專利名稱：用于高通量試驗的三維組織的制作方法
用于高通量試驗的三維組織相關申請的交叉引用本申請要求2008年6月5日提交的美國臨時專利申請No. 61/059，126的優先權 的權益，在此作為參考引用其全部內容。關于聯邦資助研究的聲明本發明在由NIH/NCCAM授予的R41基金號AT003984的政府支持下進行。美國政 府對本發明具有一定權利。
背景技術：
對在正常發育過程中以及在疾病狀態下的活細胞中的各種生物分子的表征的需 要促進了細胞基試驗的發展。如今高通量細胞基試驗形成了生物醫學研究的基礎。這些試 驗不僅用于基礎研究，如細胞組分和方法的發現，也用于應用研究，如藥物開發。例如，已開 發細胞基試驗用于監測細胞活動和功能，如細胞生存能力、細胞增殖、基因表達和細胞內信 號和細胞間信號。這種試驗可用于高通量(HTP)篩選應用。然而，許多細胞基試驗不適于 高通量篩選，因為檢測靈敏度或信號強度過低。此外，高通量細胞基試驗通常在單層細胞上 進行，這些試驗不能充分描述組織內的細胞行為。需要增加的靈敏度和增加的信號強度，使 得細胞基試驗可適用于高通量應用。
發明內容
本文提供了使用三維組織模型的高通量細胞試驗體系以及進行這種試驗的方法。 所述試驗可用于監測組織對使用各種試劑和應激源的處理的響應。三維組織在置于多孔板 中的一個孔內的支架上形成。組織懸浮于孔底部以上。試驗在懸浮的組織上進行，試驗的 輸出(output)在孔中測量。在一個方面，本文提供了檢測組織對試劑的響應的方法。所述方法包括使生物人 工組織與試劑接觸，使用生物人工組織進行產生指示劑的試驗，以及檢測孔中的指示劑水 平。指示劑水平表示生物人工組織對試劑的響應。在試驗中所用的生物人工組織包含細胞 和細胞外基質，并在支架支撐上形成而不使用促進組織粘合的持著器(fastener)。所述支 架支撐位于孔底部以上。試驗輸出可為比色或熒光產物，產物的積聚可使用板閱讀器測量。可使用本發明 的體系進行的示例性的試驗包括但不限于細胞增殖試驗、細胞死亡試驗、細胞凋亡試驗、蛋 白質表達試驗、基因表達試驗、酶試驗、信號試驗(如激酶活性試驗、Ca2+信號試驗和GPCR 信號試驗)、評估線粒體活性的試驗，以及細胞外基質降解試驗。
本發明可參照結合附圖的具體實施方案的詳細描述而得以更好的理解。圖Ia顯示了一個高通量體系，其說明了圖Ib所示的三角形和矩形(可選擇的形 狀)支架的使用，所述支架由直徑為約1毫米的不銹鋼絲制成，并提供了形成重組三維組織的支撐。圖2顯示了支架的幾種視圖。圖加為支架的俯視圖。圖2b為支架的側視圖。圖 2c為為了易于在高通量應用中使用將幾個支架彼此連接的一種方式的側視圖。圖3為顯示典型設計的三維組織的照片。圖4為表示三維組織與細胞單層之間的區別的圖示。該圖演示了可通過使用三維 組織代替細胞單層而實現的增加的細胞基試驗信號強度。圖5 (A)為The Palpator 的照片。該體系包括等長力(isometric force)傳感 器(a)、探針浴(b)和在溫度調節器板(d)上的水凝膠組織構建物(HTC)臺(C)。圖5 (B) 為顯示將帶有連接的探針的力傳感器置于HTCs上并降低探針至用于力測量的組織之上的 x-y-z移動機械臂的照片。圖5(C)為帶有連接的力傳感器和探針的機械臂的示意圖。圖 5(D)為置于HCT的中平面以上1毫米處的探針(a)，然后降低直至該探針首先接觸(b)，然 后拉伸(c)組織的照片。圖5(E)為顯示在HTC壓入過程中記錄的代表性力的圖。箭頭a、 b和c顯示與在(D)中所示的探針位置相關的力測量。圖5(f和g)為顯示依賴于Mio激酶 抑制劑1(RKI1)、細胞松弛素D(CD)、魚藤酮(ROT)和2，4_ 二硝基苯酚(DNP)的劑量而減小 的HTC收縮力的圖。將HTCs預處理，然后用所示四種藥物的不同濃度進行處理。在3小時 (f)和對小時(g)時測量力。力測量相對于對照介質處理的HTCs (F。)進行表示。數據顯 示主要是4次重復，幾個2和3次重復的平均值和SEM ；Z-因子> 0. 44 0和0. 59 O。圖 5(h)為顯示細胞松弛素D處理減少的細胞F肌動蛋白的圖。將用藥物處理M小時的HTCs 固定并用Alexa 568共軛毒傘素標記。熒光強度在板閱讀器上讀取并相對于對照介質處理 的HTCs (Ic)作圖。數據顯示3次重復的平均值和SEM ；通過Student的t_測試相比對照物 (Ctrl), p < 0. 02。圖 5(i-w)為顯示用介質(i，η, s)、CD(j，ο, t)、RKIl(k，ρ, u)、DNP(l， q，ν)和ROT (m, r，w)處理的REF單層的顯微圖片。在3小時(i_m)和24小時(n_r，s-w) 后處理時，將代表性的單層固定，并用Alexa 568共軛毒傘素和DAPI染色。