KO小鼠施用PEG化的rFVI 11 (64kDPEG14,實心正方形)，和 iv)對vWF KO小鼠施用不同PEG化的rFVIII (64kDPEG2+14,實心三角形)后的血漿FVIII 活性的時間過程。發明詳述本發明基于如下的發現，即可以在不在N端胺處的預定位點處將具有FVIII活性 的多肽共價附接于生物相容性聚合物，及此類多肽基本上保留其促凝血活性。此外，這些多 肽偶聯物具有改善的循環時間和降低的免疫原性。本發明進一步基于如下的發現，即在預定位點處與生物相容性聚合物共價連接的 FVIII突變蛋白在缺乏vWF的受試者的循環中具有比未修飾的FVIII長的促凝血活性半衰 期。使用本發明的偶聯物來治療基本上缺乏vWF的受試者可以比使用具有與FVIII隨機聚 合物附接或在N端處附接的現有技術偶聯物有利。定點附接容許設計避免生物學活性所 需要的區域，由此維持本質性FVIII活性的修飾。它還容許設計為附接聚合物以阻斷牽涉 FVIII清除的位點處的結合。定點附接還容許一致的產物，而不是本領域中通過隨機聚合物 偶聯生成的異質偶聯物。通過避免在輕鏈的N端胺處的附接，本發明的偶聯物避免來自在 FVIII多肽的活性位點處附接配體的可能的活性損失。定義生物相容性聚合物。生物相容性聚合物包括聚環氧烷烴諸如但不限于聚乙 二醇(PEG)、右旋糖苷(dextrans)、多聚乙酰神經氨酸或其它基于碳水化合物的聚合 物(colominic acids or other carbohydrate based polymers)、M 基酸白勺聚合物、 生物素衍生物、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸鹽(polycarboxylates)、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙 火希—共-馬來酸fff (polyethylene-co-maleic acid anhydride)、聚苯乙；！；希一共一蘋果 酸Sf (polystyrene-co-malic acid anhydride)、聚口 惡唑啉(polyoxazoline)、聚丙烯酰 嗎啉(polyacryloylmorpholine)、肝素、清蛋白、纖維素、殼聚糖的水解產物、淀粉諸如羥 乙基淀粉和羥丙基淀粉、糖原、瓊脂糖及其衍生物、瓜爾膠(guar gum)、普魯分支葡聚糖 (pullulan)、菊粉(inulin)、黃胞膠(xanthan gum)、角叉藻聚糖(carrageenan)、果膠、褐 藻酸水解產物、其它生物聚合物及其任何等同物。聚合物的例子是聚乙二醇諸如甲氧基 聚乙二醇(mPEG)。其它有用的聚亞烷基二醇化合物是聚丙二醇(PPG)、聚丁二醇(PBG)、 PEG-縮水甘油醚(Epox-PEG)、PEG-氧羰基咪唑(PEG-oxycarbonyl imidazole) (CD I-PEG)、 分支的聚乙二醇、線性聚乙二醇、叉狀的聚乙二醇和多臂的或“超分支的”聚乙二醇(星 型-PEG)。聚乙二醇(PEG)。如本文中所使用的，“PEG”和“聚乙二醇”可互換，包括任何水 溶性聚(環氧乙烷)。通常，依照本發明使用的PEG包含以下結構“--(0CH2CH2)n--”，其中 (η)是2至4000。如本文中所使用的,PEG還包括“一CH2CH2—0 (CH2CH20) n—CH2CH2—”和“-(0CH2CH2) nO-”，這取決于末端氧是否已經置換。遍及整個說明書和權利要求書，應當記 住，術語“PEG”包括具有各種末端或“末端加帽”基團，諸如但不限于羥基或C1-20烷氧基基 團的結構。術語“PEG”還指含有大多數(即大于50%)-0CH 2CH2-重復亞基的聚合物。 關于具體的形式，PEG可以采用任何數目的多種分子量，以及結構或幾何學諸如分支的、線 性的、叉狀的、和多功能性的。PEG化。PEG化是一種由此將聚乙二醇(PEG)共價附接于分子諸如蛋白質的方法。激活的或活性的功能團。在將功能團諸如生物相容性聚合物描述為激活的時，該 功能團容易與另一分子上的親電體或親核體起反應。B域缺失型FVIII (BDD)。如本文中所使用的，BDD的特征在于具有含有FVIII B域 的幾乎14個氨基酸的缺失的氨基酸序列。B域的前4個氨基酸(SFSQ，SEQ ID NO 2)與B 域的后 10 個殘基(NPPVLKRHQR, SEQ ID NO 3)連接(Lind 等，Eur. J. Biochem. 232 19-27， 1995)。本文中所使用的BDD具有氨基酸序列SEQ ID NO :4。BDD多肽的例子記載于WO 2006/053^9，通過提及而將其收入本文。FVIII。血液凝固因子VIII (FVIII)是一種由肝合成并釋放入血流中的糖蛋白。在 循環的血液中，它結合von Willebrand因子(vWF，又稱為FVIII相關抗原)以形成穩定的 復合物。由凝血酶激活后，它與復合物解離以與凝固級聯中的其它凝固因子相互作用，這最 后導致形成血栓。人全長FVIII具有氨基酸序列SEQ ID NO :1，雖然等位變體是有可能的。功能性FVIII多肽。