細胞分化方法及其在血管建立中的應用的制作方法

專利名稱：細胞分化方法及其在血管建立中的應用的制作方法
細胞分化方法及其在血管建立中的應用本發明涉及細胞分化方法及其在血管建立中的應用。本發明還涉及特定氧濃度用 于實施細胞分化方法的用途。在發育生物學中，細胞分化是指特化性較低的細胞變成特化性較高的細胞類型的 過程。在多細胞生物體發育過程中，隨著生物體從單個受精卵變成組織和細胞類型的復雜 系統，會發生多次分化。分化也是成體中的常見過程在組織修復和正常細胞周轉過程中， 成年干細胞分裂并產生完全分化的子代細胞。細胞分化引起細胞的大小、形狀、極性、代謝 活性和對信號的響應性的顯著改變。這些改變很大程度上是由于基因表達的高度受控的修 飾造成的。除了幾個例外以外，細胞分化幾乎從不涉及DNA序列本身的變化。因此，不同的 細胞可以具有差別非常大的物理性質，雖然它們具有相同的基因組。能夠分化成很多細胞類型的細胞稱作多能的(pluripotent)。這些細胞在動物中 被稱為干細胞。能夠分化成所有細胞類型的細胞稱作全能的。在哺乳動物中，只有受精卵 和早期胚胎細胞是全能的。當精子和卵子發生受精作用并產生具有形成完整生物體的潛力的單個細胞時，發 育開始。在受精后的前幾個小時，該細胞分裂成相同的細胞。在人類中，在受精后大約4天 和細胞分裂數個循環之后，這些細胞開始特化(specialize)，形成細胞的空心球體，稱為胚 泡。胚泡具有外層細胞，在空心球內有稱作內細胞團(inner cell mass)的細胞簇。內細 胞團的細胞將繼續形成最終的人體的所有組織。雖然內細胞團的細胞最終可以形成人體中 發現的每種類型的細胞，但是它們不能形成生物體。這些細胞被稱作多能的。多能(pluripotent)干細胞經過進一步的特化成為多潛能(multipotent)祖細 胞，然后，多潛能祖細胞產生功能細胞。干細胞和祖細胞的實例包括 來自骨髓的造血干細胞(成年干細胞)，其產生紅細胞、白細胞和血小板； 來自骨髓的間充質干細胞(成年干細胞)，其產生基質細胞、脂肪細胞和多種類 型的骨細胞； 上皮干細胞(祖細胞)，其產生多種類型的皮膚細胞； 肌衛星細胞(祖細胞)，其促成分化的肌肉組織。生物體中每種特化的細胞類型表達構成該物種的基因組的所有基因的亞集。每種 細胞類型由受調節的基因表達的特定模式所定義。因此，細胞分化是細胞從一種細胞類型 到另一種類型的轉化，其涉及從一種基因表達模式到另一種的轉換。一些進化上保守類型 的分子過程通常參與控制這些轉換的細胞機制。控制細胞分化的主要類型的分子過程涉及 信號傳導。在控制細胞分化過程中將信息從一個細胞傳遞到另一個細胞的很多信號分子被 稱為生長因子。另一個重要的策略是使親代細胞內的分子分化控制信號不平均地分配。胞 質分裂之后，此類細胞內分化控制信號的數量在子代細胞中是不平均的，這種不平均會導 致不同子代細胞的分化的不同模式。廣泛研究的實例是果蠅中的身體軸線模式的研究。RNA 分子是一種重要的細胞內分化控制信號。體外擴增，即增殖，以及分化過程在本領域中已進行了深入研究。尤其是用于富集 造血干細胞的造血干細胞增殖培養條件是熟知的。
例如，WO 2007/049096公開了擴增造血干細胞并允許其向內皮細胞分化的方法。 該方法包括在特定培養基中體外培養干細胞，其中所述干細胞附著到允許/增強其向內皮 細胞分化的載體上。此外，該文獻未提及使用CD34-陽性抗原純化的干細胞可以提供除了內皮細胞之 外的其它附著細胞。所以，雖然科學家對于分化過程的了解越來越多，但是細胞分化的機理和命運仍 待闡明。此外，本領域中尚無文獻報道允許從干細胞向分化的細胞分化的方法或特定條件 的使用，其中所述分化的細胞在天然生物學過程中不是衍生自所述干細胞。需要提供一種簡單的、獨特的或準獨特的程序以使干細胞分化為所有想要的分化 的細胞。該需求對于手術治療和處理與分化過程改變相關的病癥、或損傷后器官重建是特 別重要的。尤其重要的是提供工程化組織(例如血管)以治療患有心血管病或血管疾病(例 如栓塞、中風)的個體。所有的血管都具有相同的基礎結構。從內至外有三個層·內膜(最薄的層)通過多糖細胞間基質粘合在一起的單層的簡單磷狀內皮細 胞，周圍是內皮下結締組織的薄層，交錯著很多循環排列的彈性帶(稱為內彈力膜)。·中膜(最厚的層)循環排列的彈性纖維、結締組織、多糖物質，第二層和第三層 被另一個厚的彈性帶(稱作外彈力膜)分開。