在3小時之時 (j)，CD引起大量肌動蛋白解聚。RKIUDNP和ROT限于無影響。CD和ROT引發的細胞毒性 由細胞收縮&，1和」)、雙核形成(1)和核分裂(ο)而得以證實。請注意在(g)和(1)中的 更大的比例。圖像在Leica SP5共焦顯微鏡上使用浸水63x物鏡，比例尺=50微米截取。圖6(a)為顯示DNP的解偶聯效應使用板閱讀器在細胞單層中不可計量的圖。平 均值和SEM顯示，η =11。圖6(b)為顯示相同的效應在HTCs中可計量的圖。平均值和SEM 顯示，η = 4。圖6 (c)為顯示在用DNP處理的REF單層中的顯微鏡定量的TMRE信號的代表 性圖線的圖。圖6(d)為顯示在用DNP處理的HTC底細胞層中的顯微鏡定量的TMRE信號的 代表性圖線的圖。相比于來自HTCs的細胞層的結果(c)，TMRE信號的降低量級更高。圖 6 (e和f)為顯示DNP劑量依賴的解偶聯HTC線粒體電位的圖。預載TMRE (IOOnM, 30分鐘) 的HTCs用不同濃度的CD、RKI1、DNP和ROT進行處理。在3 (a)和對…)小時后處理時使用 板閱讀器測量TMRE熒光信號。信號強度相對于對照的介質處理的HTCs (I。)表示。顯示了 4次(幾種為2或3次)重復的平均值和SEM ；Z-因子> 0. 64 O和0. 46 O。圖7 (a)為顯示⑶和ROT表現出劑量依賴的細胞毒性的圖。藥物處理的HTCs的 生存能力在M小時時通過MTT試驗測定。甲臜(formazan)(由活細胞中的MTT轉化)的 吸光度在板閱讀器上讀取，并相對于對照的介質處理的HTCs(Ae)表示。10%DMS0處理用作 該試驗的陽性對照(positive control)，其得到0. 11 士 9X10—3的A/A。(在圖中未顯示)；對于對照相比10% DMSO分析，Z-因子> 0. 85。數據顯示主要4次(幾種為2和3次)重 復的平均值和SEM。圖7(b)為HTC篩選的工作流程圖。持續時間表示加工每一板(plate) HTCs所需的時間量。合成HTCs，并在使用之前使其收縮48小時。修色的(Shaded)平形四 邊形指示數據點獲取。對于原位指示器，例如TMRE而言，重復測量是可能的。終點試驗法， 例如MTT，需要犧牲HTCs，并在實驗結束時進行。圖7(c-f)為顯示用于篩選化合物的表型 圖線(profiles)的圖。每個化合物在M小時時的生理學數據，即組織力(tissue force) (Force)、線粒體電位(Mit. Pot.)和MTT轉化率(MTT Conv.)歸一化至最大效應(通過四 個化合物之一)，然后用線性或四參數邏輯函數(直線)進行擬合。由1減少至0的圖線 表示化合物對特定的生理學具有最大負效應。表型圖線通過證實RKIl為最佳候選化合物 (因為RKIl有效降低了組織力(由1至0)，并同時表現出最小解偶聯活性(線粒體毒性) 和MTT轉化率(細胞毒性)的降低)而簡化了化合物選擇過程。
具體實施例方式由于由比色指示劑或熒光指示劑產生的低信號強度，許多可得的細胞基高通量篩 選試驗的有用性是有限的。這種試驗通常使用在單層或懸浮體培養基中的細胞，而不是存 在于組織中的細胞。此外，單層和懸浮細胞不必然與組織的三維環境中的體內細胞表現類 似。本文呈現的試驗和組織使得這些高通量試驗能夠在更接近類似于體內環境(setting) 的組織基體系中進行。此外，由于相比于在相同區域中的細胞單層，更多數目的細胞存在于 三維組織中，在三維組織上進行的試驗的輸出所產生的信號得以放大。本發明改進了使用光檢測系統(如分光光度測量和熒光板閱讀器)的試驗測量細 胞生理學的效率。這是使用組織(如工程化或生物人工組織)的生理曲線體系的另一特征。 如美國專利No. 7，449，306中所在先描述，工程化組織(生物人工組織)可以小型形式，包 括96孔板形式得以構造。例如，在工程化組織(3D組織類器官)中的細胞生長可加載熒光 探針，該熒光探針用于報告細胞內和/或細胞外活性的生理學。熒光探針通過改變其強度 或移動其發射光譜而報告生理狀態。本文提供了檢測組織對試劑的響應的方法。所述方法包括使生物人工組織與試劑 接觸，在生物人工組織上進行產生指示劑的試驗，以及檢測孔中的指示劑水平。指示劑水平 表示生物人工組織對試劑的響應。在試驗中所用的生物人工組織包含細胞和細胞外基質， 并在支架支撐上形成而不使用促進組織粘合的持著器。試驗可適用于高通量篩選方法。可經由本領域技術人員可得到的任何方式使生物人工組織與試劑接觸。例如，可 將試劑加入含有生物人工組織的孔中，或者可在形成生物人工組織之前將試劑提供至細 胞。可選擇地，可利用載體(如病毒載體或脂質體)，或經由受體介導靶向而使試劑與細胞 接觸。