如本文中所使用的，功能性FVIII多肽表示能夠在體內或在 體外改正例如以血友病A表征的人FVIII缺陷的功能性多肽或多肽組合。FVIII在自然狀 態中具有多種降解或加工形式。這些是以蛋白水解方式自前體，即單鏈蛋白質衍生的，如本 文中所表明的。功能性FVIII多肽包括此類單鏈蛋白質，而且還提供了這些各種降解產物， 它們具有改正人FVIII缺陷的生物學活性。可能存在等位變異。功能性FVIII多肽包括產 生FVIII衍生物的所有此類等位變異、糖基化型式、修飾和片段，只要它們含有人FVIII的 功能區段，而且本質的、特征性的人FVIII功能活性在種類上保持不受影響。可以容易地通 過本文中所描述的直接體外測試來鑒定那些擁有必要功能活性的FVIII衍生物。此外，功 能性FVIII多肽能夠在存在FIXa、鈣、和磷脂的情況中催化因子X(FX)轉化為FXa，以及改 正自血友病A受累個體衍生的血漿中的凝固缺陷。從人FVIII氨基酸序列的序列和本文中 功能區的公開內容看，可以經由對DNA的限制酶切割或對人FVIII蛋白的蛋白水解或其它 降解衍生的片段對于本領域技術人員會是顯而易見的。功能性FVIII多肽的例子記載于WO 2006/053^9，通過提及而將其收入本文。FIX。如本文中所使用的，FIX指凝固因子IX，其又稱為人凝固因子IX，或血漿促 凝血酶原激酶成分。FX。如本文中所使用的，FX指凝固因子X，其又以名稱人凝固因子X及以名祖斯圖 亞特因子(Stuart-Prower factor)知名。藥動學。“藥動學”(“冊”)是一項用于描述藥物在身體中的吸收、分布、代謝、和 消除的特性的術語。對藥物藥動學的改良指那些使藥物在體內作為治療劑更有效的特征， 尤其在身體中的其有用的持續時間的改善。突變蛋白質。突變蛋白質是一種由于對蛋白質或多肽的實驗室誘導的突變生成的 經遺傳工程化改造的蛋白質。
蛋白質。如本文中所使用的，蛋白質和多肽是同義詞。FVIII清除受體。如本文中所使用的，FVIII清除受體指功能性FVIII多肽上結合 或聯合一種或多種其它分子以導致FVIII自循環清除的受體區。FVIII清除受體包括但不 限于FVIII分子中結合LRP、LDL受體和/或HSPG的區域。預想可以在預定的位點處突變任何功能性FVIII多肽，然后在所述位點處共價附 接于依照本發明方法的生物相容性聚合物。有用的多肽包括但不限于具有如SEQ ID NO 1 中所顯示的氨基酸序列的全長FVIII和具有如SEQ IDNO 4中所顯示的氨基酸序列的BDD FVIIIo本發明偶聯物中所使用的生物相容性聚合物可以是上文所討論的任何聚合物。生 物相容性聚合物選擇為提供想要的藥動學改善。例如，選擇聚合物的身份、大小和結構以改 善具有FVIII活性的多肽的循環半衰期或降低多肽的抗原性而沒有不可接受的活性降低。 聚合物可以包含PEG，而且作為一個例子，可以具有作為PEG的至少50%的其分子量。在一 個實施方案中，聚合物是用末端加帽模塊諸如羥基、烷氧基、取代烷氧基、烯氧基、取代烯氧 基、炔氧基(alkynoxy)、取代炔氧基、芳氧基和取代芳氧基末端加帽的聚乙二醇。在另一個 實施方案中，聚合物可以包含甲氧基聚乙二醇。在別的實施方案中，聚合物可以包含具有大 小范圍為3kD至lOOkD、或5kD至64kD、或5kD至43kD的甲氧基聚乙二醇。聚合物可以具有反應性模塊。例如，在一個實施方案中，聚合物具有能與功能 性FVIII多肽上的游離半胱氨酸起反應以形成共價連接的巰基反應性模塊。此類巰基反 應性模塊包括硫醇、三氟甲烷磺酸基(triflate)、三氟乙基磺酸基(tresylate)、氮丙啶 (aziridine)、環氧乙烷、S-吡啶基、或馬來酰亞胺模塊。在一個實施方案中，聚合物是線性 的，而且具有在一端的不對巰基強反應性的“帽”(諸如甲氧基)和在另一端的巰基反應性 模塊。在一個實施方案中，偶聯物包含PEG-馬來酰亞胺，而且具有5kD至64kD的大小范圍。隨后的例子中提供了關于選擇有用的生物相容性聚合物的進一步指導。可以通過本領域中已知的任何方法來發生編碼具有FVIII活性的多肽的核苷酸 序列的定點突變。方法包括誘變以在選擇用于共價附接聚合物的位點處引入半胱氨酸密碼 子。這可以使用商品化定點誘變試劑盒諸如MratagenecQuickChange II定點誘變試劑 盒、Clontech ^Transformer定點誘變試劑盒號K1600-1、Invitrogen GenTaylor定點誘變系 統號 12397014、Promega AlteredSites II 體外誘變系統試劑盒號 Q6210、或 Takara Mirus Bio LA PCR誘變試劑盒號TAK RR016來實現。可以如下制備本發明的偶聯物，即首先用半胱氨酸密碼子替換功能性FVIII多肽 表面上的一個或多個氨基酸的密碼子，在重組表達系統中生成半胱氨酸突變蛋白質，將突 變蛋白質與半胱氨酸特異性聚合物試劑起反應，并純化突變蛋白質。在此系統中，可以經由聚合物上的馬來酰亞胺活性功能性來實現半胱氨酸位點處 的聚合物添加。下文提供了此技術的例子。所使用的巰基反應性聚合物的量應當與要衍生 化的半胱氨酸的摩爾量至少等摩爾，而且優選地過量存在。