中膜(尤其是動脈中的中膜)可以富含血管 平滑肌，其控制管徑。 外膜完全由結締組織構成。它還包含提供肌肉層的神經，以及更大的血管中的 營養毛細血管(血管滋養管)。現有技術中公開了一些在體外產生血管的方法WO 2005/003317公開了使用分化的平滑肌細胞和內皮細胞在體外建立血管的方 法。此外，該文獻還公開了通過使用平滑肌細胞的干細胞(或祖細胞)和內皮細胞的干細 胞(或祖細胞)在體外建立血管。該文獻還公開了允許形成功能性的、可移植的、“工程化的”血管的基質。在該文獻的方法中，雖然公開了血管是可移植的，但是需要收集兩種類型的干細 胞用于構建血管。所以，該方法的缺點在于實施重要的侵入性手術來收集可用的細胞。WO 2006/099372公開了使用允許隱靜脈純化的內皮細胞或純化的內皮干細胞附 著的基質產生血管的方法。該文獻中公開的方法允許形成管狀基質，其中植入內皮細胞以 建立血管。但是，該文獻沒有提及體外產生的血管的可移植性。L，Heureux 等人在兩篇文獻[FASEB journal, vol 12，pp 47-56(1998) ；FASEB journal, vol 15，pp 515-524(2001)]中公開了使用分離自健康新生兒供體的臍帶的內皮 細胞和平滑肌細胞在體外生產血管的方法。在這些文獻中，作者公開了功能性血管的產生， 其能夠具有收縮特性。最近，1，Heureux等人.[Nat. Med. , 12 (3)March, pp 361-364(2006)]公開了皮膚衍生的纖維原細胞用于形成載體的用途，其中平滑肌細胞和內皮細胞能夠附著于所述載體 上以形成新的血管。這三篇文獻中公開的方法允許在體外使用工程化的血管，但是，所使用的細胞的 來源嚴重降低了移植所述工程化的血管的可能性，并增大了移植物排斥的可能性。本發明提供了獨特的、易于使用的和迅速的使單個干細胞分化的方法。本發明還提供了用于干細胞分化并且根據條件產生不同的分化的干細胞的培養基。本發明還提供了使用單一類型的干細胞制備血管的方法。所述血管是功能性的并 且易于向提供干細胞的個體移植，而無移植物排斥。本發明涉及特定氧濃度用于實施使衍生自骨髓或血液或脂肪組織或臍帶的干細 胞分化的體外方法的用途，條件是所述干細胞不是人類胚胎干細胞并且植于合適的培養基 中的載體上，其中所述分化-在含氧量正常條件下并在合適的培養基中產生第一組特化分化的細胞，和-或，在低氧條件下產生第二組特化分化的細胞，其處于與用于獲得第一組特化分 化的細胞的培養基性質相同的培養基中，其中所述低氧條件不同于缺氧(anoxia)，所述第一和第二組特化分化的細胞保留通過天然生物學過程獲得的各自相對應 的特化分化的細胞的功能特性，所述第一組特化分化的細胞具有與所述第二組特化分化的細胞不同的細胞功能 特性。本發明涉及特定氧濃度用于實施使衍生自骨髓或血液或脂肪組織或臍帶的干細 胞分化的方法、優選體外方法的用途，條件是所述干細胞不是人類胚胎干細胞并且植于合 適的培養基中的載體上，其中所述分化-在含氧量正常條件下并在合適的培養基中產生第一組特化分化的細胞，-或，在低氧條件下產生第二組特化分化的細胞，其處于與用于獲得第一組特化分 化的細胞的培養基性質相同的培養基中，所述第一和第二組特化分化的細胞保留通過天然生物學過程獲得的各自相對應 的特化分化的細胞的功能特性。本發明源于以下出人預料的發現當把干細胞植于允許其增殖的培養基中的載體 (如下文所述)上時，可以根據特定的培養基氧濃度分化成兩種不同的分化的細胞。本發明的“分化”公開了這樣的方法，其在于將未成熟的細胞“轉化”為很多不同 的成熟細胞。細胞分化是指這樣的過程，通過該過程，特化性較低的細胞變成特化性較高的細 胞類型。細胞命運決定是細胞沿著指定的細胞分化途徑的程序設定。通常，以細胞的末端 分化狀態來討論細胞。在發育過程中，可以在某些時間指定一些少數細胞的命運。當提及 發育命運或細胞命運時，人們談論的是該細胞以及在發育中該點之后它的后代所發生的所 有事件。細胞定向為某個狀態的過程可以分成兩個階段特化(specification)和決定 (determination)。特化不是持久時期，基于不同的指令，細胞可以被逆轉。相反，決定是指細胞不可逆地定向為特定命運。該過程受到細胞外環境和細胞基因組內容的作用的影響。 決定在顯微鏡下是不可見的，當細胞變成決定的時，它們不改變其外觀。