生物人工組織模型可用于定量和快速地評估許多不同類的試劑的效應，所述試劑 包括但不限于藥物或潛在的藥物、毒素、化學物質、核酸、肽、多肽和包括病原體或載體的微 生物。例如，可用作活化劑的試劑包括但不限于胎牛血清(FBS)、溶血磷脂酸(LPA)；凝血 酶、包括表皮生長因子(EGF)、血小板衍生生長因子(PDGF)的生長因子，血管緊張素-II，內 皮素-1，加壓素及其組合。抑制劑包括但不限于結合細胞表面受體的抑制劑(包括血管緊 張素II受體的受體拮抗劑)以及在細胞內作用的抑制劑。本文可用的抑制劑包括但不限于抑制信號傳導通道的那些，包括染料木素、除莠霉素和在細胞骨架上作用的試劑。抑制劑 也包括但不限于細胞松弛素D、拉春庫林B、帕克利托科(paclitoxol)、諾考達唑、花萼海綿 誘癌素A、丁烷二酮一肟(BDM)及其組合。提供至生物人工組織的試劑的含量為有效引起來自組織模型或經由組織模型的 響應的含量。有效含量通常在約InM至IOOmM,合適地IOOnM至ImM，更合適的500nM至 500 μ M之間。在用試劑處理之后，可在生物人工組織上進行試驗。設計用以產生如比色指示劑、 熒光指示劑或放射性指示劑的指示劑的任何試驗可適用于本發明的3D生物人工組織。包 括但不限于細胞增殖試驗、細胞死亡試驗、凋亡試驗、蛋白質表達試驗、基因表達試驗、酶試 驗、信號試驗(如激酶活性試驗、Ca2+信號試驗和GPCR信號試驗)、評估線粒體活性的試驗 和細胞外基質降解試驗的試驗可用于本文所述的方法中。開發用于細胞單層，特別是依賴 于細胞攝取的試劑或試驗試劑的那些的試驗需要較長的培養時間以使得試劑和試驗試劑 由生物人工組織內的細胞吸收。試驗試劑濃度也需要調節。最后，檢測由試驗產生的指示劑水平。產生的指示劑水平是指由試驗進行所產生 的試驗輸出或信號。所述水平可與產生的指示劑含量或指示劑本身的變化(例如發射光譜 的改變，或由細胞攝取的標記指示劑的改變)相關。指示劑水平表示生物人工組織對試劑 的響應。指示劑水平的檢測可利用顯微鏡、光學或熒光板閱讀器或閃爍器，這取決于所選的 指示劑和試驗。由顯微鏡檢測的信號靈敏度高于板閱讀器檢測的信號靈敏度。顯微鏡聚焦 于細胞層以極有效地收集光信號(檢測體積集中且小)。板閱讀器使用散射(未聚焦)光 束(例如未聚焦激光)以檢測在由光束照明的大體積中的分子。在常規細胞培養體系中， 板閱讀器測量來自單個細胞層的光信號。然而，在工程化組織中的細胞形成至少5-10層， 因此板閱讀器可立刻測量大量細胞，從而得到被放大至少5-10倍的由板閱讀器檢測的光 信號。參見圖4。板閱讀器可快得多地讀取信號，因為它們不需要聚焦于單個細胞，因此板 閱讀器的使用適于高通量應用。由顯微鏡拍攝的圖像的分析也比使用板閱讀器拍攝的那些 更耗時。用于測量細胞生理學的常規細胞基試驗常常使用圖像分析。圖像通常由自動化顯 微鏡捕獲并由圖像分析軟件進行分析。治療和測量治療效果的試驗必須通過收集來自數百 個細胞的數據而進行評估。自單個細胞獲得的數據的統計方差過高而不能預測任何治療的 平均效果。為了獲得統計上顯著的數據，必須收集來自至少數百個細胞的數據。板閱讀器可用于獲得相同的信息(例如Ca濃度)，但信號比由自動化顯微鏡獲得 的信號弱得多。該問題的一個解決辦法是增加由板閱讀器測量的細胞數目。細胞形成工程 化3D組織中的多層，因此板閱讀器可測量在相同區域中更多的細胞。對于分析活細胞的動力學性質，板閱讀器優于顯微鏡。使用本文所公開的組織構 建物的測量的改進信號和高統計上的顯著性將使得許多小規模試驗可應用于細胞基高含 量分析。由于增大的靈敏度，目前通常使用顯微鏡，但本文所述的方法使得板閱讀器可用于 細胞基高含量分析。現在參照圖Ia和lb，其中顯示了支架20，該支架合適地包括框架22，例如三角形 框架。重組組織沈在支架20上形成。在此說明性的具體實施方案中，孔42向底部略微逐 漸變細，并且是96孔板40的孔。支架20牢固地位于每個孔42的底部以上，合適地為約1
6毫米以上。將含有所述的細胞和適當的細胞培養介質的膠原的非聚合溶液傾入孔中，將孔 填充至孔底部以上3毫米的水平(圖la)。96孔板40可在37°C下用5% CO2培養。在培 養過程中，細胞自組裝為生物人工組織沈，并通過擠出液體而壓縮膠原基體，由此總體積減 少了約10倍。無支架20時，重組或生物人工組織收縮為漂浮于組織培養介質中的小球。支架20合適地由任何無孔生物可相容的材料，如金屬、非金屬或塑料制成。在實 施例中，支架由不銹鋼制成。本領域技術人員將理解包括但不限于玻璃、聚丙烯或聚苯乙烯 的其他材料也可合適地用于制備支架。框架22合適地支撐于孔42的底部43以上。可通過使用具有錐形孔的組織培養 板40由孔側支撐框架22。