通過(guò)使用小分子調(diào)節(jié)劑誘導(dǎo)復(fù)能基因而重編程細(xì)胞的制作方法

專利名稱：通過(guò)使用小分子調(diào)節(jié)劑誘導(dǎo)復(fù)能基因而重編程細(xì)胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的實(shí)施方案涉及細(xì)胞生物學(xué)、干細(xì)胞、細(xì)胞分化、體細(xì)胞核轉(zhuǎn)移和基于細(xì)胞 的治療學(xué)的領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明的實(shí)施方案涉及用于重編程細(xì)胞以及基于細(xì)胞的治療 法的方法、組合物和試劑盒。
背景技術(shù)：
再生醫(yī)學(xué)作為用于許多人類疾病的治療具有巨大的前景，但也帶來(lái)一些在現(xiàn)代科 學(xué)研究中面臨的最困難的技術(shù)挑戰(zhàn)。對(duì)再生醫(yī)學(xué)的技術(shù)挑戰(zhàn)包括低的克隆效率，潛在復(fù)能 組織的供應(yīng)不足，以及對(duì)于如何控制細(xì)胞分化和哪種類型的胚胎干細(xì)胞能被用于所選的治 療的知識(shí)的普遍缺乏。盡管ES細(xì)胞具有極大的可塑性，但是未分化的ES細(xì)胞能夠形成含 有組織類型的混合物的畸胎瘤(良性腫瘤)。此外，從一種來(lái)源向另一種來(lái)源移植ES細(xì)胞 將可能需要施用藥物來(lái)防止新細(xì)胞的排斥。已經(jīng)進(jìn)行了嘗試來(lái)鑒定由非胎兒源的組織產(chǎn)生干細(xì)胞的新途徑。一種方法包括操 縱自體的成體干細(xì)胞。使用自體的成體干細(xì)胞用于再生醫(yī)學(xué)的優(yōu)勢(shì)在于它們來(lái)源于且返回 至同一患者，并且因此不經(jīng)受免疫介導(dǎo)的排斥反應(yīng)的事實(shí)。主要的缺點(diǎn)是這些細(xì)胞缺少ES 細(xì)胞的可塑性和復(fù)能性，并因此它們的潛能是不確定的。另一種方法旨在將來(lái)自成體組織 的體細(xì)胞重編程以產(chǎn)生復(fù)能的ES樣細(xì)胞。然而，這種方法是困難的，因?yàn)槎嗉?xì)胞生物體中 的每種細(xì)胞類型具有獨(dú)特的表觀遺傳學(xué)標(biāo)記，認(rèn)為在細(xì)胞分化后或從細(xì)胞周期中退出后該 標(biāo)記便是固定的。細(xì)胞DNA—般以染色質(zhì)(一種包含核酸和蛋白質(zhì)的復(fù)合物)的形式存在。事實(shí)上， 大部分細(xì)胞RNA分子還以核蛋白復(fù)合物的形式存在。如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，染色質(zhì)的 核蛋白結(jié)構(gòu)已經(jīng)是廣泛研究的對(duì)象。一般而言，染色體DNA被包裝成核小體。核小體包含 核心和連接區(qū)。核小體核心包含核心組蛋白(H2A、H2B、H3和H4各二個(gè))八聚體，約150個(gè) 堿基對(duì)的染色體DNA纏繞在該八聚體周圍。此外，約50個(gè)堿基對(duì)的連接區(qū)DNA區(qū)段與連接 區(qū)組蛋白Hl締合。核小體被組織成更高階的染色質(zhì)絲并且染色質(zhì)絲被組織成染色體。參 見(jiàn)，例如，Wolffe "chromatin Structure and Function(染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能)，，第 3 版， Academic Press, San Diego,1998。染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)不是靜態(tài)的，而是易于被統(tǒng)稱為染色質(zhì)重建的過(guò)程修飾。染色質(zhì)重建可用于，例如從DNA區(qū)去除核小體；將核小體從一個(gè)DNA區(qū)移到另一個(gè)DNA區(qū)；改變核 小體之間的間距；或?qū)⒑诵◇w添加至染色體中的DNA區(qū)中。染色質(zhì)重建也能導(dǎo)致更高階結(jié) 構(gòu)的改變，從而影響轉(zhuǎn)錄活性的染色質(zhì)(開(kāi)放染色質(zhì)或常染色質(zhì))和無(wú)轉(zhuǎn)錄活性的染色質(zhì) (閉合的染色質(zhì)或異染色質(zhì))之間的平衡。染色體蛋白易受許多類型的化學(xué)修飾影響。這些核心組蛋白的翻譯后修飾的一種 機(jī)制是高度保守的堿性N-末端賴氨酸殘基的ε-氨基的可逆的乙?；?。組蛋白乙?；?穩(wěn)態(tài)通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性的組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶和組蛋白脫乙酰酶(本文稱為HDAC)之間的動(dòng)態(tài)平衡 而建立。早已將組蛋白的乙?；兔撘阴；c轉(zhuǎn)錄的控制相聯(lián)系。組蛋白的可逆的乙?；?能導(dǎo)致染色質(zhì)重建并且如此可以充當(dāng)基因轉(zhuǎn)錄的控制機(jī)制。總的來(lái)說(shuō)，組蛋白的高度乙酰 化有利于基因的表達(dá)，然而組蛋白的脫乙?；c轉(zhuǎn)錄阻抑有關(guān)。據(jù)顯示組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶 充當(dāng)轉(zhuǎn)錄的輔激活蛋白，然而發(fā)現(xiàn)脫乙酰酶屬于轉(zhuǎn)錄阻抑途徑。組蛋白乙?；徒M蛋白脫乙酰化之間的動(dòng)態(tài)平衡對(duì)于正常的細(xì)胞生長(zhǎng)是必不可 少的。組蛋白脫乙酰化的抑制導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯、細(xì)胞分化、凋亡和轉(zhuǎn)化的表型的逆轉(zhuǎn)。牽涉在基因表達(dá)的調(diào)節(jié)中的另一組蛋白是DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)，其負(fù)責(zé)引起轉(zhuǎn) 錄沉默的基因組的甲基化模式的產(chǎn)生。DNA甲基化對(duì)于許多哺乳動(dòng)物的過(guò)程包括胚胎發(fā)育、 X-失活、基因組印記和基因表達(dá)的調(diào)節(jié)是核心性的。哺乳動(dòng)物中DNA的甲基化通過(guò)甲基基 團(tuán)從S-腺苷-甲硫氨酸轉(zhuǎn)移至胞嘧啶的C5位置而實(shí)現(xiàn)。這個(gè)反應(yīng)由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶催化 并對(duì)于CpG 二核苷酸中的胞嘧啶是特異性的。在人基因組的CpG 二核苷酸中所有胞嘧啶的 百分之七十(70% )是甲基化的并易于脫氨基，導(dǎo)致胞嘧啶向胸腺嘧啶轉(zhuǎn)變。這個(gè)過(guò)程引起 鳥嘌呤和胞嘧啶的頻率全面下降至所有核苷酸的約40%，并引起CpG 二核苷酸的頻率進(jìn)一 步下降至它們的預(yù)期頻率的約四分之一。在哺乳動(dòng)物中已經(jīng)鑒定了四種活性DNA甲基轉(zhuǎn)移酶。它們被命名為DNMTl、DNMT2、 DNMT3A和DNFHB。