用于改進微生物產生異戊二烯的異戊二烯合酶變體的制作方法

專利名稱：用于改進微生物產生異戊二烯的異戊二烯合酶變體的制作方法
技術領域：
本發明提供方法和包含具有改進的催化活性和/或溶解度的至少一種異戊二烯合酶的組合物。具體地，本發明提供了用于增加微生物宿主細胞中異戊二烯產生的變異植物異戊二烯合酶。生物合成產生的本發明異戊二烯用于橡膠和高彈體的制造中。
背景技術：
類異戊二烯是用于藥物、營養藥、調料、香料和橡膠產品中的異戊二烯聚合物。但是，天然類異戊二烯供應因生態顧慮而受限。出于該原因并為了提供具有更少雜質和更大均一性的類異戊二烯組合物，往往合成產生類異戊二烯，如橡膠。異戊二烯甲基-1，3-丁二烯)是不溶于水中并可溶于醇中的揮發烴。商業可行量的異戊二烯可以通過從石油C5裂化餾分直接分離或通過C5異烷烴或異烯烴脫水來獲得(Weissermel 禾口 Arpe, Industrial Organic Chemistry,第 4 版，Wiley-VCH,第 117-122 頁，200 。C5骨架也可以從更小的亞單位合成。但是，希望具有不依賴于不可再生資源的產生異戊二烯的商業可行方法。異戊二烯的生物合成產生通過兩條不同代謝途徑發生(Julsing等人，Appl Microbiol Biotechnol，75 1377-1384，2007)。在真核生物和古細菌(archae)，異戊二烯通過甲羥戊酸(MVA)途徑形成，而一些真細菌和高等植物通過甲基赤蘚糖醇磷酸(MEP)途徑產生異戊二烯。異戊二烯從植物中發散是光線和溫度依賴的，其增加與葉發育相關。產生異戊二烯的酶(異戊二烯合酶)已經在楊屬(Aspen)樹木中被鑒定(Silver和i^all，Plant Physiol,97 :1588-1591,1991 ；和 Silver 和 Fall, J Biol Chem,270 :13010-13016，1995) 并認為負責體內從完整葉中產生異戊二烯。異戊二烯的細菌產生也已經被描述(Kuzma等人，Curr Microbiol, 30 :97-103,1995 ；和 ffilkins, Chemosphere，32 1427-1434，1996) 并且在量上隨細菌生長的階段和培養基的營養含量變化(授予!^11等人的美國專利號 5, 849, 970 ；和 Wagner 等人，JBacteriol，181 :4700_4703，1999，這兩份文獻均通過引用的方式完整并入本文)。然而，通過現有技術的細菌系統可獲得的異戊二烯水平不足以商用。因而，本領域需要的是為制造類異戊二烯提供原料的高效、大規模、細菌性異戊二烯產生方法。本文提到的全部專利、專利申請、文章和出版物在此通過引用的方式明確地并入本文。發明概述本發明提供方法和包含具有改善的催化活性和/或溶解度的至少一種異戊二烯合酶的組合物。具體地，本發明提供了用于增加微生物宿主細胞中異戊二烯產生的植物變異異戊二烯合酶。生物合成產生的本發明異戊二烯用于橡膠和高彈體的制造中。
具體地，本發明提供了分離的異戊二烯合酶變體，其中該變體在與葛異戊二烯合酶的一個或多個(1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個)殘基相對應的位置處包含替換，所述的葛異戊二烯合酶包含SEQ ID NO :2中所述的氨基酸序列。在一些實施方案中，異戊二烯合酶變體是葛(葛屬物種(Pueraria sp.))異戊二烯合酶變體或楊(楊屬物種(Populus sp.)異戊二烯合酶變體。在一些實施方案中，所述一個或多個殘基選自但不限于由L26、E30、F31、 Q33、L35、E36、N37、L39、K40、V41、K43、L44、R61、V62、D63、Q65、K87、E94、N95、L99、D100、 N105、K137、E138、G143、E144、N182、L184、K185、G187、N189、T190、P225、H226、K247、T257、 E258、M259、D266、N334、D353、S357、I358I、E361、N389、I392、I393、K398、E401、C421、Q423、 Q424、E425、D426、H430、L432、R433、S434、D437、R443、L462、E463、H476、N478、D479、Q485、 D508、P513、A515、Q532、Y533、L537、G538、R539、Y542、A543 和 P557 組成的組。在一些實施方案中，所述一個或多個殘基選自但不限于由P24、N25 J309、D310、L377、F381、E384、Y399、 N402、A403、S406、S407、G409、A411、L413、F449、A456、T457、S458、A459、A460、E461、L462、 E463、R464、G465、E466、T467、T468、N469、M523、S527 和 Y531 組成的組。在一些實施方案中，所述一個或多個殘基選自但不限于A20、N21、Y22、Q23、R271、W278、F299, V302和S408 組成的組。本發明也提供了分離的異戊二烯合酶變體，其具有葛異戊二烯合酶中的A20G替換，所述的葛異戊二烯合酶具有SEQ ID NO :2中所述的氨基酸序列。在這些實施方案的子集中，該變體包含至少兩個替換0、3、4、5、6、7、8、9或10)，其中所述替換之一是具有SEQ ID NO :2中所述氨基酸序列的葛異戊二烯合酶中的A20G替換。本發明也提供了分離的異戊二烯合酶變體，其具有葛異戊二烯合酶中的S408D替換，所述的葛異戊二烯合酶具有SEQ ID NO 2中所述的氨基酸序列。在這些實施方案的子集中，該變體包含至少兩個替換(2、3、 4、5、6、7、8、9或10)，其中所述替換之一是具有SEQ ID NO :2中所述氨基酸序列的葛異戊二烯合酶中的S408D替換。在一些優選的實施方案中，與野生型異戊二烯合酶相比，該異戊二烯合酶變體具有至少一種改進的特性。在一些特別優選的實施方案中，至少一種改進的特性選自但不限于由比活性(從二甲基烯丙基二磷酸產生異戊二烯)和溶解度組成的組。此外，本發明還提供編碼該異戊二烯合酶變體的多核苷酸序列。也提供了包含與啟動子有效連接的編碼該異戊二烯合酶變體的多核苷酸序列的表達載體。在其他實施方案中，本發明提供了包含該表達載體的宿主細胞。也提供該宿主細胞的裂解物，其中裂解物還包含溶菌酶。在一些實施方案中，該裂解物具有中性PH(6. 5至7.幻，而在其他實施方案中，該裂解物具有堿性PH(高于7. 5且低于9. 5)。本發明也提供產生異戊二烯的方法，包括(a)提供包含該表達載體的宿主細胞；和(b)在適合產生異戊二烯的條件下培養該宿主細胞。在一些實施方案中，該方法還包括(c)回收異戊二烯。仍在其他實施方案中，該方法還包括(d)聚合異戊二烯。本發明還提供了檢測異戊二烯合酶活性的方法，包括(a)在適合產生異戊二烯合酶變體的條件下培養包含該表達載體的宿主細胞；(b)用包含溶菌酶的裂解緩沖液裂解宿主細胞以產生細胞裂解物；和(c)通過測量來自二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)的異戊二烯產生來檢測該細胞裂解物中的異戊二烯合酶活性。在一些實施方案中，宿主選自但不限于由革蘭氏陽性細菌細胞、革蘭氏陰性細菌細胞、絲狀真菌細胞和酵母細胞組成的組。在一些優選的實施方案中，宿主選自但不限于由埃希氏菌屬物種(Escherichia sp.)(大腸桿菌(E. col))、泛菌屬物種(Panteoa sp.)(檸檬泛菌 (P. citrea))、芽孢桿菌屬物種(Bacillus sp.)(枯草芽孢桿菌(B. subtilis))、耶氏酵母屬物種(Yarrowia sp.)(解脂耶氏酵母(Y. Iipolytica))和木霉屬(Trichoderma)(里氏木霉(T. reesei))組成的組。在一些實施方案中，宿主細胞在包括碳源的培養基中培養，所述碳源選自由葡萄糖、丙三醇、甘油、二羥基丙酮、酵母提取物、生物量、糖蜜、蔗糖和油組成的組。另外，本發明提供了檢測多份樣品中異戊二烯的方法(高通量篩選法)，包括(a) 提供i)分別包含異戊二烯合酶的多份樣品；ii)包含多個孔的玻璃板；和iii)該玻璃板的封蓋；(b)將多份樣品置于該玻璃板的多個孔中；(c)用封蓋密封該玻璃板以產生密封的玻璃板，其具有與多個孔的每孔中樣品相關的頂空；(d)在異戊二烯合酶有活性的條件下孵育該玻璃板；(e)檢測頂空中的異戊二烯。在一些實施方案中，異戊二烯由氣相色譜-質譜法(GC-MQ檢測。在一些實施方案中，所述多份樣品包含有包含表達載體的宿主細胞，所述的表達載體包含與啟動子有效連接的編碼異戊二烯合酶變體的多核苷酸序列。在一些實施方案中，所述多份樣品包含宿主細胞裂解物、溶菌酶和二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)。在一些優選的實施方案中，玻璃板是深孔玻璃塊。在一些優選的實施方案中，所述多個孔包括至少M個孔(優選地至少48個孔、更優選地至少96個孔、仍更優選地至少192個孔和最優選地至少384個孔)。在特別優選實施方案中，所述多個孔各自包含包含2ml或更小(優選地2ml至0. 2ml)的容積。額外地，本發明提供了宿主細胞，其包含與啟動子有效連接的編碼異戊二烯合酶變體的異源多核苷酸序列，其中該異戊二烯合酶變體在與葛異戊二烯合酶的一個或多個 (1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個)殘基相對應的位置處包含替換，所述的葛異戊二烯合酶包含 SEQ ID NO :2中所述的氨基酸序列。在一些實施方案中，所述一個或多個殘基選自但不限于由 L26、E30、F31、Q33、L35、E36、N37、L39、K40、V41、K43、L44、R61、V62、D63、Q65、K87、E94、 N95、L99、D100、N105、K137、E138、G143、E144、N182、L184、K185、G187、N189、T190、P225、 H226、K247、T257、E258、M259、D266、N334、D353、S357、I358I、E361、N389、I392、I393、K398、 E401、C421、Q423、Q424、E425、D426、H430、L432、R433、S434、D437、R443、L462、E463、H476、 N478、D479、Q485、D508、P513、A515、Q532、Y533、L537、G538、R539、Y542、A543 和 P557 組成的組。在一些實施方案中，所述一個或多個殘基選自但不限于由P24、N25、Y309、D310、 L377、F381、E384、Y399、N402、A403、S406、S407、G409、A411、L413、F449、A456、T457、S458、 A459、A460、E461、L462、E463、R464、G465、E466、T467、T468、N469、M523、S527 和 Y531 組成的組。在一些實施方案中，所述一個或多個殘基選自但不限于々20、擬1、￥22、023、1 271、 W278、F299, V302和S408組成的組。本發明也提供了分離的異戊二烯合酶變體，其具有葛異戊二烯合酶中的A20G替換和/或S408D替換，所述的葛異戊二烯合酶具有SEQ ID NO 2中所述的氨基酸序列。在一些優選的實施方案中，與野生型異戊二烯合酶相比，該異戊二烯合酶變體具有至少一種改進的特性。在一些特別優選的實施方案中，至少一種改進的特性選自但不限于由比活性(從二甲基烯丙基二磷酸產生異戊二烯)和溶解度組成的組。在一些優選的實施方案中，該多核苷酸序列含于質粒內。在其他優選實施方案中，該多核苷酸序列整合到宿主細胞的染色體中。在一些實施方案中，宿主選自但不限于由革蘭氏陽性細菌細胞、革蘭氏陰性細菌細胞、絲狀真菌細胞和酵母細胞組成的組。在一些優選的實施方案中，宿主選自但不限于由埃希氏菌屬物種(Escherichia sp.)(大腸桿菌(E.coli))、泛菌屬物種(Panteoa sp.)(檸檬泛菌(P. citrea))、芽孢桿菌屬物種(Bacillus sp.)(枯草芽孢桿菌(B. subtilis))、耶氏酵母屬物種(Yarrowia sp.)(解脂耶氏酵母(Y. Iipolytica)) 和木霉屬(Trichoderma)(里氏木霉(T.reesei))組成的組。在一些實施方案中，宿主細胞在包括碳源的培養基中培養，所述碳源選自由葡萄糖、丙三醇、甘油、二羥基丙酮、酵母提取物、生物量、糖蜜、蔗糖和油組成的組。在一些實施方案中，宿主細胞還包含有時與天然DXP 途徑組合的編碼IDI多肽的異源或天然核酸和/或編碼DXS多肽的異源或天然核酸(例如， 在天然DXP途徑之外，在大腸桿菌中表達dxs和idi)。備選地，完整的DXP途徑(

圖15)可以在質粒上表達或整合于染色體上作為操縱子，帶有調控表達的單個啟動子或調控各個基因中一個或多個基因的不同強度的多個啟動子(例如GI 1.20,GI 1.5或GI 1. 6)。在一些實施方案中，宿主細胞還包含編碼IDI多肽和DXS多肽的一種或多種核酸，而在一些優選的實施方案中，一個載體編碼該異戊二烯合酶變體、該IDI多肽和該DXS多肽。在一些實施方案中，宿主細胞還包含編碼MVA途徑多肽(例如來自釀酒酵母(Saccharomyces cerevisia) 或糞腸球菌(Enterococcus faecalis)的MVA途徑多肽)的異源核酸。在一些實施方案中， 宿主細胞還包含編碼MVA途徑多肽和DXS多肽的一種或多種核酸，而在一些優選的實施方案中，一個載體編碼該異戊二烯合酶變體、該MVA途徑多肽和該DXS多肽。在一些優選的實施方案中，宿主細胞還包含編碼DXS多肽、IDI多肽、或者其余DXP途徑多肽中一種或多種多肽和MVA途徑多肽的一種或多種核酸。在一些實施方案中，該載體還包含選擇標記(例如， 抗生素抗性核酸)。也提供了產生異戊二烯的方法，包括(a)在用于產生異戊二烯的合適培養條件下培養該宿主細胞；和(b)產生異戊二烯。在一些實施方案中，該方法還包括(c) 回收異戊二烯。在一些優選的實施方案中，該方法還包括(d)聚合異戊二烯。本發明也提供產生異戊二烯合酶的方法，包括(a)提供(i)宿主細胞；和(ii)與啟動子有效連接的編碼異戊二烯合酶變體的核酸，其中該異戊二烯合酶變體在與葛異戊二烯合酶的一個或多個(1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個)殘基相對應的位置處包含替換，所述葛異戊二烯合酶包含SEQ ID NO 2中所述的氨基酸序列；(b)使宿主細胞與該核酸接觸以產生轉化的宿主細胞；和(C)在用于產生異戊二烯合酶的合適培養條件下培養轉化的宿主細胞。在另一方面，本發明提供了分離的楊異戊二烯合酶變體。在一個實施方案中，該變體包含在異戊二烯合酶氨基端部分中的截短。在另一個實施方案中，該異戊二烯合酶變體與全長異戊二烯合酶相比具有增加的比活性。在另一個實施方案中，該異戊二烯合酶是 SEQ ID NO :120的銀白楊異戊二烯合酶。在另一個實施方案中，該變體選自由MEA變體(SEQ ID NO :122)、MSV 變體(SEQ ID NO :124)、MVS 變體(SEQ ID NO 126), MTE 變體(SEQ ID N0:U8)、MNV變體(SEQ ID NO :130)組成的組。在另一個實施方案中，該變體是MEA變體 (SEQ ID NO :122)。在另一個實施方案中，該變體選自由TRC (-3)變體(SEQ ID NO :136)、 TRC (-4)變體(SEQ ID NO :138)、TRC (-5)變體(SEQ ID NO :140)、TRC (-6)變體(SEQ ID NO 142)和TRC(-7)變體(SEQ ID NO :144)組成的組。在另一個實施方案中，該變體是美洲山楊異戊二烯合酶的MET變體(SEQ ID NO 146) 0在另一個實施方案中，該變體是毛果楊(P. trichocharpa)異戊二烯合酶的 MET 變體(SEQ ID NO :148)。在另一方面，本發明提了分離的楊異戊二烯合酶變體，其中該變體包含野生型異戊二烯合酶的一個或多個氨基酸殘基的替換；并且其中該異戊二烯合酶變體與野生型異戊二烯合酶相比具有增加的異戊二烯合酶活性。在一個實施方案中，增加的異戊二烯合酶活性由包含異戊二烯合酶變體的宿主細胞顯示，該宿主細胞與包含親本異戊二烯合酶的宿主細胞相比在二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)存在下以更快速率生長。在另一個實施方案中， 該異戊二烯合酶是SEQ ID NO :120的銀白楊異戊二烯合酶。在另一個實施方案中，該變體包含選自由 V10M、F12S、T15A、E18G、V58I、V58F、L70Q、L70V、L70T、T71P、V79L、E89D、G94A、 S119F、F120L、G127R、E175V、T212I、S257A、R262G、A266G、F280L、N297K、F305L、L319M、 E323K、A328T、D342E、A359T、K366N、E368D、L374M、S396T、V418S、K438N、H440R、T442I、 T442A、I449V、A469S、K500R、K505Q、G507S、S509N、F511Y 和 Ν53^(組成的組中的多個氨基酸替換之一。在另一個實施方案中，所述至少一個氨基酸替換是L70R替換。在另一個實施方案中，該變體包含選自由 G127R/F511Y、L70Q/G94A/R262G/F305L、F12S/T15A/E18G/N297K、 S396T/T442I、V10M/E323K、F120L/A266G、K438N/K500R、V79L/S509N、E175V/S257A/E368D/ A469S、T71P/L374M、F280L/H440R、E89D/H440R、V58F/A328T/N532K、S119F/D342E/I449V 和 K366N/G507S組成的組中的多個氨基酸替換之一。在另一方面，本發明提供了包含SEQ ID NO :120的氨基酸殘基(圖19)的多肽的
