專利名稱：轉基因糖用甜菜植物的制作方法
轉基因糖用甜菜植物一般而言，本發明涉及植物分子生物學、植物轉化、和植物育種領域。更具體而言， 本發明涉及具有延遲抽苔的表型的轉基因糖用甜菜植物。本發明進一步涉及多核苷酸標志 物，其在糖用甜菜基因組內與抽苔基因或B基因緊密連鎖或駐留(residing)于抽苔基因或 B基因內，而且可以用于區分一年生與二年生基因型或展現出二年生基因型的糖用甜菜植 株的植物分組內的不同單元型(haplotypes)。栽培的糖用甜菜(Beta vulgaris ssp. vulgaris L.)是一種二年生植物，其在第 一年形成貯藏根和蓮座葉。在一段時間的低溫后開始枝條延長(抽苔)和花形成。比較而 言，一年生甜菜(B. vulgaris ssp. maritime)屬的許多野生甜菜顯示一年生生長習性，這是 由于B基因座處存在抽苔基因B，其位于染色體II的中央區。抽苔基因(B基因)負責決定 糖用甜菜中的一年生習性。認為甜菜物種中的一年生是單基因的且顯性的性狀。與攜帶b 等位基因的二年生植物相反，攜帶顯性B等位基因的植物能夠以不依賴于春化的方式自幼 年期轉變成生殖期，所述二年生植物強制性需要春化進行抽苔，隨后發生開花。基因座B的 顯性等位基因在野生甜菜中是豐富的，而且在長日照下引起抽苔，無需對于攜帶隱性等位 基因的二年生栽培種而言通常至關重要的冷(低溫，cold)要求(Abe等，1997)。抽苔(莖延長)(stem elongation)是營養性向生殖性生長轉換中明顯可見的第 “步 。傳統上，二年生栽培的糖用甜菜在春季種植并在秋季收獲。然而，預期通過在秋季 播種并在冬季里栽培來延長生長期本質上提高產率，而且會容許延長糖用甜菜加工活動， 解決糖工業的一項需求。然而，在中部歐洲在冬季里栽培目前的糖用甜菜(即作為冬季作 物)目前是不可能，這是因為春化(通過暴露于冬季期間的寒冷溫度誘導的)會導致抽苔 和產率損失。如此，高度想要開發非抽苔冬季甜菜，其中修飾春化響應以賦予冷誘導后對抽 苔的抗性或抽苔的顯著延遲。由于B基因在糖用甜菜的春化響應中發揮關鍵作用，它代表 用于通過調控春化響應來工程化改造抽苔抗性的有希望的候選。此外，在栽培的糖用甜菜中，抽苔是不想要的現象，因為它導致產率顯著降低而 且引起收獲和提取糖期間的問題。糖用甜菜的商業性種子生產常常在生長有一年生雜生 (weed)甜菜的地區進行，它們能在種子生產中引起花粉污染，導致商業性種子中有一年生 植物。這是客戶不能接受的。為了鑒定一年生植物的污染，在收獲種子后立即在沒有野生 型一年生甜菜生長的地區種植各批次的商業性種子。不對植物春化，而且通過抽苔者的存 在來鑒定污染。非常希望用基于標志物的篩選測定法來替代此測試，因為能更早地得到結 果，這會導致種子加工中成本節約。基于標志物的方法還能有利地用于糖用甜菜育種，例如用于加快育種過程， 或用于引入來自野生海甜菜的新變異。由于B等位基因的不完全滲透(incomplete penetration)及其環境依賴性，還需要緊密連鎖的分子標志物來篩選它在育種系中的存 在。對于所有這些情況，重要的是要有與B基因緊密連鎖的能夠精確鑒定一年生植物或二 年生植物的標志物。出于上述原因，需要轉基因手段來調控糖用甜菜的春化響應，而且還需要標志物輔助手段來在種子生產中和糖用甜菜育種中區分B基因的一年生和二年生等位基因。本發明現在提供了解決上述需要的此類轉基因手段以及標志物輔助手段。發明概述本發明涉及核酸序列，其與如下的核酸序列具有至少70%的序列同一性，所述核 酸序列選自如SEQ ID NO :1、4、5、6、7、8、9、10、53或討之任一項中所列的核酸序列的組， 涉及核酸序列，其包含如下核酸序列的至少15個連續核苷酸，所述核酸序列選自如SEQ ID NO :1、4、5、6、7、8、9、10、53或討之任一項中所列的核酸序列的組，涉及所述核酸序列；涉及 所述一個(to said one)，或者涉及核酸序列，其在嚴格條件下與如下的核酸序列雜交，所 述核酸序列選自如SEQ ID NO :1、4、5、6、7、8、9、10、53或討之任一項中所列的核酸序列的 組。在一個優選的實施方案中，上文所描述的本發明的核酸序列是分離的核酸。關于 同源性，本發明應當同樣地涵蓋所有個別數值(它們落入以至少70%開始的范圍中，如上 文所提及的，即 71%,72%,73%,74%,75%,. · · ,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%, 87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%)。優選地，本發 明的核酸序列的長度包含選自下組的核酸序列的至少15、20、25、30、35、40、45、或至少50 個連續的核苷酸如SEQ ID NO :1、4、5、6、7、8、9、10、53、或討之任一項中所列的核酸序列。 要理解的是，術語“至少χ個核苷酸”涵蓋具有以χ開始的任何數值及以上的核酸分子。例 如，術語“至少15個核苷酸”意圖涵蓋具有15、16、17、18、19、20、和更多個核苷酸的核酸分 子。在一個進一步優選的實施方案中，上文所描述的本發明的核酸序列在嚴格條件下，更優 選地在高度嚴格條件下與選自下組的核酸序列雜交如SEQ ID N0:l、4、5、6、7、8、9、10、53、 或M之任一項中所列的核酸序列。在此方面的一個別的實施方案中，核酸分子包含選自下組的核苷酸序列及其互補 物SEQ ID而1、4、5、6、7、8、9、10、53、或討。在另一個優選的實施方案中，上文所描述的 本發明的核酸序列包含如SEQ ID NO :8中所描述的核酸序列，其中所述序列包含一處或多 處核酸替代、缺失、或添加，如表7-1和表7-2中所顯示的，其中表7-1和表7-2中顯示的多 態性分別代表SEQID NO 8中所描述的序列的18種一年生和2種二年生等位基因。表7_1 和表7-2也顯示為
圖10和圖11。依照另一方面，本發明進一步提供了由上文所描述的本發明的核酸序列編碼的多 肽。在一個優選的實施方案中，上文所描述的本發明的多肽具有選自下組的氨基酸序列如 SEQ ID NO 11或12中所描述的氨基酸序列。本發明進一步涉及B基因特別地BvPRR7基因在用于生成顯現出非抽苔表型的植 物的轉基因方法中的用途。具體地，本發明涉及包含表達盒的嵌合構建體，所述表達盒包含 在調節元件控制下，優選地在植物中有功能的調節元件控制下的如上文所描述的本發明的 核酸序列。在本發明的一個實施方案中，如上文所描述的嵌合構建體可以進一步含有選擇標 志基因，其容許在選擇方法(selection procedure)中區分經轉化的和未轉化的植物材料。在一個實施方案中，本發明的嵌合構建體包含負選擇標志，特別地編碼對植物毒 性化合物諸如抗生素或除草劑的抗性的選擇標志。在另一個實施方案中，本發明的嵌合構 建體包含正向選擇標志，特別地編碼給經轉化的植物提供超過非轉化植物的選擇優勢，特別地營養優勢的酶的選擇標志諸如例如磷酸甘露糖異構酶基因或木糖異構酶基因。在一個優選的實施方案中，提供了本發明的嵌合構建體以轉基因下調BvPRR7基 因表達，特別地經由反義或RNAi辦法來進行。在此上下文中，術語“下調”或“抑制”想要指 與相同條件下非轉化的植物中的基因表達相比BvPPR7基因的表達水平的任何降低。這包 括基因“沉默”，使得可以檢測不到基因表達。在另一個優選的實施方案中，用于轉基因下調 BvPRR7基因表達的本發明的嵌合構建體包含編碼dsRNA的核酸分子，所述dsRNA能夠靶向 通過轉錄編碼B基因蛋白，優選地BvPRR7蛋白的DNA序列生成的mRNA以進行降解。在另 一個優選的實施方案中，上文所描述的本發明的嵌合構建體包含編碼所述dsRNA的核酸分 子，其中所述核酸分子具有至少21個核苷酸的長度，而且與所述BvPRR7基因的編碼序列的 至少一部分基本上相同。BvPRR7基因的所述編碼序列優選是上文所描述的本發明的核酸序 列。更優選地，BvPRR7基因的所述編碼序列是具有本發明中如列為SEQ ID NO :1、4、5、6、9、 10、53、或M的序列的核酸分子。“基本上相同的”指能夠在嚴格條件下彼此雜交的兩種核 酸分子。一般地，在dsRNA的整個長度里不要求dsRNA與BvPRR7基因的編碼序列或其部分 之間的同一性或同源性。足夠的是如果至少21個核苷酸的區段具有同一性，但是優選地， 選擇編碼在超過21個核苷酸的區段里與靶RNA分子具有同源性的dsRNA的核酸序列。優 選地，上文所描述的本發明的嵌合構建體包含編碼dsRNA且具有超過21個核苷酸，更優選 超過50、100、250、500、600、750、1000或更多個核苷酸的長度的核酸分子。在一個優選的實施方案中，編碼本發明嵌合構建體中包含的dsRNA的核酸分子具 有在組成型啟動子，優選地來自擬南芥的啟動子的控制下的如SEQ ID NO :1中所描述 的核苷酸序列。在另一個實施方案中，本發明的嵌合構建體進一步包含來自馬鈴薯^LSl 基因的第二內含子的序列(Eckes等，1986 ；Vancanneyt等，1990)。在一個優選的實施方案 中，本發明的嵌合構建體包含靶向BvPRR7的反向重復，其由如SEQ ID NO :1中所描述的核 苷酸序列組成，以由來自馬鈴薯的StLSl基因第二內含子分開的反義和有義兩種取向克隆 在Ubi3啟動子(Norris等，1993)與Nos終止子之間。在本發明的一個實施方案中，提供了轉化載體和/或表達載體，特別地植物轉化 載體和/或表達載體，其包含如上文所描述的本發明的嵌合構建體。在一個別的實施方案 中，植物表達載體是RNAi表達載體，其包含上文所描述的本發明的嵌合構建體。在一個更 優選的實施方案中，RNAi表達載體包含圖11中所顯示的本發明的嵌合構建體。在本發明的一個別的方面，提供了一種植物細胞，其包含依照本發明的和如上文 所描述的嵌合構建體或載體分子(例如轉化載體或表達載體)。在一個優選的實施方案中， 所述包含本發明的嵌合構建體或載體分子的植物細胞是糖用甜菜植物的植物細胞。進一步提供了具有延遲抽苔的表型的轉基因植物特別地糖用甜菜植物或其細胞、 組織或種子，各包含本發明的植物細胞和/或依照本發明的嵌合構建體和/或如上文所描 述的本發明的的核酸序列，其中所述轉基因植物表達所述dsRNA，從而延遲特別地抑制抽 苔，并且所述植物展現出延遲抽苔的表型優選地非抽苔表型。“抽苔的延遲”應當理解為調 控糖用甜菜植物的天然抽苔反應。在抽苔期間，植物春化(即暴露于冷溫度)后作為第一步 并且在從營養性轉變成生殖性生長過程中莖伸長，最終導致花形成。