另外，DNMT3L是結(jié)構(gòu)上與DNMT3A和DNFHB緊密相關(guān)的蛋白，且對(duì)DNA 甲基化是至關(guān)重要的，但單獨(dú)的DNMT3L表現(xiàn)為是失活的。在含有CpG島的啟動(dòng)子區(qū)中的胞 嘧啶的甲基化引起脊椎動(dòng)物細(xì)胞中下游編碼序列的轉(zhuǎn)錄失活。稱為甲基-CpG結(jié)合蛋白(MBD 1至MBD 4)的蛋白家族被認(rèn)為在甲基化介導(dǎo)的轉(zhuǎn) 錄沉默中起重要作用。MeCP2是這個(gè)家族被鑒定的第一個(gè)成員且含有甲基-CpG結(jié)合結(jié)構(gòu) 域(MBD)和轉(zhuǎn)錄阻抑結(jié)構(gòu)域(TRD)，MeCP2有利于與甲基化的DNA的相互作用并將Sin3A/ HDAC復(fù)合物靶向甲基化的DNA。像MeCP2 —樣，MBD1、MBD2和MBD3已顯示是有效的轉(zhuǎn)錄阻 抑劑。MBD4是修復(fù)G:T錯(cuò)配的DNA糖基化酶。除MBD3之外，該家族的每個(gè)成員在哺乳動(dòng)物 細(xì)胞中與甲基化的DNA形成復(fù)合物，而且除MBDl和MBD4之外的所有成員都位于已知的染 色質(zhì)重建復(fù)合物中。Mi-2復(fù)合物結(jié)合DNA甲基化作用使染色質(zhì)重建和組蛋白脫乙酰。牽涉在表觀遺傳學(xué)調(diào)節(jié)中的另一組蛋白是組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶(HMT)，組蛋白甲基 轉(zhuǎn)移酶是催化一個(gè)至三個(gè)甲基基團(tuán)從輔因子S-腺苷甲硫氨酸轉(zhuǎn)移至組蛋白的賴氨酸殘基 和精氨酸殘基的酶組蛋白-賴氨酸N-甲基轉(zhuǎn)移酶和組蛋白精氨酸N-甲基轉(zhuǎn)移酶。甲基化 的組蛋白與DNA更緊密地結(jié)合，這抑制轉(zhuǎn)錄。染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)也能夠通過(guò)稱為染色質(zhì)重建復(fù)合物的高分子組件的活性而改變。 參見(jiàn)，例如，Cairns (1998) Trends Biochem. Sci. 23 :20 25 ；Workman 等.(1998) Ann. Rev. Biochem. 67 545 579 ；Kingston 等.(1999)Genes Devel. 13 :2339 2352 R Murchardt等· (1999) J. Mol. Biol. 293 185 197。染色質(zhì)重建復(fù)合物參與核小體陣列的斷裂或重新形 成，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)、DNA的復(fù)制和DNA的修復(fù)(Bochar等.(2000)PNAS USA 97(3) :1038 43)。雖然這些染色質(zhì)重建復(fù)合物中的許多具有不同的亞基組成，但都依賴于AIPase酶的 重建活性。體內(nèi)也有需要染色質(zhì)重建復(fù)合物的活性以活化基因的幾個(gè)實(shí)例。復(fù)能細(xì)胞或全能細(xì)胞發(fā)育為分化的、特化的表型由在發(fā)育期間表達(dá)的特定組的基 因決定。基因表達(dá)由能實(shí)現(xiàn)正調(diào)節(jié)或負(fù)調(diào)節(jié)的基因調(diào)節(jié)蛋白的序列特異性結(jié)合直接介導(dǎo)。 然而，這些調(diào)節(jié)蛋白的任一種直接介導(dǎo)基因表達(dá)的能力至少部分地取決于它們?cè)诩?xì)胞DNA 內(nèi)的結(jié)合位點(diǎn)的可接近性。如上文所討論的，細(xì)胞DNA中序列的可接近性通常取決于在其 中包裝細(xì)胞DNA的細(xì)胞染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)。因此，鑒定能夠誘導(dǎo)復(fù)能性所需要的基因的表達(dá)的方法、組合物和試劑盒，包括能 夠抑制參與阻抑轉(zhuǎn)錄的蛋白的活性的方法、組合物和試劑盒是有用的。發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明涉及用于重編程細(xì)胞的方法、組合物和試劑盒。本發(fā)明的實(shí)施方案涉及包 括誘導(dǎo)復(fù)能基因或多能基因的表達(dá)的方法。在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明還涉及產(chǎn)生重編 程的細(xì)胞。在還一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明涉及包括抑制參與阻抑轉(zhuǎn)錄的蛋白的活性的方法。在 又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種用于重編程細(xì)胞的方法，包括改變調(diào)節(jié)蛋白的活性、表 達(dá)、或活性和表達(dá)二者。方法還包括誘導(dǎo)復(fù)能基因或多能基因的表達(dá)，及重編程細(xì)胞。本發(fā)明的實(shí)施方案還涉及重編程細(xì)胞的方法，包括將細(xì)胞、細(xì)胞群、細(xì)胞培養(yǎng)物、 來(lái)自細(xì)胞培養(yǎng)物的細(xì)胞亞群、同質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)物或異質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)物與抑制參與阻抑轉(zhuǎn)錄 的蛋白的活性、表達(dá)、或活性和表達(dá)二者的劑相接觸，誘導(dǎo)復(fù)能基因或多能基因的表達(dá)，以 及重編程細(xì)胞。方法還包括使重編程的細(xì)胞再分化。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于重編程細(xì)胞的方法，包括將細(xì)胞暴露于改 變調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)、活性、或表達(dá)和活性二者的小分子調(diào)節(jié)劑，誘導(dǎo)復(fù)能基因或多能基因的 表達(dá)，以及篩選細(xì)胞，其中所述細(xì)胞已經(jīng)恢復(fù)分化潛能。改變參與阻抑轉(zhuǎn)錄的蛋白或者調(diào)節(jié)蛋白的活性、表達(dá)、或活性和表達(dá)二者的劑包 括但不限于小分子、小分子抑制劑和小分子活化劑。誘導(dǎo)復(fù)能基因或多能基因的表達(dá)的劑包括但不限于小分子、小分子抑制劑和小分 子抑制劑。參與阻抑轉(zhuǎn)錄的任何蛋白，包括但不限于DNA甲基轉(zhuǎn)移酶、組蛋白脫乙酰酶、甲基 結(jié)合結(jié)構(gòu)域蛋白、組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶、SWI/SNF復(fù)合物的組分、NuRD復(fù)合物的組分和IN080 復(fù)合物的組分，能夠被本發(fā)明的方法抑制。在一些實(shí)施方案中，至少一種小分子抑制劑能用于抑制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶、組蛋白 脫乙酰酶、甲基結(jié)合結(jié)構(gòu)域蛋白或組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶的活性。