決定之后是分化， 生物化學、結構和功能上的實際變化，這些變化導致產生不同類型的細胞。分化可以包括外 觀以及功能上的變化。細胞定向的狀態也稱作其發育潛力。當發育潛力小于或等于發育命運時，細胞顯 示出嵌合體行為(mosaic behavior)。當發育潛力大于發育命運時，細胞顯示出調控行為 (regulative behavior)0細胞分化還與有限的細胞增殖相關。的確，在發育過程中，在特定的條件下，干細 胞能夠被“動員”以進行干細胞庫的自我更新。然后干細胞增殖并根據有絲分裂過程分裂， 這允許親代細胞精確地分裂為含有相同DNA含量、相同形態和生物學及生物化學特性的兩 個子代細胞。當干細胞決定分化時，分化過程通過有限的有絲分裂過程開始，所述有絲分裂過 程包含至少兩次分裂，但是子代細胞在這些有限分裂過程中，逐漸獲得那些它們將在分化 過程末端具有的特定特征。所以，在包含生物體或器官的干細胞庫的干細胞小生境中，存在自我更新和分化 之間的平衡。根據本發明的方法優選在體外實施，意思是細胞優選在其所衍生而來的生物體之 外進行分化。在本發明中，干細胞定義為能夠分化成多種特化的細胞類型的細胞的細胞。根據 本發明，這些干細胞定義為，它們具有分化的本性，分化為一(單能)或雙(雙能)至η(多 潛能)分化的細胞，η大于2。本發明涉及多能細胞，其是全能細胞的子代。在多細胞生物體中，從雄性和雌性配 子融合而來的全能細胞能夠分化成構成生物體的所有細胞。這種全能細胞的第一次分裂 (有絲分裂)產生一些多能細胞。這些多能細胞已經獲得特化，并且已經喪失了產生所有的 分化細胞的能力。因此，根據本發明的干細胞涉及多能的(pluripotent)、多潛能的(multipotent)、 雙能的和單能的細胞。在本發明中，可以使用胚胎干細胞(ESC)，其對應于從雄性和雌性配 子融合而來的細胞。在一個具體實施方式
中，來自人的胚胎干細胞“人類胚胎干細胞”(HESC)被排除在 實施本發明方法的用途之外。所以，在該具體實施方式
中，干細胞涉及所有的動物干細胞， 條件是所述干細胞不是人類胚胎干細胞。根據本發明，術語“衍生自血液或骨髓或脂肪組織或臍帶的干細胞”意思是該干 細胞分離自相應的組織，即血液或骨髓或脂肪組織或臍帶，尤其是渥頓氏胨膠(Wharton’ s jelly)ο在血液中，干細胞占總的單核細胞的0. 01 %至0. 0001 % [S. S. Khan, Μ. A. Solomon, J. P. McCoy Jr, Cytometry B Clin. Cytom. 2005，64，1]。在經典方法中，通 過例如密度梯度分離法，將單核細胞與無核細胞即紅細胞分開。本領域已知的其它方法 經常用于分離單核細胞。這種梯度導致在密度梯度的界面處形成包含單核細胞的環。這 些“白細胞”可以在體外培養于補充了允許內皮細胞增殖的生長因子的合適的培養基中[T. Asahara, T. Murohara, A. Sullivan, Μ. Silver, R. van derZee, Τ.Li, B. Witzenbichler, G. Schatteman, J. Μ. Isner, Science 1997，275,964.]。當在體外培養時，從血液中提取的造 血干細胞具有與載體結合的性質，可以通過除掉未結合的細胞容易地將其從其它白細胞中 純化出來。血液中還含有所有的能夠循環的干細胞。例如，血液還含有間充質干細胞。在本發明中，血液是指外周血和胎盤血。通常，胎盤血是從臍帶獲得的。在本發明 中，胎盤血也稱作臍帶血。另外，本發明涉及組織和器官中包含的血液。在骨髓中存在三種類型的干細胞造血干細胞、間充質干細胞。造血干細胞是能夠分化成所有的循環的白細胞(例如紅細胞、巨噬細胞、單核細 胞等)的多潛能干細胞。間充質干細胞是能夠分化成所有的器官細胞(即成骨細胞、軟骨細胞、肌細胞或 脂肪細胞等)的多潛能細胞。在脂肪組織中，干細胞也稱作脂肪組織衍生的干細胞，其能夠分化成幾種分化的 細胞，例如內皮細胞。在臍帶中，渥頓氏胨膠是臍帶內的凝膠狀物質，由大量的粘多糖(透明質酸和硫 酸軟骨素)構成，其包含(除了其它細胞之外)成年干細胞，尤其是間充質干細胞。“合適的培養基”意思是包含培養的細胞存活所需的營養物的培養基。這種培養基 具有通常的PH、葡萄糖濃度、生長因子和對于體外細胞存活特異性的營養物組成。用于補充培養基的生長因子通常衍生自動物血液，例如牛血清。