抽苔反應的延遲想要 指與正常的植物相比較晚開始的莖伸長；那些植物展現出延遲抽苔的表型。抽苔反應可以 延遲幾天(即5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天)和多至數周(即2、3、4周)或數月(即1、2、3、5、或6個月)。在一個優選的實施方案中，完全抑制抽苔響應；此類植物在春化后未 開始抽苔，而且展現出非抽苔表型。在一個進一步優選的實施方案中，本發明提供了轉基因 植物特別地糖用甜菜植物，其是自本發明的和上文所描述的細胞、組織或種子生成的。在另一方面，本發明提供了一種用于生成雜種種子的方法，可以自所述雜種種子 種植具有受調控的抽苔的表型的植物特別地糖用甜菜植物。優選地，所述方法(a)提供具 有受調控的抽苔的表型的植物系特別地糖用甜菜系特別地本發明的和如上文所描述的轉 基因糖用甜菜植物作為第一親本系，(b)提供具有不同基因型的第二植物系，特別是糖用甜 菜系作為第二親本系；其中步驟a)或步驟b)的所述親本系之一是雄性不育CMS系，且其中 另一親本系是雄性能育，并(c)容許所述雄性能育親本系的植物傳粉給第二雄性不育親本 系的花，讓所述種子形成，并收獲所述雜種種子；其中收獲的雜種種子是具有延遲抽苔的表 型的雜種植物特別地糖用甜菜雜種植物的種子。在一個優選的實施方案中，兩種親本系都 是糖用甜菜植物系，其中至少一種糖用甜菜親本系是本發明的轉基因糖用甜菜系。至少一 種具有受調控的抽苔的表型的糖用甜菜親本系也可以優選是沒有任何轉基因的植物，然后 其通過遺傳操作的其它方法獲得，如下文所描述的。在此方面的一個實施方案中，步驟(a) 中提供的糖用甜菜親本系是雄性不育CMS近交糖用甜菜系，其包含一種或多種本發明的核 酸序列或其片段，而步驟(b)中提供的第二糖親本系是雄性能育近交糖用甜菜系。在另一 個優選的實施方案中，步驟(a)中提供的糖用甜菜親本系是雄性能育糖用甜菜植物，其包 含一種或多種本發明的核酸序列或其片段，而步驟(b)中提供的第二糖親本系是雄性不育 CMS近交糖用甜菜系。本發明的別的方面涉及展現出延遲抽苔的表型的植物特別地糖用甜菜植物的雜 種種子。在本發明的又一方面，所述雜種種子是通過本發明的和如上文所描述的方法生成 的。在一個進一步優選的實施方案中，具有延遲抽苔的表型的雜種植物特別地雜種糖用甜 菜植物是通過種植上文所描述的本發明的雜種種子生成的。本發明的進一步優選的實施方 案涉及選自下組的植物部分種子、胚、小孢子、合子、原生質體、細胞、胚珠、花粉、直根、子 葉、提取物或生物學樣品，它們衍生自本發明的轉基因糖用甜菜植物(taproots)或其種子 或者衍生自本發明的雜種植物或其種子，如上文所描述的。本發明的另一方面涉及本發明的核酸序列或其片段用于轉化植物細胞特別地糖 用甜菜植物細胞的用途。用本發明的核酸序列或其片段轉化植物細胞特別地糖用甜菜植物 細胞的目的是調控植物的抽苔習性，如上文所描述的。此方面的另一個實施方案涉及轉化 植物細胞特別地糖用甜菜植物細胞的方法，其中該方法包括使用本發明的核酸序列或本發 明的嵌合構建體或本發明的和如上文所描述的載體。在另一方面，本發明提供了本發明的轉基因植物、本發明的雜種植物、或本發明的 和如上文所描述的植物部分在選自下組的方法中的用途糖生產的方法、需氧發酵的方法 和厭氧發酵的方法。優選地，在生產糖的方法中使用本發明的轉基因植物、本發明的雜種植 物、或本發明的和如上文所描述的植物部分。另一方面涉及一種用于生產糖的方法，其中加 工本發明的和如上文所描述的糖用甜菜植物、或其細胞或組織以生產糖。本發明進一步提 供了自本發明的和如上文所描述的糖用甜菜植物、或其細胞或組織生產的糖。在別的方面，本發明涉及基于核酸序列開發的多核苷酸標志物，所述核酸序列可 獲自糖用甜菜中顯示與抽苔基因(B基因)相關表型完美共分離的基因組DNA區，且其中所述標志物容許區分一年生與二年生基因型或展現出二年生或一年生表型的糖用甜菜植物 的植物分組內的不同單元型。在一個優選的實施方案中，本發明的多核苷酸標志物具有可 獲自本發明的和如上文所描述的一種或多種核酸序列的核酸序列。在一個實施方案中，本 發明的多核苷酸標志物進一步包含一個或多個多態性，特別是基于SNP、SSR、或至少一個核 苷酸的缺失或插入的多態性，但是特別是基于SNP的多態性，該多態性診斷B基因座處的B 等位基因。優選地，所述多核苷酸標志物能夠檢測本文中列為SEQ ID NO :8的所述基因組 序列的不同等位基因中存在的和表7-1 (圖10中進一步描繪的)和表7-2 (圖10中進一步 描繪的)中所顯示的多種SNP的至少一種，其中所述多核苷酸標志物能夠區分不同等位基 因，特別地區分一年生和二年生糖用甜菜系。在一個優選的實施方案中，本發明的多核苷酸 標志物能夠檢測至少一種選自下組的SNP，該組包括列為SEQ ID NO :8的序列的位置#2對、 #351、#615、#897、#1082、#1841、#1915、#2334、#11592、#12316、#12490、或 #12544 處的和 如表7-1(圖10中進一步描繪的)和表7-2(圖11中進一步描繪的)中所顯示的SNP。本 發明的別的方面涉及一組多核苷酸標志物，其包含本發明的和上文所描述的眾多多核苷酸 標志物。在此上下文中，術語“眾多”指一組超過一個的多核苷酸標志物，其優選地由兩種、 三種或更多種標志物組成。本發明的另一方面涉及引物對，其由正向引物和反向引物組成，所述引物能夠與 糖用甜菜基因組DNA中顯示與抽苔基因(B基因)完美共分離的基因組區域內的核苷酸序 列退火。在一個優選的實施方案中，本發明的引物對與本發明的和如上文所描述的核酸序 列退火，并擴增本發明的多核苷酸，優選多核苷酸標志物，或其信息部分，其中所述多核苷 酸包含一個或多個多態性，特別地一處或多處診斷B基因座處的B等位基因且容許區分一 年生和二年生基因型的多態性。在一個優選的實施方案中，本發明的引物對選自下組(a) 與BvPPR7的第三內含子內如SEQ ID NO :6中所描述的核苷酸序列退火的引物對，其自包含 多態性特別地包含位置#87處的C/T SNP和/或位置#160處的C/T SNP和/或位置#406 處的A/G SNP的多態性的所述區域擴增信息片段；或(b)弓丨物對，其與列為SEQ ID NO 8 的核酸序列退火，并自包含多態性的所述序列擴增信息片段，所述多態性選自基于所述序 列的不同等位基因中存在的SNP的多態性，如表7-1 (圖10中進一步描繪的)和表7-2 (圖 11中進一步描繪的)中所顯示的。在一個進一步優選的實施方案中，本發明的引物對包含 (a)如SEQ ID NO 49中所描述的正向引物PRR7(T6)_F和如SEQ ID NO 50中所描述的反 向引物PRR7(T6)-R，用于擴增包含SNP#2334的片段；或(b)如SEQID NO 13中所描述的 正向引物PRR7 (T1) -F和如SEQ ID NO 14中所描述的反向引物PRR7 (T1) -R，用于擴增包含 SNP#160的片段；或(c)用于擴增片段的如SEQ ID NO :55中所描述的正向引物lr22 (Tl)-F 和如SEQ ID NO :56中所描述的反向引物lr22(Tl)-R和如SEQ ID NO :57中所描述的探針分 子lr22 (Tl) -VIC,作為用作為第一熒光染料的VIC標記的第一探針分子，和如SEQ ID NO 58中所描述的探針分子lr22 (Tl)-FAM，作為用作為第二熒光染料的FAM標記的第二探針分 子。在一個實施方案中，本發明涉及一種或多種探針分子和/或涉及一種或多種引 物，特別地一種或多種引物對，但是特別地一種或多種由正向引物和反向引物組成的引物 對，所述引物能夠與可獲自糖用甜菜中顯示與抽苔基因(B基因)有關的表型完美共分離的 基因組DNA區域的核酸序列退火，且其中所述標志物容許區分一年生與二年生基因型或展現出二年生或一年生基因型的糖用甜菜植物的植物分組內的不同單元型。在一個實施方案中，本發明涉及一組探針多核苷酸，其包含與包含多態性位點的 依照本發明的和如上文中所描述的信息多核苷酸片段內的亞區互補的至少兩種不同探針 分子，并擴增在交疊的區域中僅相差一個或兩個堿基錯配的部分交疊片段，其中第一探針， 特別地用第一熒光染料，更特別用第一熒光染料和猝滅劑標記的探針代表一種等位基因， 而第二探針，特別地用第二熒光染料(其與第一染料不相同)，更特別地用第二熒光染料和 猝滅劑標記的探針代表另一等位基因。可以在用于鑒定糖用甜菜植物中與一年生(armuality)有關的等位基因的缺失 或存在的等位區分測定法中使用本發明的上述多核苷酸標志物、本發明的一組多核苷酸標 志物或本發明的引物對。在本發明的另一方面，提供了用于鑒定糖用甜菜植物中與一年生有關的等位基因 的缺失或存在的等位區分測定法，其容許區分一年生和二年生植物。在一個優選的實施方 案中，在此測定法中使用本發明的多核苷酸標志物、本發明的一組多核苷酸標志物、或本發 明的引物對。在一個進一步優選的實施方案中，本發明的等位區分測定法包括下列步驟(a) 自要分析的糖用甜菜植物獲得基因組DNA的樣品，(b)使用本發明的引物對自所述樣品或 基因組DNA擴增片段，并(c)比較所擴增的片段與已知與二年生表型有關但與一年生表型 無關的等位序列。在此測定法中，比較步驟(c)的擴增片段的序列與已知與二年生表型有 關的等位基因的序列。若序列與二年生等位基因的序列不同，則這指明一年生等位基因 (即一年生植物)的存在。在另一個優選的實施方案中，用包含對一年生等位基因特異性的 序列的經第一熒光標記的探針分子探查本發明等位區分測定法的步驟c)中獲得的擴增片 段。若第一探針的染料熒光在反應過程中升高，則這指明一年生等位基因的存在。在一個優選的實施方案中，本發明的測定法采用(a)用于擴增包含SNP#2334的片 段的如SEQ ID NO :49中所描述的正向引物raR7(T6)-F和如SEQID NO :50中所描述的反向 引物PRR7(T6)-R和如SEQ ID NO :51中所描述的探針分子PRR7 (T6)-VIC作為用作為第一熒 光染料的VIC標記的第一探針分子和如SEQ ID NO 52中所描述的探針分子PRR7 (T6) -FAM 作為用作為第二熒光染料的FAM標記的第二探針分子；或(b)用于擴增包含SNP#160的 片段的如SEQ ID NO 13中所描述的正向引物PRR7 (Tl)-F和如SEQ ID NO :14中所描述 的反向引物PRR7 (Tl)-R和如SEQ ID NO :15中所描述的探針分子PRR7 (Tl)-VIC作為用 作為第一熒光染料的VIC標記的第一探針分子和如SEQ ID NO :16中所描述的探針分子 PRR7 (Tl)-FAM作為用作為第二熒光染料的FAM標記的第二探針分子；或(c)用于擴增片段 的如SEQ ID NO 55中所描述的正向引物lr22(Tl)_F和如SEQ ID NO 56中所描述的反向 引物lr22(Tl)-R和如SEQ ID NO :57中所描述的探針分子lr22 (Tl)-VIC作為用作為第一熒 光染料的VIC標記的第一探針分子和如SEQ ID N0:58中所描述的探針分子lr22(Tl)-FAM 作為用作為第二熒光染料的FAM標記的第二探針分子。在一個實施方案中，本發明涉及一種在商業種子中鑒定一年生污染物的方法，其 使用依照本發明的和如上文所描述的基于標志物的等位區分測定法來進行。附圖簡述MM