在又一個(gè)實(shí)施方案中，多于一 種的小分子抑制劑能用于抑制參與阻抑轉(zhuǎn)錄的多于一種蛋白的活性，所述蛋白包括但不限 于DNA甲基轉(zhuǎn)移酶、組蛋白脫乙酰酶、甲基結(jié)合結(jié)構(gòu)域蛋白或組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶。在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種包括以下的方法將細(xì)胞與抑制至少一種 DNMT的活性的小分子抑制劑相接觸；將至少一個(gè)CpG 二核苷酸脫甲基；誘導(dǎo)促使細(xì)胞為復(fù) 能或多能的至少一種基因的表達(dá)，和重編程細(xì)胞。在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種包括以下的方法將具有第一表型的細(xì)胞暴露于改變至少一種調(diào)節(jié)蛋白的活性、表達(dá)、或活性和表達(dá)二者的小分子調(diào)節(jié)劑；將細(xì)胞的 第一表型與將細(xì)胞暴露于小分子調(diào)節(jié)劑之后獲得的表型相比較，以及篩選已被重編程的且 是復(fù)能或多能的細(xì)胞。在又一個(gè)實(shí)施方案中，方法包括將細(xì)胞暴露于小分子調(diào)節(jié)劑之前的 細(xì)胞基因型與用小分子調(diào)節(jié)劑處理之后獲得的細(xì)胞基因型相比較。在又一個(gè)實(shí)施方案中， 方法包括將細(xì)胞暴露于小分子調(diào)節(jié)劑之前的細(xì)胞的表型和基因型與細(xì)胞暴露于小分子調(diào) 節(jié)劑之后的細(xì)胞的表型和基因型相比較。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種用于重編程細(xì)胞的方法，包括將細(xì)胞暴露 于誘導(dǎo)復(fù)能基因或多能基因表達(dá)的小分子調(diào)節(jié)劑；以及篩選細(xì)胞，其中所述細(xì)胞已經(jīng)恢復(fù) 分化潛能。在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于重編程細(xì)胞的方法，包括將細(xì)胞暴露于 改變調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)、活性、或表達(dá)和活性二者的小分子調(diào)節(jié)劑，誘導(dǎo)復(fù)能基因或多能基因 的表達(dá)；以及篩選細(xì)胞，其中所述細(xì)胞已經(jīng)恢復(fù)分化潛能。在又一個(gè)實(shí)施方案中，方法包括將篩選的細(xì)胞培養(yǎng)或擴(kuò)增成細(xì)胞群。在另一個(gè)實(shí) 施方案中，方法包括使用與復(fù)能基因或多能基因編碼的蛋白相結(jié)合的抗體或使用與多能標(biāo) 記物或復(fù)能標(biāo)記物相結(jié)合的抗體分離細(xì)胞，所述多能標(biāo)記物或復(fù)能標(biāo)記物包括但不限于 SSEA3、SSEA4、1Tra-1-60和 ει-1-81。在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明還包括將暴露于所述小 分子調(diào)節(jié)劑之前的復(fù)能基因或多能基因的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)與暴露于所述小分子調(diào)節(jié)劑之后獲 得的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)相比較。使用有效的用于分離細(xì)胞的任何方法也可分離細(xì)胞，所述任何方 法包括但不限于熒光細(xì)胞激活分選儀、免疫組織化學(xué)和ELISA。在另一個(gè)實(shí)施方案中，方法 包括篩選具有比原始細(xì)胞低的分化狀態(tài)的細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于重編程細(xì)胞的方法，包括將具有第一轉(zhuǎn)錄 模式的細(xì)胞暴露于誘導(dǎo)復(fù)能基因或多能基因表達(dá)的小分子調(diào)節(jié)劑；將細(xì)胞的第一轉(zhuǎn)錄模式 與暴露于所述調(diào)節(jié)劑之后獲得的轉(zhuǎn)錄模式相比較；以及篩選細(xì)胞，其中所述細(xì)胞已經(jīng)恢復(fù) 分化潛能。在另一個(gè)實(shí)施方案中，篩選細(xì)胞包括篩選具有比原始細(xì)胞低的分化狀態(tài)的細(xì)胞。在又一個(gè)實(shí)施方案中，篩選細(xì)胞包括鑒定具有轉(zhuǎn)錄模式至少5% -10%、 10 % -20 %,20 % -30 %,30 % -40 %,40 % -50 %,50 % -60 %,60 % -70 %,70 % -80 %, 80% -90%,90% _94%、95%或95% -99%類似于分析的胚胎干細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄模式的細(xì)胞。 不需要比較胚胎干細(xì)胞的整個(gè)轉(zhuǎn)錄模式，盡管這是可以的。反而，可比較的胚胎基因的亞 組包括但不限于1-5 個(gè)、5-10 個(gè)、10-25 個(gè)、25-50 個(gè)、50-100 個(gè)、100-200 個(gè)、200-500 個(gè)、 500-1，000 個(gè)、1，000-2，000 個(gè)、2，000-2，500 個(gè)、2，500-5，000 個(gè)、5，000-10，000 個(gè)和多于 10，000個(gè)基因?？捎枚绞奖容^轉(zhuǎn)錄模式，即，可以進(jìn)行比較來(lái)確定基因是轉(zhuǎn)錄的還是未 轉(zhuǎn)錄的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以比較每個(gè)基因或基因亞組的轉(zhuǎn)錄速率和/或程度。能使 用本領(lǐng)域已知的任何方法來(lái)確定轉(zhuǎn)錄模式，所述任何方法包括但不限于RT-PCR、定量PCR、 微陣列、DNA印跡和雜交。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于重編程細(xì)胞的方法，包括將細(xì)胞暴露于干 擾第一調(diào)節(jié)蛋白的活性、表達(dá)、或活性和表達(dá)二者的小分子調(diào)節(jié)劑；將所述細(xì)胞暴露于抑制 第二調(diào)節(jié)蛋白的活性、表達(dá)、或表達(dá)和活性二者的第二劑，其中所述第二調(diào)節(jié)蛋白具有與第 一調(diào)節(jié)蛋白不同的功能；誘導(dǎo)復(fù)能基因或多能基因的表達(dá)；以及篩選細(xì)胞，其中所述細(xì)胞 已經(jīng)恢復(fù)分化潛能。在另一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞或細(xì)胞群可同時(shí)或相繼地暴露于第一劑和 第二劑。第二劑包括但不限于小分子、小分子抑制劑、小分子活化劑、核酸序列、和shRNA構(gòu)建體。本發(fā)明的實(shí)施方案也包括使用根據(jù)本文公開(kāi)的方法產(chǎn)生的重編程的細(xì)胞來(lái)治療 多種疾病的方法。