曰曰形。在另一方面，本發明提供了產生異戊二烯的方法，包括(a)提供包含表達載體的宿主細胞，所述的表達載體包含編碼異戊二烯合酶變體的多核苷酸序列；和(b)在適合產生異戊二烯的條件下培養宿主細胞。在一個實施方案中，該方法還包括(c)回收異戊二烯。 在另一個實施方案中，該方法還包括(d)聚合異戊二烯。在另一方面，本發明提供了檢測異戊二烯合酶活性的方法，包括(a)在適合產生異戊二烯合酶變體的條件下培養包含表達載體的宿主細胞；(b)用包含溶菌酶的裂解緩沖液裂解該宿主細胞以產生細胞裂解物；和(c)通過測量來自二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP) 的異戊二烯產生來檢測該細胞裂解物中的異戊二烯合酶活性。在一個實施方案中，宿主細胞選自由革蘭氏陽性細菌細胞、革蘭氏陰性細菌細胞、絲狀真菌細胞和酵母細胞組成的組。 在另一個實施方案中，宿主細胞選自由埃希氏菌屬物種(大腸桿菌)、泛菌屬物種(檸檬泛菌)、芽孢桿菌屬物種(枯草芽孢桿菌)、耶氏酵母屬物種(解脂耶氏酵母)和木霉屬(里氏木霉)組成的組。在另一個實施方案中，宿主細胞在包含碳源的培養基中培養，所述碳源選自由葡萄糖、丙三醇、甘油、二羥基丙酮、酵母提取物、生物量、糖蜜、蔗糖和油組成的組。在另一方面，本發明提供了宿主細胞，其包含與啟動子有效連接的編碼異戊二烯合酶變體的異源多核苷酸序列，其中該異戊二烯合酶變體在與楊異戊二烯合酶的一個或多個(1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個)殘基相對應的位置處包含替換。在一個實施方案中，該異戊二烯合酶是SEQ ID N0:120的銀白楊異戊二烯合酶。在另一個實施方案中，該變體選自由 MEA 變體(SEQ ID NO :122)、MSV 變體(SEQ ID NO :124)、MVS 變體(SEQ ID NO :126)、MTE 變體(SEQ ID N0:U8)、MNV變體(SEQ ID NO :130)組成的組。在另一個實施方案中，該變體選自由 TRC(-3)變體(SEQ ID NO :136) ,TRC(-4)變體(SEQ ID NO :138) ,TRC(-5)變體(SEQ ID NO 140), TRC (-6)變體(SEQ ID NO :142)和 TRC(_7)變體(SEQ ID NO :144)組成的組。 在另一個實施方案中，該變體是美洲山楊異戊二烯合酶的MET變體(SEQ ID N0:146)。在另一個實施方案中，該變體是毛果楊異戊二烯合酶的MET變體(SEQ ID N0:148)。在另一個實施方案中，該變體包含選自由 V10M、F12S、T15A、E18G、V58I、V58F、L70Q、L70V、L70T、T71P、 V79L、E89D、G94A、Sl 19F、F120L、G127R、E175V、T212I、S257A、R262G、A266G、F280L、N297K、F305L、L319M、E323K、A328T、D342E、A359T、K366N、E368D、L374M、S396T、V418S、K438N、 H440R、T442I、T442A、I449V、A469S、K500R、K505Q、G507S、S509N、F511Y 和 Ν53^(組成的組中的多個氨基酸替換之一。在另一個實施方案中，所述至少一種氨基酸替換是L70R替換。在另一個實施方案中，該變體包含選自由 G127R/F511Y、L70Q/G94A/R262G/F305L、F12S/T15A/ E18G/N297K、S396T/T442I、V10M/E323K、F120L/A266G、K438N/K500R、V79L/S509N、E175V/ S257A/E368D/A469S、T71P/L374M、F280L/H440R、E89D/H440R、V58F/A328T/N532K、S119F/ D342E/I449V和K366N/G507S組成的組中的多個氨基酸替換之一。在另一個實施方案中，該多核苷酸序列含于質粒內。在另一個實施方案中，該多核苷酸序列整合到宿主細胞的染色體中。在另一個實施方案中，宿主選自由革蘭氏陽性細菌細胞、革蘭氏陰性細菌細胞、絲狀真菌細胞和酵母細胞組成的組。在另一個實施方案中，宿主選自由埃希氏菌屬物種(大腸桿菌)、泛菌屬物種(檸檬泛菌)、芽孢桿菌屬物種(枯草芽孢桿菌)、耶氏酵母屬物種(解脂耶氏酵母)和木霉屬(里氏木霉)組成的組。在另一個實施方案中，宿主細胞在包括碳源的培養基中培養，所述碳源選自由葡萄糖、丙三醇、甘油、二羥基丙酮、酵母提取物、生物量、 糖蜜、蔗糖和油組成的組。在另一個實施方案中，宿主細胞還包含編碼IDI多肽的異源或天然核酸和/或編碼DXS多肽的異源或天然核酸，其任選地與天然DXP途徑組合。在另一個實施方案中，宿主細胞還包含編碼IDI多肽和DXS多肽的一種或多種核酸。在另一個實施方案中，宿主細胞包含編碼該異戊二烯合酶變體、該IDI多肽和該DXS多肽的一個載體。在另一個實施方案中，宿主細胞還包含編碼MVA途徑多肽的異源核酸，所述MVA途徑多肽選自由 : 自酉良(Saccharomyces cerevisia)禾口$1(Enterococcus faecalis) ^ MVA 途徑多肽組成的組。在另一個實施方案中，宿主細胞還包含編碼MVA途徑多肽和DXS多肽的一種或多種核酸，并且其中一個載體編碼該異戊二烯合酶變體、該MVA途徑多肽和該DXS 多肽。在另一個實施方案中，宿主細胞還包含編碼DXS多肽、IDI多肽、或者其余DXP途徑多肽中一種或多種多肽和MVA途徑多肽的一種或多種核酸。在另一方面，本發明提供了產生異戊二烯的方法，包括(a)在用于產生異戊二烯的合適培養條件下培養宿主細胞，其包含與啟動子有效連接的編碼異戊二烯合酶變體的異源多核苷酸序列，其中該異戊二烯合酶變體在與楊異戊二烯合酶的一個或多個(1、2、3、4、 5、6、7、8、9或10個)殘基相對應的位置處包含替換；和(b)產生異戊二烯。在一個實施方案中，該方法還包括(c)回收異戊二烯。在另一個實施方案中，該方法還包括(d)聚合異戊 -~ 火布ο在另一方面，本發明提供了產生異戊二烯合酶的方法，包括(a)提供(i)宿主細胞；和(ii)與啟動子有效連接的編碼異戊二烯合酶變體的核酸，其中異戊二烯合酶變體在與SEQ ID NO :120的銀白楊異戊二烯合酶的一個或多個(1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個)殘基相對應的位置處包含替換；(b)使宿主細胞與該核酸接觸以產生轉化的宿主細胞；和(C) 在用于產生異戊二烯合酶的合適培養條件下培養轉化的宿主細胞。附圖簡述圖1提供了為大腸桿菌中表達而密碼子優化的葛(葛麻姆(Pueraria montana)) 異戊二烯合酶的編碼序列(SEQ ID NO :1)。圖2提供葛異戊二烯合酶的氨基酸序列(SEQ ID NO 2)。圖3提供了為大腸桿菌中表達而密碼子優化的楊(銀白楊χ歐洲山楊(Populusalba χ tremula))異戊二烯合酶的編碼序列(SEQ ID NO :6)。圖4提供楊(銀白楊χ歐洲山楊)異戊二烯合酶的氨基酸序列(SEQ ID NO 7)。圖5提供葛異戊二烯合酶同源性模型，同時半胱氨酸殘基突出顯示為空間填充分子。圖6提供楊異戊二烯合酶同源性模型，同時半胱氨酸殘基突出顯示為空間填充分子(深灰色)。此外，來自圖5葛模型的的半胱氨酸殘基作為空間填充分子(淺灰色)疊加到楊模型。圖7提供曲線圖，其顯示實施例5的葛IspS半胱氨酸突變體的生長曲線。圖8顯示來自裂解細胞的葛IspS半胱氨酸突變體的SDS-PAGE分析結果。通過離心制備沉淀物和上清液級分。圖 9 提供質粒 MCM93 (pCR2. 1-Kudzu)的圖。圖10提供質粒MCM93的核苷酸序列(SEQ ID NO 22)。圖 11 提供 pETMD-Kudzu 的圖。圖 12 提供 pET24D-Kudzu 的核苷酸序列(SEQ ID NO 23)。圖13顯示含葛異戊二烯合酶的包含體的SDS-PAGE分析結果。泳道M含有分子量標記，而其余泳道含有遞增量的純化包含體制備物。該葛異戊二烯合酶估計具有> 90%的純度。圖14提供曲線圖，其顯示就Y22、A20和S408位置而言葛位點評價文庫(SEL)成員的異戊二烯合酶活性。大部分成員顯示高度降低的活性，而保守性替換顯示較少的活性降低。分圖A顯示與獨立的野生型樣品(劃圈的WT)相比Y22文庫成員的驗定結果。分圖 B顯示與野生型樣品(劃圈的WT)相比A20文庫成員的驗定結果。分圖C顯示S408文庫成員的驗定結果，表明成員S408D具有比野生型對照的平均值高1. 5至2倍的活性。圖15顯示異戊二烯的MVA和DXP代謝途徑(基于F. Bouvier等人，Progress in Lipid Res. 44 :357-4 ，2005)。以下描述包括所述途徑中每種多肽的備選名稱和公開了測量所述多肽活性的測定法的參考文獻(這些參考文獻的每一篇因而分別通過引用的方式完整并入，尤其是測定MVA和DXP途徑中多肽的多肽活性的測定法)。甲羥戊酸途徑 AACT ；乙酰-CoA 乙酰轉移酶，MvaE, EC 2. 3. 1. 9，測定法 J. Bacteriol.，184 :2116-2122, 2002 ；HMGS ；羥甲基戊二酰-CoA 合酶，MvaS, EC 2. 3. 3. 10，測定法 J. Bacteriol.，184 4065-4070，2002 ；HMGR ；3-羥基-3-甲基戊二酰-CoA 還原酶，MvaE, EC 1. 1. 1. 34，測定法 J. Bacteriol.，184 :2116-2122,2002 ；MVK ；甲羥戊酸激酶，ERG12, EC 2. 7. 1. 36，測定法 Curr Genet 19 :9-14,1991 ；PMK ；磷酸甲羥戊酸激酶，ERG8, EC 2. 7. 4. 2，測定法:Mol Cell Biol. ,11 =620-631,1991 ；DPMDC ；二磷酸甲羥戊酸脫羧酶，MVD1, EC 4. 1. 1. 33，測定法 Biochemistry, 33 13355-13362，1994 ；IDI ；異戊烯二磷酸△-異構酶，IDI1, EC 5. 3. 3. 2， 測定法:J. Biol. Chem. 264 19169-19175，1989。DXP 途徑=DXS ；1-脫氧木酮糖 ~5~ 磷酸合酶，dxs，EC 2. 2. 1. 7，測定法=PNAS, 94 12857-62，1997 ；DXR ； 1-脫氧-D-木酮糖 5-磷酸還原異構酶，dxr，EC 2. 2. 1. 7，測定法:Eur. J. Biochem. 269 :4446-4457,2002 ；MCT ；4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤蘚糖醇合酶，IspD，EC 2. 7. 7. 60，測定法PNAS，97 :6451-6456,2000 ； CMK ；4- 二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤蘚糖醇激酶，IspE, EC 2. 7. 1. 148，測定法=PNAS, 97 1062-1067，2000 ；MCS ；2C-甲基-D-赤蘚糖醇 2,4-環二磷酸合酶，IspF, EC 4. 6. 1. 12，測定法PNAS，96 :11758-11763,1999 ；HDS ；1-羥基-2-甲基 _2-(E)_ 丁烯基 4- 二磷酸合酶，ispG, EC 1. 17.4.3，測定法 J. Org. Chem. ,70 :9168-9174,2005 ；HDR; 1-羥基-2-甲基-2-(E)-丁烯基 4-二磷酸還原酶，IspH，EC 1. 17. 1. 2，測定法JACS，126 12847-12855， 2004。圖16提供了 pDu27的圖。圖17提供pDu27中氨基端加6Xhis標記的銀白楊IspS的氨基酸序列(SEQ ID NO 118)。圖18提供質粒pDu27的核苷酸序列(SEQ ID NO :119)。圖19提供pET2^中全長銀白楊IspS的氨基酸序列(SEQ ID NO :120)。以下劃線標出的殘基表示質粒pDu39至pDu43中IspS內氨基端截短的位置。圖20提供銀白楊質粒pDu27的核苷酸序列(SEQ ID NO :121)。圖21顯示純化的IspS通過SDS-PAGE分析而顯示一個較低分子量“雙聯體”。圖22顯示通過質譜法鑒定的胰蛋白酶肽。圖23提供攜帶銀白楊IspS氨基端截短的pDu40、pDu41、pDu42和pDu43的圖。圖M提供(菌株MD09-173中)作為未加標簽的pETMa-銀白楊MEA的Pdu39的25提供pDu39中銀白楊IspS的截短“MEA”變體的氨基酸序列(SEQ ID NO 122)。圖26提供質粒pDu39的核苷酸序列(SEQ ID NO :123)。圖27提供pDu41中銀白楊IspS的截短“MSV”變體的氨基酸序列(SEQ ID NO 124)。圖28提供質粒pDu41 (未加標簽的pETMa-銀白楊(MSV))的核苷酸序列(SEQ ID NO 125)。圖四提供pDu43中銀白楊IspS的截短“MVS”變體的氨基酸序列(SEQ ID NO 126)。圖30提供質粒pDu43 (未加標簽的pETMa-銀白楊(MVS))的核苷酸序列(SEQ ID NO 127)。圖31提供pDu42中銀白楊IspS的截短“MTE”變體的氨基酸序列(SEQ ID NO 128)。圖32提供質粒pDu42 (未加標簽的pETMa-銀白楊(MTE))的核苷酸序列(SEQ ID NO 129)。圖33提供pDu40中銀白楊IspS的截短“MNV”的氨基酸序列(SEQ IDNO :130)。圖34提供質粒pDu40 (未加標簽的pETMa-銀白楊(MNV))的核苷酸序列(SEQ ID NO 131)。圖35提供羧基端加TEV、6XHis標記的IspS變體MD09-161和MD09-163的圖。圖36提供MD09-163中銀白楊MEA (+) TEV的氨基酸序列(SEQ ID NO :132)。圖 37 提供質粒 MD09-163(pET24a-MEA(+)TEV)的核苷酸序列(SEQ ID NO :133)。 CDS以下劃線標出，TEV蛋白酶位點是粗體字。圖38提供MD09-161中銀白楊FL(+) TEV的氨基酸序列(SEQ IDNO :134)。
圖 39 提供質粒 MD09-161(pET24a-FL(+)TEV)的核苷酸序列(SEQ ID NO 135) CDS以下劃線標出，TEV蛋白酶位點是粗體字。圖40顯示了代表MD09-167、全長(FL)、MD09-165和截短異戊二烯合酶 (MD09-173)的比活性的曲線圖。反應在30°C于下述溶液中進行15分鐘，所述溶液含有 IOOmM TrisUOOmM NaCl、50mM MgCl2、5mM DMAPP 禾Π 2. 5-4. 5 μ g 在完整細胞裂解物的上清液中的異戊二烯合酶。圖41顯示了展示速率/[E]對[DMAPP]的曲線圖。X代表MD09-173，圓圈代表 MD09-167，菱形代表MD09-165并且正方形代表全長IspS。圖42顯示了展示異戊二烯合酶活性對[DMAPP]的曲線圖。X，s代表用MD09-173 截短的異戊二烯合酶產生的數據。圓圈代表用MD09-167異戊二烯合酶產生的數據。菱形代表用MD09-165異戊二烯合酶產生的數據。正方形代表用全長異戊二烯合酶產生的數據。 每個數據組一式三份來自獨立培育的培養物。圖43顯示了展示不同的k-和Ks^PKi對反應速率影響的曲線圖。在分圖A中，曲線1代表在不同的DMAPP濃度下作圖的截短的異戊二烯合酶活性的速率等式除以全長異戊二烯合酶速率等式。曲線2代表全長異戊二烯合酶的速率等式(其中k。at已經被截短異戊二烯合酶k。at取代)除以全長異戊二烯合酶速率等式。曲線3代表全長異戊二烯合酶的速率等式(其中Km已經被截短異戊二烯合酶Km取代)除以全長異戊二烯合酶速率等式。曲線4代表全長異戊二烯合酶的速率等式(其中Ki已經被截短異戊二烯合酶Ki取代)除以全長異戊二烯合酶速率等式。分圖B顯示一個曲線圖，其展示截短異戊二烯合酶的速率等式與全長異戊二烯合酶之比相對于[DMAPP]的數據擬合。圖44顯示一個曲線圖，其展示MCM531因甲羥戊酸(MVA)所致的生長抑制。細胞在微量滴定平板中于TM3培養基中伴以不同濃度的MVA下培育。在所示的時間測量一式四份孔的OD6tltl。圖45顯示了展示L70SSL平板的DMAPP測定法的曲線圖。深色條形代表全長(銀白楊pET24a)或pDU39(截短)對照。選擇C3 Q7)、D3 (39)或E3(51)孔中的變體用于進一步分析。 圖46顯示一個曲線圖，其展示為用蛋白質測定為DMAPP測定法所選擇的全部變體的平均比活性。誤差線表示一個標準差。全部3個L70R變體顯示高于對照(WT)的活性。圖47顯示一個曲線圖，其展示全部3個L70R變體與“MEA”截短的銀白楊IspS酶相比的平均比活性。誤差線表示一個標準差。圖 48 提供質粒 pDu47-3、pDu47_4 和 pDu47_5 的圖。圖 49 提供質粒 pDu47-6、pDu47_7 和 pDu48 的圖。圖 50 提供質粒 pDu49、pDu50 和 pDu50_4 的圖。圖51提供pDu47-3中銀白楊TRC (_3)的氨基酸序列(SEQ ID NO :136)。圖52提供質粒pDu47-3的核苷酸序列(SEQ ID NO :137)。圖53提供pDu47-4中銀白楊TRC (_4)的氨基酸序列(SEQ ID NO :138)。圖M提供質粒pDu47_4的核苷酸序列(SEQ ID NO :139)。圖55提供pDu47-5中銀白楊TRC (_5)的氨基酸序列(SEQ ID NO :140)。圖56提供質粒pDu47-5的核苷酸序列(SEQ ID NO :141)。
圖57提供pDu47-6中銀白楊TRC (_6)的氨基酸序列(SEQ ID NO :142)。圖58提供質粒pDu47-6的核苷酸序列(SEQ ID NO :143)。圖59提供pDu47-7中銀白楊TRC (_7)的氨基酸序列(SEQ ID NO :144)。圖60提供質粒pDu47-7的核苷酸序列(SEQ ID NO :145)。圖61提供pDu48中美洲山楊TRC(MET)的氨基酸序列(SEQ IDNO :146)。圖62提供質粒pDu48的核苷酸序列(SEQ ID NO :147)。圖63提供pDu49中毛果楊(TRC)的氨基酸序列(SEQ ID NO :148)。圖64提供質粒pDu49的核苷酸序列(SEQ ID NO :149)。圖 65 提供 pDu50 中葛 TRC (MEA)的氨基酸序列(SEQ ID NO :150)。圖66提供質粒pDu50的核苷酸序列(SEQ ID NO :151)。圖67 提供 pDu50-4 中葛 TRC (_4)的氨基酸序列(SEQ ID NO :152)。圖68提供質粒pDu50_4的核苷酸序列(SEQ ID NO :153)。圖69顯示一個曲線圖，其展示來自IspS截短變體的DMAPP測定法的原始數據和 OD歸一化數據。圖70顯示了代表IspS截短體比活性的曲線圖。相對于銀白楊“全長”變體，比較了銀白楊、美洲山楊和毛果楊截短體的比活性。圖71提供質粒p9795的圖。圖72提供質粒p9795的核苷酸序列(SEQ ID NO :154)。圖73提供質粒PiTrcKudzu的圖。圖74提供質粒PiTrcKudzu的核苷酸序列(SEQ ID NO :155)。圖75提供質粒pMAL-C4X的圖。圖76提供質粒pMAL-C4X的核苷酸序列(SEQ ID NO :156)。圖 77 提供質粒 pMAL-C4X_Kudzu 的圖。圖 78 提供質粒 pMAL-C4X-Kudzu 的核苷酸序列(SEQ ID NO :157)。圖79提供質粒PET24、美洲山楊pET2^和毛果楊pET2^的圖。圖80提供毛果楊pET24a中美洲山楊IspS的氨基酸序列(SEQ ID NO :158)。圖81提供質粒美洲山楊pET24a的核苷酸序列(SEQ ID NO :159)。圖82提供毛果楊pET2^中毛果楊IspS的氨基酸序列(SEQ ID NO :160)。圖83提供質粒毛果楊pET2^的核苷酸序列(SEQ ID NO :161)。圖 84 提供質粒 pDu30、pDu31 和 pDu32 的圖。圖85提供pDu30中IspS變體銀白楊TRC_pET200的氨基酸序列(SEQID NO :162)。圖86提供pDu30的核苷酸序列(SEQ ID NO 163)。圖87提供pDu31中IspS變體美洲山楊TRC_pET200的氨基酸序列(SEQ ID NO 164)。圖88提供pDu31的核苷酸序列(SEQ ID NO :165)。圖89提供pDu32中IspS變體毛果楊TRC-pET200的氨基酸序列(SEQ ID NO :166)。圖90提供pDu32的核苷酸序列(SEQ ID NO 167)。圖91提供顯示為二聚體的美洲山楊IspS的三維結構。鏈A為深灰色，鏈B為中等灰色并且每個活性中心內的單個鎂離子為淺灰色。