圖1 不同物種間的REC域和糖用甜菜EST CV301305的推定REC域的氨基酸 序列比較。相同的氨基酸以黑色標示；保守的氨基酸以灰色標示；弱相似的氨基酸以 淺灰色標示；而不相似的氨基酸以白色標示。Bb，支氣管炎博德特氏菌(Bordetella bronchiseptica) ；Bs，才古草芽子包桿菌(Bacillus subtilis) ；Bv，舌甘菜(Beta vulgaris)； Ec，大腸埃希氏菌/大腸桿菌(Escherichia coli) ；Kp，肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae) ；Pa，銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa) ；Re，莢膜紅細菌(Rhodobacter capsulatus) ；Sc,天藍色鏈霉菌(Streptomyces coelicolor) ；Sf,弗氏志賀氏菌 (Shigella flexneri) ；St,鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)。圖2 擬南芥PRR7蛋白質與來自糖用甜菜EST CV301305的預測部分蛋白質的氨 基酸序列比較。相同的氨基酸以黑色標示；相似的氨基酸以灰色標示；而不相似的氨基酸 以白色標示。圖3 擬南芥PRR7基因與糖用甜菜EST CV301305之間的基因組和mRNA序列的序 列比對。擬南芥與甜菜之間保守的核苷酸以灰色標示。內含子以長劃串代表。圖4 糖用甜菜染色體II的遺傳學圖。染色體右邊給出了標志物名稱，左邊標示 了累積遺傳距離。圖5 :BvPRR7基因的基因結構的示意圖，顯示了推定的外顯子和內含子。由EST CV301305覆蓋的區域以黑色箭頭顯示了。圖6 擬南芥PRR基因家族成員和BvPRR7蛋白質的氨基酸序列比較。相同的氨基 酸以黑色標示；保守的氨基酸以灰色標示；弱相似的氨基酸以淺灰色標示；而不相似的氨 基酸以白色標示。圖7 :BvPRR7與來自其它開花植物的相關蛋白質之間的系統發生關系，其通過使 用Neighbor-Joining方法(&iitou和Nei，1987)基于對來自數種植物物種的PRR基因家 族中的多種成員(包括來自糖用甜菜、擬南芥(Arabidopsisthaliana) (T0C1, NP_200946 ； PRR3, NP_568919 ；PRR5, NP_568446 ；PRR7, NP_568107 ；和 PRR9，NP_566085)、稻(Oryza sativa)(PRR37, Q0D3B6),大麥(Hordeum vulgare)(PPD-H1， AAY17586)和普通小麥 (Triticum aestivum) (PPD-D1，ABL09477)的PRR7同系物)的系統發生分析得到。采用 自1000個復制品推導出的自展共有樹來代表所分析的分類單位的進化史O^elsenstein， 1985)。折疊與在少于50%的自展復制品中再現的分區對應的分支。在分支的后面顯示了 復制樹(replicate tree)的百分比，其中相關的分類單位在自展(bootstrap)測試(1000 個復制品)中簇集到一起。該樹是按比例繪制的，分支長度的單位與用于推導系統發生樹 的進化距離的相同。進化距離是使用Poisson矯正法(Zuckerkandl和Pauling，1965)計 算的，單位為每個位點的氨基酸替代數目。自數據集消除所有含有缺口和缺失數據的位置 (完全缺失選項)。最終的數據集中有總共352個位置。圖8:—年生和二年生糖用甜菜植物中BvPRR7的晝夜表達樣式。貫穿M小時的 期間每2小時收獲葉組織。白色和深灰色背景分別表示光照期和黑暗期。所顯示的數據 是來自三份獨立生物學樣品的均值數值。數值表示為通過幾何學平均分析(Vandesompele 等，200 相對于BvI⑶H參照基因標準化的相對表達水平。誤差棒士SD。ZT，授時因子 (zeitgeber)時間。圖9 一組一年生和二年生植物個體之間的等位區分分析的端點讀取。Y和X軸上的數值分別表示FAM染料和VIC染料的熒光水平。VIC染料熒光(X軸)的本質升高僅指明二 年生等位基因(在此圖中稱為等位基因X)的純合性。FAM染料熒光的本質(substantial) 升高僅指明一年生等位基因((在此圖中稱為等位基因Y)的純合性。兩種熒光信號的本質 升高指明雜合性，即具有B基因座雜合性的一年生植物。圖10 用于借助RNAi來轉基因抑制BvPRR7的二元載體的質粒圖。BvPRR7的反向 重復由0.61Λ cDNA片段組成，以由來自馬鈴薯WMLSl基因第二內含子(Eckes等，1986 ； Vancarmeyt等，1990)分開的反義和有義兩種取向克隆在啟動子(Norris等，1993)與 Nos終止子之間。選擇標志由在HSP80啟動子(Brunke和Wilson，1993)控制下的PMI基因 組成。圖11 顯示在比較BvPRR7的18種一年生和2種二年生等位基因時BvPRR7的啟 動子區域中鑒定的多態性的表；依照SEQ ID NO :8編號表中所標示的SNP位置。圖12 顯示在比較BvPRR7的18種一年生和2種二年生等位基因時BvPRR7的編 碼區中鑒定的多態性的表；依照SEQ ID NO 8編號表中所標示的SNP位置。序列SEQIDNO1描述了糖用甜菜EST CV301305的核苷酸序列SEQIDNO2描述了正向引物PRR7-F的核苷酸序列SEQIDNO3描述了反向引物PRR7-R的核苷酸序列SEQID NO 4描述了 BvPRR7等位變體2 (單元型#2)的內含子3的核苷酉変序列SEQIDNO5描述了 BvPRR7等位變體1 (單元型#1)的內含子3的核苷酉変序列SEQID NO 6描述了 BvPRR7內含子3的核苷酸序列及其用于定位的等位變異性SEQIDNO7描述了 BvPRR7的二年生等位基因的基因組核苷酸序列SEQIDNO8描述了包括啟動子和終止子區域的BvPRR7的基因組核苷·I序列的核苷酸丨序列。SEQIDNO9描述了 BvPRR7的二年生等位基因的編碼區的核苷酸序列SEQIDNO10描述了 BvPRR7的一年生等位基因的編碼區的核苷酸序列SEQIDNO11描述了 BvPRR7的二年生等位基因的推定的氨基酉堯序列SEQIDNO12描述了 BvPRR7的一年生等位基因的推定的氨基酉堯序列SEQIDNO13描述了引物PRR7 (Tl)-F的核苷酸序列SEQIDNO14描述了引物PRR7 (Tl)-R的核苷酸序列SEQIDNO15描述了探針PRR7(T1)-VIC的核苷酸序列SEQIDNO16描述了探針PRR7 (Tl)-FAM的核苷酸序列SEQIDNO:17描述了引物GJ131 (Tl)-F的核苷酸序列SEQIDNO18描述了引物GJ131 (Tl)-R的核苷酸序列SEQIDNO19描述了探針GJ131(T1)-VIC的核苷酸序列SEQIDNO20描述了探針GJ131 (Tl)-FAM的核苷酸序列SEQIDNO21描述了引物ED031700(T1)-F的核苷酸序列SEQIDNO22描述了引物ED031700(T1)-R的核苷酸序列SEQIDNO23描述了探針ED031700(T1)-VIC的核苷酸序列SEQIDNO24描述了探針ED031700 (Tl) -FAM的核苷酸序列13
SEQIDNO25描述了引物9_27(T2)-F的核苷酸序列SEQIDNO:26描述了引物9_27(T2)-R的核苷酸序列SEQIDNO27描述了探針9_27(I^)-VIC的核苷酸序列SEQIDNO28描述了探針9_27 (T2) -FAM的核苷酸序列SEQIDNO四描述了引物GJO1 (T1) -F的核苷酸序列SEQIDNO30描述了引物GJOl (Tl)-R的核苷酸序列SEQIDNO31描述了探針GJOI(TI)-VIC的核苷酸序列SEQIDNO32描述了探針GJOl (Tl)-FAM的核苷酸序列SEQIDNO33描述了引物SELA3977的核苷酸序列SEQIDNO:；34描述了引物SELA3988的核苷酸序列SEQIDNO:35描述了引物SELA4442的核苷酸序列SEQIDNO:36描述了引物SELA3809的核苷酸序列SEQIDNO37描述了引物SELA3810的核苷酸序列SEQIDNO38描述了引物SELA3807的核苷酸序列SEQIDNO:39描述了引物SELA3766的核苷酸序列SEQIDNO40描述了引物SELA3769的核苷酸序列SEQIDNO41描述了引物SELA3857的核苷酸序列SEQIDNO42描述了引物SELA3860的核苷酸序列SEQIDNO43描述了引物SELA3861的核苷酸序列SEQIDNO44描述了引物SELA3864的核苷酸序列SEQIDNO45描述了用于基因表達分析的正向引物BvPRR7的核苷菌δ序列SEQIDNO46描述了用于基因表達分析的反向引物BvPRR7的核苷菌δ序列SEQIDNO47描述了用于基因表達分析的正向引物BvICDH的核苷菌δ序列SEQIDNO48描述了用于基因表達分析的反向引物BvICDH的核苷菌δ序列SEQIDNO49描述了引物PRR7(T6)-F的核苷酸序列SEQIDNO50描述了引物PRR7(T6)-R的核苷酸序列SEQIDNO51描述了探針PRR7 (T6)-VIC的核苷酸序列SEQIDNO52描述了探針PRR7 (T6) -FAM的核苷酸序列SEQIDNO:53描述了一年生PRR7等位基因中在其啟動子區下游約1，31Λ的編碼區的核苷酸序列SEQIDNO力4描述了 BvPRR7的一年生等位基因的編碼區的核苷環_序列，所述BvPRR7包含約1，31Λ的其啟動子區和約0. 7kb的其終止子區域SEQIDNO55描述了引物lr22(Tl)-F的核苷酸序列SEQIDNO56描述了引物lr22(Tl)-R的核苷酸序列SEQ ID NO :57描述了探針lr22(Tl)_VIC的核苷酸序列SEQ ID NO :58描述了探針lr22(Tl)_FAM的核苷酸序列定義如果本文中下文沒有另外指明，一般給予本申請范圍內使用的技術術語和表述以 植物分子生物學有關領域中通常應用于它們的含義。