在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明也涉及重編程的細(xì)胞和已再分化的重編程 的細(xì)胞的治療用途。本發(fā)明的實(shí)施方案也涉及通過(guò)本發(fā)明的方法產(chǎn)生的重編程的細(xì)胞。重編程的細(xì)胞 能夠再分化成單一的譜系或多于一種譜系。重編程的細(xì)胞能夠是多能的或復(fù)能的。在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及根據(jù)包括下列步驟的方法產(chǎn)生的富集的重編程 的細(xì)胞群將細(xì)胞暴露于誘導(dǎo)復(fù)能基因或多能基因表達(dá)的小分子調(diào)節(jié)劑；以及篩選細(xì)胞， 其中多數(shù)細(xì)胞已恢復(fù)分化潛能，并培養(yǎng)所述篩選的細(xì)胞以產(chǎn)生細(xì)胞群。在又一個(gè)實(shí)施方 案中，重編程的細(xì)胞表達(dá)選自由以下組成的組的細(xì)胞表面標(biāo)記物SSEA3、SSEA4、Tra-1-60 和Tra-1-81。在又一個(gè)實(shí)施方案中，重編程的細(xì)胞占富集的細(xì)胞群的至少5 % -10%, 10 % -20 %,20 % -30 %,30 % -40 %,40 % -50 %,50 % -60 %,60 % -70 %,70 % -80 %, 80% -90%,90% -95%,96% -98% ；或至少 99%。本發(fā)明的實(shí)施方案也涉及用于制備本發(fā)明的方法和組合物的試劑盒。試劑盒尤其 能夠用于重編程細(xì)胞和產(chǎn)生ES-樣細(xì)胞和干細(xì)胞樣細(xì)胞。附圖簡(jiǎn)述

圖1是報(bào)道用DNMT抑制劑(500 μ M RG108)處理的原代人肺成纖維細(xì)胞中的 Oct-4和Nanog的上調(diào)的柱狀圖。MC是對(duì)照培養(yǎng)基。圖2是報(bào)道在VPA的存在下，在幾種細(xì)胞類型中的幾種復(fù)能基因的表達(dá)增加的柱 狀圖。HDi^a指的是成人皮膚成纖維細(xì)胞；HDFf指的是人胎兒皮膚成纖維細(xì)胞；HDi^n指的是 人新生兒皮膚成纖維細(xì)胞；且BJF指的是BJ成纖維細(xì)胞(包皮)。圖3是報(bào)道用在VPA處理的成人皮膚成纖維細(xì)胞和人胎兒皮膚成纖維細(xì)胞中對(duì) HDACll和HDAC9表達(dá)的效應(yīng)的柱狀圖。圖4是報(bào)道用煙酰胺處理4天的成人皮膚成纖維細(xì)胞中的Oct-4的表達(dá)增加的柱 狀圖。圖5是報(bào)道用苯基丁酸鈉處理4天的成人皮膚成纖維細(xì)胞中的Oct-4的表達(dá)增加 的柱狀圖。圖6是報(bào)道用valproxam處理4天的成人皮膚成纖維細(xì)胞中的0ct_4的表達(dá)增加 的柱狀圖。圖7是報(bào)道用2-PCPA (組蛋白/賴氨酸1脫甲基酶抑制劑)處理8天的BJ成纖 維細(xì)胞中的Oct-4的表達(dá)增加的柱狀圖。圖8A是在成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的成人皮膚成纖維細(xì)胞的照片。圖8B是在DMEM/F12培養(yǎng)基中的成人皮膚成纖維細(xì)胞的照片。圖8C是在基質(zhì)膠上的mTeSR hES細(xì)胞培養(yǎng)基中的VPA處理的(500 μ Μ)的成人皮 膚成纖維細(xì)胞的照片。圖8D是在基質(zhì)膠上的mTeSR hES細(xì)胞培養(yǎng)基中的VPA處理的(500 μ Μ)的成人皮 膚成纖維細(xì)胞的照片。優(yōu)選實(shí)施方案的詳述定義
除非另外指明，否則在本公開(kāi)內(nèi)容中的數(shù)值范圍是近似的，并因此可包括該范圍 之外的值。數(shù)字范圍包括來(lái)自以一個(gè)單位遞增的下限值和上限值之間的所有值并且包括下 限值和上限值，前提條件是在任何下限值和任何上限值之間存在至少兩個(gè)單位的分隔。作 為實(shí)例，如果組分性質(zhì)、物理性質(zhì)或其它性質(zhì)諸如，例如分子量、熔化指數(shù)、溫度等是100至 1，000，則旨在清楚地列舉所有單個(gè)的值例如100、101、102等和子范圍例如100至144、155 至170、197至200等。對(duì)于含有少于1的值或含有大于1的分?jǐn)?shù)數(shù)字(例如1. 1、1. 5等) 的范圍，一個(gè)單位視情況被認(rèn)為是0. 0001,0. 001,0. 01或0. 1。對(duì)于含有少于10的單數(shù)字 的范圍(例如，1至5)，通常認(rèn)為一個(gè)單位是0. 1。這些僅是具體旨指的范圍的實(shí)例，且認(rèn)為 在列舉的最低值和最高值之間的數(shù)值的所有可能的組合在本公開(kāi)內(nèi)容中清楚地陳述。在本 公開(kāi)內(nèi)容中尤其提供的數(shù)字范圍是混合物中組分的相對(duì)量和方法中所引用的各種溫度以 及其他參數(shù)范圍。除非明確地限制為相反情況，否則“細(xì)胞”(“cell”或“cells”)包括任何體細(xì)胞、 胚胎干(EQ細(xì)胞、成體干細(xì)胞、器官特異性干細(xì)胞、核轉(zhuǎn)移(NT)單位和干樣細(xì)胞。細(xì)胞能 夠從任何器官或組織中獲得。細(xì)胞能夠是人或其它動(dòng)物的。例如，細(xì)胞能夠是小鼠的、豚鼠 的、大鼠的、牛的、馬的、豬的、綿羊的、山羊的等。細(xì)胞也能夠來(lái)自非人靈長(zhǎng)類?！芭囵B(yǎng)基”或“生長(zhǎng)培養(yǎng)基”指的是能夠支持細(xì)胞生長(zhǎng)的合適的培養(yǎng)基?！胺只敝傅氖羌?xì)胞在胚胎發(fā)育期間變得結(jié)構(gòu)和功能特化的過(guò)程。"DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑”和“DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的抑制劑”指的是能夠與DNA甲基轉(zhuǎn) 移酶相互作用且抑制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的活性的化合物?！耙种艱NA甲基轉(zhuǎn)移酶活性”指的是 降低DNA甲基轉(zhuǎn)移酶甲基化特定底物諸如CpG 二核苷酸序列的能力。在一些實(shí)施方案中， DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性的這種降低是至少約25%至少約50%，在另外的實(shí)施方案中是至少約 75%，且在其它的實(shí)施方案中是至少約90%。在又一個(gè)實(shí)施方案中，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性降 低至少95%且在另一個(gè)實(shí)施方案中降低至少99%?！氨碛^遺傳學(xué)”指的是關(guān)于功能上可遺傳的改變而無(wú)核苷酸序列改變的DNA狀態(tài)。 表觀遺傳學(xué)改變能夠由DNA的修飾諸如由甲基化或由脫甲基化引起，而無(wú)在DNA的核苷酸 序列上的任何改變。“組蛋白”指的是在染色體中發(fā)現(xiàn)的負(fù)責(zé)壓縮DNA足以使DNA適于在細(xì)胞核中的一 類蛋白分子?！扒玫?Knock down) ”指的是以基因特異的方式阻抑基因的表達(dá)。