圖92提供美洲山楊IspS結構的單體視圖。鎂顯示為淺灰色球體并且標出氨基末端和羧基末端。圖 93 顯示(A)BdpS 與 LS、(B)BdpS 與楊 IspS, (C)LS 與楊 IspS 以及(D) TEAS 與楊 IspS之間的結構比對。在每種情況下，第一個結構為淺灰色并且第二個結構為深灰色。二價鎂離子顯示為球體。圖94顯示BdpS和LS中的環的三維結構。分圖A顯示淺灰色的Ls的氨基端環和深灰色的BdpS的氨基端環。分圖B顯示環I和環II是結構上同源的。圖95顯示BdpS(深灰色)和楊IspS(淺灰色)的氨基端環是結構上趨異的。分圖A顯示氨基端環并且分圖B顯示環I和環II。圖96顯示LS(淺灰色)和楊IspS(深灰色)的氨基端環是結構上趨異的。分圖 A顯示氨基端環并且分圖B顯示環I和環II。圖97顯示TEAS(淺灰色)和楊IspS(深灰色)的氨基端環是結構上趨異的。分圖A顯示氨基端環并且分圖B顯示環I和環II。環I在TEAS中扭曲。發明的一般性描述本發明提供了方法和包含催化活性和/或溶解度改進的至少一種異戊二烯合酶的組合物。具體地，本發明提供了用于增加微生物宿主細胞中異戊二烯產生的植物變異異戊二烯合酶。生物合成產生的本發明異戊二烯用于橡膠和高彈體的制造中。除非另外說明，本發明的實施涉及分子生物學、微生物學和重組DNA中常用的常規技術，它們處在本領域技術人員能力范圍內。此類技術是本領域技術人員已知的并且在眾多教材和參考書中描述(見例如，Sambrook等人，“Molecular Cloning :A Laboratory Manual,"2 版，Cold Spring Harbor,1989 ；禾口 Ausubel 等人，"Current Protocols in Molecular Biology，” 1987)。除非本文另外定義，本文中所用的全部術語及科學術語具有與本發明所屬領域的技術人員通常理解的相同意義。例如，Singleton等人，DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY，2 版，John Wiley and Sons, New York (1994)；和 Hale 與Markham，THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, NY(1991)向本領域技術人員提供了具有本發明中所用眾多術語的通用字典。盡管與本文中所述那些方法和材料相似或相等的任意方法和材料用于本發明的實施中，然而本文中描述了優選的方法和材料。因而，通過整體地參考本說明書更充分地描述了下文馬上定義的術語。此外，本文中提供的標題不限制本發明的多個方面或實施方案，可以通過整體地參考本說明書得出所述標題。因此，通過整體地參考本說明書更完整地描述下文立即定義的術語。然而，為了促進理解本發明，下文定義了眾多術語。定義除非本文另外定義，本文中所用的全部技術及科學術語具有與本發明所屬領域的技術人員通常理解的相同意義。盡管與本文中所述那些方法和材料相似或等同的任意方法和材料可用于本發明的實施中，然而本文中描述了優選的方法和材料。因而，通過整體地參考本說明書更充分地描述了下文馬上定義的術語。除非本文另外定義，本文中所用的單數形式包括復數指代。除非另外指出，核酸以 5’到3’方向書寫；氨基酸序列以氨基到羧基方向書寫。可以理解本發明不限于描述的具體的方法學、方案和試劑，因為這些取決于本領域技術人員使用它們的背景而可以改變。意圖是，在本說明書通篇范圍內給出的每個最大數字界限包括每個較小的數字界限，如同在本文中清楚地寫出此類較小的數字界限。在本說明書通篇范圍內給出的每個最小數字界限將包括每個較高的數字界限，如同在本文中明確地寫出此類較高的數字界限。 在本說明書通篇范圍內給出的每個數字范圍將包括落入這種較寬泛數字范圍內的每個較窄的數字界限，如同在本文中明確地寫出此類較窄的數字界限。本說明書中提到的全部文件通過引用的方式并入有關部分中。然而，對任一文件的引用不得解釋為承認該文件是本發明的現有技術。如本文中所用，術語2-甲基-1，3-丁二烯(CAS# 78-79-5)( “異戊二烯”)指從 3，3-二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)消去焦磷酸所致的直接和最終揮發性C5烴產物并且不涉及將[一個]IPP分子連接或聚合至[一個]DMAPP分子。如本文中所用，術語“異戊二烯合酶”和“IspS”指催化焦磷酸從二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)消去以形成異戊二烯的酶。 在一些優選的實施方案中，IspS是從植物如葛、楊或紅櫟獲得的酶。在一些實施方案中，術語“ IspS"指天然存在的成熟酶或其部分。相關(和衍生物)蛋白質包含“變體蛋白”。在一些優選的實施方案中，變體蛋白因少數氨基酸殘基而不同于親本蛋白(例如，描述為SEQ ID NO :2的葛IspS或楊IspS)并且彼此不同。不同氨基酸殘基的數目可以是一個或多個，優選地1、2、3、4、5、10、15、20、30、 40、50個或更多個氨基酸殘基。在一些優選的實施方案中，變體之間不同氨基酸的數目在1 到10之間。在一些特別優選的實施方案中，相關蛋白并且特別地變體蛋白包含至少35%、 40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98% 或 99% 氨基酸序列同一性。額外地，如本文中所用的相關蛋白或變體蛋白指在突出區域的數目上不同于另一種相關蛋白或親本蛋白的蛋白質。例如，在一些實施方案中，變體蛋白具有1、2、3、 4、5或10個不同于親本蛋白的相應突出區域。適合產生本發明酶的變體的幾種方法是本領域已知的，包括但不限于位點飽和誘變、掃描誘變、插入誘變、隨機誘變、位點定向誘變和定向進化以及多種其他重組方法。對野生型和突變蛋白的表征通過任何手段或合適“試驗”實現并且優選地基于對目的特性的評估。例如，在本發明的一些實施方案中評估了一個或多個以下特性pH穩定性；溫度穩定性；氧化穩定性；蛋白水解的穩定性；溶解度；DMAPP在體外轉變成異戊二烯的Km和/或比活性；DMAPP在體內在宿主生物(例如，大腸桿菌)的環境下轉變成異戊二烯的Km和/或比活性；和DXP途徑和/或MVA途徑酶的表達。實際上，構思了在一種或多種試驗條件下具有各種程度的穩定性、溶解度、活性和/或表達水平的酶將用于本發明中。如本文中所用，術語“基因”指多核苷酸(例如，DNA區段)，其編碼多肽并包括編碼區之前和之后的區域，以及各個編碼區段(外顯子)之間的間插序列(內含子)。如本文中所用，“同源基因”指來自不同但通常相關的物種中的一對基因，它們相互對應并且是彼此相同或極相似的。該術語包括因物種形成(即，新物種的發展)而隔離的基因(例如，直向同源基因)以及因遺傳重復而隔離的基因(例如，旁系同源基因)。如本文中所用，“直向同源物”和“直向同源基因”指不同物種中因物種形成而已經從共同先祖基因(即同源基因)進化而來的基因。一般而言，直向同源物在進化期間仍保留相同的功能。直向同源物的鑒定用于可靠地預測新測序基因組中的基因功能。
如本文中所用，“旁系同源物”和“旁系同源基因”指由于基因組內部重復而相關的基因。盡管直向同源物在進化期間自始至終保留相同的功能，然而旁系同源物演化出新功能，盡管一些功能經常與原始功能相關。如本文中所用，“同源性”指序列相似性或同一性，優選同一性。這種同源性使用本領域已知的標準技術(見例如，Smith 和 Waterman，Adv. Adv Appl Math, 2 :482,1981 ； Needleman 禾口 Wunsch, J Mol Biol,48 :443,1970 ；Pearson 禾口 Lipman, Proc Natl Acad Sci USA，85 :2444，1988 ；程序如威斯康辛遺傳學軟件包(Wisconsin Genetics Software Package) Genetics Computer Group,Madison, WI 中的 GAP、BESTFIT、FASTA 和 TFASTA 以及 Devereux 等人，Nucl Acid Res, 12 :387-395,1984)確定。如本文中所用，“類似序列”是這樣一種序列，其中基因的功能與基于葛異戊二烯合酶(IspS)或楊IspSdspS)的該基因基本上相同。額外地，類似基因包括與葛異戊二烯合酶序列有至少 45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、 99%或100%序列同一性。在額外的實施方案中，多于一種上文的特性適用于該序列。類似序列由已知的序列比對方法確定。通常使用的比對方法是BLAST，不過如上文及下文所示， 存在也用于比對序列的其他方法。有用算法的一個實例是PILEUP。使用累進配對比對，PILEUP從一組相關序列產生多重序列比對結果。它也可以繪制樹，其中所述樹顯示用來產生該比對結果的聚類關系。PILEUP 使用 Feng 和 Doolittle 累進比對方法(Feng 和 Doolittle，J Mol Evol, 35 351-360,1987)的簡化形式。該方法類似于Higgins和Siarp描述的方法(Higgins和 Sharp, CABIOS 5 :151-153,1989)。有用的PILEUP參數包括默認空位權重3. 00、默認空位長度權重0. 10和加權末端空位。有用算法的另一個例子是Altschul等人(Altschul等人，J Mol Biol,215 403-410，1990 和 Karlin 等人，Proc Natl Acad Sci USA，90 :5873_5787，1993)描述的 BLAST算法。一個特別有用的BLAST程序是WU-BLAST-2程序(見，Altschul等人，Meth Enzymol, 266 =460-480,1996)。WU-BLAST-2使用幾個搜索參數，它們大部分設置為默認值。 設置具有以下值的可調整參數重疊覆蓋區=1，重疊分數=0. 125，字閾值(T) = 11。HSP S和HSP S2參數是動態值并且由程序自身根據特定序列的組成和特定數據庫的組成建立， 其中針對所述的特定數據庫檢索目的序列。然而，可以調整所述值以提高靈敏度。通過匹配性相同殘基數除以所比對區域中“較長”序列的總殘基數來確定％氨基酸序列同一性值。 “較長”序列是比對區域中具有最多實際殘基的序列(忽略由WU-Blast-2導入以最大化比對評分的空位)。因而，“核酸序列同一性百分數(％)”定義為候選序列中與起始序列(即目的序列)的核苷酸殘基相同的核苷酸殘基百分數。優選的方法使用設置成默認參數的 WU-BLAST-2的BLASTN模塊，重疊覆蓋區和重疊分數分別設置成1和0. 125。如本文中所用，術語“雜交”指核酸的一條鏈通過如本領域已知的堿基配對作用與互補鏈結合的過程。若一個核酸序列和一個參比核酸序列在高嚴格性雜交和洗滌條件下彼此特異性雜交，則這兩個核酸序列被視為“選擇性雜交”。雜交條件基于核酸結合復合體或探針的解鏈溫度(Tm)。例如，“最大嚴格性” 一般在約Tm-5°C (該探針Tm以下5°C )出現；“高嚴格性”在該Tm以下約5-10°C出現；“中等嚴格性”在該探針Tm以下約10_20°C出現并且“低嚴格性”在該Tm以下約20-25°C出現。功能上，最大嚴格性條件可以用來鑒定與雜交探針具有嚴格同一性或近乎嚴格同一性的序列；而中等或低嚴格性雜交可以用來鑒定或檢測多核苷酸序列同源物。中等和高嚴格性雜交條件是本領域熟知的。高嚴格性條件的實例包括在約42°C 于 50% 甲酰胺，5 X SSC，5 XDenhardt' s 溶液，0.5% SDS 和 100 μ g/ml 變性載體 DNA 中雜交，隨后在室溫于2X SSC^PO. 5% SDS中洗滌2次并且在42°C于0. IX SSC^PO. 5% SDS中額外洗滌2次。中等嚴格條件的實例包括在37°C于包含20%甲酰胺、5XSSC(150mM NaCl, 15mM檸檬酸三鈉)、50mM磷酸鈉(pH 7. 6) ,5 XDenhardt' s溶液、10%硫酸葡聚糖和20mg/ ml變性剪切鮭精DNA的溶液中孵育過夜，隨后在約37-50°C于1 X SSC中洗滌濾膜。本領域技術人員知道如何按照需要調整溫度、離子強度等以適應諸如探針長度等因素。如本文中所用，“重組體”包括對細胞或載體的指代，其中所述的細胞或載體已經因異源核酸序列導入而修飾或該細胞從如此修飾的細胞衍生。因而，例如重組細胞表達在該細胞的天然(非重組)形式中不以相同形式存在的基因或表達否則因故意人為干預而異常表達、不足表達或根本不表達的天然基因。“重組”、和生成“重組”核酸一般是兩個或多個核酸片段的裝配，其中所述裝配產生嵌合基因。在優選的實施方案中，在至少一個密碼子中用位點飽和誘變法產生突變DNA序列。在另一個優選的實施方案中，對2個或多個密碼子進行位點飽和誘變。在又一個實施方案中，突變DNA序列與野生型序列具有大于50 %、大于55 %、大于60 %、大于65 %、大于 70%、大于75%、大于80%、大于85%、大于90%、大于95%或大于98%同源性。在備選實施方案中，使用任何已知的誘變方法如例如輻射法、亞硝基胍等在體內產生突變DNA。想要的DNA序列隨后分離并且用于本文所提供的方法中。如本文中所用，術語“靶序列”指宿主細胞中編碼下述序列的DNA序列，其中希望將該進入序列插入宿主細胞基因組中。在一些實施方案中，靶序列編碼有功能的野生型基因或操縱子，而在其他實施方案中，靶序列編碼有功能的突變基因或操縱子，或無功能的基因或操縱子。如本文中所用，“側翼序列”指位于所討論序列的上游或下游的任意序列(例如，對于基因A-B-C，基因B側翼為A和C基因序列)。在優選的實施方案中，該進入序列在每一側具有同源盒。在另一個實施方案中，該進入序列和同源盒包含在每一側具有填充序列的單元。在一些實施方案中，側翼序列僅存在于單側(3'或5'側)，但是在優選的實施方案中，它存在于被側翼包圍的序列的每一側。在一些實施方案中，側翼序列僅存在于單側(3 ‘ 或5'側)，而在優選的實施方案中，它存在于被側翼包圍的序列的每一側。如本文中所用，術語“填充序列”指存在于同源盒側翼的任意額外DNA(—般是載體序列)。然而，該術語包括任意非同源的DNA序列。不受任何理論限制，填充序列為細胞提供不重要的靶標用于啟動DNA攝取。如本文中所用，術語“擴增”和“基因擴增”指一個過程，其中特定DNA序列借助該過程不成比例地復制，從而擴增的基因以高于基因組中最初存在的拷貝數存在。在一些實施方案中，通過藥物(例如可可抑制酶的抑制物)存在下的生長而選擇細胞，這導致編碼在該藥物存在下生長所需的基因產物的內源基因擴增，或通過擴增編碼這種基因產物的外源(即，輸入)序列或這兩種方式選擇細胞。“擴增”是涉及模板專一性的核酸復制的特定情況。它應與非特定模板復制(即具有模板依賴性但不依賴于特定模板的復制)形成對比。模板專一性這里與復制忠實性(即合成正確的多核苷酸序列)和核苷酸(核糖或脫氧核糖)特異性相區別。模板專一性經常按照“靶”特異性而描述。靶序列在如此意義上是“靶”，在該意義上試圖將它們與其他核酸分選出來。已經設計主要用于這種分選過程的擴增技術。如本文中所用，術語“共擴增”指將可擴增的標記連同其他基因序列(即包含一個或多個不可選擇的基因，如表達載體內包含的那些基因)導入單個細胞并且施加適宜的選擇壓力，從而該細胞擴增這個可擴增的標記和其余不可選擇的基因序列。可擴增的標記可以與其余基因序列物理上連接，或備選地，可以將兩個分開的DNA片段(一個片段含有可擴增的標記并且另一個片段含有不可選擇的標記)導入相同細胞。如本文中所用，術語“可擴增的標記”、“可擴增的基因”和“擴增載體”指允許該基因在適宜生長條件下擴增的基因或編碼該基因的載體。在大多數擴增技術中通過選擇酶來實現“模板專一性”。擴增酶是在使用這些酶的條件下僅會加工核酸的不均一混合物中特定核酸序列的酶。例如在復制酶的情況下， MDV-I RNA是該復制酶的專一模板(見例如Kacian等人，Proc Natl Acad Sci USA 69 3038，1972)并且其他核酸不被這種擴增酶復制。類似地，在T7RNA聚合酶的情況下，這種擴增酶具有對其自身啟動子的嚴格專一性(見Chamberlin等人，Nature 228 :227 (1970))。在 T4DNA連接酶的情況下，該酶不會連接兩個寡核苷酸或多核苷酸，其中該寡核苷酸或多核苷酸底物與模板之間在連接接頭處存在錯配(見mi和Wallace，Genomics 4 :560，1989)。最后，因Taq和Pfu聚合酶在高溫下發揮作用的能力，發現這兩種酶針對被引物結合并且因而限定的序列表現出高度專一性；所述高溫產生了熱動力學條件，其有利于引物與靶序列雜交并且不與非靶序列雜交。如本文中所用，術語“可擴增的核酸”指可以通過任意擴增方法擴增的核酸。構思了 “可擴增的核酸”通常會包含“樣品模板”。如本文中所用，術語“樣品模板”指源自某樣品的核酸，其中對所述樣品分析(下文定義的)“靶”的存在。相反，“背景模板”用來指并非樣品模板的核酸，它可能存在或可能不存在于樣品中。背景模板最經常是偶然存在的。它可能是攜帶污染的結果，或它可能歸因于存在試圖從該樣品中純化出去的核酸雜質。例如，源自除待檢測生物之外生物的核酸可以作為背景存在于試樣中。如本文中所用，術語“引物”指寡核苷酸，無論天然存在(如存在于純化的限制性消化產物中)或合成產生，其中當置于誘導與一條核酸鏈互補的引物延伸產物合成的條件下(即存在核苷酸和誘導物質(如DNA聚合酶)并在適宜的溫度和pH下)時，所述寡核苷酸能夠充當合成的起始點。引物優選地是單鏈的，旨在擴增中效率最大，不過備選地可以是雙鏈的。如果是雙鏈的，則首先處理該引物以使其鏈在使用前分開以制備延伸產物。優選地，引物是寡脫氧核糖核苷酸。引物必須足夠地長以在誘導物質存在下引發延伸產物的合成。引物的確切長度將取決于眾多因素，包括溫度、引物來源和方法的使用。如本文中所用，術語“探針”指能夠與另一種目的寡核苷酸雜交的寡核苷酸(即核苷酸序列)，無論是天然存在的(如存在于純化的限制性消化產物中)或合成地、重組地或通過PCR擴增產生的。探針可以是單鏈的或雙鏈的。探針可用于檢測、鑒定和分離特定的基因序列。構思的是，本發明中所用的任意探針將用任何“報道分子”標記，從而是可在任意檢測系統中檢測到的，所述的檢測系統包括，但不限于酶系統(例如ELISA以及基于酶的組織化學測定法)、熒光系統、放射性系統和化學發光系統。不意圖使本發明限于任何特定的檢測系統或標記物。如本文中所用，在關于聚合酶鏈反應使用時，術語“靶”指被用于聚合酶鏈反應的引物結合的核酸區域。因而，試圖將“靶”與其他核酸序列分選出來。“區段”定義為該靶序列內部的核酸區域。如本文中所用，在一個實施方案中，術語“聚合酶鏈反應”(“PCR”)指通過引用方式并入的美國專利號4，683，195,4, 683，202和4，965，188的方法，所述方法包括用于提高基因組DNA混合物中靶序列區段的濃度而不進行克隆或純化的方法。用于擴增靶序列的這種方法由以下組成導入大量過量的兩種寡核苷酸引物至含有預期靶序列的DNA混合物， 隨后是在DNA聚合酶存在下的一系列精確熱循環。兩條引物互補于雙鏈靶序列的各自鏈。 為實現擴增，將混合物變性并且所述引物隨后與靶分子內它們的互補序列復性。復性后，引物用聚合酶延伸，從而形成新的一對互補鏈。變性、引物復性和聚合酶延伸的步驟可以重復許多次(即，變性、復性和延伸構成一個“循環”；可以存在眾多“循環”)以獲得所需靶序列的高濃度擴增區段。所需靶序列的擴增區段的長度由引物彼此的相對位置決定，并且因而，這個長度是可控參數。由于該過程的重復方面，將該方法稱作“聚合酶鏈反應”(下文 “PCR”)。因為靶序列的所需擴增區段在該混合物中變成優勢序列(就濃度而言)，所以稱它們被“PCR擴增”。如本文中所用，術語“擴增試劑”指除引物、核酸模板和擴增酶之外的為擴增所需的那些試劑(脫氧核糖核苷酸三磷酸、緩沖液等)。一般而言，將擴增試劑連同其他反應組分放置并納入反應容器(試管、微孔等)中。采用PCR，可以擴增基因組DNA中特定靶序列的單拷貝至幾種不同方法學(例如， 與標記的探針雜交；摻入生物素化引物，隨后是抗生物素蛋白-酶綴合物檢測；將32P-標記的脫氧核苷酸三磷酸如dCTP或dATP摻入擴增的區段)可檢測的水平。除基因組DNA之外， 任意的寡核苷酸或多核苷酸序列還可以用適宜的成套引物分子擴增。特別地，由PCR方法自身產生的擴增區段本身是后續PCR擴增的有效模板。如本文中所用，術語“PCR產物”、“PCR片段”和“擴增產物”指兩輪或多輪變性、復性和延伸PCR步驟結束后所得的化合物混合物。這些術語包括其中已經擴增一個或多個靶序列的一個或多個區段的情況。如本文中所用，術語“RT-PCR”指RNA序列的復制和擴增。在這個方法中，逆轉錄偶聯于PCR，最經常地使用其中使用熱穩定性聚合酶的單一酶方法，如通過引用方式并入本文的美國專利號5，322，770中所述。在RT-PCR，RNA模板因該聚合酶的逆轉錄酶活性轉化成cDNA，并隨后使用該聚合酶的聚合活性(即，如其他PCR方法中那樣)擴增。如本文中所用，術語“限制性核酸內切酶”和“限制酶”指細菌酶，其各自在特定核苷酸序列處或其附近切割雙鏈DNA。“限制性位點”指被給定限制性核酸內切酶識別和切割并往往作為DNA片段插入位點的核苷酸序列。在本發明的某些實施方案中，將限制性位點工程化到DNA構建體的選擇標記中和5'和3'末端中。如本文中所用，術語“染色體整合”指進入序列借以導入宿主細胞染色體的過程。 轉化性DNA的同源區與染色體的同源區域對齊。隨后，同源盒之間的序列在雙交換(即，同源重組)中被進入序列替換。在本發明的一些實施方案，DNA構建體的失活性染色體區段的同源部分與埃希氏菌屬染色體的固有染色體區域的側翼同源區對齊。隨后，該固有染色體區域由該DNA構建體在雙交換(即，同源重組)中缺失。“同源重組”意指在兩個DNA分子或配對染色體之間在相同或幾乎相同的核苷酸序列位點處DNA片段的交換。在優選的實施方案中，染色體整合是同源重組。如本文中所用， “同源序列”意指在最佳對比用于比較時，與另一個核酸或多肽序列具有100<%、99%、98%、 97%,96%,95%,94%,93%,92%,91%,90%,88%,85%,80%,75%^； 70%序列同一性的核酸或多肽序列。在一些實施方案中，同源序列具有85%到100%之間的序列同一性，而在其他實施方案中，存在90%與100%之間的序列同一性，并且在更優選的實施方案中，存在 95%與100%之間的序列同一性。如本文中所用，“氨基酸”指肽或蛋白質序列或其部分。術語“蛋白質”、“肽”和“多肽”可互換地使用。如本文中所用，術語“異源蛋白，，指不天然存在于宿主細胞中的蛋白質或多肽。異源蛋白的實例包括酶，如異戊二烯合酶。在一些實施方案中，編碼所述蛋白質的基因是天然存在的基因，而在其他實施方案中，使用突變基因和/或合成的基因。如本文中所用，“同源蛋白，，指細胞中固有或天然存在的蛋白質或多肽。在優選的實施方案中，所述細胞是革蘭氏陰性細胞，而在特別優選的實施方案中，該細胞是埃希氏菌屬宿主細胞。