如本說明書和所附權利要求書中所使用的，單數形式“一個”、“一種”、和“所述”、 “該”包括復數稱謂，除非上下文另外明確指明。如此，例如，提到“一株/種植物”包括一或 多株/種植物，而提到“一個/種細胞”包括細胞、組織、等等的混合物。“糖用甜菜”指甜菜(Beta)屬內的所有種和亞種，以及甜菜的所有種類栽培甜 菜。已經將栽培的甜菜分成四組葉甜菜(leaf beet)、菜用甜菜(gardenbeet)、飼料甜菜 (fodder beet)和糖用甜菜(sugar beet)。“糖用甜菜”也指所有栽培甜菜，包括那些為制 糖以外的目的(諸如乙醇、塑料或工業產品)而種植的。具體而言，“糖用甜菜”指飼料甜菜 和糖用甜菜，但是尤其指糖用甜菜。此術語還包括適合于在熱帶或亞熱帶地區生長的糖用 甜菜植物。“一年生糖用甜菜系”指以雜合或純合狀態在B基因座處含有顯性等位基因B的糖 用甜菜植物。“二年生糖用甜菜系”指以純合狀態在B基因座處含有隱性等位基因b的糖用甜菜 植物。“抽苔”指自營養性蓮座階段向花序或生殖性生長階段的轉換。如本文中所使用的，“延遲的抽苔”或“抽苔的延遲”必須理解為調控糖用甜菜植 物的天然抽苔反應。在具有延遲的抽苔的植物中，作為抽苔的第一可見步驟的莖伸長比在 正常植物中開始得晚。抽苔反應可以延遲僅幾天(即，例如5、6、7、8、9、10、11、12、13或14 天)和多至數周(即2、3、4周)或數月(即1、2、3、5、或6個月)。抽苔的延遲還可以導致 對抽苔響應的完全抑制；此類植物在春化后不抽苔，而且展現出非抽苔表型。如本文中所使用的，“B基因”指負責決定糖用甜菜中的一年生習性(早期抽苔) 的基因。攜帶顯性等位基因B的植物能夠以不依賴于春化的方式自幼年期轉變成生殖期， 即在沒有先前暴露于冷溫度的情況中進行枝條伸長，接著開花。“春化”指有些植物中將植物暴露于冷一段時間促進成花誘導的過程。“等位基因”在本發明范圍內理解為指與不同形式的基因或任何種類的可鑒定遺 傳元件有關的各種遺傳單元的交替形式，因為它們位于同源染色體中的相同基因座，所以 它們在遺傳方面是交替的。在二倍體細胞和生物體中，給定基因(或標志物)的兩個等位 基因通常占據一對同源染色體的對應基因座。如本文中所使用的，術語“單元型”指個體自一個親本遺傳的一組等位基因。如 此，二倍體個體具有兩份單元型。術語“單元型”可以以更有限的意義使用，指與表型性狀 (諸如本發明的上下文中的糖用甜菜植物的一年生或二年生抽苔習性)有關的物理上連鎖 的和/或不連鎖的遺傳標志物(例如序列多態性)。關于B基因，此基因的單元型還直接賦 予表型。例如，糖用甜菜的一年生生長習性是由染色體II上基因座B的顯性等位基因的存 在引起的。“基因座”在本發明范圍內理解為指染色體上包含基因或任何其它促成性狀的遺 傳元件或因子的區域。如本文中所使用的，短語“遺傳標志物”指與一個或多個感興趣基因座有關的個體 基因組特征(例如存在于個體基因組中的核苷酸或多核苷酸序列)。在一些實施方案中，遺 傳標志物在感興趣群體和由多態性占據的基因座中是多態性的，這取決于上下文。遺傳標 志物包括例如單核苷酸多態性(SNP)、插入/缺失、簡單序列重復(SSR)、限制性片段長度多態性(RFLP)、隨機擴增多態性DNA(RAPD)、切割擴增多態性序列(CAPS)標志物、多樣性陣列 技術(DArT)標志物、和擴增片段長度多態性(AFLP)、等許多其它例子。遺傳標志物可以用 于例如在染色體上定位含有促成表型性狀表達變應性的等位基因的遺傳基因座。短語“遺 傳標志物”還可以指與基因組序列互補的多核苷酸序列，諸如用作探針的核酸序列。遺傳標志物可以在物理上位于染色體上與它相關的遺傳基因座之內或之外的位 置中(即分別是基因內的或基因外的)。換言之，雖然當與感興趣基因座對應的基因在染色 體上的位置尚未鑒定且遺傳標志物和感興趣基因座之間的重組率非零時通常采用遺傳標 志物，但是當前公開的主題也可以采用在物理上在遺傳基因座邊界內的遺傳標志物(例如 在與基因對應的基因組序列之內，諸如但不限于基因內含子或外顯子內的多態性)。在當前 公開的主題的一些實施方案中，一種或多種遺傳標志物包含1-10種標志物，而在一些實施 方案中，一種或多種遺傳標志物包含超過10種遺傳標志物。如本文中所使用的，短語“表型性狀”指個體源自其基因組與環境相互作用的外觀 或其它可檢測特征。“表型”在本發明范圍內理解為指遺傳控制性狀的可區分特征。如本文中所使用的，術語“緊密連鎖的”或“遺傳上緊密連鎖的”在糖用甜菜基因組 中與B基因連鎖的基因組區域的上下文中理解為指所述基因組區域和B基因在遺傳力上緊 密聯合，這是由于同一染色體上接近的兩者的位置，其通過基因座之間的百分比重組(厘 摩，cM)來測量。如本文中所使用的，術語“連鎖”及其語法變型指同一染色體上不同基因座 處的等位基因一起分離(共分離)的趨勢比在它們的傳遞是獨立的情況中偶然會預期的趨 勢更頻繁。如本文中所使用的，短語“信息片段”指具有可回收的且能幫助測定和/或表征感 興趣遺傳基因座的信息內容的多核苷酸片段。此信息內容可以由與所述感興趣基因座有關 的多態性來代表，諸如例如單核苷酸多態性(SNP)、插入/缺失、簡單序列重復(SSR)、限制 性片段長度多態性(RFLP)、隨機擴增多態性DNA(RAPD)、切割擴增多態性序列(CAPS)標志 物、多樣性陣列技術(DArT)標志物、和擴增片段長度多態性(AFLP)、等許多其它例子，而且 可用于開發遺傳標志物。此類“信息片段”的信息內容也可以由能通過相應探針分子來檢 測的特定序列來代表。此類信息片段可以是引物或標志物或其部分。此類片段具有至少10 個核苷酸，優選至少15、20、25、30、50、或100個核苷酸的長度。“基于標志物的選擇”在本發明范圍內理解為指使用遺傳標志物來檢測一種或多 種來自植物的核酸，其中所述核酸與期望性狀有關以鑒定攜帶關于期望(或不期望)性狀 的基因的植物，使得那些植物可用于(或避免用于)選擇性育種程序。"PCR (聚合酶鏈式反應)”在本發明范圍內理解為指生成相對較大量的DNA特定區 域的方法，由此使得各種基于那些區域的分析成為可能。“PCR引物”或“引物”在本發明范圍內理解為指特定DNA區域的PCR擴增中使用 的分離的單鏈DNA的短片段。通過核酸雜交將它們與互補的靶DNA鏈退火以形成引物與靶 DNA鏈之間的雜合物，然后通過聚合酶諸如DNA聚合酶沿著靶DNA鏈延伸。可以使用引物 對或組來擴增核酸分子，例如通過聚合酶鏈式反應(PCR)或其它常規的核酸擴增方法來進 行。引物一般長10-15個核苷酸或更多。引物還可以長至少20個核苷酸或更多，或至少25 個核苷酸或更多，或長至少30個核苷酸或更多。此類引物在高嚴格雜交條件下與靶序列特16異性雜交。依照本發明的引物可以具有與靶序列的完全序列互補性。要理解的是，本發明 引物的長度可以是本文中規定的數值之間的任何數值。如此，一般長10-15個核苷酸或更 多的引物涵蓋具有10、11、12、13、14、或15個核苷酸的長度的引物，而表述“至少20個核苷 酸”進一步包括具有16、17、18、19或更多個核苷酸的長度的引物。其適用于表述“至少25 個核苷酸或更多”和“長至少30個核苷酸或更多”。如本文中所使用的，術語“擴增的”意指使用至少一種核酸分子作為模板構建多拷 貝的核酸分子或與核酸分子互補的多拷貝。擴增系統包括聚合酶鏈式反應(PCR)系統、連 接酶鏈式反應(LCR)系統、基于核酸序列的擴增(NASBA，Cangene，Mississauga，Ontario)、 Q-β復制酶系統、基于轉錄的擴增系統(TAS)、和鏈置換擴增(SDA)。參見例如Diagnostic Molecular Microbiology :Principles and Applications, D. H. Persing 等編，American Society forMicrobiology, Washington, D. C. (1993)。擴增產物稱作擴增子。“探針”是附著有常規的可檢測標記物或報告分子諸如放射性同位素、配體、化學 發光劑、熒光標記物或酶的分離的核酸。此類探針與靶核酸的鏈互補。依照本發明的探針 不僅包括脫氧核糖核酸或核糖核酸，而且還包括聚酰胺和其它探針材料，它們特異性結合 靶DNA序列，而且可以用于檢測所述靶DNA序列的存在。引物和探針一般長10-15個核苷酸或更多。引物和探針也可以長至少20個核苷酸 或更多，或至少25個核苷酸或更多，或長至少30個核苷酸或更多。此類引物和探針在高嚴 格雜交條件下與靶序列特異性雜交。依照本發明的引物和探針可以具有與靶序列的完全序 列互補性，雖然可以通過常規的方法來設計與靶序列不同且保留與靶序列雜交的能力的探 針。要理解的是，本發明引物和探針的長度可以是本文中規定的數值之間的任何數值。如 此，一般長10-15個核苷酸或更多的引物和探針涵蓋具有10、11、12、13、14、或15個核苷酸 的長度的引物和探針，而表述“至少20個核苷酸”進一步包括具有16、17、18、19或更多個 核苷酸的長度的引物和探針。其適用于表述“至少25個核苷酸或更多”和“長至少30個核 苷酸或更多”。“多態性”在本發明范圍內理解為指群體中存在兩種或更多種形式的基因、遺傳標 志物、或遺傳性狀。“單核苷酸多態性”或“SNP”在本發明的范圍內理解為指在基因組中的單個核苷酸 (或其它共享的序列)在物種的成員間或個體中配對的染色體間有所不同時發生的DNA序 列變異。來自在單個核苷酸上含有差異的不同個體的兩種測序的DNA片段稱作兩種等位基 因。優選地，SNP僅具有兩種等位基因。術語“多核苷酸”在本文中理解為指由含有糖、磷酸根和堿基(或是嘌呤或是嘧 啶)的單體(核苷酸)構成的高分子量的聚合物分子，其可以是單鏈的或雙鏈的。“多核苷 酸片段”是給定多核苷酸分子的一部分。在高等植物中，脫氧核糖核酸(DNA)是遺傳物質， 而核糖核酸(RNA)涉及將DNA內所含信息轉移至蛋白質。“基因組”是生物體的每個細胞中 所含遺傳物質的整體。如此，術語“多核苷酸”指DNA或RNA聚合物，其可以是單鏈的或雙鏈 的，任選含有能夠摻入DNA或RNA聚合物的合成的、非天然的或改變的核苷酸堿基。