作為一個例子，使用至少5倍摩 爾過量的巰基反應性聚合物，或者使用至少10倍過量的此類聚合物。可用于共價附接的其 它條件在本領域技術人員的技術范圍內。在隨后的例子中，以本領域中常規的方式命名突變蛋白質。用于命名突變蛋白質 的約定基于如SEQ ID NO :1中所提供的成熟的、全長FVIII的氨基酸序列。作為分泌性蛋白質，FVIII含有在翻譯過程期間以蛋白水解方式切割的信號序列。除去19個氨基酸的信 號序列后，分泌性FVIII產物的第一個氨基酸是丙氨酸。如作為常規的和本文中所使用的，在提及BDD FVIII中的突變氨基酸時，突變氨基 酸以其在全長FVIII序列中的位置指明。例如，下文所討論的PEG6突變蛋白稱作K1808C， 因為它將與全長序列中第1808位相似位置處的賴氨酸(K)改變為半胱氨酸(C)。用于共價結合聚合物的預定位點最好選自多肽表面上暴露的不牽涉FVIII活性 的位點。此類位點還最好選自那些已知牽涉FVIII失活或自循環清除的機制的位點。在下 文更為詳細地討論了這些位點的選擇。優選的位點包括(a)低密度脂蛋白受體相關蛋白、 (b)硫酸肝素蛋白聚糖、(c)低密度脂蛋白受體、和/或(d)FVIII抑制性抗體的結合位點中 或附近的氨基酸殘基。“結合位點中或附近”指與結合位點足夠接近以使生物相容性聚合物 共價附接于該位點會導致結合位點的位阻的殘基。例如，預期此類位點在結合位點的20A 內。在本發明的一個實施方案中，將生物相容性聚合物在下列結合位點中或附近的氨 基酸殘基處共價附接于功能性FVIII多肽(a)能夠降解FVIII的蛋白酶的結合位點和/或 (b)FVIII抑制性抗體的結合位點。蛋白酶可以是活化的蛋白C(APC)。在另一個實施方案 中，將所述生物相容性聚合物在所述功能性FVIII多肽上的預定位點處共價附接，使得低 密度脂蛋白受體相關蛋白對所述多肽的結合小于未將所述多肽偶聯時對其的結合，例如， 小2倍以上。在一個實施方案中，將所述生物相容性聚合物在所述功能性FVIII多肽上的 預定位點處共價附接，使得硫酸乙酰肝素蛋白聚糖對所述多肽的結合小于未將所述多肽偶 聯時對其的結合，例如，小2倍以上。在一個別的實施方案中，將所述生物相容性聚合物在 所述功能性FVIII多肽上的預定位點處共價附接，使得FVIII抑制性抗體對所述多肽的結 合小于未將所述多肽偶聯時對其的結合，例如，比未將所述多肽偶聯時對其的結合小2倍 以上。在另一個實施方案中，將所述生物相容性聚合物在所述功能性FVIII多肽上的預定 位點處共價附接，使得低密度脂蛋白受體對所述多肽的結合小于未將所述多肽偶聯時對其 的結合，例如，小2倍以上。在另一個實施方案中，將所述生物相容性聚合物在所述功能性 FVIII多肽上的預定位點處共價附接，使得血漿蛋白酶比未將所述多肽偶聯時更少地降解 所述多肽。在一個別的實施方案中，所述血漿蛋白酶對所述多肽的降解比未將所述多肽偶 聯時對其的降解小2倍以上，如在相同時間期限里在相同條件下測量的。可以使用表面等離振子共振技術(Biacore)來測定對FVIII的LRP、LDL受體、 或HSPG結合親和力。例如，可以將FVIII直接或經由FVIII抗體間接包被至Biacore 芯 片，并可以讓不同濃度的LRP在芯片上通過以測量相互作用的結合速率和解離速率兩者 (Bovenschen等，J. Biol. Chem. 278 :9370-9377,2003) 兩種速率的比率給出親和力的測 量。PEG化后親和力降低2倍、5倍、10倍、或30倍會是想要的。可以通過本領域技術人員已知的任何方法來測量蛋白酶APC對FVIII的降解。在一個實施方案中，方法包括施用在下組FVIII氨基酸位置之一處或多處共價附 接于多肽的生物相容性聚合物第81位、第1 位、第377位、第378位、第468位、第487 位、第491位、第504位、第556位、第570位、第711位、第1648位、第1795位、第1796位、 第1803位、第1804、第1808位、第1810位、第1864位、第1903位、第1911位、第2091位、 第2118位和第2284位。在另一個實施方案中，將生物相容性聚合物在下組FVIII氨基酸位置之一處或多處共價附接于多肽第377位、第378位、第468位、第491位、第504位、 第556位、第1795位、第1796位、第1803位、第1804、第1808位、第1810位、第1864位、第 1903、第1911位、和第2284位，而且(1)偶聯物對低密度脂蛋白受體相關蛋白的結合小于 未偶聯多肽對所述低密度脂蛋白受體相關蛋白的結合；( 所述偶聯物對低密度脂蛋白受 體的結合小于未偶聯多肽對所述低密度脂蛋白受體的結合；或(3)所述偶聯物對低密度脂 蛋白受體相關蛋白和低密度脂蛋白受體兩者的結合小于所述未偶聯多肽對所述低密度脂 蛋白受體相關蛋白和所述低密度脂蛋白受體的結合。在一個別的實施方案中，方法包括施用在下組FVIII氨基酸位置之一處或多處共 價附接于所述多肽的生物相容性聚合物第377位、第378位、第468位、第491位、第504 位、第556位和第711位，而且偶聯物對硫酸肝素蛋白聚糖的結合小于未偶聯多肽對硫酸肝 素蛋白聚糖的結合。