具有一個(gè)或多 個(gè)被“敲低”的基因的細(xì)胞被稱為敲低的機(jī)體或僅僅為“敲低”?！皬?fù)能”指的是能夠分化成3種胚層細(xì)胞類型或基本組織類型?！皬?fù)能基因”指的是促使細(xì)胞為復(fù)能的細(xì)胞的基因。“復(fù)能細(xì)胞培養(yǎng)物”當(dāng)展現(xiàn)與胚胎來(lái)源或成體來(lái)源的分化細(xì)胞明顯區(qū)分它們的形 態(tài)時(shí)被稱為是“大體上未分化的”。復(fù)能細(xì)胞通常具有高的核/質(zhì)比、突起的核仁、以及具有 難以辨認(rèn)的細(xì)胞連接的致密的集落形成，且易于被本領(lǐng)域技術(shù)人員識(shí)別。認(rèn)識(shí)到未分化細(xì) 胞集落能被分化的鄰近細(xì)胞環(huán)繞。然而，當(dāng)在適當(dāng)?shù)那闆r下培養(yǎng)時(shí)，大體上未分化的細(xì)胞集 落將繼續(xù)存在，并且在分離培養(yǎng)的細(xì)胞后，未分化的細(xì)胞組成細(xì)胞的主要部分。在本公開(kāi)內(nèi) 容中描述的有用的細(xì)胞群含有任何比例的具有這些標(biāo)準(zhǔn)的大體上未分化的復(fù)能細(xì)胞。大體 上未分化細(xì)胞培養(yǎng)物可含有約20^^40^^60%或甚至80%的未分化的復(fù)能細(xì)胞(以群中所有細(xì)胞的百分比計(jì))?！罢{(diào)節(jié)蛋白”指的是調(diào)節(jié)生物學(xué)過(guò)程的任何蛋白，包括正向調(diào)節(jié)和負(fù)向調(diào)節(jié)。調(diào)節(jié) 蛋白能夠?qū)ι飳W(xué)過(guò)程具有直接的或間接的影響，并能直接地發(fā)揮作用或者通過(guò)參與復(fù)合 物中發(fā)揮作用?！爸鼐幊獭敝傅氖且瞥酥械谋碛^遺傳學(xué)標(biāo)記，然后建立不同組的表觀遺傳學(xué)標(biāo) 記。在多細(xì)胞生物體的發(fā)育期間，不同的細(xì)胞和組織獲得不同的基因表達(dá)程序。這些不同 的基因表達(dá)模式表現(xiàn)為實(shí)質(zhì)上由諸如DNA甲基化、組蛋白修飾和其他染色質(zhì)結(jié)合蛋白等表 觀遺傳學(xué)修飾調(diào)節(jié)。因此多細(xì)胞生物體中的每種細(xì)胞類型具有獨(dú)特的表觀遺傳標(biāo)志，通常 認(rèn)為該標(biāo)志在細(xì)胞分化后或退出細(xì)胞周期后會(huì)變成“固定的”且不變的。但是，一些細(xì)胞在 正常發(fā)育或某些疾病期間，進(jìn)行主要的表觀遺傳學(xué)的“重編程”?！靶》肿诱{(diào)節(jié)劑”指的是涵蓋為小分子抑制劑或小分子活化劑的化合物。小分子調(diào) 節(jié)劑可以在一些生理環(huán)境中起小分子抑制劑的作用且在另外的生理環(huán)境中起小分子活化 劑的作用。小分子調(diào)節(jié)劑對(duì)于一個(gè)靶點(diǎn)可起小分子抑制劑的作用且對(duì)于另一個(gè)靶點(diǎn)可起小 分子活化劑的作用。同一小分子調(diào)節(jié)劑可既起小分子活化劑的作用又起小分子抑制劑的作用?！叭堋敝傅氖悄軌虬l(fā)育成完整的胚胎或完整的器官。本發(fā)明的實(shí)施方案涉及包括誘導(dǎo)促使細(xì)胞為復(fù)能或多能的至少一種基因的表達(dá) 的方法。在一些實(shí)施方案中，方法誘導(dǎo)促使細(xì)胞為復(fù)能或多能的至少一種基因的表達(dá)；且產(chǎn) 生能夠定向分化為至少一種譜系的重編程的細(xì)胞。本發(fā)明的實(shí)施方案還涉及包括下列的方法修飾染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，和重編程細(xì)胞為復(fù) 能或多能的。在又一個(gè)實(shí)施方案中，修飾染色質(zhì)結(jié)構(gòu)包括使用小分子調(diào)節(jié)劑以改變參與調(diào) 節(jié)轉(zhuǎn)錄的至少一種調(diào)節(jié)蛋白的活性。在又一個(gè)實(shí)施方案中，修飾染色質(zhì)結(jié)構(gòu)包括使用小分子抑制劑以抑制參與阻抑轉(zhuǎn) 錄的至少一種蛋白的活性。本發(fā)明的實(shí)施方案也涉及包括修飾促使細(xì)胞為復(fù)能或多能的基因的啟動(dòng)子區(qū)域 或上游DNA序列的方法。在又一個(gè)實(shí)施方案中，修飾啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)或上游DNA序列包括使 用小分子調(diào)節(jié)劑以改變參與轉(zhuǎn)錄的至少一種調(diào)節(jié)蛋白的活性、表達(dá)、或活性和表達(dá)二者。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包括使用小分子調(diào)節(jié)劑以改變參與轉(zhuǎn)錄的至少 一種調(diào)節(jié)蛋白的活性、表達(dá)、或活性和表達(dá)二者，并誘導(dǎo)促使細(xì)胞為復(fù)能或多能的至少一種 基因的表達(dá)的方法。在又一個(gè)實(shí)施方案中，方法包括抑制至少一種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的活性 并產(chǎn)生重編程的細(xì)胞。在又一個(gè)實(shí)施方案中，方法包括使用小分子抑制劑以抑制至少一種DNA甲基轉(zhuǎn)移 酶的活性，將CpG 二核苷酸中的至少一種胞嘧啶脫甲基，并誘導(dǎo)促使細(xì)胞為復(fù)能或多能的 至少一種基因的表達(dá)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，方法包括將細(xì)胞與小分子抑制劑相接觸；抑制參與阻抑轉(zhuǎn) 錄的至少一種蛋白的活性；以及誘導(dǎo)促使細(xì)胞為復(fù)能或多能的至少一種基因的表達(dá)。在又 一個(gè)實(shí)施方案中，方法還包括產(chǎn)生重編程的細(xì)胞。該重編程的細(xì)胞能夠是復(fù)能或多能的。在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于重編程細(xì)胞的方法，該方法包括將細(xì)胞暴 露于誘導(dǎo)復(fù)能基因或多能基因的表達(dá)的小分子調(diào)節(jié)劑；以及篩選細(xì)胞，其中所述細(xì)胞已經(jīng)恢復(fù)分化潛能。在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于重編程細(xì)胞的方法，該方法包括將 細(xì)胞暴露于改變至少一種調(diào)節(jié)蛋白的活性、表達(dá)、或活性和表達(dá)二者的小分子調(diào)節(jié)劑，誘導(dǎo) 復(fù)能基因或多能基因的表達(dá)，以及篩選細(xì)胞，其中所述細(xì)胞已經(jīng)恢復(fù)分化潛能。復(fù)能或多能 基因可被誘導(dǎo)以任何倍數(shù)增加表達(dá)，包括但不限于0. 25-0. 5,0. 5-1,1. 0-2. 5,2. 5_5、5_10、 10-15、15-20、20-40、40-50、50-100、100-200、200-500 和大于 500。