此外，可以加入重 組特異性生長因子以特異性地啟動特定細胞過程，例如增殖、分化等。“植于”在本發明中定義為細胞沉積在載體上并允許附著到所述載體上。其是本 領域中的通常做法，術語“植于”涉及體外培養細胞，其是技術人員通常使用并理解的。在動物中，一些細胞自然生長而不附著到表面，例如存在于血流中的細胞。其它細 胞需要表面，例如衍生自固體組織的多數細胞。這些粘附細胞可以在組織培養塑料上生長， 可以使用細胞外基質成分包被所述組織培養塑料以增加其粘附性質，并提供生長所需的其 它信號。根據本發明，“特化分化的細胞”意思是這些細胞已經分化至末端過程，并且已經 獲得了完全的特化功能。在這個分化過程中，從干細胞開始，細胞逐漸獲得特定特征和功 能，此外逐漸喪失了分化成不同細胞的能力。在分化過程在最后步驟，特化分化的細胞能夠 實施具體功能(例如分泌激素、肌肉收縮性等)并仍然保持能夠倒退至分化過程。所以，它 們在功能上是特化的，并且是分化的。根據本發明，“含氧量正常條件”是指環境中的正常氧氣濃度。“含氧量正常”與“含 氧量正常條件”相關，是指地球上存在的空氣的天然組成。本發明中環境空氣定義為，環境例如房間、盒子、溫育箱等中包含的空氣。地球上 氧氣的濃度通常是大約21 %，但是根據海拔和溫度變化。所以，環境空氣取決于做實驗的位置。根據本發明，“低氧條件”是指低于“含氧量正常條件”的異常的氧氣濃度。“低氧” 與“低氧條件”相關，其對應于大大低于天然濃度的氧濃度。低氧在病理學上與窒息以及所 有受到環境空氣中低水平氧氣加劇或誘導的病癥相關。低氧的最終狀態是完全不存在02，這對應于缺氧。根據本發明的低氧條件不同于缺氧，即總是存在02，即使其濃度非常低。例 如在本發明中，低氧對應于定義為0. 氧氣至12%氧氣范圍內的低氧濃度。通常，細胞生物學領域技術人員會通過添加已知濃度的(X)2來調節溫育箱的氣體 含量。的確，培養的細胞通常生長于包含2%-15% CO2的空氣中。最佳的CO2濃度取決于 每個細胞以提供增殖和/或其它細胞過程的最佳條件。然后，通過人工的空氣組成和特定的設備，研究氧氣影響的技術人員能夠獲得優 選的含氧培養空氣。根據本發明，術語“保留通過天然生物學過程獲得的各自相對應的特化分化的細 胞的功能特性的特化分化的細胞”意思是通過本發明的方法獲得的特化分化的細胞是與取 自動物的細胞實質上相同的細胞。例如，如果本發明的方法允許干細胞分化成特化分化的肌細胞，則獲得的肌細胞 將能夠具有收縮性，以按照與從動物提取的肌細胞相同的方式產生細胞外基質。同樣地，本發明中“具有與第二組特化分化的細胞不同的細胞功能特性的第一組 特化分化的細胞”意思是在含氧量正常條件下通過分化方法獲得的分化細胞在功能上不同 于在缺氧條件下通過分化方法獲得的細胞。例如，如果在低氧條件下細胞分化成有收縮性 的細胞，則在含氧量正常條件下相同的細胞將分化成具有不同于收縮性的功能的細胞。技術人員可以通過目檢(細胞形態的差異)、特定顏色情況(確定的分化細胞的特 定顏色情況)或通過使用本領域已知的任何允許例如鑒定膜標志物的方法(所述膜標志物 對于確定的分化細胞是特異性的)容易地確定兩組特化分化的細胞之間的差異。本發明還涉及兩種具有特定氧濃度的培養基的二元組用于干細胞分化、優選體外 分化的用途，所述每種特定氧濃度的培養基對應于具有特定氧濃度的培養基，所述干細胞 源自骨髓或血液或脂肪組織，條件是所述干細胞不是人類胚胎干細胞并且植于載體上，所 述分化分別-通過在含氧量正常條件下在培養基中的載體上培養所述干細胞獲得第一組特化 分化的細胞，和-通過在低氧條件下在與用于獲得第一組特化分化的細胞的培養基性質相同的培 養基中的載體上培養所述干細胞獲得第二組特化分化的細胞，其中所述低氧條件不同于缺 氧，所述第一和第二組特化分化的細胞保留通過天然生物學過程獲得的各自相對應 的特化分化的細胞的功能特性，所述第一組特化分化的細胞具有與所述第二組特化分化的細胞不同的細胞功能 特性。所以本發明涉及包含兩種具有特定氧濃度的培養基的組的用途，所述組包含-兩種培養基，其具有細胞增殖和分化必需的營養物和生長因子，-兩個容納器或表面，其能夠包含每種培養基，在所述容納器或表面中沉積允許細 胞附著的載體。所述兩種培養基的區別僅在于環境中氧的濃度不同。第一種具有特定氧濃度的培養基含有如上文定義的正常氧濃度，并且第二種具有 特定氧濃度的培養基含有低氧濃度。