在一個別的實施方案中，將所述生物相容性聚合物在下組FVIII氨基 酸位置之一處或多處共價附接于所述多肽第81位、第1 位、第377位、第378位、第468 位、第487位、第491位、第504位、第556位、第570位、第711位、第1648位、第1795位、第 1796位、第1803位、第1804位、第1808位、第1810位、第1864位、第1903位、第1911位、 第2091位、第2118位和第2284位，而且偶聯物具有比未偶聯多肽小的對FVIII抑制性抗 體的結合。在一個別的實施方案中，將所述生物相容性聚合物在下組FVIII氨基酸位置之 一處或多處共價附接于所述多肽第81位、第1 位、第377位、第378位、第468位、第487 位、第491位、第504位、第556位、第570位、第711位、第1648位、第1795位、第1796位、 第1803位、第1804位、第1808位、第1810位、第1864位、第1903位、第1911位、第2091 位、第2118位和第2284位，例如，在第377位、第378位、第468位、第491位、第504位、第 556位、和第711位之一處或多處，而且偶聯物具有比未偶聯多肽少的來自能夠FVIII降解 的血漿蛋白酶的降解。血漿蛋白酶可以是活化的蛋白C。在一個別的實施方案中，方法包括施用在下組氨基酸位置共價附接于B域缺失型 FVIII的生物相容性聚合物第1 位、第491位、第1804位、和/或第1808位。在一個別 的實施方案中，將所述生物相容性聚合物在FVIII氨基酸位置1804處附接于所述多肽，而 且所述生物相容性聚合物包含聚乙二醇。一個或多個供生物相容性聚合物附接用的預定位 點可以受位點特異性半胱氨酸突變控制。功能性FVIII多肽上的一個或多個位點(例如1或2個)可以是供聚合物附接用 的預定位點。在具體的實施方案中，多肽是單PEG化的或二 PEG化的。本發明還涉及一種用于制備偶聯物的方法，包括突變編碼功能性FVIII多肽的核 苷酸序列以在預定位點處用半胱氨酸殘基的編碼序列取代；表達突變核苷酸序列以生成半 胱氨酸升高的突變蛋白質；純化突變蛋白質；使突變蛋白質與已經活化的生物相容性聚合 物起反應以基本上僅在還原性半胱氨酸殘基處與多肽起反應，從而形成偶聯物；并純化該 偶聯物。在另一個實施方案中，本發明提供了一種用于FVIII突變蛋白的定點PEG化的方 法，包括(a)表達定點FVIII突變蛋白，其中所述突變蛋白具有FVIII突變蛋白的暴露表 面上的氨基酸殘基的半胱氨酸取代，而且所述半胱氨酸是加帽的；(b)在輕度還原半胱氨 酸突變蛋白質并釋放帽的條件下使半胱氨酸突變蛋白質與還原劑接觸；(c)自半胱氨酸突 變蛋白質除去帽和還原劑；并(d)在除去還原劑后至少約5分鐘、至少15分鐘、至少30分 鐘，在使得生成PEG化的FVIII突變蛋白的條件下用包含巰基偶聯模塊的PEG處理半胱氨酸突變蛋白質。PEG的巰基偶聯模塊選自下組硫醇、三氟甲烷磺酸基、三氟乙基磺酸基、氮 丙啶、環氧乙烷、S-吡啶基、或馬來酰亞胺模塊。本發明還關注用于胃腸外施用的藥物組合物，其包含治療有效量的本發明偶聯物 和藥學可接受賦形劑。藥學可接受賦形劑是可以添加到活性成分以幫助配制或穩定化制 劑，而不對患者引起顯著不利毒物學效果的物質。此類賦形劑的例子是本領域技術人員公 知的，包括水、糖諸如麥芽糖或蔗糖、清蛋白、鹽等。其它賦形劑由E.W.Martin記載于例如 Remington's PharmaceuticalSciences0此類組合物會含有有效量的其偶聯物以及合適量 的媒介物，以便制備適合于對宿主有效施用的藥學可接受組合物。例如，可以以可隨出血事 件的嚴重性而變化的劑量對罹患血友病A的受試者胃腸外施用偶聯物。對血友病A靜脈內 施用的平均劑量范圍為對于手術前適應癥為每千克40個單位、對于微小出血為每千克15 至20個單位、和對于維持劑量為8小時期間里施用的每千克20至40個單位。對于治療vWD， 劑量可以是每千克25-400IU。其它對于vWD有用的劑量是25-50、25-100、50-75、50_100、 100-200,150-200,200-300,250-300,300-350,300-400,25-250,100-400 和 200-400IU/ kg。較低劑量可用于預防，而較高劑量可用于具有FVIII抑制劑的患者中的免疫耐受性誘 導。在一個實施方案中，發明的方法牽涉用半胱氨酸替換一個或多個表面BDD氨基 酸，在哺乳動物表達系統中生成半胱氨酸突變蛋白質，還原已經在表達過程中由來自生長 培養基的半胱氨酸加帽的半胱氨酸，除去還原劑以容許BDD 二硫化物再形成，并與半胱氨 酸特異性生物相容性聚合物試劑，諸如諸如PEG-馬來酰亞胺起反應。此類試劑的例子是 具有諸如5、22、或43kD的PEG大小分別以Nektar產品目錄編號2D2M0H01 mPEG-MAL棚 5, OOODa,2D2M0P01 mPEG-MAL MW 20kD、2D3X0P01 mPEG2-MAL MW 40kD 可購自圣卡洛斯 (San Carlos)，CA 的 Nektar Therapeutics 或具有諸如 12 或 33kD 的 PEG 大小分別以 NOF 產品目錄編號 Sunbright ME-120MA和 SunbrightME_300MA可購自 NOF Corporation，東京， 日本的PEG-馬來酰亞胺。