除非另 外指明，本發明的特定核酸序列還隱含地涵蓋其保守修飾變體(例如簡并密碼子替代)和 互補序列，就像明確指明的序列。具體而言，簡并密碼子替代可通過生成其中一個或多個選 定(或所有)密碼子的第三位用混和堿基和/或脫氧肌苷殘基替代的序列來實現(Batzer等，1991 ；Ohtsuka等，1985 ；Rossolini等，1994)。術語多核苷酸與核酸、核苷酸序列可互換 使用，而且可包括基因、由基因編碼的mRNA、cDNA等。在本發明的核酸分子的上下文中使用時，術語“分離的”指在各自的來源生物體 內在其染色體核酸序列背景內鑒定的和自其染色體核酸序列背景分離/分開的核酸序列。 分離的核酸不是像它在其天然背景中出現的那樣的核酸，如果它確實有天然存在對應物的 話。比較而言，未分離的核酸是以它們在自然界中存在的狀態找到的核酸諸如DNA和RNA。 例如，在宿主細胞染色體上在接近鄰近基因處找到給定的DNA序列(例如基因)。分離的核 酸序列可以以單鏈或雙鏈形式存在。或者，它可以含有有義和反義鏈兩者(即核酸序列可 以是雙鏈的)。如果在植物基因組的背景中要求保護，本發明的核酸分子與天然存在對應物 的區別在于基因組中的插入位點和插入位點處的側翼序列。在一個優選的實施方案中，本 發明的核酸分子理解為分離的。如本文中所使用的，短語“核酸”指能與核苷酸串(或鏈)對應的，單體單元的任何 物理串，包括核苷酸聚合物(例如典型的DNA或RNA聚合物)、修飾的寡核苷酸(例如包含 對于生物學RNA或DNA而言不是典型的堿基的寡核苷酸，諸如2’-0_甲基化寡核苷酸)、諸 如此類。在一些實施方案中，核酸可以是單鏈的、雙鏈的、多鏈的、或其組合。除非另外指明， 當前公開主題的特定核酸序列任選在任何明確指明的序列之外還包含或編碼互補序列。術語“基因”廣泛用于指與生物學功能有關的任何核酸區段。如此，基因包括其表 達需要的編碼序列和/或調控序列。例如，基因指表達mRNA或功能性RNA或編碼特定蛋白 質且包括調控序列的核酸片段。基因還包括不表達的DNA區段，其例如形成其它蛋白質的 識別序列。基因可以自多種來源分離，包括自感興趣來源分離或自已知或預測序列信息合 成，而且可以包括設計成具有期望參數的序列。如本文中所使用的，“表達盒”意指能夠在合適的宿主細胞中指導特定核苷酸序列 表達的核酸分子，其包含與感興趣的核苷酸序列可操作連接的啟動子，所述感興趣的核苷 酸序列與終止信號可操作連接。典型地，它還包含核苷酸序列的正確翻譯所需要的序列。表 達盒還可以包含直接表達感興趣的核苷酸序列不必要的但由于便于自表達載體除去該盒 的限制性位點而存在的序列。包含感興趣核苷酸序列的表達盒可以是嵌合的，意味著至少 一種其構件就至少一種其其它構件而言是異源的。表達盒還可以是天然存在的但已經以可 用于異源表達的重組形式獲得的表達盒。典型地，然而，表達盒對于宿主而言是異源的，即 表達盒的特定核酸序列在宿主細胞中不天然存在，而且必須已經通過本領域中已知的轉化 方法導入宿主細胞或宿主細胞的祖先中。表達盒中核苷酸序列的表達可以在組成型啟動子 或誘導型啟動子的控制下，所述誘導型啟動子僅在將宿主暴露于某些特定的外部刺激物時 啟動轉錄。在多細胞生物體諸如植物的情況中，啟動子也可以是對特定組織、或器官、或發 育階段特異性的。表達盒或其片段在轉化入植物中時也可以稱為“插入的序列”或“插入序 列，，。術語“表達”在用于提及核酸序列諸如基因時指將基因中編碼的遺傳信息經由基 因的“轉錄”(即經由RNA聚合酶的酶促作用)轉化成RNA(例如mRNA、rRNA、tRNA、或snRNA) 和在可適用的情況(此時基因表達蛋白質)中經由mRNA的“翻譯”轉化成蛋白質的過程。 可以在該過程中的許多階段調節基因表達。術語“嵌合基因”指含有以下各項的任何基因1)沒有在自然界中一起找到的DNA序列，包括調控和編碼序列，或幻編碼天然不相連的、蛋白質各部分的序列，或幻天然不相 連的、啟動子各部分。因而，嵌合基因可包含自不同來源衍生的調控序列和編碼序列，或包 含自相同來源衍生的但以與在自然界中找到的方式不同的方式排列的調控序列和編碼序 列。“轉基因”指已經通過轉化導入基因組中并穩定維持的基因。轉基因可包括例如對 于要轉化的特定植物的基因而言異源或同源的基因。另外，轉基因可包含插入非天然生物 體的天然基因，或嵌合基因。“轉化”是用于將異源核酸導入宿主細胞或生物體的方法。具體地，“轉化”意指DNA 分子穩定整合入感興趣的生物體的基因組中。“轉化的/轉基因的/重組的”指其中已經導入異源核酸分子的宿主生物體諸如 細菌或植物。可以將核酸分子穩定地整合入宿主的基因組中或者核酸分子也可以以染色 體外分子存在。此類染色體外分子可以是自主復制的。經轉化的細胞、組織、或植物理解 為不僅涵蓋轉化方法的終產物，而且還涵蓋其轉基因后代。“未轉化的”、“非轉基因的”、 “非重組的”宿主指野生型生物體，例如細菌或植物，其不含異源核酸分子。如本文中所使 用的，“轉基因的”指如下的植物、植物細胞、或眾多結構化的(structured)或非結構化的 (unstructured)植物細胞，其具有經由遺傳操作和基因插入的公知技術在與通常存在于 天然植物或植物細胞中的基因座不同的基因座處或以比通常存在于天然植物或植物細胞 中的拷貝數目大的拷貝數目整合入植物基因組中，并且通常整合入細胞核、線粒體或其它 含有染色體的細胞器的染色體中的代表感興趣基因的核酸序列。與天然存在的突變形成 對比，轉基因植物源自操作和插入此類核酸序列以生成非天然存在的植物或具有非天然存 在的基因型的植物。用于轉化植物和植物細胞的技術是本領域中公知的，并且可以包括例 如電穿孔、顯微注射、土壤桿菌屬(Agrobacterium)介導的轉化、和彈道轉化(ballistic transformation) 0術語“蛋白質”、“肽”和“多肽”在本文中可互換使用。“編碼序列”指編碼特定氨基酸序列且排除非編碼序列的DNA或RNA序列。它可構 成“不中斷的編碼序列”，即缺少內含子，諸如cDNA，或者它可包括一個或多個以適宜剪接點 為界的內含子。“內含子”是包含在初級轉錄物中但經由細胞內為創建能翻譯成蛋白質的成 熟mRNA對RNA的切割和再連接被切除的RNA序列。“啟動子”指通常位于其編碼序列上游(5’ )的核苷酸序列，其通過提供正確轉錄 需要的RNA聚合酶識別和其它因子來控制編碼序列的表達。“啟動子”包括最小啟動子，它 是由TATA框和承擔規定轉錄起始位點的其它序列構成的短DNA序列，向其添加用于控制表 達的調控元件。“啟動子”還指包括最小啟動子加能夠控制編碼序列或功能性RNA表達的 調控元件的核苷酸序列。此類啟動子序列由近端和更多遠端上游元件組成，后一類元件常 常稱作增強子。因而，“增強子”是能刺激啟動子活性的DNA序列，而且可以是啟動子的內 在元件或為了增強啟動子的水平或組織特異性而插入的異源元件。它能夠以兩個方向(正 常的或倒轉的)運轉，而且甚至在移動到啟動子上游或下游時仍能夠運行。增強子和其它 上游啟動子元件都結合介導其效應的序列特異性DNA結合蛋白。啟動子可以整體衍生自天 然基因，或者由自在自然界中找到的不同啟動子衍生的不同元件構成，或者甚至由合成DNA 區段構成。啟動子還可以含有涉及響應生理或發育條件控制轉錄起始效率的蛋白質因子的結合的DNA序列。“起始位點”是圍繞作為所轉錄序列一部分的第一個核苷酸(也定義為+1位置) 的位置。就此位點而言，對基因及其控制區的所有其它序列編號。下游序列(即3’方向的 其它蛋白質編碼序列)命名為正數，而上游序列(主要是5’方向的控制序列)命名為負值。在上游激活缺失的情況中沒有活性或具有大大降低的啟動子活性的啟動子元件， 特別是TATA元件稱作“最小或核心啟動子”。在存在合適轉錄因子的情況中，最小啟動子發 揮允許轉錄的功能。如此，“最小或核心啟動子”僅僅由轉錄起始需要的所有基礎元件(例 如TATA框和/或起始子)組成。“組成性表達”指使用組成性或可調型啟動子的表達。“條件性”和“可調型表達” 指由可調型啟動子控制的表達。“組成型啟動子”指能夠在所有或幾乎所有植物組織中在植物的所有或幾乎所有 發育階段期間表達它控制的可讀框(ORF)的啟動子。每一個轉錄激活元件不顯示絕對組織 特異性，但是在大多數植物部分中以轉錄最有活性的植物部分中達到的水平以上的水 平介導轉錄激活。“可調型啟動子”指以不是組成性的，而是時間和/或空間受調控的方式指導基因 表達的啟動子，而且包括組織特異性的和誘導型的啟動子。它包括天然的和合成的序列，以 及可以是合成序列與天然序列的組合的序列。不同啟動子可以在不同組織或細胞類型中、 在發育的不同階段、或響應不同環境條件指導基因表達。不斷地發現在植物細胞中有用的 各種類型新啟動子，眾多例子可見于匯編Okamuro等(1989)。在植物中有用的典型的可調 型啟動子包括但不限于安全劑可誘導的啟動子、自四環素可誘導系統衍生的啟動子、自水 楊酸可誘導系統衍生的啟動子、自醇可誘導系統衍生的啟動子、自糖皮質激素可誘導系統 衍生的啟動子、自病原體可誘導系統衍生的啟動子、和自蛻皮激素可誘導系統衍生的啟動 子。“組織特異性啟動子”指不是在所有植物細胞中表達，而是只在特定器官(諸如葉 或種子)、特定組織(諸如胚或子葉)、或特定細胞類型(諸如葉薄壁組織或種子貯藏細胞) 的一種或多種細胞類型中表達的可調型啟動子。這些還包括時間受調控的啟動子，諸如在 胚胎發生的早期或晚期、在種子或果實發育中果實成熟期間、或在完全分化的葉中、或在衰 老開始時。“誘導型啟動子”指那些能在一種或多種細胞類型中被外部刺激(諸如化學制品、 光、激素、壓力、或病原體)開啟的可調型啟動子。“可操作連接”指單一核酸片段上各核酸序列的聯系，使得一核酸序列的功能受到 另一核酸序列的影響。例如，若調控DNA序列和編碼RNA或多肽的DNA序列的定位使得調控 DNA序列影響編碼DNA序列的表達(即編碼序列或功能性RNA處于啟動子的轉錄控制下)， 則說這兩序列“可操作連接”或“相關”。編碼序列可以以有義或反義取向與調控序列可操 作連接。“表達”指內源基因、ORF或其部分的、或轉基因在植物中的轉錄和/或翻譯。例如， 就反義構建體而言，表達可以僅僅指反義DNA的轉錄。另外，表達指有義(mRNA)或功能性 RNA的轉錄和穩定積累。表達還可以指蛋白質的生成。“過表達”指轉基因細胞或生物體中的表達水平超過正常或未轉化(非轉基因)細胞或生物體中的表達水平。“反義抑制”指能夠抑制自內源基因或轉基因表達蛋白質的反義RNA轉錄物的生 成。“基因沉默”指對病毒基因、轉基因、或內源細胞核基因的，同源性依賴性抑制。