如果一種酶在宿主細胞中以高于它在相應野生型細胞中表達的水平表達，則該酶 “過量表達”于此細胞中。術語“蛋白質”和“多肽”在本文中互換地使用。在本公開通篇范圍內使用如按照 UPAC-IUB生物化學命名聯合委員會(JCBN)所定義的氨基酸3字母代碼。也可以理解由于遺傳密碼子的簡并性，多肽可以由多于一種核苷酸序列編碼。術語蛋白質或肽的“成熟”形式指該蛋白質或肽的最終功能形式。例如，葛異戊二烯合酶的成熟形式包括SEQ ID NO :2的氨基酸序列。術語“前體”形式的蛋白質或肽指蛋白質的成熟形式，其具有與該蛋白質氨基端或羧基端有效連接的前序列。該前體也可以具有與該前序列的氨基端有效連接的“信號”序列。該前體也可以具有參與翻譯后活性的額外多核苷酸(例如從中切除以形成蛋白質或肽的成熟形式的多核苷酸)。“天然存在酶”指一種酶，其具有與自然界中存在的氨基酸序列相同的未修飾的氨基酸序列。天然存在酶包括天然酶，即特定微生物中天然表達或發現的那些酶。 在兩個核酸序列或多肽序列的環境中，術語“相同的”指這兩個序列中為最大對應性進行比對時相同的殘基，如使用以下序列比較或分析算法之一測量。術語“最佳比對”指產生最高同一性百分數評分的比對。“序列同一性百分數”、“氨基酸序列同一性百分數”、“基因序列同一性百分數”和 /或“核酸/多核苷酸序列同一性百分數”就兩個氨基酸序列、多核苷酸序列和/或基因序列(根據需要)而言，指在最佳比對兩個序列時這兩個序列中相同的殘基的百分數。因而， 80 %氨基酸序列同一性意指這兩個最佳比對的多肽序列中80 %氨基酸是相同的。在兩個核酸或多肽的環境下，短語“基本上相同的”因而指下述多核苷酸或多肽， 其中使用程序或算法(例如BLAST、ALIGN、CLUSTAL)，使用標準參數，與參考序列相比時， 所述多核苷酸或多肽包含至少70%序列同一性、優選至少75%、優選至少80%、優選至少 85 %、優選至少90 %、優選至少95 %、優選至少97 %、優選至少98 %并且優選至少99 %序列同一性。兩個多肽基本上相同的一個指標是第一多肽與第二多肽具有免疫學交叉反應。一般而言，因保守氨基酸替換而不同的多肽是免疫學交叉反應的。因而，例如，一個多肽與第二多肽基本上相同，其中這兩個肽僅因保守性替換而不同。兩個核酸序列基本上相同的另一個指標是這兩個分子在嚴格條件(例如，中等至高嚴格性范圍內)下相互雜交。術語“分離的”或“純化的”指從其原始環境(例如天然環境，若它是天然存在的) 中移出的物質。例如，該物質在特定組合物中以高于或低于天然存在生物或野生型生物 (例如，葛)中的濃度存在或與從天然存在生物或野生型生物表達時通常不存在的組分組合存在時，稱該物質是“純化”的。例如，活動物中存在的天然存在的多核苷酸或多肽不是分離的，然而與該天然系統中一些或全部共存物質分開的相同多核苷酸或多肽是分離的。 此類多核苷酸可以是載體的一部分和/或此類多核苷酸或多肽可以是組合物的一部分，并且仍是分離的，因為這種載體或組合物不是其天然環境的一部分。例如在優選的實施方案中，如果核酸或蛋白質在電泳凝膠或印跡中產生基本上一條帶，則稱該核酸或蛋白質是純化的。關于DNA序列使用時，術語“分離的”指一種DNA序列，它已經從其天然遺傳環境中被移出并且因而不含有其他外部或不想要的編碼序列，并且處在適合用于基因工程蛋白質產生系統中的形式。關于重組DNA序列使用時，術語“分離的”指一種DNA序列，它已經從宿主生物的天然遺傳環境中被移出并且因而不含有其他外部或不想要的編碼序列(例如， 大腸桿菌中增殖的葛IspS表達載體)。此類分離的分子是與其天然環境分開的那些分子并且包括cDNA和基因組克隆。本發明的分離的DNA分子不含有通常與之結合的其他基因， 但可以包含天然存在的5'和3'非翻譯區如啟動子和終止子。結合區域的鑒定將對本領域普通技術人員而言是顯而易見的(見，例如Dynan和Ti jan，Nature 316 =774-78,1985) 術語“分離的DNA序列”備選地稱作“克隆的DNA序列”。當關于蛋白質使用時，術語“分離的”指在其天然環境以外的條件下發現的蛋白質。在優選的形式中，分離的蛋白質基本上不含其他蛋白質，特別是其他同源蛋白。關于重組產生的蛋白質使用時，術語“分離的”指一種蛋白質，它已經從宿主生物的蛋白質環境中被移出并且因而不含有其他外部或不想要的蛋白質(例如，大腸桿菌中產生的重組葛 IspS) 0如SDS-PAGE所測定，分離的蛋白質是大于10%純的、優選大于20%純的并且甚至更優選大于30%純的。本發明的其他方面包括高度純化形式(即，大于40%純的、大于60% 純的、大于80%純的、大于90%純的、大于95%純的、大于97%純的并且甚至大于99%純) 的蛋白質，如SDS-PAGE所測定。以下的盒誘變方法可以用來輔助本發明酶變體的構建，盡管可以使用其他方法。 首先，如本文中所述，獲得編碼該酶的天然存在基因并將它完全或部分地測序。隨后，掃描該序列的一個點，其中想要在編碼的酶中產生在所述點處的一個或多個氨基酸的突變(缺失、插入或替換)。對該點側翼的序列評價限制性位點的存在性，旨在以表達時會編碼多種突變體的寡核苷酸庫替代該基因的短區段。此類限制性位點優選地是該蛋白質基因內部的獨特位點，從而有助于替代該基因區段。然而，可以使用該酶基因中不過度冗余的任何便利限制性位點，前提是由限制性消化產生的基因片段可以按正確順序再裝配。如果限制性位點不存在于距離所選位點的便利距離(從10至15個核苷酸)內的位置處，則通過在最終構建中既不改變可讀框，也不改變所編碼氨基酸的方式替換該基因中的核苷酸來產生此類位點。根據廣泛已知的方法，通過M13引物延伸作用實現對基因的突變旨在改變其序列以符合所希望的序列。定位合適的側翼區并評價需要的改變以獲得兩個便利限制性位點序列的任務通過遺傳密碼冗余性、該基因的限制酶圖譜和大量不同的限制酶而變成例行工作。應指出，如果便利的側翼限制性位點是可獲得的，則上述方法僅需要聯合不含位點的側翼區使用。一旦克隆天然存在的DNA和/或合成性DNA，位于待突變位置側翼的限制性位點用同族限制酶消化并且將多個末端互補性寡核苷酸盒連接到該基因中。誘變通過這種方法簡化，因為全部寡核苷酸均可以合成，從而具有相同的限制性位點并且不需要合成性接頭以產生限制性位點。如本文中所用，“對應于”指在蛋白質或肽中所枚舉位置處的殘基，或與蛋白質或肽中所枚舉殘基的類似、同源或等同的殘基。如本文中所用，“相應區域”通常指沿相關蛋白或親本蛋白的類似位置。如本文中所用，術語“組合誘變法”指其中產生起始序列變體文庫的方法。在這些文庫中，所述變體含有選自預定義突變集合的一個或幾個突變。此外，所述方法提供了導入隨機突變的手段，其中所述的隨機突變不是預定義突變集合的成員。在一些實施方案中，所述方法包括通過引用方式并入的美國申請號09/699,250中所述的那些方法。在備選的實施方案中，組合誘變方法包括市售試劑盒(例如，QUIKCHANGE多位點誘變試劑盒， Stratagene, San Diego, CA)0如本文中所用，術語“突變體文庫”指一群細胞，它們在其絕大部分的基因組中相同但包括一個或多個基因的不同同源物。此類文庫可以用來例如鑒定具有改良性狀的基因或操縱子。如本文中所用，術語“起始基因”和“親本基因”指編碼待使用本發明予以改進和/ 或改變的目的蛋白的目的基因。如本文中所用，術語“多重序列比對”和“MSA”指使用一種算法(例如，Clustal W) 進行比對的一個起始基因的多個同源物的序列。如本文中所用，術語“共有序列，，和“規范序列，，指原型氨基酸序列，具體目的蛋白質或目的序列的全部變體與之進行比較。該術語也指一種序列，其給出目的DNA序列中最經常存在的核苷酸。對于基因的每個位置，共有序列給出了 MSA中該位置內最多見的氨基酸。如本文中所用，術語“共有突變”指起始基因和共有序列的序列中差異。共有突變通過比較起始基因和從MSA所獲得共有序列的序列進行鑒定。在一些實施方案中，將共有突變導入起始基因，從而起始基因變得更相似于共有序列。共有突變也包括將起始基因中的氨基酸改變成下述氨基酸的氨基酸變化，其中所述氨基酸相對于該氨基酸在起始基因中的頻率更頻繁地存在于MSA中該位置處。因而，術語“共有突變”包含這樣的全部單個氨基酸改變，它們將起始基因的一個氨基酸替換為豐度高于MSA中該氨基酸的豐度的一種氨基酸。術語“修飾的序列”和“修飾的基因”在本文中互換地用來指包括天然存在的核酸序列的缺失、插入或中斷的序列。在一些優選的實施方案中，修飾序列的表達產物是截短的蛋白質(例如，該修飾是序列的缺失或中斷時)。在一些特別優選的實施方案中，這種截短的蛋白質仍保留生物學活性。在備選的實施方案中，修飾序列的表達產物是延長的蛋白質 (例如，包含核酸序列中一個插入的修飾)。在一些實施方案中，插入導致截短的蛋白質(例如，該插入導致終止密碼子的形成時)。因而，插入可以產生截短的蛋白質或延長的蛋白質作為表達產物。如本文中所用，術語“突變序列”和“突變基因”互換地使用并且指在宿主細胞的野生型序列中出現的至少一個密碼子中具有改變的序列。該突變序列的表達產物是具有相對于野生型而言已改變的氨基酸序列的蛋白質。該表達產物可以具有改變的功能性能力(例如，增強的酶活性)。(本文中互換地使用的)術語“誘變引物”或“誘變寡核苷酸”意圖指與模板序列的一部分相對應并且能夠與之雜交的寡核苷酸組合物。就誘變引物而言，該引物不會精確地匹配模板核酸，利用該引物中的錯配或多個錯配以將想要的突變導入核酸文庫中。如本文中所用，“非誘變引物”或“非誘變寡核苷酸”指與模板核酸精確匹配的寡核苷酸組合物。 在本發明的一個實施方案，僅使用誘變引物。在本發明的另一個優選實施方案中，所述引物如此設計，從而對于已經包括誘變引物的至少一個區域，也存在包含于寡核苷酸混合物中的非誘變引物。通過添加誘變引物和與所述誘變引物至少之一相對應的非誘變引物的混合物，可能產生所得核酸文庫，其中存在多種組合突變模式。例如，如果想要的是該突變核酸文庫的一些成員仍在某些位置處保留其親本序列，而其他成員在此類位點處是突變的， 則所述非誘變引物提供以下能力針對給定殘基獲得該核酸文庫內部特定水平的非突變成員。本發明的方法使用一般是10-50之間堿基長度、更優選約15-45堿基長度的誘變和非誘變寡核苷酸。然而，可能需要使用短于10個堿基或長于50個堿基的引物以獲得想要的誘變結果。就相應的誘變和非誘變引物而言，相應的寡核苷酸應當具有相同長度不是必需的，但是僅需要與待添加突變相對應的區域內存在重疊。引物可以按本發明的預定比率添加。例如，如果想要的是所得文庫在相同或不同的位點處具有明顯水平的某種特定突變和較少量的不同突變，則通過調整添加的引物數量，可能產生想要的偏倚文庫。或者，通過添加更少或更多數量的非誘變引物，可以調節突變核酸文庫中產生相應突變的頻率。術語“野生型序列”和“野生型基因”在本文中互換地用來指宿主細胞中固有或天然存在的序列。在一些實施方案中，野生型序列指作為蛋白質工程化項目起點的目的序列。 此野生型序列可以編碼同源或異源蛋白。同源蛋白是無干預下宿主細胞將產生的蛋白質。 異源蛋白是宿主細胞本不會產生但因干預而產生的蛋白質。如本文中所用，術語“裂解物”指含有裂解細胞內容物的溶液。在一些實施方案中， 裂解物是細菌細胞裂解物(例如，使用來自Epicentre的READYLYSE 溶菌酶溶液裂解的大腸桿菌細胞；或使用弗氏細胞壓碎器裂解的大腸桿菌細胞)。
如本文中所用的術語“溶菌酶”指一種葡糖苷酶，其水解N-乙酰基胞壁酸與N-乙酰葡糖胺之間的鍵，從而切開許多細菌的細胞壁中的重要聚合物。隨本發明使用的合適溶菌酶包括但不限于雞蛋清溶菌酶(Sigma)、T4溶菌酶、重組的非哺乳動物非鳥類溶菌酶 (READYLYSE )或真菌溶菌酶。如本文中所用，術語“頂空”指在密封容器中固體或液體樣品上方所截獲的蒸汽/ 空氣混合物。如本文中所用，術語“高通量篩選法”和“HTS”指以4小時或更少時間測量至少96 份樣品中的異戊二烯。在優選的實施方案中，樣品容積小于2mL。除非另外說明，全部組分或組合物的水平指該組分或組合物的有效水平，并且排除了雜質，例如可能存在于市售原料中的殘余溶劑或副產物。酶組分重量以總的活性蛋白質為基礎。除非另外說明。全部百分數和比率以重量計算。除非另外說明，全部百分數和比率基于總的組成計算。發明詳述異戊二烯單體用于聚異戊二烯和多種共聚物(與異丁烯、丁二烯、苯乙烯或其他單體)的制造中。為建立能夠產生商業可行水平的異戊二烯的(原核或真核)菌株，要求優化MVA至異戊二烯或DXP至異戊二烯的整條途徑。該途徑中的一種關鍵酶是異戊二烯合酶(IspS)，它將前體DMAPP轉化成異戊二烯。迄今鑒定的異戊二烯合酶(IspQ僅是來自植物(如楊、歐洲櫟和葛藤)的那些異戊二烯合酶。雖然一些細菌(如枯草芽孢桿菌)也產生異戊二烯，然而原核IspS仍待鑒定并且芽孢桿菌屬中的天然IspS活性不足夠用于商業過程。已經部分地通過大腸桿菌中的表達局部地表征了迄今鑒定的植物IspS酶，并且已經用純化的蛋白質在體外確定這些酶的一些動力學參數。然而，天然IspS酶的動力學參數 (Km、速率等)不足夠用于生物宿主中異戊二烯的商業生產。為解決如本文中所述的這個問題，在細菌宿主中表達植物IspS。另外，該IspS工程化以改變目的特性。對野生型和突變IspS的表征通過任何手段或合適“試驗”實現并且優選地基于對目的特性的評估。目的特性包括，但不限于最適PH、溫度穩定性(例如，Tffl 值)、胞內和胞外溶解度、Kffl值、kcat值或比活性，以及對潛在抑制物(包括底物)的靈敏度或產物抑制作用。氧化穩定性及蛋白水解穩定性也是目的特性。另外，因金屬離子效應和離子強度所致的激活作用或抑制作用是目的特性。可以通過體外用純化或部分純化的異戊二烯合酶或體內在表達DXP途徑、MVA途徑或這兩者的宿主生物(如大腸桿菌)環境下將 DMAPP轉化成異戊二烯，評估這些特性和參數。構思了在一種或多種試驗條件下具有各種程度的穩定性、溶解度、活性和/或表達水平的酶將用于本發明中以在多種宿主中產生異戊二烯。需要以經濟的方式研究這些特性的高通量方法，如實施例10中所述的那些方法。本發明描述了產生增加量的異戊二烯的組合物和方法。特別地，這些組合物和方法提高異戊二烯產生的速率并增加所產生異戊二烯的總量。用于本文中所述異戊二烯產生的生物合成方法是使用天然橡膠的想要的備選方案。如下文進一步討論，可以通過編碼異戊二烯合酶(IspQ多肽的異源核酸導入細胞而大大增加由該細胞產生的異戊二烯的量。 異戊二烯合酶多肽將二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)轉化成異戊二烯。如實施例中所示，在革蘭氏陰性細菌細胞(例如，大腸桿菌)中表達異源葛麻姆(葛)異戊二烯合酶多肽及其變體。還在實施例中顯示和在本發明的范圍構思了在革蘭氏陰性細菌細胞(例如，大腸桿菌)中表達楊異戊二烯合酶多肽及其變體。植物IspS在細菌宿主細胞中的異源表達導致比缺少該植物IspS的相應細胞產生更多的異戊二烯。已經顯示，使蛋白酶表面上的氨基酸殘基突變可以改善酶的活性、表達和穩定性 (W02008/153925、W02008/153934、W02008/153935)。出乎意料地，我們發現使一種完全不同的酶，即異戊二烯合酶的表面上的氨基酸殘基突變可以增強該酶的表達、溶解度和活性。 L70R是這種有益表面突變的的一個實例。闡明酶的三維結構對于精確鑒定其表面上的氨基酸殘基是必需的。使用下述結構的同源建模可以揭示所建模的結構的大體方面，但是不足以精確地鑒定表面暴露的殘基并量化它們的表面暴露程度，其中所述的結構具有與異戊二烯合酶(例如，龍腦基合酶和苧烯合酶，結構已知的與異戊二烯合酶具有最密切同一性的酶)大約40%同一性的序列。氨基酸殘基的表面暴露由其側鏈的溶劑可及性表面積百分數量化。異戊二烯合酶中突變的以下分類可以通過靶定下述氨基酸殘基改善該酶的溶解度，其中所述的氨基酸殘基是> 50%暴露于溶劑的，優選地是> 65%暴露于溶劑的并且最優選地是> 85%暴露于溶劑的疏水性一帶正電荷，并且反之亦然疏水性一帶負電荷，并且反之亦然疏水性一中性極性，并且反之亦然中性極性一帶正電荷，并且反之亦然中性極性一帶負正電荷，并且反之亦然帶正電荷一帶負電荷，并且反之亦然另外，由含有異源異戊二烯合酶核酸的細胞的異戊二烯生產可以通過增加由該細胞表達的1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(DXQ多肽和/或異戊烯二磷酸異構酶(IDI) 多肽的量來增強。例如，DXS核酸和/或IDI核酸可以導入該細胞。該DXS核酸可以是異源核酸或是內源核酸的重復拷貝。類似地，該IDI核酸可以是異源核酸或是內源核酸的重復拷貝。在一些實施方案中，通過DXS和/或IDI內源啟動子或調節區替換為導致DXS和 /或IDI核酸更大轉錄的其他啟動子和/或調節區來增加DXS和/或IDI多肽的量。在一些實施方案中，該細胞含有編碼異戊二烯合酶多肽(例如，植物異戊二烯合酶核酸)的異源核酸和編碼異戊二烯合酶多肽的內源核酸的重復拷貝。編碼的DXS和IDI多肽是生物合成異戊二烯的DXP途徑的組成部分(圖15)。DXS 多肽將丙酮酸和D-甘油醛-3-磷酸轉化成1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸。盡管不意圖受任何具體理論限制，然而認為增加DXS多肽的量增加了經過DXP途徑的碳通量，從而導致更大的異戊二烯生產。IDI多肽催化異戊烯二磷酸(IPP)和二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)互變。盡管不意圖受任何具體理論限制，然而認為增加細胞中IDI多肽的量增加了被轉化成 DMAPP的IPP的量，所述DMAPP又被轉化成異戊二烯。在一些實施方案中，由含有異源異戊二烯合酶核酸的細胞所致的異戊二烯生產可以通過增加該細胞中MVA多肽的表達來增強(圖15)。示例性MVA途徑多肽包括任意的以下多肽乙酰-CoA酰基轉移酶(AA-CoA硫解酶)多肽、3-羥基-3-甲基戊二酰-CoA合酶 (HMG-CoA合酶)多肽、3-羥基-3-甲基戊二酰-CoA還原酶(HMG-CoA還原酶)多肽、甲羥戊酸激酶(MVK)多肽、磷酸甲羥戊酸激酶(PMK)多肽、二磷酸甲羥戊酸脫羧酶(MVD)多肽、 IDI多肽和具有兩種或多種MVA途徑多肽活性的多肽(例如融合多肽)。例如，一種或多種 MVA途徑核酸可以導入該細胞。在一些實施方案中，該細胞含有上方MVA途徑，該途徑包括 AA-CoA硫解酶核酸、HMG-CoA合酶核酸和HMG-CoA還原酶核酸。在一些實施方案中，該細胞含有下方MVA途徑，該途徑包括MVK核酸、PMK核酸、MVD核酸和IDI核酸。在一些實施方案中，該細胞含有整個MVA途徑，該途徑包括AA-CoA硫解酶核酸、HMG-CoA合酶核酸、HMG-CoA 還原酶核酸、MVK核酸、PMK核酸、MVD核酸和IDI核酸。MVA途徑核酸可以是異源核酸或是內源核酸的重復拷貝。在一些實施方案中，通過MVA途徑核酸的內源啟動子或調節區替換為導致所述MVA途徑核酸更多轉錄的其他啟動子和/或調節區來增加一種或多種MVA途徑多肽的量。在一些實施方案中，該細胞含有編碼異戊二烯合酶多肽(例如，植物異戊二烯合酶核酸)的異源核酸和編碼異戊二烯合酶多肽的內源核酸的重復拷貝。在一些實施方案中，至少一部分細胞在連續培養物(如無稀釋的連續培養)中保留異源異戊二烯合酶核酸、DXS核酸、IDI核酸和/或MVA途徑核酸至少約5、10、20、50、75、 100、200、300次或更多次細胞分裂。在本發明任意方面的一些實施方案中，包含內源異戊二烯合酶核酸、DXS核酸、IDI核酸和/或MVA途徑核酸之異源或重復拷貝的核酸也包含選擇標記如卡那霉素、氨芐青霉素、羧芐西林、慶大霉素、潮霉素、腐草霉素、博來霉素、新霉素或氯霉素抗生素抗性核酸。I.示例性多肽和核酸多種異戊二烯合酶、DXS、IDI和/或MVA途徑多肽和核酸可以用于本發明的組合物和方法中。如本文中所用，“多肽”包括下述多肽、蛋白質、肽、多肽片段和融合多肽，它們包含第一多肽(例如，異戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途徑多肽)的部分或全部和第二多肽(例如，輔助純化或檢測融合多肽的肽，如His標記)的部分或全部。在一些實施方案中，融合多肽具有兩種或多種MVA途徑多肽(如AA-CoA硫解酶和HMG-CoA還原酶多肽)的活性。在一些實施方案中，該多肽是具有兩種或多種MVA途徑多肽活性的天然存在多肽(如糞腸球菌mvaE核酸編碼的多肽)。在多種實施方案中，多肽具有至少或約50、100、150、175、200、250、300、350、400