PEG化的產物使用離子交換層析來純化以除去未反應的PEG，并 使用大小排阻層析來除去未反應的BDD。可以使用此方法來鑒定并選擇性防護與FVIII的 任何不利相互作用，諸如受體介導的清除、抑制性抗體結合、和蛋白水解酶的降解。我們注 意到，由Nektar或NOF作為5kD供應的PEG試劑在我們的實驗室中測試為6kD，而且類似 地，在我們的實驗室中，作為線性20kD供應的PEG試劑測試為22kD，作為40kD供應的測試 為43kD，而作為60kD供應的測試為64kD。為了避免混淆，我們在本文中的討論中使用如我 們實驗室中所測試的分子量，除5kD PEG外，我們將其報告為5kD，如制造商將其鑒定的。在BDD的第491位和第1808位半胱氨酸突變(上文所公開的)外，將第487位、 第496位、第504位、第468位、第1810位、第1812位、第1813位、第1815位、第1795位、 第1796位、第1803位、和第1804位突變為半胱氨酸以潛在地容許PEG化后阻斷LRP結合。 還有，將第377位、第378位、和第556位突變為半胱氨酸以容許PEG化后阻斷LRP和HSPG 結合兩者。第81位、第1 位、第422位、第523位、第570位、第1864位、第1911位、第 2091位、和第2284位選擇為在BDD上相等地間隔，從而這些位置處用大的PEG(大于40kD) 的定點PEG化以及天然糖基化位點01、239、和2118)和LRP結合位點處的PEG化應當完全 覆蓋BDD的表面，并鑒定關于BDD的新的清除機制。在一個實施方案中，細胞培養基含有通過形成二硫鍵為突變蛋白質上的半胱氨酸殘基“加帽”的半胱氨酸。在偶聯物的制備中，用來自培養基的半胱氨酸為重組系統中生成 的半胱氨酸突變蛋白質加帽，并通過釋放帽的輕度還原來除去此帽，之后添加半胱氨酸特 異性聚合物試劑。也可以使用本領域中已知用于FVIII的位點特異性突變的其它方法，其 對于本領域技術人員會是顯而易見的。FVIII的結構活件相互關系分析FVIII和BDD FVIII是具有許多牽涉生物學反應的不同位點的非常大的復雜分 子。先前嘗試共價修飾它們以改善藥動學特性，這具有混合的結果。令人驚訝的是，可以將 分子特異性突變，然后以位點特異性方式添加聚合物。此外，鑒于引起非特異性添加和活性 降低的關于過去聚合物偶聯物的問題，改善的藥動學特性和保留的活性結果也是令人驚訝 的。在一個實施方案中，本發明關注使用半胱氨酸特異性配體諸如PEG-馬來酰亞胺 進行的定點誘變。非突變BDD沒有任何可用的半胱氨酸來與PEG-馬來酰亞胺起反應， 因此僅突變的半胱氨酸位置會是PEG化的位點。更具體地，BDD FVIII具有19個半胱 氨酸，其中16個形成二硫化物，而其中另3個是游離的半胱氨酸(McMullen等，Protein Sci. 4740-746，1995)。BDD的結構模型提示了所有3個游離的半胱氨酸是掩埋的 (Stoliova-McPhie等，Blood 99 1215-1223，2002)。因為氧化的半胱氨酸不能通過PEG-馬 來酰亞胺來PEG化，所以不能在不首先進行還原的情況中PEG化在BDD中形成二硫化物的 16個半胱氨酸。基于BDD的結構模型，BDD中的3個游離半胱氨酸在不首先使蛋白質變性 以將這些半胱氨酸暴露于PEG試劑的情況中不能被PEG化。如此，似乎不可行的是，在不顯 著改變BDD結構的情況中通過在天然半胱氨酸殘基處進行PEG化來實現BDD的特異性PEG 化，所述顯著改變BDD結構最可能會破壞其功能。全長FVIII B域中的4個半胱氨酸的氧化還原狀態是未知的。B域中的4個半胱 氨酸的PEG化可以是有可能的，若它們不形成二硫化物，而且是表面暴露的話。然而，因為 全長FVIII和BDD具有相似的藥動學(PK)譜(profile)和相似的體內半衰期(Gruppo等， Haemophilia 9 :251力60，2003)，所以B域PEG化不可能導致改善的血漿半衰期，除非PEG 恰好還保護非B域區。為了在具有FVIII活性的多肽上確定預定的位點以進行會保留FVIII活性并改善 藥動學的聚合物附接，基于BDD FVIII來呈現以下準則。修飾應當靶向清除、失活、和免疫 原性機制諸如LRP、HSPG、APC、和抑制性抗體結合位點。Moilova-McPhie等，(Blood 99: 1215-23,2002)顯示了 BDD的結構。例如，為了延長半衰期，可以在A2殘基484-509和A3 殘基1811-1818中的LRP結合位點處或附近的特定位點處引入單個PEG。這些位點處龐大 的PEG的引入應當破壞FVIII結合LRP的能力，而且降低FVIII自循環的清除。還認為為 了延長半衰期而不顯著影響活性，可以在殘基1648處引入PEG，所述殘基1648在全長分子 中的B域與A3域的接合處和BDD的A2和A3域之間的14個氨基酸的接頭I中。可以使用重組DNA誘變技術來將單個半胱氨酸殘基工程化改造入A2或A3域中， 接著用半胱氨酸特異性PEG試劑諸如PEG-馬來酰亞胺對引入的半胱氨酸進行位點特異性 PEG化，從而實現PEG化的特異性。