在另一個(gè)實(shí)施方案中， 方法包括鋪板分化的細(xì)胞，將所述分化的細(xì)胞暴露于小分子調(diào)節(jié)劑，培養(yǎng)所述細(xì)胞，及鑒定 已經(jīng)被重編程的細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，改變調(diào)節(jié)蛋白的活性、表達(dá)、或表達(dá)和活性二者能夠引起 調(diào)節(jié)蛋白活性的增加，調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)的增加，調(diào)節(jié)蛋白活性的降低或調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)的降 低。調(diào)節(jié)蛋白的活性或表達(dá)能夠增加或降低任何的量，包括但不限于-5%,5% -10%, 10 % -20 %,20 % -30 %,30 % -40 %,40 % -50 %,50 % -60 %,60 % -70 %,70 % -80 %, 80 % -90 %,90 % -95 %、及 95 % -99 %,99 % -200 %,200 % -300 %,300 % -400 400% -500%和大于 500% ο在又一個(gè)實(shí)施方案中，方法還包括使用針對(duì)由復(fù)能基因或多能基因編碼的蛋白或 蛋白片段的抗體或針對(duì)復(fù)能標(biāo)記物或多能標(biāo)記物的抗體來(lái)篩選細(xì)胞。能夠使用任何類型的 抗體，包括但不限于單克隆、多克隆、抗體片段、模擬肽、活性區(qū)的抗體、及蛋白的保守區(qū)的 抗體。在又一個(gè)實(shí)施方案中，方法包括篩選細(xì)胞及擴(kuò)增或培養(yǎng)所述細(xì)胞為復(fù)能細(xì)胞培養(yǎng)物。在又一個(gè)實(shí)施方案中，方法還包括使用由復(fù)能基因或多能基因驅(qū)動(dòng)的報(bào)道分子或 復(fù)能表面標(biāo)記物或多能表面標(biāo)記物來(lái)篩選細(xì)胞。能夠使用任何類型的報(bào)道分子，包括但不 限于熒光蛋白、綠色熒光蛋白、青色熒光蛋白(CFP)、黃色熒光蛋白(YFP)、細(xì)菌螢光素酶、 水母發(fā)光蛋白、增強(qiáng)型綠色熒光蛋白、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)、dsRED、半乳糖苷酶和 堿性磷酸酶。在又一個(gè)實(shí)施方案中，方法還包括使用下列的抗性作為選擇標(biāo)記物來(lái)篩選細(xì)胞， 包括但不限于抗生素抗性、殺真菌劑抗性、嘌呤霉素抗性、潮霉素抗性、二氫葉酸還原酶抗 性、胸苷激酶抗性、新霉素抗性(neo)、G418抗性、霉酚酸抗性(gpt)、博來(lái)霉素(zeocin)抗 性蛋白和鏈霉素抗性。在又一個(gè)實(shí)施方案中，方法還包括將暴露于小分子調(diào)節(jié)劑之前存在的細(xì)胞的復(fù)能 基因或多能基因的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)與用小分子調(diào)節(jié)劑處理之后獲得的復(fù)能基因或多能基因的 染色質(zhì)結(jié)構(gòu)相比較。能夠比較染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的任何方面，包括但不限于常染色質(zhì)、異染色 質(zhì)、組蛋白乙?；?、組蛋白甲基化、組蛋白或組蛋白組分的存在和不存在、組蛋白的位置、組 蛋白的排列、及與染色質(zhì)締合的調(diào)節(jié)蛋白的存在或不存在?？杀容^基因的任何區(qū)域的染色 質(zhì)結(jié)構(gòu)，包括但不限于增強(qiáng)子元件、激活子元件、啟動(dòng)子、TATA盒、轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的上游區(qū) 域、轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的下游區(qū)域、外顯子和內(nèi)含子。小分子抑制劑或“小分子化合物”指的是在本發(fā)明的方法、組合物、和試劑盒中有 用的具有可測(cè)量的活性或抑制活性的化合物。在一些實(shí)施方案中，小分子抑制劑具有不多 于1000D的相對(duì)分子量，且在還一個(gè)方案中不多于500D。小分子抑制劑能夠是有機(jī)性質(zhì)的 或無(wú)機(jī)性質(zhì)的。除小有機(jī)化合物和小無(wú)機(jī)化合物外，預(yù)期肽、抗體、環(huán)肽和模擬肽也可用于 本公開(kāi)的方法中。小分子調(diào)節(jié)劑可以是包含在小分子文庫(kù)中的任何化合物或衍生于包含在小分子文庫(kù)中的化合物的修飾的化合物。幾種小分子文庫(kù)可從包括但不限于BIOMOL INTERNATIONAL (現(xiàn)稱Enzo Life Sciences)的商業(yè)來(lái)源供應(yīng)，并包括但不限于生物活性 脂質(zhì)文庫(kù)、內(nèi)源性大麻素文庫(kù)、脂肪酸文庫(kù)、ICCB已知的生物活性體文庫(kù)、離子通道配體文 庫(kù)、激酶抑制劑文庫(kù)、激酶/磷酸酶抑制劑文庫(kù)、神經(jīng)遞質(zhì)文庫(kù)、天然產(chǎn)物文庫(kù)、核受體文 庫(kù)、孤兒配體文庫(kù)、蛋白酶抑制劑文庫(kù)、磷酸酶抑制劑文庫(kù)、和稀有天然產(chǎn)物文庫(kù)。小分子抑制劑能夠用于抑制參與阻抑轉(zhuǎn)錄的任何蛋白，包括但不限于組蛋白脫 乙酰酶(HDAC)、甲基結(jié)合結(jié)構(gòu)域蛋白(MBD)、甲基腺苷基轉(zhuǎn)移酶(MAT)、DNA甲基轉(zhuǎn)移酶 (DNMT)、組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶和甲基循環(huán)酶。優(yōu)選地，這樣的抑制是特異性的，即，對(duì)于DNMT小分子抑制劑，DNMT抑制劑以比產(chǎn) 生另一種不相關(guān)的生物學(xué)效應(yīng)所需要的抑制劑濃度低的濃度來(lái)降低DNA甲基轉(zhuǎn)移酶甲基 化特定底物的能力或降低DNA甲基轉(zhuǎn)移酶與甲基化需要的另一種組分相互作用的能力。優(yōu) 選地，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的抑制活性需要的抑制劑的濃度比產(chǎn)生不相關(guān)的生物學(xué)效應(yīng)需要的 濃度低至少2倍、更優(yōu)選地低至少5倍、甚至更優(yōu)選地低至少10倍、且最優(yōu)選地低至少20 倍。任何數(shù)量、任何組合和任何濃度的小分子調(diào)節(jié)劑能夠用于改變參與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的一 種蛋白或多于一種蛋白的活性、表達(dá)、或活性和表達(dá)二者，包括但不限于1、2、3、4、5、6、7、 8、9、10、11-15、16-20、21-25、25-50、50-100、100-250 和多于 250 種蛋白。小分子調(diào)節(jié)劑能
夠針對(duì)一種特定的蛋白或多于一種蛋白、一類具體的蛋白或多于一類蛋白、一個(gè)具體的蛋 白家族或多于一個(gè)蛋白家族或通用轉(zhuǎn)錄組分。小分子調(diào)節(jié)劑可具有不可逆的作用機(jī)制或可逆的作用機(jī)制。小分子調(diào)節(jié)劑能具 有任何的結(jié)合親和力，包括但不限于毫摩(mM)、微摩(μΜ)、納摩(ηΜ)、皮摩(ρΜ)和分摩 (fM)。小分子調(diào)節(jié)劑能夠與蛋白的調(diào)節(jié)區(qū)或催化區(qū)結(jié)合。表I中提供了可被本發(fā)明的方法抑制的蛋白的代表性列表。表I.參與阻抑轉(zhuǎn)錄的蛋白的代表性列表