基 因沉默可以是轉錄的，這時抑制是由于受影響基因的轉錄降低，或者是轉錄后的，這時是由 于與受影響基因同源的RNA種類的周轉(降解)升高。基因沉默包括病毒誘導的基因沉默。"RNA干擾”(RNAi)指植物和動物中由短干擾RNA(siRNA)介導的序列特異性轉錄 后基因沉默的過程。各種術語諸如siRNA、靶RNA分子、切酶或核糖核酸酶III酶是本領域 技術人員已知的概念，并且與RNAi有關的這些術語和其它概念的全面描述可以參見文獻。 理解的是，描述RNAi機制的任何特定假設對于實施本發明不是必需的。術語“siRNA”指短干擾RNA。在一些實施方案中，siRNA包含長約21_23個核苷酸 的雙鏈體或雙鏈區；siRNA在每條鏈的3’端處常含有約2-4個未配對的核苷酸。siRNA的 雙鏈體或雙鏈區的至少一條鏈與靶RNA分子基本上同源或基本上互補。與靶RNA分子互補 的鏈是“反義鏈”；與靶RNA分子同源的鏈是“有義鏈”，而且還與siRNA反義鏈互補。siRNA 還可以含有別的序列；此類序列的非限制性例子包括連接序列、或環，以及莖和其它折疊結 構。siRNA表現為在無脊椎動物和脊椎動物中觸發RNA干擾中和在植物中在轉錄后基因沉 默過程中觸發序列特異性RNA降解中起關鍵媒介物的作用。“dsRNA”或“雙鏈RNA”是具有兩條互補鏈的RNA，其經由稱為RNA干擾(RNAi)的 過程指導mRNA的序列特異性降解。將dsRNA切成干擾特定基因表達的siRNA。術語“靶RNA分子”指與siRNA(或dsRNA)的短雙鏈區的至少一條鏈同源或互補 的RNA分子。典型地，在此類同源性或互補性在至少21個核苷酸的區段里是約100%時， siRNA能夠沉默或抑制靶RNA分子的表達。雖然認為經加工的mRNA是siRNA的靶物，本發 明不限于任何具體的假設，而且此類假設對于實施本發明不是必需的。如此，涵蓋的是，其 它RNA分子也可以是siRNA的靶物。此類RNA靶分子包括未加工的mRNA、核糖體RNA、和病 毒RNA基因組。靶RNA分子與dsRNA之間在dsRNA的整個長度里有100%的同源性不是必 要的，但是dsRNA的發夾應當包含至少21個核苷酸，優選至少23個核苷酸，更優選至少50 個核苷酸，甚至更優選至少500個核苷酸，最優選至少700個核苷酸，和多至1000個核苷酸 的區段，其與靶RNA分子間具有至少95%，優選100%的同源性。如本文中所使用的，術語“雜交”指常規雜交條件，優選如下的雜交條件，其中使用 5x SSPE,1% SDS, Ix Denhardts溶液作為溶液和/或雜交溫度介于35°C和70°C之間，優 選65°C。雜交后，優選首先用h SSC，1% SDS進行清洗，隨后用0. SSC進行清洗，溫度 介于35°C和75°C之間，特別是介于45°C和65°C之間，但是尤其是59°C (關于SSPE、SSC和 Denhardts溶液的定義參見Sambrook等見上文)。舉例而言，Sambrook等，見上文中記載 的高嚴格性雜交條件是特別優選的。例如，若如上所述于65°C進行雜交和清洗，則存在特別 優選的嚴格雜交條件。例如，于45°C進行雜交和清洗的非嚴格雜交條件優選程度較低，而 35 °C甚至更低。“序列同源性或序列同一性”在本文中可互換使用。處于“相同”或百分比“同一 性”在兩種或更多種核酸或蛋白質序列的語境中指在為了最大對應而比對或比較時，如使 用下述序列比較算法之一或通過肉眼檢查所測量的，兩種或更多種序列或亞序列是相同的或具有特定百分比的、相同的氨基酸殘基或核苷酸。若要彼此比較的兩種序列長度不同，則 序列同一性優選涉及較短序列中與較長序列的核苷酸殘基相同的核苷酸殘基的百分比。序 列同一性可使用計算機程序諸如Bestfit程序(Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park,575Science Drive Madison, WI 53711)常規測定。Bestfit 利用 Smith 和 Waterman，Advances in Applied Mathematics 2 (1981)，482-489的局部同源性算法來尋找兩種序列間具有最高序 列同一性的區段。在使用Bestfit或另一種序列比對程序來測定特定序列是否與本發明參 比序列具有例如95%同一性時，優選調整參數使得在參比序列全長上計算同一性百分比且 容許參比序列中有占核苷酸總數多至5%的同一性缺口。在使用Bestfit時，所謂的任選參 數優選保留它們的預設(“默認/缺省”)值。在給定序列與上文所述本發明序列之間的比 較中出現的偏差可能是由添加、缺失、替代、插入或重組引起的。優選的是，此類序列比較也 可以用程序“fasta20u66” (2. 0u66版，1998年9月，William R. Pearson和弗吉尼亞大學； 還可參見Pearson，1990，所附例子和http //workbench, sdsc. edu/)進行。為此目的，可使 用“缺省”參數。兩種核酸序列基本上相同的另一項指標是這兩種分子在嚴格條件下彼此雜交。短 語“特異性雜交”指當特定核苷酸序列存在于復雜混合物(例如總細胞DNA或RNA)中時， 在嚴格條件下一種分子只與該序列結合、形成雙鏈、或雜交。“基本上結合”指探針核酸與靶 核酸之間的互補性雜交，而且涵蓋微小錯配，其可以通過降低雜交介質的嚴格性來容許，用 以實現對靶核酸序列的期望檢測。“嚴格條件”、“嚴格雜交條件”或“嚴格雜交清洗條件”在核酸雜交實驗諸如 Southern和Northern雜交的語境中包括提及探針會以比對其它序列可檢出地更大程度 與其靶序列雜交的條件。嚴格條件是靶序列依賴性的，而且在不同環境參數下是不同的， 并且會隨多核苷酸的結構而有所不同。較長的序列在較高的溫度特異性雜交。關于核 酸雜交的廣泛指導可參見 Tijssen P. , 1993Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology-Hybridization with Nucleic Acid Probes,第 I 部分，第 2 章 “Overviewof principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays，，Elsevier, New York ；禾口 Current Protocols in Molecular Biology,第 2 章， Ausubel 等編，Greene Publishing and Wiley-Interscience :New York(1995),及還有 Sambrook等(2001)Molecular Cloning :A Laboratory Manual (第 5版CoIdSpring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)。特異性通常是雜交后清洗的功能，關鍵的因素是最終清洗溶液的離子強度和溫 度。一般而言，高度嚴格雜交和清洗條件選擇成比特定序列在限定離子強度和PH的熱解鏈 點(Tm)低大約5°。典型的是，在“嚴格條件”下，探針會與其靶亞序列雜交，但不與其它序 列雜交。Tm是50%的靶序列與完全匹配的探針雜交的溫度(在限定的離子強度和pH下)。 很嚴格的條件選擇成等于特定探針的Tm。具有超過100個互補殘基的互補核酸在濾器上 在Southern或Northern印跡中的雜交的嚴格雜交條件的一個例子是50%甲酰胺及Img肝 素，雜交于42 °C進行過夜。通常，高嚴格清洗之前有低嚴格清洗以消除背景探針信號。高度嚴格的清洗條件22的一個例子是0. 2x SSC于65°C清洗15分鐘(關于SSC緩沖液的說明參見Sambrook，見下 文)，而非常高度嚴格的清洗條件的例子是0. 15M NaCl于72°C達約15分鐘。用于例如超 過100個核苷酸的雙鏈體的中等(中間)嚴格性清洗的一個例子是Ix SSC于45°C達15分 鐘。用于例如超過100個核苷酸的雙鏈體的低嚴格清洗的一個例子是4-6x SSC于40°C15 分鐘。對于短探針(例如大約10-50個核苷酸)，嚴格條件通常涉及低于大約1. OM Na離 子、通常大約0.01-1. OM Na離子濃度(或其它鹽)的鹽濃度，于pH 7. 0-8. 3，而且溫度通 常是至少大約30°C。嚴格條件還可以通過添加去穩定劑諸如甲酰胺來實現。一般而言，特 定雜交測定法中用無關探針觀察到的信噪比2倍(或更高)的信噪比指示檢測到特異性雜 交。若由核酸編碼的蛋白質基本上相同，則在嚴格條件下彼此不雜交的核酸仍然是基本上 相同的。這發生于例如使用遺傳密碼容許的最大密碼子簡并性來創建核酸拷貝的時候。以下是雜交/清洗條件的例示性組，其可以用于雜交與本發明的參照核苷酸序 列基本上相同的核苷酸序列優選地，參照核苷酸序列在7%十二烷基硫酸鈉(SDS)、0. 5M NaPO4UmM EDTA中于50°C與參照核苷酸序列雜交，其中在2X SSC、0. 1% SDS中于50°C清 洗，更期望地在十二烷基硫酸鈉(SDS)、0. 5M NaPO4UmM EDTA中于50°C雜交，其中在 IX SSC、0. 1% SDS中于50°C清洗，更期望地仍在7%十二烷基硫酸鈉(SDS)、0. 5M NaPO4, ImMEDTA中于50°C雜交，其中在0. 5X SSC、0. 1 % SDS中于50°C清洗，優選地在7%十二烷基 硫酸鈉(SDS)、0.5M NaPO4UmM EDTA 中于 50°C雜交，其中在 0. IX SSC,0. 1%SDS 中于 50°C 清洗，更優選地在7%十二烷基硫酸鈉(SDS)、0. 5M NaPO4UmM EDTA中于50°C雜交，其中在 0. IX SSC、0. 1%SDS中于65°C清洗。可以使用所有上述條件來檢測本發明的序列。出于限 定本發明的目的，使用高度嚴格性條件。“植物”是處于任何發育階段的任何植物，特別是種子植物。“植物細胞”是植物的結構和生理單元，包含原生質體和細胞壁。植物細胞可以是 分離的單細胞或培養的細胞的形式，或者是更高級的、有組織的單元諸如例如植物組織、植 物器官、和完整植株的一部分。“植物細胞培養物”指植物單元，諸如例如原生質體、細胞培養細胞、植物組織中的 細胞、花粉、花粉管、胚珠、胚囊、合子和各種發育階段的胚的培養物。“植物材料”指植物的葉、莖、根、花或花的各部分、果實、花粉、卵細胞、合子、種子、 插條、細胞或組織培養物、或任何其它部分或產物。這還包括愈傷組織(callus)或愈傷組 織組織以及提取物(諸如來自直根的提取物)或樣品。