詞語“特定氧濃度”意思是二元組中包含的特定氧濃度的培養基中所含的氧濃度 是已知的、測定的并且是受控的，以便獲得含氧量正常的條件或低氧條件。根據本發明，第一種具有特定氧濃度的培養基被置于正常氧濃度，并且提供從干 細胞進行細胞分化為第一組特化分化的細胞所需的所有細胞。根據本發明，第二種具有特定氧濃度的培養基被置于低氧濃度，并且提供從與第 一種特定氧濃度培養基中所用的相同干細胞進行細胞分化為第二組特化分化的細胞所需 的所有細胞，所述第一和第二組特化分化的干細胞以彼此不同的特定功能進行特化。術語“載體”意思是允許細胞附著的任何生物學或化學分子或聚合物。術語“表面”定義了可被上述載體涵蓋的任何容納器或容器，并易于盛裝液體。因此，當使用本發明的二元組時，根據本發明的和如上所定義的干細胞被植于沉 積在表面上的載體上，所述表面被包含營養物和生長因子的營養培養基覆蓋。然后，將附著 于沉積在表面上的載體上的第一部分干細胞置于含氧量正常條件下并允許其分化成第一 組特化分化的細胞，所述表面被包含營養物和生長因子的營養培養基覆蓋；并且將附著于 沉積在表面上的載體上的剩余部分的干細胞置于低氧條件下并允許其分化成第二組特化 分化的細胞，所述表面被包含營養物和生長因子的營養培養基覆蓋。使用根據本發明的特定氧濃度的二元組的結果是，僅有一組如上文定義的干細胞 可以提供兩種不同的特化分化的細胞，所述細胞保持分離自動物的對應細胞的天然特性。在一個有利的實施方式中，本發明涉及如上文定義的用途，其中含氧量正常的條 件是指，環境空氣中的氧濃度是，總環境氣體的13 %至21 %摩爾含量/體積(mc/v)，優選是 總環境氣體的15%至20%摩爾含量/體積(mc/v)。含氧量正常的條件對應于地球大氣中含有的天然氧濃度并且與生命相容。地球 大氣是環繞地球行星的氣體層，其被地球重力所保持。其大約含有(按摩爾含量/體積 計)78. 08%氮氣、20. 95%氧氣、0. 93%氬氣、0. 038%二氧化碳、痕量的其它氣體，和數量可 變的(平均大約1%)的水蒸汽。氧氣濃度隨著壓力和溫度而變化，本領域普遍接受的是空氣中氧氣濃度是 21+/-1%。體外細胞培養物的天然氧濃度是大約20%。但是，哺乳動物組織中觀察到的天然氧濃度低于環境空氣中的濃度。所以，本領域 技術人員通常通過使用人工的和已知的氣體組合物調節細胞培養物的氧濃度。所以，在細胞生物學中，可以在含有較低氧氣的空氣中培養細胞或細胞系，例如， 含有15%的氧氣。雖然這些條件與空氣中的天然氧濃度不同，但是其與正常細胞增殖是相 容的，不會誘導主要的細胞變化，例如細胞調亡或轉化。所以，在細胞生物學中，15%+/-2% 的氧(取決于測定儀器的精確性)對應于含氧量正常的條件。在另一個有利的實施方式中，本發明涉及如上文定義的用途，其中低氧條件是指， 環境空氣中的氧濃度是，總環境氣體的2%至12%摩爾含量/體積(mc/v)，優選是總環境氣 體的3%至8%摩爾含量/體積(mc/v)，更優選是總環境氣體的4%至6%摩爾含量/體積 (mc/ν) ο如上文所定義，對應于低氧濃度的低氧在本發明中也稱作低氧條件，其定義為2 % 的氧氣至12%的氧氣的范圍。在低于摩爾含量/體積的氧氣時，細胞不能正常地存活并且會通過壞死而死亡(急性低氧)。高于12%時，氧濃度是足夠的，條件變成含氧量正常。在另一個有利的實施方式中，本發明涉及如上文定義的用途，其中所述載體包含 或由下列組成-白明膠、纖連蛋白、膠原、層粘蛋白、RGD肽或其組合，或-聚電解質多層，優選是聚陽離子和聚陰離子，優選是交替物，-所述聚陽離子選自聚烯丙胺(PAH)，聚乙烯亞胺(PEI)，聚乙烯胺，聚氨基酰胺 (PAMAM)，聚丙烯酰胺(PAAm)，聚二甲基二烯丙基氯化銨(PDAC)，帶正電的多肽、例如聚賴 氨酸，以及帶負電的多糖、例如殼聚糖，并且-所述聚陰離子選自聚丙烯酸(PAA)，聚甲基丙烯酸(PMA)，聚苯乙烯磺酸(PSS或 SPS)，帶負電的多肽、例如聚谷氨酸和聚天冬氨酸，以及帶負電的多糖、例如透明質酸鹽和 藻酸鹽，-優選地選自(PAH-PSS)3、(PAH-PSS) 3_PAH 和 PEI- (PSS-PAH) 3，所述載體沉積于表面上。根據本發明，將干細胞植于允許細胞附著的載體上。所述載體可以是人工載體，其模擬或部分再現每個細胞所附著的細胞外基質。所以載體可以由一種或多種細胞外基質成分的重組組合物構成。細胞外基質(ECM)是動物組織的細胞外部分，其通常向細胞提供結構支持，另外 實施多種其它重要功能。