組蛋白脫乙酰 酵甲基結(jié)合 結(jié)構(gòu)域蛋 白曱基腺苷 基轉(zhuǎn)移酶DNA曱基 轉(zhuǎn)移酶組蛋白曱基 轉(zhuǎn)移酶甲基循 環(huán)酶I類(HDAC 1-3、8、11)MBDlMAT2ADNMTlEHMTlMTHFRII 類(HDAC 4-7、9、10)MBD2MATlADNMT2HDMG9ACBSIII 類(SIRTI 1-7)MBD3MAT2BDNMT3ASUV39H1IV 類(HDAC 11)MBD4DNMT3BSETDBlMeCP2DNMT3L 例如，甲基結(jié)合結(jié)構(gòu)域蛋白，例如MeCP2，與甲基化的胞嘧啶結(jié)合并募集組蛋白脫 乙酰酶，之后將組蛋白脫乙酰基，導(dǎo)致凝聚的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，而凝聚的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)抑制轉(zhuǎn)錄。 本發(fā)明的方法能夠抑制參與阻抑轉(zhuǎn)錄的蛋白并藉此誘導(dǎo)復(fù)能基因的轉(zhuǎn)錄。
因此，基于阻抑復(fù)合物的以上代表性描述，小分子抑制劑能夠用于抑制MeCP2的 活性，藉此顯著性降低HDAC募集到染色質(zhì)結(jié)構(gòu)。這能引起對(duì)于細(xì)胞為復(fù)能或多能的至關(guān) 重要的基因的上調(diào)，并因此增加體細(xì)胞中的分化能力。同樣地，小分子抑制劑能用于抑制 DNMT，這將同樣地引起促使細(xì)胞為復(fù)能或多能的基因的上調(diào)。而且，針對(duì)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的 小分子抑制劑和針對(duì)甲基結(jié)合蛋白的小分子抑制劑能同時(shí)或相繼地用于降低包含在阻抑 復(fù)合物中的至少一種蛋白的活性，這可引起復(fù)能基因的誘導(dǎo)，并因此引起細(xì)胞的重編程。以 上討論僅是說(shuō)明性的目的且不應(yīng)解釋為限制本發(fā)明的范圍。0匪1"小分子抑制劑可與包括但不限于1)匪11、0匪12、0匪134、和1)匪138、及1)匪丁31^ 的任何DNA甲基轉(zhuǎn)移酶相互作用并抑制它們。DNMTl可能是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中最豐富的DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶，并被認(rèn)為參與維持哺乳動(dòng)物中的甲基轉(zhuǎn)移酶。DNMTl主要甲基化哺乳動(dòng)物基因 組中半甲基化的CpG 二核苷酸。與體外未甲基化的底物相比，DNMTl酶對(duì)半甲基化DNA的 活性高7-20倍，然而它對(duì)從頭甲基化比其他DNMT活性還高。DNMTl酶長(zhǎng)約1620個(gè)氨基酸。 前1100個(gè)氨基酸構(gòu)成DNMTl酶的調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域，且剩余的殘基構(gòu)成催化結(jié)構(gòu)域。調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域 和催化結(jié)構(gòu)域由谷氨酸-賴氨酸重復(fù)單位連接。DNMTl的催化功能需要這二個(gè)結(jié)構(gòu)域。DNMT2具有與原核細(xì)胞和真核細(xì)胞二者的5_甲基胞嘧啶甲基轉(zhuǎn)移酶強(qiáng)的序列相 似性。DNMT2也已顯示將天冬氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)RNA中的第38位點(diǎn)甲基化。DNMT3是能夠以相同的速度將半甲基化的CpG 二核苷酸和未甲基化的CpG 二核苷 酸甲基化的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶家族。DNMT3酶的結(jié)構(gòu)類似于DNMTl，具有與催化結(jié)構(gòu)域相連的 調(diào)節(jié)區(qū)。DNMT3A和DNFHB負(fù)責(zé)在發(fā)育期間建立DNA的甲基化模式。DNMT3A蛋白和DNFHB 蛋白在胚胎形成的不同階段表達(dá)。DNFHB表現(xiàn)為在諸如內(nèi)層細(xì)胞群、外胚層細(xì)胞和胚胎外 胚層細(xì)胞等多能胚胎細(xì)胞中表達(dá)，而DNMT3A表現(xiàn)為在胚胎10. 5天(E10. 5)之后同時(shí)普遍 地表達(dá)。DNMT3L含有DNA甲基轉(zhuǎn)移酶基序并參與建立母體的基因組印跡。DNMT3L也被認(rèn) 為在轉(zhuǎn)錄阻抑中發(fā)揮作用。在本發(fā)明的方法、組合物和試劑盒中使用的DNMT小分子抑制劑可與DNMT1、 DNMT2、DNMT3A、DNMT3B或DNMT3L相互作用。DNMT抑制劑可與DNMT的一種類型、DNMT的 所有類型、或DNMT的多個(gè)類型相互作用，包括但不限于包括DNMT1和DNMT2 ；DNMTl和 DNMT3A ；DNMTl 禾口 DNMT3B ；DNMTl 禾口 DNMT3L ；DNMT2 禾口 DNMT3A ；DNMT2 禾口 DNMT3B ；DNMT2 和 DNMT3L ；DWT3A 禾口 DNMT3B ；DWT3A 禾口 DNMT3L ；DWT3B 禾口 DNMT3L ；DNMTU DNMT2、DNMT3A ； D匪Tl、D匪T2 和 DNMT3B ；D匪Tl、D匪T2 和 DNMT3L ；DWT2、D匪T3A 和 DNMT3B ；DNMT2、DNMT3A 和 DNMT3L ；DNMT2.DNMT3B 和 DNMT3L 以及 DWT1、DWT2、DWT3A 和 DNFHB。本發(fā)明的 DWT 抑制劑也可與不落在已知類型之一的DNMT或是仍未歸類的DNMT相互作用。在另一個(gè)實(shí)施方案中，DNMT抑制劑可通過(guò)與DNMT的調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域或催化結(jié)構(gòu)域相 結(jié)合而發(fā)揮作用。在另一個(gè)實(shí)施方案中，DNMT抑制劑可是核苷類似物(摻入DNA或RNA中) 或非核苷類似物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，DNMT抑制劑可以是DNMT(包括但不限于DNMTl、 DNMT2、DNMT3A、DNMT;3B或DNMT3L)的反義寡核苷酸。在又一個(gè)實(shí)施方案中，DNMT抑制劑也 可通過(guò)阻斷蛋白與蛋白的相互作用而發(fā)揮作用。在另一個(gè)實(shí)施方案中，為抑制Dnmt的活性和胞嘧啶的甲基化，細(xì)胞可在下列培養(yǎng) 基中生長(zhǎng)