“植物器官”是植物的獨特的且明顯有結構的且分化的部分，諸如根、莖、葉、花芽、 或胚。如本文中所使用的，“植物組織”指組織成結構和功能單元的一組植物細胞。包括種 植或培養的植物的任何組織。此術語包括但不限于完整植株、植物器官、植物種子、組織培 養物和組織成結構和/或功能單元的任何植物細胞組。此術語在連同上文所列或此定義以 其它方式涵蓋的任何特定類型植物組織或在沒有任何特定類型植物組織的情況中的使用 并非意圖排除任何其它類型的植物組織。如本文中所使用的，術語“育種”及其語法變形指生成后代個體的任何過程。育種 可以是有性的或無性的，或其任意組合。例示性的非限制性類型的育種包括雜交、自交、重 雙單倍體衍生物生成、及其組合。“選擇性育種”在本發明范圍內理解為指使用擁有或顯示期望性狀的植株作為親本的育種程序。如本文中所使用的，“發酵”指使用微生物將有機分子轉化成另一種分子的過程。 例如，“發酵”可以指需氧轉化來自植物材料諸如本發明的植物材料的糖或其它分子以生成 醇(例如乙醇、甲醇、丁醇)；有機酸(例如檸檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸、葡糖酸)；酮(例如 丙酮)、氨基酸(例如谷氨酸)；氣體(例如H2和CO2)、抗生素(例如青霉素和四環素)；酶； 維生素(例如核黃素、B12、β -胡蘿卜素)；和/或激素。發酵包括可消費醇工業(例如啤 酒和酒)中使用的發酵。發酵還包括厭氧發酵，例如，用于生產生物燃料。可以通過適合于 用于想要的發酵步驟的任何生物體(包括但不限于細菌、真菌、古細菌、和原生生物)來實 現發酵。合適的發酵生物體包括那些能將單糖、二糖、和三糖，特別地葡萄糖和麥芽糖，或任 何其它生物量衍生的分子直接或間接轉化成想要的發酵產物(例如乙醇、丁醇等)的生物 體。合適的發酵生物體還包括那些能將非糖分子轉化成想要的發酵產物的生物體。此類生 物體和發酵方法對于本領域技術人員是已知的。如本文中所使用的，術語“生物燃料”指由植物材料的需氧或厭氧發酵生成的任何 生物燃料。通過需氧發酵獲得的生物燃料的非限制性例子是生物乙醇。可以通過厭氧發酵 獲得的生物燃料包括但不限于沼氣和/或生物柴油(biodiesel)。需氧和/或厭氧發酵的 方法對于本領域技術人員是已知的。發明詳述本發明公開了具有延遲抽苔的表型的轉基因糖用甜菜植物。栽培的糖用甜菜是一種二年生植物，其在第一年形成貯藏根和蓮座葉。在一段時 間的低溫后開始枝條延長(抽苔)和花形成，而一年生甜菜屬的許多野生甜菜顯示一年生 生長習性，這是由于B基因座處存在抽苔基因B。抽苔基因(B基因)負責決定糖用甜菜中 的一年生習性。認為甜菜物種中的一年生是單基因的且顯性的性狀。與攜帶b等位基因的 二年生植物相反，攜帶顯性B等位基因的植物能夠以不依賴于春化的方式自幼年期轉變成 生殖期，所述二年生植物強制性需要春化進行抽苔，隨后發生開花。基因座B的顯性等位基 因在野生甜菜中是豐富的，而且在長日照下引起抽苔，無需對于攜帶隱性等位基因的二年 生栽培種而言通常至關重要的冷要求(Abe等，1997)。本發明人現在使用候選基因辦法來鑒定和表征糖用甜菜中推定的抽苔控制基因。 在此辦法中，依靠使用BLAST具的同源性搜索將具有登錄號CV301305的EST序列鑒定為 PRR7的推定甜菜同源物(參見實施例1. 1)。相應的氨基酸序列顯示了假響應調節物接受者 (PRR, pfam00072)或信號接受者(REC，cd00156)域的部分存在(圖1)，即均在晝夜節律鐘 中起至關重要作用的PRR基因家族的一種標志(Nakamichi等，2005)。圖2顯示了 CV301305 與PRR7，即其最接近的擬南芥同源物的氨基酸序列比對。如最初在擬南芥中所描述的假響 應調節物7(PRR7)基因是假響應調節物基因家族(PRR1或T0C1、PRR3、PRR5、PRR7和PRR9) 的成員，所述假響應調節物基因家族都含有兩項特征性標記響應調節物接受者(REC)和 CCT域。PRR家族成員的轉錄水平以晝夜節律方式振蕩，這提示其蛋白質與晝夜節律鐘緊密 相關。事實上，PRR7在擬南芥中被描述為溫度敏感性晝夜節律系統的一種成分(Nakamichi 等，2007 ；&ι1οπι 和McClung 2005)。在植物中，晝夜節律鐘牽涉調節許多基礎生物學過程， 包括葉運動、光合作用活性的晝間變化和開發時間的光周期控制(Imaizumi和Kay，2006 ； Siou等，2007)。最近，在大麥、小麥和稻(HvPPD、TaPPD和0sraR37)中鑒定和表征PRR7同源物，而且顯示為谷物中光周期響應的主要決定子。在本發明的一方面，如此，提供了 BvPRR7的數種一年生和二年生等位基因的序 列，優選地如SEQ ID NO 1、4、5、6、7、8、9、10、53、或M中給定的序列，其編碼功能上與B基 因等同的蛋白質。基于EST序列，將約0. 5Kb的部分甜菜PRR7片段擴增并測序(參見實施例1. 1)。 使用自一年生系與對第160位的一種SNP而言多態性的二年生系之間的雜交衍生的198個 個體的F2群體的定位實驗顯示了染色體II上在GJ131標志物下游IcM的近似距離處的 BvPRR7圖(圖4)，即已知含有關于不依賴春化的開花的B基因的區域(M5hring等，2004 ； (iaafar等，2005)。標志物測定法的結果顯示了 B基因預測基因型與BvPRR7基因基因型之 間的完全匹配(參見實施例1，1)。進一步定位分析的結果，即其定位位置與其與溫度敏感 性晝夜節律有關的生物學功能的組合(&ι1οπι 和McClung，2005)顯示了 BvPRR7是B基因 的一種強候選物(實施例1. 1)。在下一步中，使用本領域技術人員公知的標準PCR技術來篩選BAC文庫以回收糖 用甜菜PRR7基因的全長基因組序列(參見實施例1. 2)。所使用的BAC文庫是已經用來自 二年生商業性糖用甜菜栽培種H20的DNA建立的BAC文庫。對大小為100-4001Λ的部分 (HindiII)消化的HMW DNA片段進行了兩次大小選擇。將DNA片段連接入載體pBeloBAC-Kan 中。所述文庫含有57，600個克隆，平均插入物大小大約1201Λ，對應于甜菜基因組的8倍覆 蓋。通過用單拷貝探針進行的篩選測試了冗余度，而且來自線粒體或質體DNA的克隆的頻 率估算為低于1%。對DNA集合后續篩選片段BvPRR7導致攜帶相應片段的BAC克隆的正鑒 定。為了得到BvPRR7基因的全長序列，使用標準測序技術對先前鑒定的BAC克隆(BAC SBA079-L24)測序。然后可以將兩個都與EST CV301305共享序列同源性的非交疊的毗連序 列群組合成一條單序列(SEQ ID NO 8)。基于BAC序列毗連序列群與EST CV301305的比對 及與來自擬南芥的PRR7基因的序列同源性，可預測包含內含子和外顯子的甜菜BvPRR7基 因的推定基因結構，如圖5所示。基于此預測，基因組序列可顯示出跨越整個BvPRR7基因 及ATG終止密碼子上游的3. 6kb序列和編碼區下游的2. 2kb序列。BvPRR7的相應氨基酸序 列顯示于SEQ ID NO 11。BvPRR7氨基酸序列與來自擬南芥的PRR基因家族所有成員(包 括TOCl (PRRl)、PRR3、PRR5、PRR7和PRR9)的比對說明了氨基末端附近假應答調控物接受 者域(PRR)基序(pfam00072)和羧基末端處CCT基序(pfam06203)的強保守性(圖6)。在 來自擬南芥的PRR基因家族之外，BvPRR7還與谷類植物中的PRR7同系物共享強同源性，如 圖7所示系統發生樹所圖示的。谷類植物中的PRR7同系物(更多地稱作Ppd)顯示出呈現 光周期應答的重大決定子(Turner等，2005 ；Beales等，2007)。尚未證明在糖用甜菜中春 化應答中的作用。基于它們與已知開花時間控制基因的同源性或根據調控蛋白代表性的保守結構 域的存在推導出的調控功能，可以將少數基因鑒定為B基因的潛在候選者。這些基因需要 通過一年生與二年生基因型之間的等位基因變異性和/或基因表達研究或借助使用轉基 因辦法進行的互補或敲除實驗來進一步驗證。由B基因賦予的一年生植物習性表現為單 一顯性性狀；因而二年生植物中對春化的要求是隱性的。如此，將BvPRR7的一年生等位 基因轉化入二年生基因型預測將一年生開花行為賦予二年生受體基因型。為了驗證此假25說，將在一年生啟動子和終止子片段控制下的BvPRR7的一年生等位基因的編碼序列轉化 入二年生基因型，諸如例如G018(參見實施例2)。轉化可通過本領域已知方法來實現，諸 如Chang等，2002所記載的，使用糖用甜菜分生組織作為外植體材料并使用磷酸甘露糖異 構酶(PMI)基因作為選擇標志。對轉基因枝條檢查選擇標志的表達，諸如例如PMI活性 (Joersbo等，1998)，隨后生根，在土壤中盆載并轉移至溫室。陰性對照由接受相同體外再生 規程但不進行土壤桿菌感染和選擇的非轉基因枝條組成。在生長室中種植植物，恒溫18°C， 光周期17小時光照和7小時暗。在這些條件(沒有通過應用冷溫度來誘導抽苔)下，非轉 基因二年生對照在多至12周的觀察期內不顯示任何抽苔跡象，而一年生對照植株通常在6 至8周內開始抽苔。與非轉基因二年生對照植株相反，實質性數目的轉基因植株在4-10周 內開始抽苔，而且基本上表現為一年生植物，盡管它們具有二年生遺傳背景。將抽苔并開花 的轉基因植株與二年生保持系交叉授粉以生成后代。對后代植株測試PMI活性，隨后在沒 有春化的情況中監測抽苔和開花。這些后代植物顯示1對1的分離比及PMI活性與一年生 習性之間的完全相關。這些數據證實糖用甜菜中BvPRR7與不依賴春化的開花之間的因果 關系。本發明人進一步發現了 BvPRR7在糖用甜菜的春化響應中起關鍵的作用，并且如 此可以用于通過抑制春化響應來將抽苔抗性工程化改造入糖用甜菜植物中。在本發明的一 方面，如此，可以在用于生成轉基因糖用甜菜植物的轉基因方法中使用BvPRR7基因，所述 轉基因糖用甜菜植物包含穩定地整合入糖用甜菜基因組中的所述多核苷酸。具體地，自基 因組表達后，可以使用表達產物來調控糖用甜菜植物的春化響應，其通過抑制或下調B基 因的表達來實現。將感興趣的DNA序列裝配入嵌合構建體中，所述嵌合構建體含有要在植物中運行 的調節元件控制下的轉基因植物中表達的核酸序列。用于裝配此類嵌合構建體的方法是本 領域技術人員公知的。在合適的植物組織中獲得足夠水平的轉基因表達是遺傳工程作物生產的一個重 要方面。異源DNA序列在植物宿主中的表達依賴于在所述植物宿主中有功能的可操作連接 的啟動子的存在。