細胞外基質是動物中的結締組織的特征。ECM的成分是由駐留細 胞在細胞內產生的，并且分泌到ECM中。一旦被分泌，它們將與已有的基質聚集。ECM由纖 維蛋白和糖胺聚糖(GAG)的聯鎖網構成。ECM中包含的纖維蛋白有膠原，其是ECM中最豐 富的糖蛋白；纖連蛋白，其是連接細胞與膠原纖維的蛋白；彈性蛋白，其為組織產生彈性； 和層粘蛋白。這些分子上的細胞粘附在本領域已有深入報道膠原[H. Itoh, Y. Aso, M. Furuse, Y. Noishiki, T. Miyata, Artif. Organs,25,213,2001],纖連蛋白[A. Rademacher， M.Paulitschke, R.Meyer, R. Hetzer, Int. J. Artif. Organs, 24, 235, 2001],層粘蛋白 [A. Sank, K. Rostami, F. Weaver, D. Ertl, Α. Yellin, Μ. Nimni, Τ. L. Tuan. Am. J. Surg. 164, 199，1992]，白明膠[J.S.Budd，P. R. Bell, R. F. James. Br. J. Surg. 76，1259，1989]。纖連蛋 白是迄今為止最有效的增強細胞附著、分散和保持的蛋白。所以，其中植入了干細胞的載體包含或由下列組成纖連蛋白、膠原或層粘蛋白。 其它分子例如白明膠或RGD肽也可構成載體。RGD肽對應于三肽精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸。在本發明中，詞語“白明膠、纖連蛋白、膠原、層粘蛋白、RGD肽或其組合”意思是載 體可以包含上述分子中的一種或這些成分中至少兩種的組合，或由上述分子中的一種或這 些成分中至少兩種的組合組成。可用于本發明的所有成分顯示于下表1
權利要求
1.特定氧濃度用于實施使衍生自骨髓或血液或脂肪組織或臍帶的干細胞分化的體外 方法的用途，條件是所述干細胞不是人類胚胎干細胞并且植于合適的培養基中的載體上， 其中所述分化-在含氧量正常條件下并在合適的培養基中產生第一組特化分化的細胞，和 -在低氧條件下產生第二組特化分化的細胞，其處于與用于獲得第一組特化分化的細 胞的培養基性質相同的培養基中，其中所述低氧條件不同于缺氧，所述第一和第二組特化分化的細胞保留通過天然生物學過程獲得的各自相對應的特 化分化的細胞的功能特性，所述第一組特化分化的細胞具有與所述第二組特化分化的細胞不同的細胞功能特性。
2.兩種具有特定氧濃度的培養基的二元組用于干細胞分化、優選體外分化的用途，所 述每種特定氧濃度的培養基對應于具有特定氧濃度的培養基，所述干細胞源自骨髓或血液 或脂肪組織或臍帶，條件是所述成年干細胞不是人類胚胎干細胞并且植于載體上，所述分 化分別-通過在含氧量正常條件下在培養基中的載體上培養所述干細胞獲得第一組特化分化 的細胞，和-通過在低氧條件下在與用于獲得第一組特化分化的細胞的培養基性質相同的培養基 中的載體上培養所述干細胞獲得第二組特化分化的細胞，其中所述低氧條件不同于缺氧，所述第一和第二組特化分化的細胞保留通過天然生物學過程獲得的各自相對應的特 化分化的細胞的功能特性，所述第一組特化分化的細胞具有與所述第二組特化分化的細胞不同的細胞功能特性。
3.根據權利要求1或2的用途，其中所述含氧量正常的條件是指，環境空氣中的氧濃度 是，總環境氣體的13%至21%摩爾含量/體積(mc/v)，優選是總環境氣體的15%至20%摩 爾含量/體積(mc/v)；并且其中所述低氧條件是指，環境空氣中的氧濃度是，總環境氣體的2%至12%摩爾含量/ 體積(mc/v)，優選是總環境氣體的3%至8%摩爾含量/體積(mc/v)，更優選是總環境氣體 的4%至6%摩爾含量/體積(mc/v)。