可選擇地，可通過使用具有連接至孔側的內置支架或具有帶壁架 (框架22擱在該壁架上)的孔的特別設計的板40而將框架22支撐于孔42的底部以上。 在另一可選擇的具體實施方案中，支架20可包括至少一個連接至框架22的支柱M以將框 架支撐于孔底部以上。支撐框架所需的支柱M的數目取決于框架的形狀而變化。圖Ib顯 示了具有4個支柱的支架20，但可如圖2所示將支架設計為具有更少或更多個支柱。支柱 24可通過從框架向下伸出并接觸孔42的底部而用于支撐框架22，或者支柱M可從框架22 向上伸出并通過將支架固定至孔42的頂部45而支撐支架20的框架。例如，支柱M可在 末端具有小鉤結構，其使得支架20能夠懸掛于孔的頂部(圖2(b))。盡管支架20的框架 22合適地支撐于孔42的底部以上，只要組織可浸入介質中，則精確的距離并不關鍵。合適 地，框架22在孔底部以上至少約0. 25毫米，更合適地，框架在孔底部以上至少約0. 5或1. 0 毫米。支架20可采用多種形狀。使用不同的支架形狀，如環狀或矩形(如圖2所示)可 將含膠原基體壓縮至不同的形狀。其他支架形狀，如圖Ib和圖2中所示的那些，產生具有 不同寬度和形狀的組織條。可使用任何形狀的支架20，包括但不限于環狀、矩形、三角形、五 邊形、六邊形或其他更高階多邊形。支架也可由超過一個元件形成。例如，支架22可由兩 個分隔的平行元件形成，其具有或不具有一個或多個連接所述平行元件的垂直元件(圖Ib 和圖2)。根據本發明的具體實施方案，細胞自組裝形成與支架，即支撐(例如線框)的形狀 相符合的組織模型。在形成中，組織覆蓋支架的元件并跨越元件之間的間距。例如，在三角 形支架上，細胞形成跨越在三個邊之間的膜，如圖Ia所示。在實施例中的支架由截面直徑 為約1毫米的元件制成，但支架可適當地具有更小或更大的截面直徑。合適地，支架由一個 或多個截面直徑在約100微米至約2毫米之間的元件制成。支架通常由圓柱狀或管狀元件 組成，其使得組織圍繞元件形成，從而使得組織覆蓋元件。組成支架的元件合適地為稍微圓 形以將施用力時組織的撕裂最小化。例如，若邊為圓形的，可使用具有矩形截面的元件使得 在施用力時組織不會被撕裂。所述元件合適地由無孔材料制成，并具有約2毫米以下，合適 地約1毫米以下的截面直徑。生物人工組織形成跨越組成支架的元件之間或橫過元件的水平截面空間的膜結 構。生物人工組織跨越的水平截面空間合適地大于10微米，但也可為孔42所允許的那 樣大，合適地，組織跨越約100微米至約5毫米之間，更合適地1毫米至4毫米之間的空 間。如圖3所示的典型的生物人工組織為大約虹虹0. 8毫米，并在8毫米χ 8毫米方形盒 (chamber)中形成。(調節盒的形狀以觀察樣品。組織用甲醛(10%)固定并用橙色染料染色以清楚觀察)。圖3顯示包括支架20的原型多孔板40。在所示具體實施方案中，使用桌面CNC碾 磨機(Sherline Products Inc. ,Vista,CA)自聚碳酸酯棒(25 χ 60 χ 10毫米)機器加工 8孔板。8 χ 8毫米的8個方形孔42含有制造框架22 (1毫米直徑)的2個不銹鋼棒。不 銹鋼棒的中心位于孔底部以上2毫米，并距孔側2毫米，使得2個棒分隔4毫米。使用硅膠 (Dow Chemical Co.，Midland, MI)，使用顯微鏡蓋玻片(1號厚度，Fisherbrand)密封每個 孔底部以促進顯微鏡成像。為了便于在高通量體系中使用多孔板形式，可將支架20通過連接體觀一起連接 成組，且包括但不限于如圖2C所示的2、4、8、12或96個支架。通過將支架20 —起連接成 組，支架可易于定位于多孔板40中。可將連接體觀制備為易于分離，例如，使得快速牽引 動作將打破連接并允許使用者自定義所用的支架數目。本領域技術人員也可使本文所述的 支架和生物人工組織體系適用于任何多孔板，包括但不限于6孔、8孔、12孔、M孔、48孔、 192孔或384孔板。由如下實施例可以看出，不需要多孔支撐材料或如Velcro持著器的其他持著器 以促進組織甚至粘附至所用線框的無孔不銹鋼表面。膠原在膜的外部或組織條上被較大程 度地壓縮，并使得組織懸浮于支架上而無需持著器。因此，該膜的外部可承受由細胞產生的 應力，并防止生物人工組織從線框上撕裂。如圖4所示，根據本發明的數個具體實施方案的生物人工組織提供了比現有細胞 基試驗的細胞單層更類似于體內環境的三維組織。增加的細胞數目導致特定測試試驗的增 加的信號輸出。因此本發明提供了一種機理，通過該機理，所有方式的細胞基試驗可在高通 量體系中成功產生。此外，不同于其他三維組織，本文的組織并非在篩網或框架(其隨后會 干擾光學測量)上生長。相反，組織跨越框架，有可能進行光學測量。