484-509和1811-1818處的PEG化的另一項優點是這兩 個表位代表患者中三類主要抑制性抗原性位點之兩種。為了實現改善的循環半衰期和免疫 原性響應降低的最大效果，可以將A2和A3LRP結合位點都進行PEG化以產生二 PEG化的產物。應當注意到，1811-1818區內的PEG化可以導致顯著的活性損失，因為此區域還牽涉 FIX結合。558-565內的定點PEG化應當消除HSPG結合，但是也可以降低活性，因為此區域 還結合FIX。可以對別的表面位點進行PEG化以鑒定新的FVIII清除機制。A2域的PEG化可以 提供別的優點，其在于A2域在激活后與FVIII解離，而且推測由于其大小更小而比FVIII 分子的剩余部分更快地自循環除去。另一方面，PEG化的A2可以大得足以逃脫腎清除，而 且具有與FVIII的剩余部分相當的血漿半衰期，并且如此可以在體內重建激活的FVIII。A2和A3區中PEG化位點的鑒定。選擇假定的A2LRP結合區處或附近的5個位置 (與PEG1-5位置對應的W87、L491、K496、L504和Q468)作為用于定點PEG化的例子，這基 于高的表面暴露和其Ca至Ci3軌跡的向外方向進行。此外，這些殘基在該分子的三維結 構中彼此是大致等距離的，因此它們可以共同代表這整個區域。選擇假定的A3LRP結合區 處或附近的 8 個位置(與 PEG6-14 對應的 1808、1810、1812、1813、1815、1795、1796、1803、 1804)作為用于定點PEG化的例子。PEG6 (K1808)與1811-1818和1810處的天然N連接的 糖基化位點鄰近。第1810位PEG化(PEG7)會用PEG替換糖。PEG8位置T1812處的突變也 會消除糖基化位點。雖然預測PEG9位置(K1813)向內指向，但是在結構模型不正確的情況 中選擇它。PEG10(Y1815)是一種在LRP結合環內的龐大的疏水性氨基酸，而且可以是一種 至關重要的相互作用殘基，因為通常在蛋白質-蛋白質相互作用中央找到疏水性氨基酸。 因為已經報告了 1811-1818區牽涉LRP和FIX結合兩者，可能認為此環內的PEG化導致活 性降低。如此，PEG11-PEG14(1795、1796、1803、1804)設計為接近1811-1818環，但不在環 內，因此可以用不同PEG大小來分離LRP和FIX結合。為了同時封閉這兩個LRP結合位點，可以產生在例如PEG2和PEG6位置處的雙PEG 化。因為已經顯示了 558-565區結合HSPG和FIX兩者，所以不在此區域內設計位點。 取而代之，在A2LRP和HSPG結合區之間設計PEG15-PEG17 (377、378、和556)，使得附接的 PEG可以干擾這兩種相互作用，而且破壞它們之間可能的相互作用。也可以在LRP和HPSG 結合區內或附近選擇別的表面暴露的且向外指向的位點。為了鑒定新的清除機制，可以系 統地將FVIII進行PEG化。在PEG1-17外，可以使用與PEG18-20對應的三個其它天然糖基 化位點，即N41、N239、和N2118作為PEG化的拴系點，因為它們應當是表面暴露的。在vWF、 FIX、FX、磷脂、和凝血酶的功能性相互作用位點外，將距PEG2、PEG6、和4個糖基化位點的 C β原子20埃半徑內的表面積定位至BDD模型上。然后選擇與Υ81、F129、Κ422、Κ523、Κ570、Ν1864、Τ1911、Q2091、和 Q2284 對應的 PEG2H9，這基于其覆蓋幾乎整個剩余的距其每個C β原子具有20埃半徑的BDD表面的能 力進行。選擇這些位置，還因為它們是完全暴露的、向外指向的、而且遠離天然的半胱氨酸 以使可能的不正確二硫化物形成最小化。選擇20埃半徑，因為預期大的PEG諸如64kD分 支的PEG具有覆蓋具有約20埃半徑的球體的潛力。PEG2H9以及PEG2和PEG6和糖基化 位點PEG18、19、和20的PEG化有可能保護幾乎整個FVIII的非功能性表面。可以組合導致增強的特性諸如改善的1 譜、較大的穩定性、或降低的免疫原性的 PEG化位置以產生具有最大增強特征的多PEG化的產物。分別通過除去A2和A3域中暴露 的二硫化物來設計PEG30和PEG31。PEG30或C630A應當釋放其二硫化物配偶C711以進行PEG化。同樣地，PEG31,即C1899A應當容許C1903進行PEG化。 實施例為了本發明可以得到更好的理解，列出了以下實施例。這些實施例僅為了例示目 的，而不要以任何方式解釋為限制本發明的范圍。通過提及而完整收錄本文中所提及的所 有出版物。實施例1 誘變可以通過在選擇用于PEG化的位點處引入半胱氨酸密碼子來生成用于FVIII的定 點PEG化的底物。使用Mratagene cQuickChange II定點誘變試劑盒來生成所有PEG突 變蛋白(Stratagene Corporation, La Jolla, CA) 使用PfuTurbo DNA 聚合酶和溫度循
環儀來進行cQuikChange 定點誘變法。使用iPfuTurbo (其不會置換引物)來延伸含