4.根據權利要求1至3任一項的用途，其中所述載體包含或由下列組成 -白明膠、纖連蛋白、膠原、層粘蛋白、RGD肽或其組合，或-聚電解質多層，優選是聚陽離子和聚陰離子，優選是交替物，-所述聚陽離子選自聚烯丙胺(PAH)，聚乙烯亞胺(PEI)，聚乙烯胺，聚氨基酰胺 (PAMAM)，聚丙烯酰胺(PAAm)，聚二甲基二烯丙基氯化銨(PDAC)，帶正電的多肽、例如聚賴 氨酸，以及帶負電的多糖、例如殼聚糖，并且-所述聚陰離子選自聚丙烯酸(PAA)，聚甲基丙烯酸(PMA)，聚苯乙烯磺酸(PSS或 SPS)，帶負電的多肽、例如聚谷氨酸和聚天冬氨酸，以及帶負電的多糖、例如透明質酸鹽和 藻酸鹽，-優選地選自(PAH-PSQ 3、(PAH-PSS) 3_PAH 和 PEI- (PSS-PAH) 3， 其中聚電解質層的層數是1至100，優選為3至50，更優選為5至10，特別是7， 所述載體沉積于表面上，優選地所述表面是天然或人工表面，更優選地 -所述人工表面選自玻璃、TCPS(細胞培養物處理的聚苯乙烯)、聚硅氧烷、全氟烴基聚醚、生物相容性聚合物尤其是Daenm 、聚氨酯、聚甲基硅氧烷、聚氯乙烯、Silastie 、膨 體聚四氟乙烯(ePTFE)和任何用于假體和/或植入系統的材料，-所述天然表面選自血管、靜脈、心臟、小腸粘膜下層、動脈、優選脫細胞的臍帶動脈，所 述血管、靜脈、動脈來自人類器官。
5.根據權利要求1至4任一項的用途，其中所述干細胞選自間充質干細胞(MSC)和造 血干細胞(HSC)。
6.根據權利要求1至5任一項的用途，其中所述第一和第二組特化分化的細胞由選自 內皮細胞和平滑肌細胞的細胞組成，并且其中，所述第一組特化分化的細胞由內皮細胞組 成，并且所述第二組特化分化的細胞由平滑肌細胞組成。
7.具有特定氧濃度的培養基，其包含 -合適的培養基，并且-所述培養基中的氧氣的濃度是，總氣體的2%至12%摩爾含量/體積(mc/v)，優選是 總氣體的3%至8%摩爾含量/體積(mc/v)，更優選是總氣體的4%至6%摩爾含量/體積 (mc/ν),優選地，所述具有特定氧濃度的培養基與沉積于表面上的載體聯合。
8.具有特定氧濃度的培養基，其包含 -合適的培養基，-所述培養基中的氧氣的濃度是，總環境氣體的13%至21%摩爾含量/體積(mc/v)， 優選是總環境氣體的15%至20%摩爾含量/體積(mc/v)， -與沉積于表面上的載體聯合。
9.兩種具有特定氧濃度的培養基的二元組，所述每種具有特定氧濃度的培養基對應于 合適的培養基和特定的氧濃度，所述二元組包含-合適的培養基，所述培養基中的氧濃度是，總環境氣體的2%至12%摩爾含量/體積 (mc/v)，優選是總環境氣體的3%至8%摩爾含量/體積(mc/v)，更優選是總環境氣體的 4%至6%摩爾含量/體積(mc/v)，所述培養基與沉積于表面的載體聯合，和-合適的培養基，所述培養基中的氧濃度是，總環境氣體的13%至21%摩爾含量/體積 (mc/v)，所述培養基與沉積于表面的載體聯合。
10.根據權利要求7或8的具有特定氧濃度的培養基，或根據權利要求9的兩種具有特 定氧濃度的培養基的二元組，其中所述沉積于表面上的載體包含或由下列組成-白明膠、纖連蛋白、膠原、層粘蛋白、RGD肽或其組合，或 -聚電解質多層，優選是聚陽離子和聚陰離子，優選是交替物，-所述聚陽離子選自聚烯丙胺(PAH)，聚乙烯亞胺(PEI)，聚乙烯胺，聚氨基酰胺 (PAMAM)，聚丙烯酰胺(PAAm)，聚二甲基二烯丙基氯化銨(PDAC)，帶正電的多肽、例如聚賴 氨酸，以及帶負電的多糖、例如殼聚糖，并且-所述聚陰離子選自聚丙烯酸(PAA)，聚甲基丙烯酸(PMA)，聚苯乙烯磺酸(PSS或 SPS)，帶負電的多肽、例如聚谷氨酸和聚天冬氨酸，以及帶負電的多糖、例如透明質酸鹽和 藻酸鹽，-優選地選自(PAH-PSQ 3、(PAH-PSS) 3_PAH 和 PEI- (PSS-PAH) 3。
11.根據權利要求10的具有特定氧濃度的培養基或兩種具有特定氧濃度的培養基的二元組，其中所述表面是天然或人工表面-所述人工表面選自玻璃、TCPS (細胞培養物處理的聚苯乙烯)、聚硅氧烷、全氟烴基聚 醚、生物相容性聚合物尤其是Daenm 、聚氨酯、聚甲基硅氧烷、聚氯乙烯、Silastie 、膨 體聚四氟乙烯(ePTFE)和任何用于假體和/或植入系統或培養系統的材料，-所述天然表面選自血管、靜脈、心臟、小腸粘膜、動脈、優選脫細胞的臍帶動脈，所述血 管、靜脈、動脈來自人類器官。