個或更多個氨基酸。在一些實施方案中，多肽片段含有來自全長多肽的至少或約25、50、 75、100、150、200、300個或更多個連續氨基酸并具有相應全長多肽的至少或約5%、10%、 20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%，或 100%活性。在特定的實施方案中， 所述多肽包括任意的天然存在異戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途徑多肽的區段或完整氨基酸序列。在一些實施方案中，與野生型異戊二烯合酶、DXS、IDI，或MVA途徑多肽的序列(即， 自然界中存在的序列)相比，該多肽具有一個或多個突變。在一些實施方案中，該多肽是分離的多肽。如本文中所用，“分離的多肽”不是多肽文庫(如2、5、10、20、50種或更多種不同多肽的文庫)的部分并且同自然界中與之共存的至少一種組分分開。分離的多肽可以例如通過表達編碼該多肽的重組核酸獲得。在一些實施方案中，該多肽是異源多肽。“異源多肽”意指一種多肽，其中所述多肽的氨基酸序列與相同宿主細胞中天然表達的另一種多肽的氨基酸序列相同。如本文中所用，“核酸”指單鏈或雙鏈形式的兩個或多個脫氧核糖核苷酸和/或核
28糖核苷酸。在一些實施方案中，該核酸是重組核酸。“重組核酸”意指不含下述一種或多種核酸(例如，基因)的目的核酸，其中所述的一種或多種核酸在自然界中存在的衍生該目的核酸的生物的基因組中分布于該目的核酸側翼。該術語因而包括例如不依賴于其他序列而摻入載體、摻入自主復制型質粒或病毒或摻入原核生物或真核生物的基因組DNA或作為獨立分子存在(例如，通過PCR或限制性核酸內切酶消化產生的cDNA、基因組DNA片段或cDNA 片段)的重組DNA。在多種實施方案中，該核酸是重組核酸。例如，在一些實施方案中，一種異戊二烯合酶核酸、DXS核酸、IDI核酸或MVA途徑核酸與編碼另一種多肽的全部或部分的另一種核酸有效連接，從而該重組核酸編碼一種融合多肽，其包括異戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途徑多肽和另一種多肽(例如，輔助純化或檢測該融合多肽的肽，如His標記)的全部或部分。在一些實施方案中，化學合成重組核酸的部分或全部。在一些實施方案中，該核酸是異源核酸。“異源核酸”意指一種核酸，其核酸序列與相同宿主細胞中天然發現的另一種核酸的核酸序列不同。在特定實施方案中，該核酸包括任意的天然存在的異戊二烯合酶核酸、DXS核酸、 IDI核酸或MVA途徑核酸的區段或完整核酸序列。在一些實施方案中，該核酸包括來自天然存在的異戊二烯合酶核酸DXS、IDI或MVA途徑核酸的至少或約50、100、150、200、300、400、 500、600、700、800個或更多連續核苷酸。在一些實施方案中，與異戊二烯合酶、DXS、IDI，或 MVA途徑核酸的野生型序列(S卩，自然界中存在的序列)相比，該核酸具有一個或多個突變。 在一些實施方案中，該核酸具有增加異戊二烯合酶核酸、DXS核酸、IDI核酸或MVA途徑核酸轉錄或翻譯的一個或多個突變(例如，沉默突變)。在一些實施方案中，該核酸是編碼異戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途徑多肽的任意核酸的簡并變體。“密碼子簡并性”指遺傳密碼中的趨異性，其允許核苷酸序列變異而不影響所編碼多肽的氨基酸序列。技術人員非常熟悉特定宿主細胞在指示給定氨基酸的核苷酸密碼子選擇上所表現的“密碼子偏倚”。因而，當合成用以改善在宿主細胞中表達的核酸時，在一些實施方案中想要的是如此設計該核酸，使得它的密碼子選擇頻率接近于該宿主細胞的優選密碼子選擇頻率。示例性異戊二烯合酶DXS、IDI和/或MVA途徑多肽和核酸的檢索號列于通過引用方式完整并入本文的美國申請號61/013，574的附件1中，特別就異戊二烯合酶、DXS、IDI和 /或MVA途徑多肽和核酸的氨基酸序列和核酸序列而言。Kegg數據庫也含有眾多示例性異戊二烯合酶、DXS、IDI和/或MVA途徑多肽和核酸的氨基酸和核酸序列(見，例如，在互聯網 “ genome. jp/kegg/pathway/map/map00100. html ”處及其中序列，所述網址和序列各自通過引用的方式完整并入，特別是異戊二烯合酶、DXS、IDI和/或MVA途徑多肽和核酸的氨基酸序列和核酸序列方面)。在一些實施方案中，一種或多種異戊二烯合酶、DXS、IDI和/或MVA 途徑多肽和/或核酸與2007年12月12日公眾可獲得的序列(如與美國申請號61/013，574 附件1中的任意檢索號相對應的任意序列或到本申請的申請日時存在于Kegg數據庫中的任意序列)具有序列同一性。下文進一步描述額外的示例性異戊二烯合酶、DXS、IDI和/ 或MVA途徑多肽和核酸。示例性異戊二烯合酶多肽和核酸如上文所述，異戊二烯合酶多肽將二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)轉化成異戊二烯。示例性異戊二烯合酶多肽包括具有異戊二烯合酶多肽的至少一種活性的多肽、多肽片段、肽和融合多肽。標準方法可以用來通過測量多肽在體外、在細胞提取物中或在體內將 DMAPP轉化成異戊二烯的能力而確定該多肽是否具有異戊二烯合酶多肽活性。細胞提取物中的異戊二烯合酶多肽活性例如可以如Silver等人，J. Biol. Chem. 270 :13010-13016, 1995和參考文獻中所述那樣測量，所述文獻在此各自通過引用的方式完整并入，特別是用于異戊二烯合酶多肽活性的測定法方面。DMAPP(Sigma)在氮氣流下蒸發至干燥并在IOOmM 磷酸鉀緩沖液PH 8.2中再水化至濃度IOOmM并貯存于-20°C。為開展該測定法，將含有 5μ 1 IM MgCl2UmM(250y g/ml)DMAPP,65y 1 植物提取緩沖液(PEB) (50mM Tris-HCl, pH 8.0、20mM 1%(12、5%丙三醇和21111 DTT)的溶液添加到帶有金屬螺旋蓋和特氟龍涂層硅隔片的20ml頂空小瓶(Agilent Technologies)中的25 μ 1細胞提取物并在37°C搖動下培育 15分鐘。通過添加200 μ 1的250mMEDTA或通過加熱失活作用終止反應并且通過GC/MS定量異戊二烯。示例性異戊二烯合酶核酸包括編碼具有異戊二烯合酶多肽至少一種活性的多肽、 多肽片段、肽和融合多肽的核酸。示例性異戊二烯合酶多肽和核酸包括來自本文中所述任意來源生物的天然存在多肽和核酸以及從本文中所述任意來源生物衍生的突變多肽和核酸。在一些實施方案中，該異戊二烯合酶多肽或核酸來自豆科(Fabaceae)、楊柳科 (Salicaceae)或殼斗科(Fagaceae)。在一些實施方案中，該異戊二烯合酶多肽或核酸是來自葛麻姆(葛)(Sharkey 等人，Plant Physiology 137 :700_712，2005)、楊(如銀白楊 χ 歐洲山楊 CAC;35696) (Miller 等人，Planta 213 :483_487，2001)、楊(如美洲山楊)(Silver 等人，JBC 270(22) :13010-1316,1995)或歐洲櫟(夏櫟(Quercus robur)) (Zimmer 等人，WO 98/02550)的天然存在多肽或核酸，所述文獻在此各自通過引用的方式完整并入，特別是異戊二烯合酶核酸和異戊二烯合酶多肽的表達方面。合適的異戊二烯合酶包括，但不限于由 GenBank 檢索號 AY341431，AY316691, AY279379, AJ457070 和 AY182241 所鑒定的那些戊二烯合酶，所述的檢索號因而各自通過引用的方式完整并入，特別是異戊二烯合酶核酸和多肽的序列方面。在一些實施方案中，該異戊二烯合酶多肽或核酸不是來自夏櫟的天然存在多肽或核酸(即，該異戊二烯合酶多肽或核酸是除了來自夏櫟的天然存在多肽或核酸之外的異戊二烯合酶多肽或核酸)。在一些實施方案中，該異戊二烯合酶核酸或多肽不是來自楊 (如銀白楊χ歐洲山楊CAC35696)的天然存在多肽或核酸。 示例性DXS多肽和核酸如上文所述，1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(DXQ多肽將丙酮酸和D-甘油醛-3-磷酸轉化成1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸。示例性DXS多肽包括具有DXS多肽的至少一種活性的多肽、多肽片段、肽和融合多肽。標準方法(如本文中所述的那些標準方法) 可以用來通過測量多肽在體外、在細胞提取物中或在體內將丙酮酸和D-甘油醛-3-磷酸轉化成1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸的能力而確定該多肽是否具有DXS多肽活性。示例性DXS 核酸包括編碼具有DXS多肽的至少一種活性的多肽、多肽片段、肽和融合多肽的核酸。示例性DXS多肽和核酸包括來自本文中所述任意來源生物的天然存在多肽和核酸以及從本文中所述任意來源生物衍生的突變多肽和核酸。示例性IDI多肽和核酸
異戊烯基二磷酸異構酶多肽(異戊烯二磷酸Δ -異構酶或IDI)催化異戊烯二磷酸(IPP)和二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)互變(例如，將IPP轉化成DMAPP和/或將DMAPP 轉化成IPP)。示例性IDI多肽包括具有IDI多肽的至少一種活性的多肽、多肽片段、肽和融合多肽。標準方法(如本文中所述的那些標準方法)可以用來通過測量多肽在體外、在細胞提取物中或在體內使IPP與DMAPP互變的能力而確定該多肽是否具有IDI多肽活性。示例性IDI核酸包括編碼具有IDI多肽的至少一種活性的多肽、多肽片段、肽和融合多肽的核酸。示例性IDI多肽和核酸包括來自本文中所述任意來源生物的天然存在的多肽和核酸以及從本文中所述任意來源生物衍生的突變多肽和核酸。示例性MVA途徑多肽和核酸示例性MVA途徑多肽包括乙酰-CoA酰基轉移酶(AA-CoA硫解酶)多肽、3-羥基-3-甲基戊二酰-CoA合酶(HMG-CoA合酶)多肽、3-羥基-3-甲基戊二酰-CoA還原酶 (HMG-CoA還原酶)多肽、甲羥戊酸激酶(MVK)多肽、磷酸甲羥戊酸激酶(PMK)多肽、二磷酸甲羥戊酸脫羧酶(MVD)多肽、IDI多肽和具有兩種或多種MVA途徑多肽活性的多肽(例如融合多肽)。特別地，MVA途徑多肽包括具有MVA途徑多肽的至少一種活性的多肽、多肽片段、肽和融合多肽。示例性MVA途徑核酸包括編碼具有MVA途徑多肽至少一種活性的多肽、 多肽片段、肽和融合多肽的核酸。示例性MVA途徑多肽和核酸包括來自本文中所述任意來源生物的天然存在多肽和核酸以及從本文中所述任意來源生物衍生的突變多肽和核酸。特別地，乙酰-CoA酰基轉移酶多肽(AA-CoA硫解酶或AACT)將兩分子的乙酰-CoA 轉化成乙酰乙酰-CoA。標準方法(如本文中所述的那些標準方法)可以用來通過測量多肽在體外、在細胞提取物中或在體內將兩分子乙酰-CoA轉化成乙酰乙酰-CoA的能力而確定該多肽是否具有AA-CoA硫解酶多肽活性。3-羥基-3-甲基戊二酰-CoA合酶(HMG-CoA合酶或HMGS)多肽將乙酰乙酰-CoA 轉化成3-羥基-3-甲基戊二酰-CoA。標準方法(如本文中所述的那些標準方法)可以用來通過測量多肽在體外、在細胞提取物中或在體內將乙酰乙酰-CoA轉化成3-羥基-3-甲基戊二酰-CoA的能力而確定該多肽是否具有HMG-CoA合酶多肽活性。3-羥基-3-甲基戊二酰-CoA還原酶(HMG-CoA還原酶或HMGR)多肽將3_羥基-3-甲基戊二酰-CoA轉化成甲羥戊酸。標準方法(如本文中所述的那些標準方法)可以用來通過測量多肽在體外、在細胞提取物中或在體內將3-羥基-3-甲基戊二酰-CoA轉化成甲羥戊酸的能力而確定該多肽是否具有HMG-CoA還原酶多肽活性。甲羥戊酸激酶(MVK)多肽磷酸化甲羥戊酸以形成甲羥戊酸-5-磷酸。標準方法 (如本文中所述的那些標準方法)可以用來通過測量多肽在體外、在細胞提取物中或在體內將甲羥戊酸轉化成甲羥戊酸-5-磷酸的能力而確定該多肽是否具有MVK多肽活性。磷酸甲羥戊酸激酶(PMK)多肽磷酸化甲羥戊酸-5-磷酸以形成甲羥戊酸-5-二磷酸。標準方法(如本文中所述的那些標準方法)可以用來通過測量多肽在體外、在細胞提取物中或在體內將甲羥戊酸-5-磷酸轉化成甲羥戊酸-5-二磷酸的能力而確定該多肽是否具有PMK多肽活性。二磷酸甲羥戊酸脫羧酶(MVD或DPMDC)多肽將甲羥戊酸_5_ 二磷酸轉化成異戊烯二磷酸多肽(IPP)。標準方法(如本文中所述的那些標準方法)可以用來通過測量多肽在體外、在細胞提取物中或在體內將甲羥戊酸-5-二磷酸轉化成IPP的能力而確定該多肽是否具有MVD多肽活性。用于分離核酸的示例性方法異戊二烯合酶核酸、DXS核酸、IDI核酸和/或MVA途徑核酸可以使用標準方法分離。從目的來源生物(如細菌基因組)獲得想要的核酸的方法是分子生物學領域常見和熟知(見，例如，WO 2004/033646及所引用的文獻，所述文獻因而各自通過引用的方式完整并入，特別是分離目的核酸方面)。例如，如果該核酸的序列是已知的(如本文中所述的任何已知核酸)，則可以通過限制性核酸內切酶消化產生合適的基因組文庫并可以用與所需核酸的序列互補的探針篩選。一旦該序列分離，則該DNA可以使用標準的引物定向擴增方法如聚合酶鏈反應(PCR)(美國專利號4，683，202，該文獻通過引用的方式完整并入，特別是 PCR方法方面)擴增以獲得適合使用適宜載體轉化的DNA量。備選地，使用標準方法，可以化學合成異戊二烯合酶核酸、DXS核酸、IDI核酸和/或MVA途徑核酸(如具有已知核酸序列的任意異戊二烯合酶核酸、DXS核酸、IDI核酸和/或MVA途徑核酸)。可以使用標準方法鑒定可能合適用于本文中所述組合物和方法中的額外異戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途徑多肽和核酸。例如，已知天然產生異戊二烯的生物的染色體DNA 的粘粒文庫可以在生物(如大腸桿菌)中構建并隨后篩選異戊二烯產生。用于獲得異戊二烯合酶核酸、DXS核酸、IDI核酸和/或MVA途徑核酸的額外方法包括通過測定法(如本文中所述的頂空測定法)或通過使用下述引物的PCR篩選宏基因組文庫，其中所述的引物針對編碼某個長度的保守氨基酸(例如，至少3個保守氨基酸)的核苷酸。可以通過比對已知異戊二烯合酶、DXS、IDI和/或MVA途徑多肽的氨基酸序列鑒定保守氨基酸。可以基于比對的已知異戊二烯合酶多肽序列鑒定異戊二烯合酶多肽的保守氨基酸。發現天然產生異戊二烯的生物可以經過(本領域熟知的)標準蛋白質純化方法處理并且所得的純化多肽可以用標準方法測序。其他方法存在于文獻中(見，例如，Julsing等人，Applied. Microbiol. Biotechnol. 75 1377-84，2007 ；和 Withers 等人，Appl Environ Microbiol. 73 :6277-83, 2007，所述文獻因而各自通過引用的方式完整并入，特別是參與合成異戊二烯的核酸的鑒定方面)。另外，可以使用標準序列比對和/或結構預測程序來基于一級結構和/或所預測多肽二級結構與已知DXS、IDI或MVA途徑多肽和核酸的相似性而鑒定額外的DXS、IDI或 MVA途徑多肽和核酸。標準數據庫如swissprot-trembl數據庫(在互聯網“expasy. org" 上，瑞士生物信息學研究所Swiss-Prot group CMU-I rue Michel Servet CH-1211 Geneva 4，瑞士)也可以用來鑒定異戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途徑多肽和核酸。可以使用標準結構預測程序如Predictfrotein (Rost等人，The PredictProtein Server. Nucleic Acids Research 32(網絡服務器發行)W321_W326，2004)的默認設置預測異戊二烯合酶、DXS、 IDI或MVA途徑多肽的二級和/或三級結構。備選地，可以使用標準方法確定異戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途徑多肽的實際二級和/或三級結構。也可以通過與探針雜交鑒定額外的異戊二烯合酶核酸、DXS核酸、IDI核酸或MVA途徑核酸，其中所述的探針從已知的異戊二烯合酶核酸、DXS核酸、IDI核酸或MVA途徑核酸產生。示例性啟動子和載體本文中所述的任意異戊二烯合酶核酸、DXS核酸、IDI核酸或MVA途徑核酸可以包含于一個或多個載體中。因而，本發明也描述了以下載體，所述載體具有編碼本文中所述的任一異戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途徑多肽的一個或多個核酸。如本文中所用，“載體”意指能夠遞送并以想要的方式在宿主細胞中表達一種或多種目的核酸的構建體。載體的實例包括，但不限于質粒、病毒載體、DNA或RNA表達載體、粘粒和噬菌體載體。在一些實施方案中，載體含有表達調控序列控制下的核酸。如本文中所用，“表達調控序列”意指指導目的核酸轉錄的核酸序列。表達調控序列可以是啟動子，如組成型或誘導型啟動子，或增強子。“誘導型啟動子”是在環境或發育調節作用下有活性的啟動子。表達調控序列與待轉錄的核酸區段有效連接。在一些實施方案中，載體含有選擇標記。術語“選擇標記”指能夠在宿主細胞中表達的允許輕易選擇含有所導入核酸或載體的那些宿主細胞的核酸。選擇標記的實例包括， 但不限于抗生素(例如，卡那霉素、氨芐青霉素、羧芐西林、慶大霉素、潮霉素、腐草霉素、博來霉素、新霉素或氯霉素)抗性核酸和/或賦予宿主細胞代謝優勢如營養優勢的核酸。在一些實施方案中，異戊二烯合酶核酸、DXS核酸、IDI核酸或MVA途徑核酸在無選擇標記的情況下整合到細胞的染色體中。合適的載體是與所用宿主細胞相容的那些載體。合適的載體可以例如從細菌、病毒(如細菌噬菌體T7或M-13衍生的噬菌體)、粘粒、酵母，或植物衍生。用于獲得和使用此類載體的方案是本領域已知(見，例如，Sambrook等人，Molecular Cloning :A Laboratory Manual，2版，ColdSpring Harbor，1989，該文獻通過引用的方式完整并入本文，特別是載體的用途方面)。啟動子是本領域熟知的。在宿主細胞中有功能的任何啟動子可以用于在宿主細胞中表達異戊二烯合酶核酸、DXS核酸、IDI核酸或MVA途徑核酸。用于驅動異戊二烯合酶核酸、DXS核酸、IDI核酸或MVA途徑核酸在多種宿主細胞中表達的起始調控區或啟動子是眾多的并且是本領域技術人員熟悉的(見，例如，WO 2004/033646和其中引用的參考文獻，所述文獻因而各自通過引用的方式完整并入，特別是用于表達目的核酸的載體方面)。實際上，能夠驅動這些核酸的任何啟動子適用于本發明，包括，但不限于lac、trp、λΡρ λΡκ、Τ7、 tac和trc (用于大腸桿菌中的表達)。在一些實施方案中，使用葡萄糖異構酶啟動子(見，例如，美國專利號7，132，527 和其中引用的參考文獻，所述文獻因而各自通過引用的方式完整并入，特別是用于表達目的多肽的啟動子和質粒系統方面)。報道的葡萄糖異構酶啟動子突變體可以用來改變與該葡萄糖異構酶啟動子有效連接的核酸所編碼多肽的表達水平(美國專利號7，132，527)。 在多種實施方案，該葡萄糖異構酶啟動子包含于低、中等或高拷貝質粒中(美國專利號 7，132，527)。在多種實施方案中，異戊二烯合酶核酸、DXS核酸、IDI核酸和/或MVA途徑核酸包含于低拷貝質粒(例如，以每個細胞約1至約4個拷貝維持的質粒)、中等拷貝質粒(例如， 以每個細胞約10至約15個拷貝維持的質粒)或高拷貝質粒(例如，以每個細胞約50或更多個拷貝維持的質粒)。在一些實施方案中，異源或額外的內源異戊二烯合酶核酸、DXS核酸、IDI核酸或MVA途徑核酸與T7啟動子有效連接。在一些實施方案中，異源或額外的內源異戊二烯合酶核酸、DXS核酸、IDI核酸或MVA途徑核酸與包含于中等或高拷貝質粒中的T7 啟動子有效連接。在一些實施方案中，異源或額外的內源異戊二烯合酶核酸、DXS核酸、IDI 核酸或MVA途徑核酸與Trc啟動子有效連接。在一些實施方案中，異源或額外的內源異戊二