本發明的體系不僅使用更少量的試劑(由于用于測試所需組織的小尺寸)，而且 使得組織分析能夠保持在組織培養條件中，包括在整個試驗程序中保持恒定的溫度和無菌 條件。例如，試驗可在層流通風櫥中進行以避免生物人工組織的污染。此外，組織內的細胞 是穩定的，使得試驗可在數小時、數天或甚至數周過程中在同一組生物人工組織上重復數 次。多孔板40可為包括用于保持生物人工組織的支架20的特定設計的板，或者合適 地為可加入支架的通常市售的組織培養多孔板。每個板的孔數目可變化。通常使用具有2 至1000個孔的板，合適地使用具有50至500個孔的板。用于形成生物人工組織的細胞可包括但不限于肌細胞、內皮細胞、上皮細胞、纖維 母細胞、胚胎干細胞、間充質干細胞和心臟細胞。生物人工組織可包含細胞和膠原或者細胞 和細胞外基質。可用于形成生物人工組織的膠原包括膠原1-4類，其包括所有的I-XIII型 及其組合。各種類型的細胞外基質也可用于形成生物人工組織，如水凝膠或Matrigel⑧。在根據本發明的數個具體實施方案的重組組織模型中的細胞在類似于它們在天 然組織和器官中的條件的環境中。因此，使用該方法的試驗結果產生類似于使用動物模型 獲得的那些結果的結果。預期一些動物測試可由本發明的組織模型代替。例如，作用于皮 膚的試劑的一些測試可使用人工活組織進行。實施例
方法由直徑為1毫米的不銹鋼線制成的三角形框架用作支架，重組組織在其上形成。 孔向底部略微逐漸變細，框架牢固地定位于孔底部以上1毫米處(圖la)。將含有細胞和適 當的細胞培養介質的膠原的非聚合溶液傾入孔中，將孔填充至底部以上3毫米的水平(圖 Ib和3)。圖3中的8孔板可在37°C下用5% CO2培養。在培養過程中，細胞通過從多孔膠 原基體擠出液體而壓縮膠原基體。在無線框下，重組組織收縮為漂浮于組織培養介質中的 小球。發現通過使用不同形狀的線框，膠原基體被壓縮為對應于框架形狀的形狀。說明性 地，三角形線框制得跨越在三條邊之間的膜，如圖Ia所示。其他線框形狀，如圖Ib所示的 一種，生成具有不同寬度的組織條。無需如Velcro持著器的多孔支撐材料以促進組織甚至 粘合至線的無孔不銹鋼表面。膠原在膜或條的外部更大程度地被壓縮。因此，該膜的外部 可承受由細胞產生的應力，并防止其從線框上撕裂膜。細胞培養和HTC形成在補加有10%胎牛血清(FBS, S11050, Atlanta Biologicals, Lawrenceville, GA)的 Dulbecco' s Modified Eagle' s Medium(DMEM, MT10013CM, Fisher Scientific, Pittsburgh, PA)中培養大鼠胚胎纖維母細胞(REF-52)。每2至3天將細胞進行再次 培養(subcultured)。為了制備水凝膠組織構建物(HTCs)，通過用0. 05 %胰蛋白酶 (MT-25-025-C1, Fisher Scientific)處理 10 至 15 分鐘而將 REF-52 細胞(40 至 70 傳代 (passages))自培養板解離。然后在IOOOg下離心細胞10分鐘。倒出胰蛋白酶溶液，將細 胞小球再懸浮于10% FBS DMEM介質中。將該細胞懸浮體稀釋至HTC組織溶液中以獲得 8 X IO5細胞/毫升的最終濃度。所述HTC組織溶液由10% FBS DMEMU毫克/毫升的在 0. 02N乙酸中的類型1膠原(3MM9，BD Biosciences, San Jose, CA)、充足的用以中和膠 原中的酸的氫氧化鈉，和充足的用以補償膠原和NaOH的體積的5 X DMEM組成。為了防止過 早的膠原聚合，將HTC組織溶液保持于冰上直至其分布至發明人的定制組織模具中(圖3)。 每個模具含有8個分開的具有兩個內置水平支撐棒的HTC-形成孔。將300毫升的HTC組 織溶液等分至在這些模具中的每個孔中，然后在37°C和5% CO2下培養30分鐘。在培養階 段之后，將350毫升10% FBS DMEM介質加入每個孔中，模具進一步培養48小時。在此時 間中，溶液收縮，從而形成跨越孔中的支撐棒的HTCs。HTC力測量使用I^alpator (如美國專利No. 7，449，306中所述，其以全文引用方式并入本文) 定量HTCs的收縮性。將模具置于I^lpator 的臺上，其將探針自動插入每個孔中，并拉伸 單獨的HTC。將探針連接至力傳感器，該力傳感器測量在HTC中引起的對拉伸響應的阻力， 并將數值輸出至計算機以記錄。使用常規Matlab算法處理并分析力數據以報導數值參數， 該數值參數指示在HTC中的活細胞力。為了獲得HTC收縮力的穩定測量，必要的是通過在 實際力測量之前通過拉伸三次以預處理HTCs。若隨后的力測量在先前拉伸的30分鐘之內， 則無需預處理。