12.使衍生自骨髓或血液或脂肪組織或臍帶的干細胞體外分化的方法，條件是所述干 細胞不是人類胚胎干細胞，并且優選選自間充質干細胞(MSC)和造血干細胞(HSC)，所述方 法包括-將源自骨髓或血液或脂肪組織的干細胞與沉積于合適的培養基中的表面上的載體接 觸，以獲得植于載體上的干細胞，條件是所述干細胞不是人類胚胎干細胞，-改變包含所述植于載體上的干細胞的所述合適的培養基中的氧濃度，以提供含氧量 正常的條件或低氧條件，所述低氧條件不同于缺氧， -使所述植于載體上的干細胞體外分化 通過將所述植于載體上的干細胞在含氧量正常的條件下培養而形成第一組特化分 化的細胞， 或，通過將所述植于載體上的干細胞在低氧條件下在與用于獲得第一組特化分化的 細胞的培養基性質相同的培養基中培養而形成第二組特化分化的細胞，所述第一和第二組特化分化的細胞保留通過天然生物學過程獲得的各自相對應的特 化分化的細胞的功能特性，所述第一組特化分化的細胞具有與所述第二組特化分化的細胞不同的細胞功能特性。
13.使用兩種具有特定氧濃度的培養基的二元組在體外形成功能性血管的方法，所述 每種特定氧濃度的培養基對應于具有特定氧濃度的合適的培養基，所述方法包括以下步 驟-將源自骨髓或血液或脂肪組織或臍帶的干細胞與沉積于合適的培養基中的表面上的 載體接觸，以獲得植于載體上的干細胞，所述干細胞優選選自間充質干細胞(MSC)和造血 干細胞(HSC)，條件是所述干細胞不是人類胚胎干細胞，-改變包含所述植于載體上的干細胞的所述合適的培養基中的氧濃度，以提供含氧量 正常的條件或低氧條件，所述低氧條件不同于缺氧， -使所述植于載體上的干細胞的體外分化 通過將所述植于載體上的干細胞在含氧量正常的條件下在培養基中培養而形成第 一組特化分化的細胞，所述第一組特化分化的細胞優選由內皮細胞組成，和 通過將所述植于載體上的干細胞在低氧條件下在與用于獲得第一組特化分化的細 胞的培養基性質相同的培養基中培養而形成第二組特化分化的細胞，所述第二組特化分化 的細胞優選由平滑肌細胞組成，-分別收集第一和第二組特化分化的細胞，和-建立由外側的第二組特化分化的細胞層和內側的第一組特化分化的細胞單層組成的 血管，并限定腔，從而允許形成功能性血管。
14.根據權利要求12或13的方法，其中-所述含氧量正常的條件是指，環境空氣中的氧濃度是，總環境氣體的13%至21%摩 爾含量/體積(mc/v)，優選是總環境氣體的15%至20%摩爾含量/體積(mc/v)，并且-所述低氧條件是指，環境空氣中的氧濃度是，總環境氣體的2%至12%摩爾含量/體 積(mc/v)，優選是總環境氣體的3%至8%摩爾含量/體積(mc/v)，更優選是總環境氣體的 4%至6%摩爾含量/體積(mc/v)。
15.根據權利要求12至14任一項的方法，其中所述載體包含或由下列組成 -白明膠、纖連蛋白、膠原、層粘蛋白、RGD肽或其組合，或 -聚電解質多層，優選是聚陽離子和聚陰離子，優選是交替物，-所述聚陽離子選自聚烯丙胺(PAH)，聚乙烯亞胺(PEI)，聚乙烯胺，聚氨基酰胺 (PAMAM)，聚丙烯酰胺(PAAm)，聚二甲基二烯丙基氯化銨(PDAC)，帶正電的多肽、例如聚賴 氨酸，以及帶負電的多糖、例如殼聚糖，并且-所述聚陰離子選自聚丙烯酸(PAA)，聚甲基丙烯酸(PMA)，聚苯乙烯磺酸(PSS或 SPS)，帶負電的多肽、例如聚谷氨酸和聚天冬氨酸，以及帶負電的多糖、例如透明質酸鹽和 藻酸鹽，-優選地選自(PAH-PSQ 3、(PAH-PSS) 3_PAH 和 PEI- (PSS-PAH) 3， 所述載體沉積于表面上，所述表面優選是天然或人工表面，更優選地 -所述人工表面選自玻璃、TCPS (細胞培養物處理的聚苯乙烯)、聚硅氧烷、全氟烴基聚 醚、生物相容性聚合物尤其是Daenm 、聚氨酯、聚甲基硅氧烷、聚氯乙烯、Silastie 、膨 體聚四氟乙烯(ePTFE)和任何用于假體和/或植入系統的材料，-所述天然表面選自血管、靜脈、心臟、小腸粘膜、動脈、優選脫細胞的臍帶動脈，所述血 管、靜脈、動脈來自人類器官。
全文摘要
本發明涉及特定氧濃度用于實施使干細胞分化的方法的用途，條件是所述干細胞不是人類胚胎干細胞并且植于合適的培養基中的載體上，其中所述分化引起在含氧量正常條件下并在合適的培養基中的第一組特化分化的細胞，或在低氧條件下的第二組特化分化的細胞，其處于與用于獲得第一組特化分化的細胞的培養基性質相同的培養基中，所述第一和第二組特化分化的細胞保留通過天然生物學過程獲得的各自相對應的特化分化的細胞的功能特性。
文檔編號C12N5/071GK102089426SQ200980126765
公開日2011年6月8日 申請日期2009年6月23日 優先權日2008年6月24日
發明者H-A·科德茹杰, J-F·斯托爾茨, N·貝泰勒米, P·默尼 申請人:亨利龐加萊南錫第一大學