33烯合酶核酸、DXS核酸、IDI核酸或MVA途徑核酸與包含于中等或高拷貝質粒中的Trc啟動子有效連接。在一些實施方案中，異源或額外的內源異戊二烯合酶核酸、DXS核酸、IDI核酸或MVA途徑核酸與Lac啟動子有效連接。在一些實施方案中，異源或額外的內源異戊二烯合酶核酸、DXS核酸、IDI核酸或MVA途徑核酸與包含于低拷貝質粒中的Lac啟動子有效連接。 在一些實施方案中，異源或額外的內源異戊二烯合酶核酸、DXS核酸、IDI核酸或MVA途徑核酸與內源啟動子如埃希氏菌屬、泛菌屬、芽孢桿菌屬、耶氏酵母、鏈霉菌屬(Streptomyces) 或木霉屬內源啟動子或內源堿性絲氨酸蛋白酶、異戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途徑啟動子有效連接。在一些實施方案中，異源或額外的內源異戊二烯合酶核酸、DXS核酸、IDI核酸或MVA途徑核酸與包含于高拷貝質粒中的內源啟動子有效連接。在一些實施方案中，載體是不整合到細胞中染色體內的復制型質粒。在一些實施方案中，載體的部分或全部整合到細胞中的染色體內。在一些實施方案中，表達載體也包括終止序列。終止控制區也可以從宿主細胞固有的多種基因衍生。在一些實施方案中，終止序列和啟動子序列從相同的來源衍生。在另一個實施方案中，終止序列對宿主細胞是內源的。在一些實施方案中，啟動子、編碼區和終止子均源自待表達的異戊二烯合酶核酸、 DXS核酸、IDI核酸或MVA途徑核酸。在一些實施方案中，將異戊二烯合酶核酸、DXS核酸、 IDI核酸或MVA途徑核酸的編碼區插入通用型表達載體，從而該編碼區處于表達構建體的啟動子和終止子序列的轉錄控制下。在一些實施方案中，基因或其部分插入cbhl強啟動子的下游。使用標準技術，異戊二烯合酶核酸、DXS核酸、IDI核酸或MVA途徑核酸可以摻入載體，如表達載體(Sambrook 等人，Molecular Cloning :A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1982，該文獻通過引用的方式完整并入本文，特別是篩選適宜DNA序列和載體構建方面)。用來連接包含目的核酸(如異戊二烯合酶核酸、DXS核酸、IDI核酸或MVA途徑核酸)、啟動子、終止子和其他序列的DNA構建體用來將它們插入合適載體的方法是本領域熟知的。例如，限制酶可以用來切割該異戊二烯合酶核酸、DXS核酸、IDI核酸或MVA途徑核酸和載體。隨后，可以連接切割的異戊二烯合酶核酸、DXS核酸、IDI核酸或MVA途徑核酸和切割的載體的相容性末端。連接一般通過在便利的限制酶位點處連接而進行。如果此類位點不存在，則根據常規實踐使用合成性寡核苷酸接頭(見，Sambrook等人，Molecular Cloning :A Laboratory Manual，2 片反，Cold Spring Harbor,1989 禾口 Bennett 禾口 Lasure， More Gene Manipulations in Fungi，Academic Press，San Diego，第 70-76頁，1991，所述文獻因而各自通過引用的方式完整并入，特別是寡核苷酸接頭方面)。另外，使用已知的重組技術(例如，Invitrogen Life Technologies, Gateway Technology)，可以構建載體。在一些實施方案中，可能想要的是以遠高于天然存在細胞中目前發現的水平過量表達異戊二烯合酶核酸、DXS核酸、IDI核酸或MVA途徑核酸。可以通過將編碼那些多肽的核酸選擇性克隆入多拷貝質粒或將那些核酸置于誘導型或組成型強啟動子下實現這個結果。用于過量表達所需多肽的方法是分子生物學領域常見和熟知的并且可以在Sambrook 等人，Molecular Cloning :A Laboratory Manual，2 片反，Cold Spring Harbor，1989 (該文獻通過引用的方式完整并入本文，特別是克隆技術方面)中找到。以下資源包括對根據本發明有用的額外一般方法學的描述Kreigler，GeneTransfer and Expression ；A Laboratory Manual, 1990 ；禾口 Ausubel 等人編著，Current Protocols in Molecular Biology，1994，1994，所述文獻因而各自通過引用的方式完整并入，特別是分子生物學和克隆技術方面。示例性來源生物異戊二烯合酶核酸、DXS核酸、IDI核酸或MVA途徑核酸(及它們的編碼多肽)可以從天然含有異戊二烯合酶核酸、DXS核酸、IDI核酸和/或MVA途徑核酸的任何生物獲得。 如上文所述，異戊二烯由多種生物如細菌、酵母、植物和動物天然地產生。生物含有產生異戊二烯的MVA途徑、DXP途徑或同時含有MVA和DXP途徑(圖15)。因而，DXS核酸可以例如從含有DXP途徑或同時含有MVA和DXP途徑的任何生物獲得。IDI核酸和異戊二烯合酶核酸可以例如從含有MVA途徑、DXP途徑或同時含有MVA和DXP途徑的任何生物獲得。MVA 途徑核酸可以例如從含有MVA途徑或同時含有MVA和DXP途徑的任何生物獲得。在一些實施方案中，異戊二烯合酶核酸、DXS核酸、IDI核酸或MVA途徑核酸的核酸序列與自然界中以下生物任何者產生的核酸的序列相同。在一些實施方案中，異戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途徑多肽的氨基酸序列與自然界中以下生物任何者產生的多肽的序列相同。在一些實施方案中，異戊二烯合酶核酸、DXS核酸、IDI核酸或MVA途徑核酸或多肽是從本文中所述的任意生物衍生的突變核酸或多肽。如本文中所用，“從……衍生”指向其中導入一個或多個突變的核酸或多肽的來源。例如，“從植物多肽衍生”的多肽指因導入一個或多個突變至野生型植物多肽的序列(即，自然界中存在的序列)中產生的目的多肽。在一些實施方案中，來源生物是細菌，如埃希氏菌屬菌株(例如，大腸桿菌)，或芽孢桿菌屬菌株(例如，枯草芽孢桿菌)。如本文中所用，“埃希氏菌屬”包括如本領域技術人員已知的“埃希氏菌屬”內的全部物種，包括但不限于大腸桿菌、非脫羧埃希氏菌(E. adecarboxylata), Ε. albertii, 蟑螂埃希氏菌(E. blattae)，弗格森埃希氏菌(E. fergusonii)、赫爾曼埃希氏菌 (E. hermannii)、E. senegalensis和傷口埃希氏菌(E. vulneris)。“埃希氏菌屬”定義為革蘭氏陰性、不形成孢子、兼性厭氧桿狀細菌，劃分為Y變形桿菌綱(Gamma Proteobacteria), 腸桿菌目(Enterobacteriales)、腸桿菌禾斗(Enterobacteriaceae)的成員。如本文中所用，“芽孢桿菌屬(Bacillus) 〃包括如本領域技術人員已知的"芽孢桿菌屬"內的全部物種，包括但不限于枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、地衣芽孢桿菌(B. Iicheniformis)、遲緩芽孢桿菌(B. Ientus)、短芽孢桿菌(B. brevis)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(B. stearothermophiIus)、嗜堿芽孢桿菌(B. alkalophilus)、解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)、克勞氏芽孢桿菌(B. clausii)、耐鹽芽孢桿菌 (B. halodurans)、巨大芽孢桿菌(B. megaterium)、凝固芽孢桿菌(B. coagulans)、環狀芽孢桿菌(B. circulans)、燦爛芽孢桿菌(B. Iautus)和蘇云金芽孢桿菌(B. thuringiensis)。 認識到芽孢桿菌屬繼續經歷分類學重新編排。因而，意圖該屬包括已經重新劃分的物種， 包括但不限于此類生物諸如嗜熱脂肪芽孢桿菌，它現在命名為"嗜熱脂肪土芽孢桿菌 (Geobacillus stearothermophiIus)“。在氧存在下產生抗性內生孢子被視為芽孢桿菌屬的定義特征，盡管該特征也適用于新近命名的脂環酸芽孢桿菌屬(Alicyclobacillus)、 雙芽孢桿菌屬(Amphibaci 1 Ius)、硫胺素芽孢桿菌屬(Aneurinibaci 1 Ius)、厭氧芽孢桿菌屬(Anoxybacillus)、短芽孢桿菌屬(Brevibacillus)、Filobacillus,薄壁芽孢桿菌
35屬(Gracilibacillus)、喜鹽芽孢桿菌(Halobacillus)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)、 需鹽芽孢桿菌屬(Salibaci llus)、熱桿菌屬(Thermobaci llus)、解脲芽孢桿菌屬 (Ureibacillus)禾口枝芽孢桿菌屬(Virgibacillus)0示例性宿主細胞多種宿主細胞可以在要求保護的發明的方法中用來表達異戊二烯合酶、DXS、IDI 和/或MVA途徑多肽和用來產生異戊二烯。示例性宿主細胞包括來自標題為“示例性來源生物”的上一節列出的任意生物的細胞。宿主細胞可以是天然產生異戊二烯的細胞或不天然產生異戊二烯的細胞。在一些實施方案中，宿主細胞使用DXP途徑天然地產生異戊二烯， 并且添加異戊二烯合酶核酸、DXS核酸和/或IDI核酸以利用該途徑增強異戊二烯產生。在一些實施方案中，宿主細胞使用MVA途徑天然地產生異戊二烯，并且添加異戊二烯合酶核酸和/或一種或多種MVA途徑核酸以利用該途徑增強異戊二烯產生。在一些實施方案中， 宿主細胞使用DXP途徑天然地產生異戊二烯，并且添加一種或多種MVA途徑核酸以利用MVA 途徑的部分或全部以及DXP途徑產生異戊二烯。在一些實施方案中，宿主細胞使用DXP和 MVA途徑天然地產生異戊二烯，并且添加一種或多種異戊二烯合酶核酸、DXS核酸、IDI核酸或MVA途徑核酸以利用這兩個途徑之一或二者增強異戊二烯產生。示例性轉化方法使用用于表達所編碼異戊二烯合酶、DXS、IDI和/或MVA途徑多肽的標準技術，可以將異戊二烯合酶核酸、DXS核酸、IDI核酸和/或MVA途徑核酸或含有它們的載體插入宿主細胞(例如，細菌細胞)。向宿主細胞中導入DNA構建體或載體可以使用以下技術實施， 如轉化；電穿孔；核內顯微注射；轉導 ’轉染(例如，脂質體轉染介導或DEAE-葡聚糖介導的轉染或使用重組噬菌體病毒的轉染)；與磷酸鈣DNA沉淀物孵育；采用DNA包被的微粒的高速粒子轟擊和原生質體融合。一般轉化技術是本領域已知的(見，例如，Current Protocols in Molecular Biology (F. Μ· Ausubel 等人(編著)第 9 章，1987 ；Sambrook等人，Molecular Cloning :A Laboratory Manual, 2 版，Cold Spring Harbor, 1989 ；禾口 Campbell 等人，Curr Genet, 16 =53-56,1989，所述文獻因而各自通過引用的方式完整并入，特別是轉化方法方面)。導入的核酸可以整合到染色體DNA中或維持為染色體外復制序列。示例性細胞培養基本發明也包括處于培養下的產生異戊二烯的細胞或細胞群。“處于培養下的細胞” 意指處于允許細胞發生一次或多次細胞分裂的溶液(例如，細胞培養基)中的兩個或多個細胞。“處于培養下的細胞”不包括作為活的多細胞植物的部分的植物細胞，其中所述的多細胞植物含有已經分化成植物組織的細胞。在多個實施方案中，細胞培養物包括至少或約 10、20、50、100、200、500、1，000,5, 000,10, 000 個或更多個細胞。任何碳源可以用來培育宿主細胞。術語“碳源”指一種或多種能夠被宿主細胞或生物代謝的含碳化合物。例如，用來培育宿主細胞的細胞培養基可以包括適合維持宿主細胞的活力或生長的任何碳源。在一些實施方案中，碳源是糖類(如單糖、二糖、寡糖或多糖)、轉化糖(例如，酶促處理的蔗糖糖漿)、丙三醇、甘油(例如，生物柴油或肥皂制造過程的甘油副產物)、二羥基丙酮、一碳源、脂肪酸(例如，飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸或多不飽和脂肪酸)、脂類、磷脂、 甘油酯類、甘油一酯、甘油二酯、甘油三酯、多肽(例如，微生物或植物蛋白質或肽)、可再生
36碳源(例如，生物量碳源如水解生物量碳源；甜菜糖蜜或甘蔗糖蜜)、酵母提取物、來自酵母提取物的組分、聚合物、酸、醇、醛、酮、氨基酸、琥珀酸、乳酸、乙酸、乙醇或前述兩種或多種物質的任意組合。在一些實施方案中，碳源是光合作用產物，包括，但不限于葡萄糖。示例性單糖包括葡萄糖和果糖；示例性寡糖包括乳糖和蔗糖，并且示例性多糖包括淀粉和纖維素。示例性糖類包括C6糖(例如，果糖，甘露糖，半乳糖，或葡萄糖)和C5糖 (例如，木糖或阿拉伯糖)。在一些實施方案中，細胞培養基包括糖類以及糖類以外的碳源 (例如，丙三醇、甘油、二羥基丙酮、一碳源、脂肪酸、脂質、磷脂、甘油酯類、甘油一酯、甘油二酯、甘油三酯、可再生碳源或來自酵母提取物的組分)。在一些實施方案中，細胞培養基包括糖類以及多肽(例如，微生物或植物蛋白質或肽)。在一些實施方案中，微生物多肽是來自酵母或細菌的多肽。在一些實施方案中，植物多肽是來自大豆、谷物、油菜、麻風樹、棕櫚、花生、向日葵、椰子、芥菜、油菜籽、棉籽、棕櫚仁、橄欖、紅花、芝麻或亞麻子的多肽。在一些實施方案中，糖類的濃度是至少或約5克/每升培養液(g/L，其中培養液的體積包括細胞培養基的體積和細胞的體積)，如至少或約10、15、20、30、40、50、60、80、100、 150、200、300、400或更大g/L。在一些實施方案中，糖類的濃度在約50與約400g/L之間， 如在約100與約360g/L之間，約120與約360g/L之間或在約200與約300g/L之間。在一些實施方案中，糖類的這個濃度包括在培養宿主細胞之前和/或期間所添加糖類的總量。示例性脂類是含有一種或多種脂肪酸的任何物質，其中所述的脂肪酸是C4及以上的飽和、不飽和或分支脂肪酸。示例性脂肪酸包括式R-COOH的化合物，其中“R”是烴。示例性不飽和脂肪酸包括其中“R”包含至少一個碳-碳雙鍵的化合物。示例性不飽和脂肪酸包括，但不限于油酸、 11-十八碳烯酸、亞油酸、棕櫚烯酸(palmitelaidic acid)和花生四烯酸。示例性多不飽和脂肪酸包括其中“R”包含多個碳-碳雙鍵的化合物。示例性飽和脂肪酸包括其中“R”是飽和脂族基團的化合物。在一些實施方案中，碳源包括一種或多種C12-C22脂肪酸，如C12飽和脂肪酸、C14飽和脂肪酸、C16飽和脂肪酸、C18飽和脂肪酸、C20飽和脂肪酸或C22飽和脂肪酸。在示例性實施方案中，脂肪酸是棕櫚酸。在一些實施方案中，碳源是脂肪酸(例如，不飽和脂肪酸)的鹽、脂肪酸(例如，不飽和脂肪酸)的衍生物或脂肪酸(例如，不飽和脂肪酸)衍生物的鹽。合適的鹽包括，但不限于鋰鹽、鉀鹽、鈉鹽等。甘油二酯和甘油三酯是丙三醇的脂肪酸酯。在一些實施方案中，脂類、脂肪酸、甘油一酯、甘油二酯或甘油三酯的濃度是至少或約1克/每升培養液(g/L，其中培養液的體積包括細胞培養基的體積和細胞的體積)，如至少或約 5、10、15、20、30、40、50、60、80、100、150、200、300、400 或以上 g/L。在一些實施方案中，脂類、脂肪酸、甘油一酯、甘油二酯或甘油三酯的濃度在約10與約400g/L之間，如在約25與約300g/L之間，約60與約180g/L之間或在約75與約150g/L之間。在一些實施方案中，該濃度包括在培養宿主細胞之前和/或期間所添加脂類、脂肪酸、甘油一酯、甘油二酯或甘油三酯的總量。在一些實施方案中，碳源包括(i)脂類、脂肪酸、甘油一酯、甘油二酯或甘油三酯和(ii)糖類，如葡萄糖。在一些實施方案中，脂類、脂肪酸、甘油一酯、甘油二酯或甘油三酯對糖類之比基于碳是約1 1(即，脂類、脂肪酸、甘油一酯、甘油二酯或甘油三酯中的一個碳/糖類碳)。在特定的實施方案中，脂類、脂肪酸、甘油一酯、甘油二酯或甘油三酯的量在約60與180g/L之間并且糖的量在約120與360g/L之間。[ 0289]示例性微生物多肽碳源包括來自酵母或細菌的一種或多種多肽。示例性植物多肽碳源包括來自大豆、玉米、油菜、麻風樹、棕櫚、花生、向日葵、椰子、芥菜、油菜籽、棉籽、棕櫚仁、橄欖、紅花、芝麻或亞麻的一種或多種多肽。示例性可再生碳源包括干酪乳清滲透物、玉米漿、甜菜糖蜜、大麥麥芽和來自任何前述物質的組分。示例性可再生碳源也包括存在于生物量(如玉米、柳枝稷、甘蔗、發酵過程的細胞廢棄物和來自大豆、玉米或小麥磨粉的蛋白質副產品)中的葡萄糖、己糖、戊糖和木糖。在一些實施方案中，生物量碳源是木質纖維素、半纖維素或纖維素性材料，如，但不限于草、小麥、小麥稈、甘蔗渣、甜菜渣、軟木漿、玉米、玉米芯或玉米殼、玉米粒、來自玉米粒、 玉米秸稈、柳枝稷、稻殼產物的纖維，或來自谷物干磨法和濕磨法的副產品(例如，玉米、高粱、黑麥、黑小麥、大麥、小麥和/或酒糟)。示例性纖維素性材料包括木材、紙和紙漿廢棄物、草本植物和果漿。在一些實施方案中，碳源包括任何植物部分，如莖、谷粒、根或塊莖。在一些實施方案中，任何以下植物的全部或部分作為碳源使用玉米、小麥、黑麥、高粱、黑小麥、稻、粟、大麥、木薯、豆類，如豆和豌豆、馬鈴薯、甘薯、香蕉、甘蔗和/或木薯。在一些實施方案中，碳源是生物量水解物，如包含木糖與葡萄糖和包含蔗糖與葡萄糖的生物量水解物。在一些實施方案中，可再生碳源(如生物量)在添加至細胞培養基之前作預處理。在一些實施方案中，預處理包括酶預處理、化學預處理或酶預處理和化學預處理的組合 (見，例如，Farzaneh 等人，Bioresource Technology 96(18) :2014_2018，2005 ；美國專利號6，176，176 ；美國專利號6，106，888 ；所述文獻因而各自通過引用的方式完整并入，特別是可再生碳源預處理方面)。在一些實施方案中，可再生碳源在添加至細胞培養基之前被部分或徹底水解。在一些實施方案中，可再生碳源(如玉米秸稈)在添加至細胞培養基之前進行氨纖維膨脹(AFEX)預處理(見，例如，Farzaneh 等人，Biosource Technology 96(18) 2014-2018，2005)。在AFEX預處理期間，可再生碳源用無水液氨在溫和溫度(如約60至約 IOO0C )和高壓(如約250至約300psi)下處理約5分鐘。隨后，迅速釋放壓力。在這個過程中，木質素增溶、半纖維素水解、纖維素解晶作用和表面積增加的組合化學和物理作用使纖維素和半纖維素近乎完全地酶促轉化成可發酵糖。AFEX預處理具有優勢，在于全部氨可以回收并再利用，同時殘留物充當下游工藝中微生物的氮源。另外，AFEX預處理不需要洗滌流。因此，AFEX處理后的干物質回收基本上是100%。AFEX是基本上干態至干態的過程。 處理的可再生碳源長時間穩定并且可以在酶促水解或發酵過程中以高固形物載量投料。纖維素和半纖維素在AFEX過程中受到充分保護，很少或無降解。在酶促水解已經經過AFEX 預處理的可再生碳源之前無需中和。酶促水解AFEX處理的碳源為后續發酵用途產生清潔的糖流。在一些實施方案中，碳源(例如，可再生碳源)的濃度等同于至少或約0. 1,0. 5、1、 1. 5、2、3、4、5、10、15、20、30、40或50%葡萄糖(w/v)。可以通過使用標準HPLC方法，以葡萄糖作為參照物以測量從該碳源所產生葡萄糖的量，確定等同量的葡萄糖。在一些實施方案中，碳源(例如，可再生碳源)的濃度等同于約0. 與約20%之間葡萄糖，如在約0. 與約10%之間葡萄糖、在約0. 5%與約10%之間葡萄糖、在約與約10%之間葡萄糖、在約