在M小時后處理之時的HTCs總是在力測量之前進行預處理。HTC TMRE 標記和 MTT 試驗使用四甲基羅丹明(tetramethylrhodamine)的乙酯(TMRE，T-669，Invitrogen, Carlsbad, CA)定量HTCs的線粒體電位。HTCs在IOOnM TMRE中培養30分鐘，然后在不含酚 紅的10% FBS DMEM中培養60分鐘。使用不含酚紅的介質以避免干擾TMRE熒光讀取。在標記之后，在背景力測量之前以三次拉伸預處理HTCs。然后在Synergy HT板閱讀器(Biotek Instruments,Winooski, VT)上讀取 HTC TMRE 信號。使用定制固定板(adapter plate)將 組織模具定位于板閱讀器的板固定架上。使用543/590激發/發射過濾設定和50的增益設 定從底部讀取熒光信號。在藥物處理之后在預定的時間點時在每次力測量之后也讀取TMRE 熒光強度。使用3- ，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5_ 二苯基四唑(MTT，M-6494，Invitrogen) 定量HTCs中的細胞活力。在藥物暴露之后，在預定時間將MTT加入每個孔中以獲得0. 5毫 克/毫升。將MTT留在孔中2小時，然后去除。然后將在細胞內形成的甲臜染料懸浮于含 有0. IN鹽酸的500微升異丙醇(S77795,Fisher Scientific)中。然后將200毫升甲臜溶 液置入96孔板孔中，并在Synergy HT板閱讀器上讀取。記錄在570和650納米處的吸光 度，差異(A57tl-A65tl)用作甲臜的吸光度強度。HTC藥物處理除非另外指出，所有的化學品均來自Sigma(Sigma-Alrich，St. Louis, M0)。將細 胞松弛素 D (CD，C8273)、魚藤酮(ROT，R8875) ,2,4- 二硝基苯酚(DNP，D198501)，和 Rho 激酶 抑制劑 1 (RKI1，555550，Calbiochem, Gibbstown, NJ)懸浮于二 甲亞砜(DMSO, D4540)中以 進行儲存。⑶、ROT和RKIl的儲液為ImM，將其連續稀釋至在不含酚紅、FBS、葡萄糖或丙酮 酸鹽(-F/P/G)的DMEM中100、10和1 μ M。將DNP稀釋至在DMSO中1Μ，然后稀釋至在-F/ G/P DMEM中100、10和ImM。在HTC預處理和背景力(即前藥)測量之后，將50微升適當 的藥物稀釋液加入每個孔中以獲得所需的處理濃度。將50微升-F/G/P DMEM加入對照孔 中。當加入藥物時，通過移液四次混合孔中的介質。REF-52細胞處理和固定將REF-52細胞置于35毫米培養皿(50，000個細胞)的10% FBS介質O毫升) 中。將細胞培養過夜，然后用化合物進行處理。將濃縮⑶、RKIl、DNP和ROT溶解于-F/G/ P介質中，然后在每個細胞板(每2毫升介質220微升)中稀釋IOX。在固定之前，細胞用 藥物培養M小時。為了固定，經處理的細胞用2毫升磷酸鹽緩沖鹽水(PBS，D565》潤洗一 次，然后在1毫升4%的多聚甲醛(Sigma)溶液(在PBS中)培養30分鐘。經固定的細胞 潤洗兩次，然后在2毫升PBS中儲存。REF-52標記和成像通過在1 毫升 0.1% Triton (BP151,Fisher Scientific)溶液(在 PBS 中)中培 養15分鐘滲透經固定的REF-52細胞。經滲透的細胞用1毫升TBST緩沖液潤洗兩次，然后 用在TBST中的1毫升5%山羊血清封閉1小時。然后將在具有2%山羊血清的TBST中的 1毫升1 200稀釋的Alexa 568共軛毒傘素(A12380，hvitrogen)加入細胞。該染色溶 液也含有400nM的DAPI (D9564)。將細胞染色30分鐘，然后用TBST潤洗兩次。將標記的細 胞安裝在Vectashield(Vector Laboratories,Burlingame,CA)上，用蓋玻片覆蓋然后用指 甲油密封。然后將板倒扣在Leica SP5共焦顯微鏡(Leica Microsystems, Bannockburn, IL)上，并用63X水浸泡物鏡成像。使用543激光線激發Alexa 568，并使用MaiTai多光 子激光激發DAPI。統計分析使用Student的t測試對⑶處理的HTCs和對照HTCs中的熒光信號的降低進行測試(圖Ih)。使用Z因子評估Palpator (圖If和lg) ,TMRE (圖加禾口 2b)和MTT (圖3a) 試驗的信噪比。在MTT試驗中，使用10 % DMSO作為陽性對照。