(a)用 Dnmtl、Dnmt2、Dnmt3a 禾口 / 或 3b siRNA (Dharmacon, Inc.)處理的培養(yǎng)基；(b)用RG108(分析系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室，路易斯安那州獸醫(yī)學(xué)校)處理的培養(yǎng)基；(c)用 5-AzadCyd(Sigma)處理的培養(yǎng)基。表II提供能夠抑制DNMT的小分子抑制劑的代表性列表。在本發(fā)明的方法、組合 物和試劑盒中使用的DNMT抑制劑包括本文提及的DNMT抑制劑的衍生物和類似物。表II.作為DNMT抑制劑的核苷類似物和非核苷類似物的代表性實(shí)例
權(quán)利要求
1.一種用于重編程細(xì)胞的方法，所述方法包括將細(xì)胞暴露于誘導(dǎo)復(fù)能基因表達(dá)的小 分子調(diào)節(jié)劑；并且篩選細(xì)胞，其中所述細(xì)胞已經(jīng)恢復(fù)分化潛能。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中篩選所述細(xì)胞包括將所述細(xì)胞暴露于所述小分子 調(diào)節(jié)劑之前和之后的表型相比較，并鑒定具有與恢復(fù)的分化潛能一致的表型的細(xì)胞。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，所述方法還包括將所述篩選的細(xì)胞擴(kuò)增為細(xì)胞群。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述小分子調(diào)節(jié)劑選自由以下組成的組組蛋白脫 乙酰酶抑制劑、甲基結(jié)合結(jié)構(gòu)域蛋白抑制劑、甲基腺苷基轉(zhuǎn)移酶抑制劑、DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑 制劑、組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑、賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑、組蛋白脫甲基酶抑制劑和甲基 循環(huán)酶抑制劑。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其中所述小分子調(diào)節(jié)劑是DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑是RG108。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中篩選所述細(xì)胞包括使用針對(duì)由復(fù)能基因表達(dá)的蛋 白的抗體或使用針對(duì)復(fù)能標(biāo)記物的抗體來(lái)分離細(xì)胞。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其中篩選所述細(xì)胞包括使用由復(fù)能基因驅(qū)動(dòng)的報(bào)道分 子或?qū)x擇標(biāo)記物的抗性來(lái)分離細(xì)胞。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述復(fù)能基因選自由0ct-4、SoX-2和Nanog組成的組。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，所述方法還包括將所述細(xì)胞暴露于所述小分子調(diào)節(jié)劑 之前復(fù)能基因的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)與暴露于所述小分子調(diào)節(jié)劑之后獲得的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)相比較。
11.一種用于重編程細(xì)胞的方法，所述方法包括將具有第一轉(zhuǎn)錄模式的細(xì)胞暴露于 小分子調(diào)節(jié)劑，其中所述調(diào)節(jié)劑誘導(dǎo)復(fù)能基因的表達(dá)；將所述細(xì)胞的所述第一轉(zhuǎn)錄模式與 暴露于所述調(diào)節(jié)劑之后獲得的轉(zhuǎn)錄模式相比較；并且篩選細(xì)胞，其中所述細(xì)胞已經(jīng)恢復(fù)分 化潛能。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中暴露于所述調(diào)節(jié)劑之后的所述轉(zhuǎn)錄模式至少50% 類似于胚胎干細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄模式。
13.如權(quán)利要求11所述的方法，其中比較所述轉(zhuǎn)錄模式之前，將所述細(xì)胞暴露于所述 小分子調(diào)節(jié)劑之前和之后的表型相比較。
14.如權(quán)利要求11所述的方法，所述方法還包括將所述篩選的細(xì)胞擴(kuò)增為細(xì)胞群。
15.如權(quán)利要求11所述的方法，其中篩選所述細(xì)胞包括使用針對(duì)由復(fù)能基因表達(dá)的 蛋白的抗體或使用針對(duì)復(fù)能標(biāo)記物的抗體來(lái)分離細(xì)胞。
16.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述復(fù)能基因選自由0ct-4、SOX-2和Nanog組成 的組。
17.一種富集的重編程的細(xì)胞群，所述重編程的細(xì)胞群根據(jù)包括以下步驟的方法產(chǎn)生 將細(xì)胞暴露于誘導(dǎo)復(fù)能基因表達(dá)的小分子調(diào)節(jié)劑；并且篩選細(xì)胞，其中所述細(xì)胞已經(jīng)恢復(fù) 分化潛能；并培養(yǎng)所述篩選的細(xì)胞至產(chǎn)生細(xì)胞群。
18.如權(quán)利要求17所述的富集的重編程的細(xì)胞群，其中所述重編程的細(xì)胞表達(dá)選自由 以下組成的組的細(xì)胞表面標(biāo)記物SSEA3、SSEA4、Tra-1-60和Tra_l_81。
19.如權(quán)利要求17所述的富集的重編程的細(xì)胞群，其中所述復(fù)能基因選自由0ct-4、 Sox-2和Nanog組成的組。
20.如權(quán)利要求17所述的富集的重編程的細(xì)胞群，其中所述重編程的細(xì)胞占所述群的 至少60%。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于重編程細(xì)胞的方法、組合物和試劑盒。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包括誘導(dǎo)促使細(xì)胞為復(fù)能或多能的至少一種基因的表達(dá)的方法。在又一個(gè)實(shí)施方案中，方法包括將細(xì)胞暴露于誘導(dǎo)促使細(xì)胞為復(fù)能或多能的至少一種基因的表達(dá)的小分子調(diào)節(jié)劑。在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及能夠具有ES樣細(xì)胞的特征，能夠再分化或轉(zhuǎn)分化為各種分化的細(xì)胞類型的重編程的細(xì)胞以及富集的重編程的細(xì)胞群。
文檔編號(hào)C12N15/113GK102083968SQ200980121405
公開(kāi)日2011年6月1日 申請(qǐng)日期2009年4月7日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月7日
發(fā)明者K·J·埃勒特森, 瑞秋·A·帕沃爾 申請(qǐng)人:紐珀滕索有限公司