與約5%之間葡萄糖或在約與約2%之間葡萄糖。在一些實施方案中，碳源包括酵母提取物或酵母提取物的一種或多種組分。在一些實施方案中，酵母提取物的濃度是至少或約1克酵母提取物/每升培養液(g/L，其中培養液的體積包括細胞培養基的體積和細胞的體積)，如至少或約5，10，15，20，30，40，50，60， 80，100，150，200，300或更大g/L。在一些實施方案中，酵母提取物的濃度在約1與約300g/ L之間，如在約1與約200g/L之間，約5與約200g/L之間或在約5與約100g/L之間，或在約5與約60g/L之間。在一些實施方案中，該濃度包括在培養宿主細胞之前和/或期間所添加酵母提取物的總量。在一些實施方案中，碳源包括酵母提取物(或其一種或多種組分) 和另一種碳源，如葡萄糖。在一些實施方案中，酵母提取物對另一種碳源的比率是約1 5、 約 1 10 或約 1 20 (w/w)。另外，碳源也可以是一碳底物如二氧化碳或甲醇。已經在甲基營養型酵母中 (Yamada等人，Agric. Biol. Chem.，53 (2) 541-543,1989，該文獻通過引用的方式完整并入本文，特別是碳源方面)和在細菌(Hunter等人，Biochemistry，對，4148-4155，1985，該文獻通過引用的方式完整并入本文，特別是碳源方面)中報道從一碳源(例如，甲醇、甲醛或甲酸)產生丙三醇。這些生物可以同化在氧化狀態從甲醇至甲酸的一碳化合物并產生丙三醇。碳同化的途徑可以通過核酮糖單磷酸途徑、通過絲氨酸途徑或通過木酮糖單磷酸途徑進行(Gottschalk，Bacterial Metabolism，第 2 片反，Springer-Verlag :New York，1986， 該文獻通過引用的方式完整并入本文，特別是碳源方面)。核酮糖單磷酸途徑涉及甲酸與核酮糖-5-磷酸縮合以形成一個六碳糖，該六碳糖變成果糖并最終變成三碳產物甘油醛醛-3-磷酸。類似地，絲氨酸途徑借助亞甲基四氫葉酸將一碳化合物同化入糖酵解途徑。除了一種和兩種碳底物外，已知甲基營養型生物也利用眾多的其他含碳化合物如甲胺、氨基葡糖和多種氨基酸用于代謝活動。例如，已知甲基營養型酵母利用來自甲胺的碳形成海藻糖或丙三醇(Bellion 等人，Microb. Growth Cl Compd Cl Compd.，[Int. Symp.], 第 7 版，415-32.編者Murrell 等人，Publisher Jntercept, Andover, UK，1993，該文獻通過引用的方式完整并入本文，特別是碳源方面)。類似地，假絲酵母屬(Candida)的多個物種代謝丙氨酸或油酸(Suiter等人，Arch. Microbiol. 153 (5)，485-9，1990，該文獻通過引用的方式完整并入本文，特別是碳源方面)。在一些實施方案中，細胞在含有生理鹽和營養物的標準培養基中培養(見，例如， Pourquie, J0等人，Biochemistry and Genetics of Cellulose Degradation編者Aubert 等人，Academic Press,第 71-86 頁，1988 ；和 Ilmen 等人，App 1. Environ. Microbiol. 63 1298-1306，1997，所述文獻因而通過引用方式并入，特別是細胞培養基方面)。示例性生長培養基是常見的商業制備的培養基，如Luria Bertani (LB)肉湯、Sabouraud Dextrose(SD) 肉湯或酵母培養基(YM)肉湯。也可以使用其他限定成分或合成的生長培養基，并且用于培育特定宿主細胞的適宜培養基是微生物學或發酵科學領域技術人員已知的。除了適宜碳源之外，細胞培養基還希望地含有合適的礦物質、鹽、輔因子、緩沖劑和本領域技術人員已知適用于培養物生長或增強異戊二烯產生的其他組分(見，例如，WO 2004/033646和其中引用的參考文獻和WO 96/35796和其中引用的參考文獻，所述文獻因而各自通過引用的方式完整并入，特別是細胞培養基和細胞培養條件方面)。在異戊二烯合酶核酸、DXS核酸、IDI核酸和/或MVA途徑核酸在誘導型啟動子控制下的一些實施方案中， 將誘導試劑(例如，糖、金屬鹽或抗微生物藥)希望地以有效誘導異戊二烯合酶、DXS、IDI 和/或MVA途徑多肽表達的濃度添加至培養基。在一些實施方案中，細胞培養基具有與具
39有一種或多種DXS、IDI或MVA途徑核酸的載體上抗生素抗性核酸(如卡那霉素抗性核酸) 相對應的抗生素(如卡那霉素)。異戊二烯的示例性產生在一些實施方案中，細胞在允許由該細胞產生異戊二烯的條件下在培養基中培養。在一些實施方案中，培養的細胞以大于或約1、10、25、50、100、150、200、250、300、400、 500、600、700、800、900、1，000,1, 250,1, 500,1, 750,2, 000,2, 500,3, 000,4, 000,5, 000 或更
多納摩爾異戊二烯/以細胞濕重計的細胞克數/小時(納摩爾/gw。m/小時)產生異戊二烯。在一些實施方案中，異戊二烯的量在約2至約5，000納摩爾/gw。m/小時之間，如在約2 至約100納摩爾/gw。m/小時之間、約100至約500納摩爾/gw。m/小時之間、約150至約500 納摩爾/gw。m/小時之間、約500至約1，000納摩爾/gw。m/小時之間、約1，000至約2，000納摩爾/g /小時或約2，000至約5，000納摩爾/gw。m/小時之間。單位為納摩爾/gw。m/小時的異戊二烯的量可以如美國專利號5，849，970中所公開那樣測量，該文獻通過引用的方式完整并入本文，特別是異戊二烯產生的測量方面。例如，使用標準氣相色譜系統，如帶有正辛烷/多孔硅膠珠C柱(Alltech Associates, Inc.，Deerf ield，IL)并連接于RGD2氧化汞還原氣體檢測儀(Trace Analytical,Menlo Park,CA)的(85°C )等溫運行的一個系統，對 2mL頂空(例如，來自培養物(如以200轉/分鐘振搖在32°C于密封小瓶中培養大約3小時的2mL培養物)的頂空)分析異戊二烯(見，例如，Greenberg等人，Atmos. Environ. 27A 2689-2692，1993 ；Silver 等人，Plant Physiol. 97 :1588-1591,1991，所述文獻因而各自通過引用的方式完整并入，特別是異戊二烯產生的測量方面)。借助標準異戊二烯濃度校準曲線，將氣相色譜面積單位換算成nmol異戊二烯。在一些實施方案中，通過獲得細胞培養物樣品的A_值并隨后基于具有已知A_值的細胞培養物的濕重校準曲線將這個A_值換算成細胞克數，計算了以細胞濕重計的細胞克數值。在一些實施方案中，通過假定具備A6tltl值 1的1升培養液(包括細胞培養基和細胞)具有1克濕細胞重量，估計出細胞的克數。該值也除以已經孵育培養物的小時數，如3小時。在一些實施方案中，培養的細胞以大于或約1、10、25、50、100、150、200、250、 300、400、500、600、700、800、900、1，000,1,250,1,500,1,750,2,000,2,500,3,000,4,000、 5，000、10，000、100，000或更多ng異戊二烯/以細胞濕重計的細胞克數/小時(ng/gw。m/小時)產生異戊二烯。在一些實施方案中，異戊二烯的量在約2至約5，000ng/gw。m小時之間，如在約2至約100ng/gwcm/小時之間、約100至約500ng/gwcm/小時之間、約500至約1，OOOng/ gwcm/小時之間、約1，000至約2，000ng/gwcm/小時或約2，000至約5，000ng/gwcm/小時之間。 可以通過單位為上文所討論的納摩爾/gw。m/小時的異戊二烯生產值乘以68. 1計算單位為 ng/gWCffl/小時的異戊二烯量(如下文等式5中所述)。在一些實施方案中，培養的細胞以大于或約1、10、25、50、100、150、200、250、 300、400、500、600、700、800、900、1，000,1,250,1,500,1,750,2,000,2,500,3,000,4,000、 5，000、10，000、50，000、100，000或更多mg異戊二烯/L培養液(mg/L，其中培養液的體積包括細胞的體積和細胞培養基的體積)產生異戊二烯的累積滴度(總量)。在一些實施方案中，異戊二烯的量在約2至約5，000mg/L培之間，如在約2至約100mg/L培之間、約100 至約500mg/L培之間、約500至約1，000mg/L培之間、約1，000至約2，000mg/L培或約 2，000至約5，000mg/L±if#a之間。可以通過從OD6tltl值大約1. 0的細胞培養物取得Iml樣品，將該樣品置于20mL小瓶中，孵育30分鐘并隨后測量頂空中異戊二烯的量而測量來自搖瓶或相似培養物的頂空的以mg異戊二烯/L計的異戊二烯的比生產率。如果0D_值不是1. 0， 則量值可以通過除以該OD6tltl值歸一化為0D_值1. 0。mg異戊二烯/L頂空的值可以通過乘以系數38換算成mg/L_a/小時/培養培養液的0D6QQ。單位為mg/L_a/小時/OD6tltl的值可以乘以小時數和該0D_值以獲得單位為mg異戊二烯/L培養液的累積滴度。可以通過取得發酵罐廢氣的樣品，對該樣品分析異戊二烯的量(如單位為每
mg異戊二烯)并且該值乘以廢氣通過每升培養液的速率(例如，在Ivvm(空氣體積/培養液體積/分鐘)時，該速率是每小時，測量發酵罐中單位為mg/L±if#a/小時的瞬間異戊二烯產生速率。因而，lmg/L^^的廢氣水平對應于空氣流量Ivvm時60mg/L_a/小時的瞬間產生速率。根據需要，單位為mg/L_a/小時的值可以除以該0D_值以獲得單位為 mg/L±if#a/小時/OD的比速率。mg異戊二烯幾氣體的平均值可以通過這個平均廢氣異戊二烯濃度乘以發酵期間每升發酵培養液產生的廢氣總量而換算成總生產率(克異戊二烯每升發酵培養液，mg/L±if#a)。因而，在Ivvm下10小時內的平均廢氣異戊二烯濃度0. 5mg/L 培養瓶/小時對應于300mg異戊二烯/L±if#a的總產物濃度。在一些實施方案中，培養的細胞將細胞培養基中大于或約0. 0015,0. 002,0. 005、 0. 0U0. 02、0· 05、0· 1、0· 12、0· 14、0· 16、0· 2、0· 3、0· 4、0· 5、0· 6、0· 7、0· 8、0· 9、1· 0、1· 2、 1.4，或1.6%的碳轉化成異戊二烯。在一些實施方案中，碳轉化成異戊二烯的百分數在約0. 002至約1. 6%之間，如約0. 002至約0. 005%、約0. 005至約0. 01 %、約0. 01至約 0. 05%、約 0. 05 至約 0. 15%,0. 15 至約 0. 2%、約 0. 2 至約 0. 3%、約 0. 3 至約 0. 5%、約0. 5 至約0.8%、約0.8至約1.0%，或約1.0至約1.6%。碳轉化成異戊二烯的百分數(也稱作“ ％碳產率”)可以通過所產生異戊二烯中的碳摩爾數除以碳源中的碳摩爾數(如分批投入和送入的葡萄糖和酵母提取物中的碳摩爾數)測量。該數字乘以100%以給出百分數值 (如等式1中所示)。等式1%碳產率=(所產生異戊二烯中的碳摩爾數)/(碳源中的碳摩爾數)*100對于該計算而言，酵母提取物可以假定含有50% w/w碳。等式2% 碳產率=(39. Ig 異戊二烯 *l/68. lmol/g*5C/mol) / [ (181221g 葡萄糖 *l/180mol/g*6C/mol) + (17780g 酵母提取物 *0. 5*l/12mol/g) ] *100 = 0. 042%本領域技術人員可以輕易地將異戊二烯產生的速率或所產生異戊二烯的量換算成任何其他單位。下文列出單位之間相互換算的示例性等式。異戊二烯產生速率的單位(總的和比)等式3Ig異戊二烯幾培養液/小時=14. 7讓01異戊二烯/L培養a/小時(總容積率)。等式4Inmol異戊二烯/gwcm/小時=Inmol異戊二烯/L培養液/小時/OD600 (該換算假定 OD600值為1的1升培養液具有1克濕細胞重量)。等式5Inmol異戊二烯Zgwcm/小時=68. Ing異戊二烯Zgwcm/小時(給定異戊二烯的分子
41量)等式6Inmol異戊二烯/L^frO2/小時=90nmol異戊二烯/L培養液/小時(在每L培養液 90L/小時的&流速下)等式7廢氣中的Iyg異戊二烯/L氣體異戊二烯=在60L氣體每L培養a的流速(Ivvm)下 60 μ g異戊二烯/L培養液/小時滴度的單位(總的和比)等式8Inmol異戊二烯/mg細胞蛋白=150nmol異戊二烯/L培養a/OD6tltl (該換算假定0D_ 值1的1升培養液具有大約150mg的總細胞蛋白)(比生產力)。等式9Ig異戊二烯/L培養液=14. 7謹ol異戊二烯/L培養液(總滴度)。根據需要，等式10可以用來換算任何單位，包括將細胞的濕重換算成包括細胞干重的相應單位。等式10細胞的干重=(細胞的濕重)/3. 3在本發明所包括的一些實施方案中，包含編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸的細胞產生下述量的異戊二烯，所述的異戊二烯量是從基本上相同條件下培育的不含編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸的相應細胞中產生的戊二烯量的至少或約2倍、3倍、5倍、10倍、 25倍、50倍、100倍、150倍、200倍、400倍或更多倍數。在本發明所包括的一些實施方案中，包含編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸和編碼DXS、IDI和/或MVA途徑多肽的一種或多種異源核酸的細胞產生下述的異戊二烯量，所述的異戊二烯量是從基本上相同條件下培育的不含所述異源核酸的相應細胞中產生的戊二烯量的至少或約2倍、3倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、150倍、200倍、400倍或更多倍數。示例性異戊二烯純化方法在一些實施方案中，本文中所述的任意方法還包括回收異戊二烯。例如，使用本發明組合物和方法產生的異戊二烯可以使用標準技術回收，如氣提、分餾、吸附/解吸附、 全蒸發、從固相熱或真空解吸附異戊二烯或用溶劑提取固定至或吸附于固相的異戊二烯 (見，例如，美國專利號4，703，007和4，570，029，所述文獻因而各自通過引用的方式完整并入，特別是異戊二烯回收與純化方法方面)。在一些實施方案中，異戊二烯的回收涉及分離液體形式的異戊二烯(如異戊二烯的純液或異戊二烯在溶劑中的溶液)。氣提法涉及以連續方式從發酵廢氣流取出異戊二烯蒸汽。這種取出可以以幾種不同方式實現，包括，但不限于吸附至固相、分配入液相或直接冷凝。在一些實施方案中，在異戊二烯蒸汽的露點上膜富集稀薄異戊二烯蒸汽流導致液態異戊二烯的冷凝。異戊二烯的回收可以涉及一個步驟或多個步驟。在一些實施方案中，同時進行從發酵廢氣取出異戊二烯蒸汽和將異戊二烯轉換成液相。例如，可以從廢氣流直接冷凝異戊二烯以形成液體。在一些實施方案中，依次進行從發酵廢氣流取出異戊二烯蒸汽和將異戊二烯轉換成液相。例如，異戊二烯可以吸附至固相并隨后用溶劑從固相提取出來。在一些實施方案中，本文中所述的任意方法還包括純化異戊二烯。例如，使用本發明組合物和方法產生的異戊二烯可以使用標準技術純化。純化指一個過程，其中借助所述過程將異戊二烯與異戊二烯生產時存在的一種或多種組分分開。在一些實施方案中，異戊二烯作為基本上純的液體獲得。純化方法的實例包括(i)從在液體提取劑中的溶液蒸餾和 (ii)層析法。如本文中所用，“純化的異戊二烯”意指與異戊二烯產生時存在的一種或多種組分分開的異戊二烯。在一些實施方案中，異戊二烯為至少約20% (以重量計)，不含異戊二烯產生時存在的其他組分。在多種實施方案中，異戊二烯以重量計具有至少或約25%、 30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、90%、95%，或 99% 的純度。純度可以通過任何適宜方法(例如通過柱層析法、HPLC分析法或GC-MS分析法)測定。異戊二烯合酶的晶體結構本發明也構思了如上文和實施例中所述植物異戊二烯合酶(例如，楊和葛)及其變體的晶形。在一個實施方案中，本發明包括具有如表16-7中所公開的楊異戊二烯合酶晶體結構的任意多肽。實驗提供以下實施例旨在展示和進一步說明本發明的某些優選實施方案和方面，并且不應解釋為限制本發明的范圍。在隨后的實驗公開內容中，使用以下縮寫V (攝氏度)；rpm(轉/分鐘)； H20(水)；diH20(去離子水)；aa和AA(氨基酸)；bp (堿基對)；1Λ (千堿基對)；kD (千道爾頓)；gm(克)；μ g和ug (微克)；mg (毫克)；ng (納克)；μ 1和ul (微升)；ml (毫升)； mm(毫米)；qs (足夠量)；nm(納米)；μπι和um(微米)；M(摩爾)；mM(毫摩爾)；μ M和 uM(微摩爾)；ρΜ(皮摩爾)；U(單位)；麗(分子量)；sec(秒)；min(分鐘)；hr (小時)； 0D_(在600nm的光密度)；BSA(牛血清白蛋白)；DMAPP(二甲基烯丙基二磷酸)；DTT(二硫蘇糖醇)出tOH(乙醇)；IPTG(異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)；異戊二烯O-甲基-1，3-丁二烯)；IspS (異戊二烯合酶)；PAGE (聚丙烯酰胺凝膠電泳)；PBS (磷酸緩沖鹽水[150mM NaCl，IOmM磷酸鈉緩沖液，pH 7. 2])和SDS (十二烷基硫酸鈉)。以下縮寫適用于在實驗實施例中已經提到其產品或服務的公司 Agi1ent (Agilent Technologies，Santa Clara，CA) ；Becton Coulter (Beeton Coulter，Inc.，Fullerton，CA) ；Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)； Cayman Chemical(Cayman Chemical Co.，Ann Arbor，MI) ；CTC Analytics (CTC Analytics A. G. , Zwingen， 瑞士)；EMS(Electron Microscopy Supply, Hatfield， PA) ；Epicentre (Epicentre Biotechnologies，Madison，WI) ； Integrated DNA Technologies (Integrated DNA Technologies, Coralville,IA) ；Invitrogen (Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA) ；Molecular Dynamics (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA)； Novagen(Novagen, Inc.，Madison，WI) ；Perkin Elmer (Perkin Elmer，Waltham, MA)； Roche (Roche Applied Science，Indianopolis，IN) ；Sigma(Sigma-Aldrich，St.Louis, M0) ；Stratagene(Stratagene Cloning Systems, La Jolla，CA) ；Qiagen (Qiagen，Inc., Valencia, CA) ；Takara(Takara Bio USA， Madison， WI) ；Thomson Instrument(Thomson Instrument Co.，Oceanside，CA) ；V&P Scientific(V&P Scientific，Inc.，San Diego,CA)；禾口 Zinsser (Zinsser North America, Northridge, CA)。實施例1克隆用于重組細菌中表達的葛異戊二烯合酶在本實施例中，描述了用來在大腸桿菌中產生葛異戊二烯合酶(IspS)的方法。葛(葛麻姆)異戊二烯合酶基因(IspS)的蛋白質序列從GenBank(AAQ84170)獲得。對大腸桿菌密碼子選擇優化的葛異戊二烯合酶基因購買自DNA2. O (Menlo Park, CA) 并如SEQ ID N0:1中描述(圖1)。該異戊二烯合酶基因通過采用BspLUllI/I^stl的限制性核酸內切酶消化從提供的質粒移出，經凝膠純化并連接至已經用Ncol/I^stl消化的 PTrcHis2B (Invitrogen)中。如此設計該構建體，從而該異戊二烯合酶基因中的終止密碼子位于I^stI位點的5’。因此，當表達該構建體時，His標記不連接于異戊二烯合酶蛋白。通過測序驗證所得的質粒pTrcKudzu。該異戊二烯合酶基因也克隆到pET16b(N0Vagen)中。在這種情況下，將該異戊二烯合酶基因插入pET16b，使得重組異戊二烯合酶蛋白含有N端His標記。使用引物組 pET-His-Kudzu-2F :5’ -CGTGAGATCA TATGTGTGCG ACCTCTTCTC AATTTAC(SEQ ID NO 3)和 pET-His-Kudzu-R 5' -CGGTCGACGG ATCCCTGCAG TTAGACATAC ATCAGCTG(SEQ ID NO :4), 過PCR從pTrcKudzu擴增該異戊二烯合酶基因。這些弓I物分別在該基因的5，末端添加NdeI 位點并且在該基因的3’末端添加BamHI位點。使用上文所述的質粒pTrcKudzu作為模板 DNA，根據制造商的說明使用HERCULASE DNA聚合酶(Stratagene)并以IOpM濃度添加引物。 PCR在25 μ 1總體積中實施。PCR產物用Ndel/BamHl消化并克隆到用相同酶消化的pET16b 中。將連接混合物轉化到大腸桿菌ToplOanvitrogen)中并通過測序選擇正確的克隆。命名為pETNHisKudzu的所得質粒隨后轉化到BL21 ( λ DE3)pLysS (Novagen)細胞中用于從T7 啟動子表達。該葛異戊二烯合酶基因也克隆到低拷貝數質粒pCL1920 (Lerner和Inouye，Nucl Acids Res, 18 :4631,1990)中。使用引物從上文所述的pTrcKudzu擴增葛異戊二烯合酶基因。正向引物添加一個HindIII位點和一個大腸桿菌共有RBS至5’端。I^stI克隆位點已經存在于pTrcKudzu中就在終止密碼子的3’，因而，構建反向引物使得最終PCR產物包括該 PstI 位點。所述引物的序列是HindIII-rbs-Kudzu F :5，-CATATGAAAG CTTGTATCGA TTAAATAAGG AGGAATAAAC C(SEQ ID NO 5)禾口 BamHl-Kudzu R 5，-CGGTCGACGG ATCCCTGCAG TTAGACATAC ATCAGCTG (SEQ ID NO :4)。使用 HERCULASE DNA 聚合酶(Stratagene)，以 IOpM 濃度的引物并以Ing模板DNA(pTrcKudzu)擴增PCR產物。擴增方案包括30個循環(95°C 1 分鐘，60°C 1分鐘，72°C 2分鐘)。產物用HindIII和PstI消化并連接到也已經用HindIII 和I3StI消化的pCL1920中。將連接混合物轉化到大腸桿菌ToplO中。通過測序分析驗證幾個轉化體。所得的質粒命名為pCL-lac-Kudzu。為了去除β -內酰胺酶基因，pTrcKudzu用BspHI消化，用蝦堿性磷酸酶(SAP) 處理，在65°C孵育10分鐘以熱滅活SAP，隨后通過與2單位Klenow片段(New England BioLabs)和dNTP孵育進行末端補平。從瓊脂糖凝膠純化出51Λ片段并將它連接至Kan (R) 基因。根據制造商的說明，使用引物MCM22和MCM23和Taq DNA聚合酶，通過PCR從 pCR-Blunt-IΙ-Τ0Ρ0(Invitrogen)制備該 Kan(R)基因。該 PCR 片段用 HindIII 和 PvuI 消化和使用Klenow片段和dNTP進行末端補平。將連接混合物轉化到大腸桿菌Top 10化學感