有期望突變的兩種互補寡核苷酸引物。使用含有野生型FVIII基因的dsDNA作為模板。多 輪延伸循環后，用DpnI內切核酸酶消化產物，所述DpnI內切核酸酶對甲基化的DNA是特異 性的。新合成的DNA(含有突變)是未甲基化的，而親本野生型DNA是甲基化的。然后使用 經消化的DNA來轉化XL-IBlue超級感受態細胞。在pSK207+BDD C2. 6或pSK207+BDD中進行誘變反應。FVIII的定點誘變、突變蛋 白質的純化、PEG化、和活性測量的描述可以參見W02006/053^9，通過提及而將其收入本 文。表1中提供了突變蛋白質的匯總。表 權利要求
1.一種用于治療血管性血友病的方法，包括對有所需要的受試者施用治療有效量的具 有FVIII促凝血活性而且能夠改正人FVIII缺陷的偶聯物，所述偶聯物包含在所述多肽上 的一個或多個預定位點處共價附接于一種或多種生物相容性聚合物的功能性FVIII多肽， 其中所述預定位點是通過所述多肽的氨基酸序列中的數字位置鑒定的特定氨基酸殘基，而 且不是N端胺。
2.權利要求1的方法，其中所述生物相容性聚合物包含聚乙二醇。
3.權利要求2的方法，其中所述聚乙二醇包含甲氧基聚乙二醇。
4.權利要求3的方法，其中所述甲氧基聚乙二醇具有5kD-64kD的大小范圍。
5.權利要求1的方法，其中將所述生物相容性聚合物在下列結合位點中或附近的氨基 酸殘基處共價附接于所述功能性FVIII多肽(a)FVIII清除受體的結合位點，(b)能夠降解 FVIII的蛋白酶的結合位點和/或(C)FVIII抑制性抗體的結合位點。
6.權利要求1的方法，其中將所述生物相容性聚合物在所述功能性FVIII多肽上的預 定位點處共價附接，使得低密度脂蛋白受體相關蛋白與所述多肽的結合小于未將所述多肽 偶聯時與其的結合。
7.權利要求6的方法，其中低密度脂蛋白受體相關蛋白與所述偶聯物的結合小于未將 所述多肽偶聯時與其的結合的一半。
8.權利要求1的方法，其中將所述生物相容性聚合物在所述功能性FVIII多肽上的預 定位點處共價附接，使得硫酸乙酰肝素蛋白聚糖與所述多肽的結合小于未將所述多肽偶聯 時與其的結合。
9.權利要求8的方法，其中硫酸肝素蛋白聚糖與所述偶聯物的結合小于未將所述多肽 偶聯時與其的結合的一半。
10.權利要求1的方法，其中將所述生物相容性聚合物在所述功能性FVIII多肽上的預 定位點處共價附接，使得FVIII抑制性抗體與所述多肽的結合小于未將所述多肽偶聯時與 其的結合。
11.權利要求10的方法，其中FVIII抑制性抗體對所述偶聯物的結合小于未將所述多 肽偶聯時與其的結合的一半。
12.權利要求1的方法，其中將所述生物相容性聚合物在所述功能性FVIII多肽上的預 定位點處共價附接，使得低密度脂蛋白受體與所述多肽的結合小于未將所述多肽偶聯時與 其的結合。
13.權利要求12的方法，其中低密度脂蛋白受體對所述偶聯物的結合小于未將所述多 肽偶聯時與其的結合的一半。
14.權利要求1的方法，其中將所述生物相容性聚合物在所述功能性FVIII多肽上的預 定位點處共價附接，使得血漿蛋白酶比未將所述多肽偶聯時更少地降解所述多肽。
15.權利要求14的方法，其中所述血漿蛋白酶對所述多肽的降解小于未將所述多肽偶 聯時對其的降解的一半，如在相同時間期限里在相同條件下測量的。
16.權利要求1的方法，其中將所述生物相容性聚合物在參照成熟的、全長人FVIII氨 基酸序列SEQ ID NO 1的下組FVIII氨基酸位置之一處共價附接于所述多肽第81位、第 129位、第377位、第378位、第468位、第487位、第491位、第504位、第556位、第570位、 第711位、第1648位、第1795位、第1796位、第1803位、第1804位、第1808位、第1810位、第1864位、第1903位、第1911位、第2091位、第2118位和第2284位。
17.權利要求1的方法，其中將所述生物相容性聚合物在參照成熟的、全長人FVIII氨 基酸序列SEQ ID NO :1的下組FVIII氨基酸位置之一處或多處共價附接于所述多肽第377 位、第378位、第468位、第491位、第504位、第556位、第1795位、第1796位、第1803位、 第1804位、第1808位、第1810位、第1864位、第1903、第1911位、和第2284位，且進一步 其中(1)偶聯物與低密度脂蛋白受體相關蛋白的結合小于未偶聯多肽與所述低密度脂蛋 白受體相關蛋白的結合；(2)所述偶聯物與低密度脂蛋白受體的結合小于未偶聯多肽與所 述低密度脂蛋白受體的結合；或C3)所述偶聯物與低密度脂蛋白受體相關蛋白和低密度脂 蛋白受體兩者的結合小于所述未偶聯多肽與所述低密度脂蛋白受體相關蛋白和所述低密 度脂蛋白受體的結合。
18.權利要求1的方法，其中將所述生物相容性聚合物在參照成熟的、全長人FVIII氨 基酸序列SEQ ID NO :1的下組FVIII氨基酸位置之一處或多處共價附接于所述多肽第377 位、第378位、第468位、第491位、第504位、第556位和第711位，且進一步其中所述偶聯 物與硫酸肝素蛋白聚糖的結合小于未偶聯多肽與硫酸肝素蛋白聚糖的結合。