結果為了測量細胞力學以進行化合物篩選，發明人開發了制造小型化的水凝膠組織構 建物(HTCs)和高通量篩選體系I^alpator (圖5ajb、5c)的技術以定量組織的力學性質。 3D HTCs提供了更天然的微環境，且細胞可更好地模擬體內形態和生理學。此外，可使用力 探針拉伸自支撐HTCs以測量細胞力學(圖6d)。使用該體系，HTCs的力學性質可定量測得 (圖6e)而無需細胞標記、復雜的顯微鏡學或圖像分析。在該研究中，將具有已知靶向和生物效應的四種不同類型的化合物加入HTCs并 測定它們對HTC力學的劑量依賴效應。用P激酶抑制劑(RKI)、H-1152和細胞松弛素D (CD) 處理HTC 3和對小時，其干擾肌動蛋白聚合，劑量依賴地降低組織力(兩者EC5tl^O. ΙμΜ， 圖5f，3小時)。二硝基苯酚(DNP)、線粒體膜電位(MMP)的解偶聯也降低組織力，但在比 H-1152或CD 10，000倍更高的濃度下。廣泛使用的對哺乳動物細胞具有公知毒性效應的 殺蟲劑魚藤酮(ROT)也降低組織力。由于其在水性介質中的低溶解度( ΙΟΟμΜ)，發明 人不能進一步增加ROT濃度。通常所有化合物的M小時培養會增加它們對力降低的效應 (圖5g)。特別地，通過另外 20小時的培養，DNP的EC5tl由1.3mM下降至20 μ Μ。然而，最 高濃度的DNP、⑶和H-1152在M小時時不會進一步降低組織力，這表明這些劑量在3小時 內達到最大效應。這些結果說明每個化合物對于降低組織力是有效的。組織力在整個細胞骨架(特別是肌動蛋白和肌球蛋白)的整體得以保持。為了定 量在用所述化合物處理的HTCs中的F(細絲狀)-肌動蛋白的含量，用Alexa 546共軛毒傘 素染色HTCs。Alexa-毒傘素的強度通過板閱讀器測量，在用⑶ΟμΜ)處理的HTCs中的 F-肌動蛋白含量顯著降低(圖證)。這與發明人的先前報道，即⑶介導的組織力降低是由 于完整F肌動蛋白的損失相一致。然而，通過Η1152和DNP力降低與F-肌動蛋白的損失無 關。在這些HTCs中的Alexa-毒傘素標記可相比于對照物。F-肌動蛋白也通過ROT處理而 得以降低，然而，由于不充足的統計顯著性，該結果是非決定性的。用2μΜ CD處理的毒傘 素-染色的細胞的顯微鏡分析顯示早在3小時時F-肌動蛋白大量破裂(圖5j)。在M小 時時，短F-肌動蛋白被再分布于較不鋪展(圖5ο)的細胞和雙核(圖5t)細胞內。RKI、DNP和ROT不顯著影響F-肌動蛋白形貌(圖5k_m)。RKI處理的細胞不顯 示有限的膜皺褶和降低的在細胞的中心區域中的毒傘素染色(圖5c)。用DNP(圖5q)和 ROT(圖5r)處理M小時的細胞的融合度低于對照物的融合度(圖5η)。在ROT處理的細 胞中的顯著核碎裂表明凋亡的引發(圖5w)。這些形貌變化可人工地在這些圖像中確認，而 自動化定量HTP分析將需要復雜的分析算法。為了進一步確定化合物降低組織力的基礎(underling)機理，使用生物染料四甲 基羅丹明乙酯(TMRE)定量線粒體電位的變化。TMRE為陽離子型，并作為MMP的函數而積聚 在線粒體中。在96孔板中的DNP處理的單層和HTCs的最初研究顯示在板閱讀器上在單層 中無法檢測到DNP介導的TMRE標記的降低(圖6a)，但在HTCs中易于量化(圖6b)。使用 共焦顯微學對DNP對TMRE積聚的影響的更詳細研究改進了在單層和HTCs兩者中的信號檢 測(圖6c，d)。然而，HTC實驗仍然顯示比細胞單層實驗更優越的在檢測通過DNP的劑量依 賴MMP降低上的靈敏度。考慮到信號檢測的優越靈敏度、改進的數據信噪比和板閱讀器掃描對HTP應用的兼容性，發明人使用HTCs用于研究化合物對MMP的效應。DNP處理3小時解偶聯MMP并劑量依賴地降低TMRE信號(圖6e)，且EC5tl 340 μ Μ。 培養另外21小時僅略微增大DNP的效應并將EC5tl進一步降低至 95 μ M(圖6f)。該通過 24小時處理將TMRE EC50降低3. 6倍顯著小于DNP的EC5tl的65倍降低對組織力的影響(圖 5f，g)。該差異表明DNP的快速MMP解偶聯導致細胞收縮活性的逐漸降低。由于肌動蛋白 聚合和肌球蛋白依賴的細胞收縮需要ATP，預期MMP的快速損失將降低線粒體中ATP的生 成，并因此降低細胞收縮性。該細胞力的時間延遲降低表明細胞內ATP儲備的存在和/或細 胞上調糖酵解以生成ATP的能力。經由糖酵解上調ATP生成已經在腫瘤細胞和一些細胞系 中報導。⑶、RKI和ROT處理降低了線粒體膜電位，但它們降低MMP的程度局限于10-20% (圖 6e，f)。最后，為了測量化合物對細胞生存能力的效應，進行使用3-(4，5-二甲基噻 唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴化物(MTT)的試驗。