44受態細胞中并在含有卡那霉素(50 μ g/ml) Luria瓊脂上選擇攜帶賦予卡那霉素抗性的質粒 pTrcKudzu (kan)的轉化體。所述引物的序列是MCM225，-gatcaagcttAACCGGAATTGCCAG CTG(SEQ ID NO 15)和 MCM23 5‘-gatccgatcgTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGC(SEQ ID N0:16)。實施例2克隆用于重組細菌中表達的楊異戊二烯合酶在本實施例中，描述了用來在大腸桿菌中產生楊異戊二烯合酶(IspS)的方法。 楊(銀白楊χ歐洲山楊)異戊二烯合酶的蛋白質序列(Schnitzler等人，Planta 222 777-786,2005)從GenBank(CAC35696)獲得。密碼子對大腸桿菌優化的一種基因購買自 DNA2. 0并如SEQ ID NO 6中描述(圖3)。該異戊二烯合酶基因通過采用BspLUllI/PstI 的限制性核酸內切酶消化從提供的質粒(p9796-poplar)移出，經凝膠純化并連接至已經用NcoI/PstI消化的pTrcHis2B中。如此克隆該構建體，從而插入序列中的終止密碼子位于PstI位點之前，這產生構建體，其中His標記不連接于異戊二烯合酶蛋白。使用在載體序列內部雜交的(正向和反向)市售引物以及引物Poplar InSeq InSeq 5’ GAGAAAATCG GTAAGGAACT GG (SEQ ID NO :8)，通過測序驗證所得的質粒 pTrcPoplar。實施例3重組細菌中的異戊二烯產生在本實施例中，描述了用來在重組大腸桿菌中產生和測量異戊二烯的方法。1.異戊二烯產生的測定對于搖瓶培養物，將1培養物從搖瓶轉移至20ml CTC頂空小瓶(Agilent瓶體目錄號5188 2753和瓶蓋目錄號5188 2759)。旋緊瓶蓋并且小瓶在恒定溫度孵育，伴以250 轉/分鐘搖動。30分鐘后，從培養箱中取出小瓶并如下文所述分析。在其中測定發酵罐中異戊二烯產生的情況下，從發酵罐的廢氣取得樣品并直接分析。使用Agilent 6890 GC/MS系統進行分析，其中所述的系統連接頂空模式運行的 CTC Analytics CombiPAL 自動進樣器。將 Agilent HP-5MS GC/MS 柱(30mx0. 25mm ;0· 25 μ m 膜厚度)用于分析物的分離。進樣器設置成進樣500 μ L頂空氣體。GC/MS方法利用流速 Iml/分鐘的氦氣作為載氣。進樣口維持在250°C，伴以50 1的分流比。分析期間，烘箱溫度在37°C維持2分鐘。Agilent 5793N質量選擇檢測儀以m/z 67上的單離子監測(SIM) 模式運行。從1.4至1.7分鐘關閉該檢測儀以允許洗脫永久氣體。在這些條件下，觀察到異戊二烯(2-甲基-1，3-丁二烯)在1.78分鐘洗脫。校準表用來量化異戊二烯的絕對量并發現從1 μ g/L至200 μ g/L是線性的。使用這種方法，估計檢測限是50至lOOng/L。II.搖瓶中異戊二烯的產生將上文所述的載體導入大腸桿菌菌株BL21( λ DE3)PLysS(Novagen)以產生菌株 BL21/ptrcKudzu、BL21/pCL-lac-Kudzu 和 BL21/pETHisKudzu。將菌株涂布用于在含有適宜抗生素(對于 BL21/ptrcKudzu 和 BL21/pETHisKudzu 是 50 μ g/ml 羧芐西林或對于 BL21/ pCL-lac-Kudzu是50 μ g/ml壯觀霉素)的LA (Luria瓊脂)上分離并在37°C孵育過夜。單菌落接種到含有20ml Luria Bertani培養基(LB)和適宜抗生素的250ml帶擋板的搖瓶中。 培養物在20°C培育過夜，伴以200轉/分鐘搖動。測量過夜培養物的0D_并且該培養物稀釋到裝有含適宜的抗生素的30ml MAGICMEDIA表達培養基(Invitrogen)的250ml帶擋板的搖瓶中至OD6tltl約0. 05。該培養物在30°C培育過夜，伴以200轉/分鐘搖動。當OD6tltl是大約0. 5-0. 8時，添加400 μ M IPTG并且細胞在30°C再孵育6小時，伴以200轉/分鐘搖動。用IPTG誘導0、2、4和6小時后，收集Iml等分試樣的培養物，測定0D_并且如上文所述測量所產生的異戊二烯的量。III. 14升發酵中從BL21/ptrcKudzu產生異戊二烯從補料分批培養物確定從含有重組葛異戊二烯合酶基因的大腸桿菌中大規模產生異戊二烯。每升發酵培養基中發酵培養基(TM2)的配方如下=K2HPO4 13. 6g，KH2PO4 13. 6g，MgS04*7H20 2g，一水合檸檬酸2g，檸檬酸亞鐵銨0. 3g，(NH4)2SO4 3. 2g，酵母提取物 5g，1000 X改良的微量金屬溶液1ml。全部組分一起添加并溶解于diH20中。pH用氫氧化鉀(KOH)調節至6. 8并且補足至體積。終產物用0. 22 μ M濾器過濾除菌，但是不進行高壓滅菌。1000Χ改良微量金屬溶液的配方如下檸檬酸*H20 40g, MnSO4^H2O 30g，NaCl 10g， FeS04*7H20 lg，CoC12*6H20 lg，ZnS04*7H20 lg，CuS04*5H20 IOOmg, H3BO3 lOOmg，NaMo04*2H20 IOOmgo每種組分一次一種溶解于diH20中，pH用HCl/NaOH調節至3. 0，隨后補足至體積， 并且用0. 22 μ M濾器過濾除菌。在14L生物反應器中實施該實驗以監測從葡萄糖中在想要的發酵，ρΗ6. 7和溫度 34°C下形成異戊二烯。在2個600ml燒瓶中的大豆胨_酵母提取物_葡萄糖培養基內制備取自冷凍小瓶的大腸桿菌菌株BL21/ptrcKUdZU的接種物。在接種物生長至OD55tl = 0. 6 后，將這2個600ml燒瓶離心并且內容物重懸于70ml上清液中以將細胞沉淀物(70ml的OD 3. 1材料)轉移至生物反應器。在接種后的多個時間，取出樣品并如上文所述測量所產生異戊二烯的量。實施例4選擇用于改善植物異戊二烯合酶的位點植物的異戊二烯合酶預期與萜烯合酶同源。已經從龍腦基二磷酸合酶(pdb條目 1N1B)和5-表-aristolochene合酶(pdb條目5EAU)測定了兩種同源萜烯合酶的三維結構。這些酶僅有32%同源性，但它們的三級結構是保守的。此外，具有這兩種酶的中間復合物的結構顯示這些酶的活性中心中的三級折疊和具體相互作用均高度保守。如下表4-1中所示，葛異戊二烯合酶和楊異戊二烯合酶比龍腦基二磷酸合酶與 5-表-馬aristolochene合酶之間具有更高的序列同一性。表4-1.多種酶的同一性百分數
權利要求
1.分離的楊異戊二烯合酶變體，其中所述的變體包含異戊二烯合酶氨基端部分中的截短。
2.權利要求1的分離的楊異戊二烯合酶變體，其中該異戊二烯合酶變體與全長異戊二烯合酶相比具有增加的比活性。
3.權利要求1的分離的楊異戊二烯合酶變體，其中所述異戊二烯合酶是SEQID NO 120的銀白楊(P. alba)異戊二烯合酶。
4.權利要求3的分離的楊異戊二烯合酶變體，其中所述變體選自由MEA變體(SEQID NO 122)、MSV 變體(SEQ ID NO :124)、MVS 變體(SEQ ID NO :126)、MTE 變體(SEQ ID NO 128)、MNV 變體(SEQ ID NO :130)組成的組。
5.權利要求4的分離的楊異戊二烯合酶變體，其中所述變體是MEA變體(SEQID NO 122)。
6.權利要求3的分離的楊異戊二烯合酶變體，其中所述變體選自由TRC(-3)變體(SEQ ID NO :136)、TRC (-4)變體(SEQ ID NO :138)、TRC (-5)變體(SEQ ID NO :140)、TRC (-6)變體(SEQ ID NO 142)和 TRC(-7)變體(SEQ ID NO :144)組成的組。
7.權利要求1的分離的楊異戊二烯合酶變體，其中所述變體是美洲山楊異戊二烯合酶的 MET 變體(SEQ ID NO :146)。
8.權利要求1的分離的楊異戊二烯合酶變體，其中所述變體是毛果楊異戊二烯合酶的 MET 變體(SEQ ID NO :148)。
9.分離的楊異戊二烯合酶變體，其中所述變體包含野生型異戊二烯合酶的一個或多個氨基酸殘基的替換；并且其中異戊二烯合酶變體與野生型異戊二烯合酶相比具有增加的異戊二烯合酶活性。
10.權利要求9的分離的楊異戊二烯合酶變體，其中增加的異戊二烯合酶活性由與包含親本異戊二烯合酶的宿主細胞相比在二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)存在下以更快速率生長的包含異戊二烯合酶變體的宿主細胞指示。
11.權利要求9的分離的楊異戊二烯合酶變體，其中所述異戊二烯合酶是SEQID NO 120的銀白楊異戊二烯合酶。
12.權利要求11的分離的楊異戊二烯合酶變體，其中所述變體包含選自由V10M、F12S、 T15A、E18G、V58I、V58F、L70Q、L70V、L70T、T71P、V79L、E89D、G94A、S119F、F120L、G127R、 E175V、T212I、S257A、R262G、A266G、F280L、N297K、F305L、L319M、E323K、A328T、D342E、 A359T、K366N、E368D、L374M、S396T、V418S、K438N、H440R、T442I、T442A、I449V、A469S、 K500R、K505Q、G507S、S509N、F511Y和N53I組成的組中的多個氨基酸替換之一。
13.權利要求11的分離的楊異戊二烯合酶變體，其中至少一個氨基酸替換是L70R替換。
14.權利要求11的分離的楊異戊二烯合酶變體，其中所述變體包含選自由G127R/ F511Y、L70Q/G94A/R262G/F305L、F12S/T15A/E18G/N297K、S396T/T442I、V10M/E323K、 F120L/A266G、K438N/K500R、V79L/S509N、E175V/S257A/E368D/A469S、T71P/L374M、F280L/ H440R、E89D/H440R、V58F/A328T/N532K、S119F/D342E/I449V 和 K366N/G507S 組成的組中的多個氨基酸替換之一。
15.包含SEQID NO :120的氨基酸殘基(圖19)的多肽的晶形。
16.產生異戊二烯的方法，包括(a)提供包含表達載體的宿主細胞，所述的表達載體包含編碼異戊二烯合酶變體的多核苷酸序列；和(b)在適合產生異戊二烯的條件下培養宿主細胞。
17.權利要求16的方法，還包括(c)回收異戊二烯。
18.權利要求17的方法，還包括(d)聚合異戊二烯。
19.檢測異戊二烯合酶活性的方法，包括(a)在適合產生異戊二烯合酶變體的條件下培養包含表達載體的宿主細胞；(b)用包含溶菌酶的裂解緩沖液裂解該宿主細胞以產生細胞裂解物；和(c)通過測量來自二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)的異戊二烯產生來檢測該細胞裂解物中的異戊二烯合酶活性。
20.權利要求19的方法，其中所述宿主細胞選自由革蘭氏陽性細菌細胞、革蘭氏陰性細菌細胞、絲狀真菌細胞和酵母細胞組成的組。
21.權利要求19的方法，其中所述宿主細胞選自由埃希氏菌屬物種(Escherichia sp.)(大腸桿菌)、泛菌屬物種(Panteoa sp.)(檸檬泛菌)、芽孢桿菌屬物種(Bacillus sp.)(枯草芽孢桿菌)、耶氏酵母屬物種(Yarrowia sp.)(解脂耶氏酵母)和木霉屬 (Trichoderma)(里氏木霉)組成的組。
22.權利要求19的方法，其中所述宿主細胞在包括碳源的培養基中培養，所述碳源選自由葡萄糖、丙三醇、甘油、二羥基丙酮、酵母提取物、生物量、糖蜜、蔗糖和油組成的組。
23.以高通量篩選檢測多份樣品中異戊二烯的方法，包括(a)提供i)分別包含異戊二烯合酶的多份樣品；ii)包含多個孔的玻璃板；和iii)該玻璃板的封蓋；(b)將多份樣品置于玻璃板的多個孔中；(c)用封蓋密封玻璃板以產生密封的玻璃板，其具有與多個孔的每孔中樣品相關的頂空；(d)在異戊二烯合酶有活性的條件下孵育玻璃板；(e)檢測頂空中的異戊二烯。
24.權利要求23的方法，其中異戊二烯由氣相色譜-質譜法(GC-MQ檢測。
25.權利要求23的方法，其中所述多份樣品包含含有表達載體的宿主細胞，所述表達載體包含與啟動子有效連接的編碼異戊二烯合酶變體的多核苷酸序列。
26.權利要求23的方法，其中所述多份樣品包含宿主細胞的裂解物、溶菌酶和二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)。
27.權利要求23的方法，其中所述玻璃板是深孔玻璃塊。
28.權利要求23的方法，其中所述多個孔包括至少M個孔。
29.權利要求23的方法，其中所述多個孔各自包含2ml或更小的容積。
30.宿主細胞，其包含與啟動子有效連接的編碼異戊二烯合酶變體的異源多核苷酸序列，其中異戊二烯合酶變體在與楊異戊二烯合酶的一個或多個(1、2、3、4、5、6、7、8、9或10 個)殘基相對應的位置處包含替換。
31.權利要求30的宿主細胞，其中所述異戊二烯合酶是SEQID NO :120的銀白楊異戊二烯合酶。
32.權利要求31的宿主細胞，其中所述變體選自由MEA變體(SEQID NO 122), MSV變體(SEQ ID NO :124)、MVS 變體(SEQ ID NO :1 )、MTE 變體(SEQ ID NO :12 、MNV 變體 (SEQ ID NO 130)組成的組。
33.權利要求31的宿主細胞，其中所述變體選自由TRC(-3)變體(SEQID NO 136), TRC (-4)變體(SEQ ID NO :138)、TRC (-5)變體(SEQ ID NO :140)、TRC (-6)變體(SEQ ID NO 142)和 TRC (-7)變體(SEQ ID NO :144)組成的組。
34.權利要求30的宿主細胞，其中所述變體是美洲山楊異戊二烯合酶的MET變體(SEQ ID NO 146)。
35.權利要求30的宿主細胞，其中所述變體是毛果楊異戊二烯合酶的MET變體(SEQID NO 148)。
36.權利要求31的宿主細胞，其中所述變體包含選自由V10M、F12S、T15A、E18G、V58I、 V58F、L70Q、L70V、L70T、T71P、V79L、E89D、G94A、S119F、F120L、G127R、E175V、T212I、S257A、 R262G、A266G、F280L、N297K、F305L、L319M、E323K、A328T、D342E、A359T、K366N、E368D、 L374M、S396T、V418S、K438N、H440R、T442I、T442A、I449V、A469S、K500R、K505Q、G507S、 S509N、F511Y和N53I組成的組中的多個氨基酸替換之一。
37.權利要求36的宿主細胞，其中至少一個氨基酸替換是L70R替換。
38.權利要求31的宿主細胞，其中所述變體包含選自由G127R/F511Y、L70Q/G94A/ R262G/F305L、F12S/T15A/E18G/N297K、S396T/T442I、V10M/E323K、F120L/A266G、K438N/ K500R、V79L/S509N、E175V/S257A/E368D/A469S、T71P/L374M、F280L/H440R、E89D/H440R、 V58F/A328T/N532K、S119F/D342E/I449V和K366N/G507S組成的組中的多個氨基酸替換之
39.權利要求30的宿主細胞，其中所述多核苷酸序列包含于質粒內。
40.權利要求39的宿主細胞，其中所述多核苷酸序列整合到宿主細胞的染色體中。
41.權利要求30的宿主細胞，其中所述宿主選自由革蘭氏陽性細菌細胞、革蘭氏陰性細菌細胞、絲狀真菌細胞和酵母細胞組成的組。
42.權利要求30的宿主細胞，其中所述宿主選自由埃希氏菌屬物種(大腸桿菌)、泛菌屬物種(檸檬泛菌)、芽孢桿菌屬物種(枯草芽孢桿菌)、耶氏酵母屬物種(解脂耶氏酵母) 和木霉屬(里氏木霉)組成的組。
43.權利要求30的宿主細胞，其中所述宿主在包含碳源的培養基中培養，所述碳源選自由葡萄糖、丙三醇、甘油、二羥基丙酮、酵母提取物、生物量、糖蜜、蔗糖和油組成的組。
44.權利要求30的宿主細胞，其中所述宿主細胞還包含編碼IDI多肽的異源或天然核酸和/或編碼DXS多肽的異源或天然核酸，其任選地與天然DXP途徑組合。
45.權利要求30的宿主細胞，其中所述宿主細胞還包含編碼IDI多肽和DXS多肽的一種或多種核酸。
46.權利要求30的宿主細胞，其中所述宿主細胞包含編碼異戊二烯合酶變體、IDI多肽和DXS多肽的一種載體。
47.權利要求46的宿主細胞，其中所述宿主細胞還包含編碼MVA途徑多肽的異源核酸，所述MVA途徑多肽選自由來自釀酒酵母(Saccharomyces cerevisia)和糞腸球菌 (Enterococcus faecalis)的MVA途徑多肽組成的組。
48.權利要求30的宿主細胞，其中所述宿主細胞還包含編碼MVA途徑多肽和DXS多肽的一種或多種核酸并且其中一種載體編碼所述異戊二烯合酶變體、MVA途徑多肽和DXS多肽。
49.權利要求48的宿主細胞，其中所述宿主細胞還包含編碼DXS多肽、IDI多肽或者剩余DXP途徑多肽中一種或多種多肽和MVA途徑多肽的一種或多種核酸。
50.產生異戊二烯的方法，包括(a)在用于產生異戊二烯的合適培養條件下培養權利要求30的宿主細胞；和(b)產生異戊二烯。
51.權利要求50的方法，還包括(c)回收異戊二烯。
52.權利要求51的方法，還包括(d)聚合異戊二烯。
53.產生異戊二烯合酶的方法，包括(a)提供(i)宿主細胞；和(ii)與啟動子有效連接的編碼異戊二烯合酶變體的核酸， 其中異戊二烯合酶變體在與SEQ ID NO :120的銀白楊異戊二烯合酶的一個或多個(1、2、3、 4、5、6、7、8、9或10個)殘基相對應的位置處包含替換；(b)將宿主細胞與該核酸接觸以產生轉化的宿主細胞；和(c)在用于產生異戊二烯合酶的合適培養條件下培養轉化的宿主細胞。
全文摘要
本發明提供了方法和包含催化活性和/或溶解度改進的至少一種異戊二烯合酶的組合物。具體地，本發明提供了用于增加微生物宿主細胞中異戊二烯產生的變異植物異戊二烯合酶。生物合成產生的本發明異戊二烯用于橡膠和高彈體的制造中。
文檔編號C12N9/88GK102171335SQ200980123460
公開日2011年8月31日 申請日期2009年4月23日 優先權日2008年4月23日
發明者A·米亞斯尼科夫, C·L·萊福, C·M·派瑞斯, D·H·韋爾斯, G·M·懷特德, J·C·麥考利夫, J·凱利斯, M·A·卡文, R·R·博特, W·韋勒 申請人:丹尼斯科美國公司, 固特異輪胎和橡膠公司