19.權利要求1的方法，其中將所述生物相容性聚合物在參照成熟的、全長人FVIII氨 基酸序列SEQ ID NO :1的下組FVIII氨基酸位置之一處或多處共價附接于所述多肽第81 位、第1 位、第377位、第378位、第468位、第487位、第491位、第504位、第556位、第 570位、第711位、第1648位、第1795位、第1796位、第1803位、第1804位、第1808位、第 1810位、第1864位、第1903位、第1911位、第2091位、第2118位和第2284位，而且偶聯物 具有比未偶聯多肽小的與FVIII抑制性抗體的結合。
20.權利要求1的方法，其中將所述生物相容性聚合物在參照成熟的、全長人FVIII氨 基酸序列SEQ ID NO :1的下組FVIII氨基酸位置之一處或多處共價附接于所述多肽第81 位、第1 位、第377位、第378位、第468位、第487位、第491位、第504位、第556位、第 570位、第711位、第1648位、第1795位、第1796位、第1803位、第1804位、第1808位、第 1810位、第1864位、第1903位、第1911位、第2091位、第2118位和第2284位，而且所述偶 聯物具有比未偶聯多肽少的來自能夠降解FVIII的血漿蛋白酶的降解。
21.權利要求20的方法，其中所述血漿蛋白酶是活化的蛋白C。
22.權利要求1的方法，其中所述功能性FVIII多肽是B域缺失型FVIII。
23.權利要求22的方法，其中將所述生物相容性聚合物在參照成熟的、全長人FVIII氨 基酸序列SEQ ID NO 1的氨基酸位置1四、491、1804、和/或1808處共價附接于B域缺失 型 FVIII。
24.權利要求1的方法，其中將所述生物相容性聚合物在參照成熟的、全長人FVIII氨 基酸序列SEQ ID NO 1的FVIII氨基酸位置1804處附接于所述多肽，而且所述生物相容性 聚合物包含聚乙二醇。
25.權利要求1的方法，其中一個或多個供生物相容性聚合物附接用的預定位點是半胱氨酸殘基。
26.權利要求1的方法，其中所述血管性血友病以vonWillebrand因子的缺乏和/或異常表征。
27.權利要求1的方法，其中所述血管性血友病是N2型。
28.權利要求1的方法，其中所述血管性血友病是3型。
29.一種制備用于治療血管性血友病的藥物的方法，包括生成具有FVIII促凝血活性 而且能夠改正人FVIII缺陷的偶聯物，所述偶聯物包含在所述多肽上的一個或多個預定位 點處共價附接于一種或多種生物相容性聚合物的功能性FVIII多肽，其中所述預定位點是 通過所述多肽的氨基酸序列中的數字位置鑒定的特定氨基酸殘基，而且不是N端胺。
30.一種用于治療血管性血友病的方法，包括對有所需要的受試者施用治療有效量的 半胱氨酸取代的FVIII變體，其具有FVIII促凝血活性，而且能夠改正人FVIII缺陷，所述 變體的特征在于FVIII序列中具有取代氨基酸的半胱氨酸殘基，其中所述取代在FVIII中 不存在半胱氨酸殘基的氨基酸位置處引起半胱氨酸殘基，所述氨基酸位置參照成熟的、全 長人FVIII氨基酸序列SEQID NO :1，所述半胱氨酸添加的變體的進一步特征在于具有共價 附接于所述取代半胱氨酸殘基的生物相容性聚合物。
31.權利要求30的方法，其中所述生物相容性聚合物包含聚乙二醇。
32.一種用于預防性處理的方法，包括在手術前對有所需要的受試者施用治療有效量 的具有FVIII促凝血活性而且能夠改正人FVIII缺陷的偶聯物，由此減弱發作性出血，所述 偶聯物包含在所述多肽上的一個或多個預定位點處共價附接于一種或多種生物相容性聚 合物的功能性FVIII多肽，其中所述預定位點是通過所述多肽的氨基酸序列中的數字位置 鑒定的特定氨基酸殘基，而且不是N端胺。
33.權利要求32的方法，其中所述受試者患有3型vWD。
34.權利要求32的方法，其中所述生物相容性聚合物包含聚乙二醇。
35.權利要求32的方法，其中所述一個或多個供生物相容性聚合物附接用的預定位點 是半胱氨酸殘基。
36.一種用于治療外傷的方法，包括對外傷受試者施用治療有效量的具有FVIII促 凝血活性而且能夠改正人FVIII缺陷的偶聯物，由此減弱發作性出血，所述偶聯物包含在 所述多肽上的一個或多個預定位點處共價附接于一種或多種生物相容性聚合物的功能性 FVIII多肽，其中所述預定位點是通過所述多肽的氨基酸序列中的數字位置鑒定的特定氨 基酸殘基，而且不是N端胺。
37.權利要求36的方法，其中所述受試者患有3型vWD。
38.權利要求36的方法，其中所述生物相容性聚合物包含聚乙二醇。
39.權利要求36的方法，其中所述一個或多個供生物相容性聚合物附接用的預定位點 是半胱氨酸殘基。
全文摘要
本發明涉及通過施用因子VIII突變蛋白來治療血管性血友病，所述因子VIII突變蛋白在不是N端胺的預定位點處共價結合一種或多種生物相容性聚合物諸如聚乙二醇。突變蛋白質偶聯物保留FVIII促凝血活性，而且在缺乏vonWillebrand因子的受試者中具有改善的藥動學特性。
文檔編號C12P21/06GK102112623SQ200980130359
公開日2011年6月29日 申請日期2009年6月4日 優先權日2008年6月4日
發明者劉彤瑤, 張欣, 格倫.皮爾斯, 潘峻亮, 約翰.E.墨菲, 蔣海燕 申請人:拜耳醫藥保健有限公司