在細胞中，通過琥珀酸脫氫酶將黃色 MTT轉化為紫色甲臜，該變化可通過在500-600納米之間的吸光度定量，所述吸光度使用 板閱讀器定量記錄。處理3小時不會導致生存能力的顯著損失，如MTT試驗所測得(結果 未顯示)。⑶和ROT處理M小時顯示HTCs的生存能力的劑量依賴降低(圖7a)。0.2和 2μΜ CD處理將MTT信號降低40%。CD毒性的觀察水平類似于報導的人類表皮樣細胞系中 的5-30 μ M的LD5Q。需要更高的ROT濃度，10 μ M以將MTT信號降低40% (圖7a)。該ROT 毒性水平略高于先前報道的在HepG2細胞中的25%毒性。RKI和DNP處理M小時不影響 MTT信號。HTC力測量、TMRE定量和MMT試驗在相同的HTC樣品上進行。完整篩選工作流程圖 (圖7b)顯示了使用HTCs獲得高含量生理學信息的效率。結果總結為表示化合物的生理學 影響的表型圖線板(圖7c-f)。DNP、⑶和RKI對于降低HTC力都非常有效。然而，DNP顯 示線粒體電位的大量解偶聯效應(圖7c)，而CD是高度毒性的(圖7d)。在另一方面，ROT 對HTC力、線粒體電位和生存能力具有中等負影響(圖7f)。RKI確定為最佳候選化合物，其 具有0. ΙμΜ的力降低EC5tl和有限的線粒體和生存能力毒性。該結果并不令人驚訝，因為公 知RKIs為可有效降低組織剛度的心臟保護的非毒性化合物。此外，最近RKI藥物!^sudil 已完成用于動脈粥樣硬化和高膽固醇血癥的第II階段臨床研究。總之，發明人已說明HTCs可如何用于篩選可降低組織收縮力并仍然對線粒體功 能和細胞生存能力具有最小影響的化合物。使用該HTC基篩選體系，發明人能夠研究細胞 生理學并在比二維培養更天然的微環境(即埋入三維基體結構)中定量機械力。此外，在HTCs中細胞的緊密和多層排列大大增加了熒光試驗的檢測極限和信噪 比。具有0. 44至0. 85的Z因子的所述試驗的高準確度和穩健性(robustness)將有利于 HTCs引入現有的HTP篩選工作流程。總之，發明人提供了使用三維組織模型用于進行細胞基試驗的高通量體系。認為 前述描述僅為本發明原理的說明。此外，由于本領域技術人員易于想到許多改變和變化，其 不旨在將本發明限制為所顯示和描述的精確的結構和操作，因此，認為所有的改變和等同 形式落入本發明的范圍內。
權利要求
1.一種檢測組織對試劑的響應的方法，該方法包括(a)使生物人工組織與試劑接觸，所述生物人工組織包含細胞和細胞外基質，該生物 人工組織在支架支撐上形成而不使用促進組織粘合的持著器，所述支架支撐位于孔底部以 上，(b)使用所述生物人工組織進行試驗，其中所述試驗產生指示劑；以及(c)檢測孔中的指示劑水平，其中該指示劑水平表示生物人工組織對試劑的響應。
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述細胞選自肌細胞、非肌細胞、內皮細胞或心臟 細胞。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其中所述孔位于多孔板內。
4.根據權利要求3所述的方法，其中所述多孔板包含2至10，000個孔。
5.根據權利要求1-2任一項所述的方法，其中所述支架支撐為線框。
6.根據權利要求5所述的方法，其中所述線為不銹鋼線。
7.根據權利要求1-6任一項所述的方法，其中所述細胞包括已知的參與疾病的細胞。
8.根據權利要求1-7任一項所述的方法，其中所述指示劑為比色指示劑或熒光指示劑。
9.根據權利要求1-8任一項所述的方法，其中所述指示劑水平使用顯微鏡進行檢測。
10.根據權利要求1-7任一項所述的方法，其中所述指示劑為放射性標記。
11.根據權利要求10所述的方法，其中所述指示劑水平使用閃爍器進行檢測。
12.根據權利要求1-11任一項所述的方法，其中所述指示劑水平使用多孔板閱讀器進 行檢測。
13.根據權利要求1-12任一項所述的方法，其中所述試驗選自細胞增殖試驗、細胞死 亡試驗、凋亡試驗、蛋白質表達試驗、基因表達試驗、酶試驗或細胞信號試驗。
14.根據權利要求1-13任一項所述的方法，其中所述試劑為候選藥物。
15.根據權利要求1-14任一項所述的方法，其中所述方法為高通量篩選方法。
全文摘要
本發明提供了通過進行使用三維生物人工組織的試驗檢測生物人工組織對試劑的響應的方法。所述方法適用于高通量平臺。
文檔編號C12M1/18GK102099458SQ200980128485
公開日2011年6月15日 申請日期2009年6月5日 優先權日2008年6月5日
發明者若槻哲郎 申請人:威斯康星醫學院公司