啟動子序列的選擇會決定何時和何處在生物體內表達所述異源DNA序 列。例如，可以采用會指導所述基因在再生植物的所有組織中表達的植物啟動子片 段。此類啟動子在本文中稱作“組成性”啟動子，而且在大多數環境條件和發育或細胞分 化狀態下是有活性的。組成型啟動子的例子包括花椰菜花葉病毒(CaMV) 35S轉錄起始區、 自根癌土壤桿菌T-DNA衍生的1’ -或2’ -啟動子、和來自技術人員知道的各種植物基因 的其它轉錄起始區。此類基因包括例如AP2基因、來自擬南芥的ACTll (Huang等Plant Mol. Biol. 33 125-139 (1996))、來自擬南芥的 Cat3 (GenBank No. U43147 ；Zhong 等，Mol. Gen. Genet. 251 :196-203(1996))、來自歐洲油菜(Brassica napus)的編碼硬脂酰-酰 基載體蛋白去飽和酶的基因(Genbank No. X74782 ;Solocombe 等 Plant Physiol. 104 1167-1176 (1994))、來自玉米的 GPcl (GenBank No. X15596 ；Martinez 等 J. Mol. Biol 208 551-565(1989))、和來自玉米的 Gpc2 (GenBank No. U45855 ；Manjunath 等，Plant Mol. Biol. 33 :97-112(1997))。或者，植物啟動子可以在特定組織中，或者可以以其它方式在更精確的環境或發育控制下指導本發明核酸分子的表達。可通過誘導型啟動子影響轉錄的環境條件的例子包 括厭氧條件、升高的溫度、或光照的存在。此類啟動子在本文中稱作“誘導型”或“組織特異 性”啟動子。技術人員會認識到，組織特異性啟動子可以在靶組織以外的組織中驅動可操作 連接的序列的表達。如此，如本文中所使用的，組織特異性啟動子指優先在靶組織中驅動表 達，但也可以在其它組織中導致一些表達的啟動子。在發育控制下的啟動子的例子包括只(或主要只)在某些組織(諸如果實、種子、 或花)中啟動轉錄的啟動子。在胚珠、花或種子中驅動核酸表達的啟動子是本發明中特別 有用的。如本文中所使用的，種子特異性或優先性啟動子指特異性地或優先在種子組織中 指導表達的啟動子，此類啟動子可以是例如胚珠特異性的、胚特異性的、胚乳特異性的、珠 被特異性的、種皮特異性的、或其組合。例子包括來自胚珠特異性BELl基因的啟動子，記載 于 Reiser 等 Cell 83:735-742(1995) (GenBank No. U39944)。其它合適的種子特異性啟動 子衍生自下列基因來自玉米的MACl (Sheridan等Genetics 142 1009-1020 (1996))、來 自玉米的 Cat3 (GenBank No. L05934 ；Abler 等 Plant Mol. Biol. 22 10131-1038 (1993))、 來自玉米的編碼油質蛋白18kD的基因(GenBank No. J05212 ;Lee等Plant Mol. Biol. 26 1981-1987(1994))、來自擬南芥的 vivparous-1 (Genbank No. U93215)、來自擬南芥的編 碼油質蛋白的基因(Genbank No. Z17657)、來自擬南芥的Atmycl (Urao等Plant Mol. Biol. 32 :571-576(1996))、來自擬南芥的2s種子貯藏蛋白基因家族(Conceicao等Plant 5 :493-505(1994))、來自歐洲油菜的編碼油質蛋白20kD的基因(GenBankNo. M63985)、來 自歐洲油菜的 napA(GenBank No. J02798 Josefsson 等 JBL26 :12196-1301 (1987))、來自 歐洲油菜的油菜籽蛋白基因(Sjodahl等Planta197 :264-271 (1995))、來自歐洲油菜的編 碼2S貯藏蛋白的基因(Dasgupta等Gene 133 :301-302 (199 )、來自大豆的編碼油質蛋白 A (Genbank No. U09118)和油質蛋白B (Genbank No.U09119)的基因、及來自大豆的編碼低分 子量硫富含蛋白的基因(Choi 等 Mol Gen. Genet. 246 :266-268(1995))。或者，可以鑒定提供具有期望表達特征的啟動子或具有表達增強活性的啟動子的 具體序列，而且可以經由突變將這些序列或相似序列引入序列中。進一步考慮可以誘變這 些序列以增強它們轉基因在特定物種中的表達。此外，組合來自超過一種啟動子的元件的啟動子也是有用的。例如，美國專利 No. 5，491，288披露了組合花椰菜花葉病毒(CaMV)啟動子與組蛋白啟動子。如此，可以將來 自本文中所公開的啟動子的元件與來自其它啟動子的元件組合。多種5’和3’轉錄調控序列可用于本發明。轉錄終止子負責轉錄終止和正確的 mRNA聚腺苷酸化。3’非翻譯調控DNA序列優選包括約50個至約1，000個、更優選約100 個至約1，000個核苷酸堿基對，而且含有植物轉錄和翻譯終止序列。適宜的轉錄終止子和 已知在植物中有功能的轉錄終止子包括CaMV35S終止子、tml終止子、胭脂堿合酶終止子、 豌豆rbcS E9終止子、來自根癌土壤桿菌章魚堿合酶基因的T7轉錄物的終止子、和來自馬 鈴薯或番茄的蛋白酶抑制劑I或II基因的3’末端，但是也可以采用技術人員知道的其它 3’元件。或者，也可以使用伽馬coixin、油質蛋白3或來自薏苡屬(Coix)的其它終止子。優選的3’元件包括來自根癌土壤桿菌胭脂堿合酶基因的3’元件(Bevan等， 1983)、來自根癌土壤桿菌章魚堿合酶基因的T7轉錄物的終止子、和來自馬鈴薯或番茄的 蛋白酶抑制劑I或II基因的3’末端。
由于轉錄起始位點與編碼序列起點之間的DNA序列(即不翻譯的前導序列)能影 響基因表達，所以也可能希望采用特定的前導序列。優選的前導序列包括包含預測指導所 附著基因最佳表達的前導序列，即包括可提高或維持mRNA穩定性和防止不當翻譯起始的 優選共有前導序列。本領域技術人員根據本公開內容會知道此類序列的選擇。自在植物中 高表達的基因衍生的序列會是最優選的。已經發現在轉基因植物中增強基因表達的其它序列包括內含子序列(例如來自 AdhU bronzel、肌動蛋白1、肌動蛋白2 (TO 00/760067)、或蔗糖合酶內含子的)和病毒前 導序列(例如來自TMV、MCMV和AMV的)。例如，已知自病毒衍生的許多非翻譯前導序列增 強表達。具體而言，來自煙草花葉病毒(TMV)、玉米褪綠斑點病毒(MCMV)、和苜蓿花葉病毒 (AMV)的前導序列已經顯示了在增強表達方面是有效的(例如feillie等，1987 ;SkuZeski 等，1990)。本領域已知的其它前導包括但不限于小RNA病毒前導，例如EMCV前導(腦心 肌炎5非編碼區MElroy-Stein等，1989)；馬鈴薯Y病毒前導，例如TEV前導(煙草蝕紋病 毒)；MDMV前導(玉米矮縮花葉病毒)；人免疫球蛋白重鏈結合蛋白(BiP)前導(Macejak 等，1991)；來自苜蓿花葉病毒外殼蛋白mRNA(AMV RNA4)的非翻譯前導(Jobling等，1987)、 煙草花葉前導(TMV) (Gallie等，1989)；和玉米褪綠斑點(chlorotic mottle)病毒前導 (MCMV) (Lommel 等，1991)。還可參見 Della-Cioppa 等，1987。在期望時，可進一步包括諸如Adh內含子KCallis等，1987)、蔗糖合酶內含子 (Vasil等，1989)或TMV Ω元件(Gallie等，1989)等調控元件。增強子的例子包括來自CaMV 35S啟動子、章魚堿合酶基因(Ellis等，1987)、稻肌 動蛋白I基因、玉米醇脫氫酶基因(Callis等，1987)、玉米皺縮I基因(Vasil等，1989)、 TMV Ω元件(feillie等，1989)和來自非植物真核生物的啟動子(例如酵母；Ma等，1988)的 元件。一種用于控制表達的主要方法是表達不足。為了表達不足，有兩種主要方法，它們 在本領域中常常稱作“反義下調”和“有義下調”(有義下調也稱作“共抑制”)。一般而言， 這些過程稱作“基因沉默”。這兩種方法都導致對靶基因表達的抑制。本發明包含用于降低本發明核酸分子的表達、量、活性和/或功能的多種策略。熟 練技術人員領會如下實情，即許多不同方法是可用的，以便以想要的方式影響本發明核酸 分子的表達、量、活性和/或功能。可以提及但不是限制性的例子是“有義”抑制本發明核苷酸序列表達的改變(優選是其表達的降低)是通過“有義”抑制得到 的(參見例如 Jorgensen 等(1996)Plant Mol. Biol. 31，957-973)。在這種情況中，在 DNA 分子中包含整個或部分的本發明核苷酸序列。所述DNA分子優選是可操作連接至在包含靶 基因的細胞(優選植物細胞)中有功能的啟動子的，并被導入該核苷酸序列在其中可表達 的所述細胞中。將所述核苷酸序列以“有義取向，，插入所述DNA分子中，這意味著所述核苷 酸序列的編碼鏈能轉錄。在一個優選的實施方案中，所述核苷酸序列是完全可轉錄的，而且 所述核苷酸序列中包含的所有遺傳信息或其一部分翻譯成多肽。在另一個優選的實施方案 中，所述核苷酸序列是部分可翻譯的，而且一種短肽得到翻譯。在一個優選的實施方案中， 這是通過在所述核苷酸序列中插入至少一個提前終止密碼子而實現的，這使得翻譯停止。 在另一個更加優選的實施方案中，所述核苷酸序列得到轉錄，但是沒有生成翻譯產物。這通常是通過消除由核苷酸序列編碼的多肽的起始密碼子(例如“ATG”)而實現的。在另一個 優選的實施方案中，包含所述核苷酸序列的DNA分子或其一部分在植物細胞的基因組中穩 定整合。在另一個優選的實施方案中，包含所述核苷酸序列的DNA分子或其一部分包含在 染色體外復制分子中。在包含上文剛剛所述DNA分子之一的轉基因植物中，與所述DNA分子中包含的核 苷酸序列對應的核苷酸序列的表達優選是降低的。優選的是，所述DNA分子中的核苷酸序 列與表達得到降低的核苷酸序列至少80%相同，更優選的是，它是至少90%相同的、仍更 優選至少95 %相同的、且最優選至少99 %相同的。“反義”抑制在另一個優選的實施方案中，本發明核苷酸序列表達的改變(優選是其表達的降 低)是通過“反義”抑制得到的。在DNA分子中包含整個或部分的本發明核苷酸序列。所 述DNA分子優選是可操作連接至在植物細胞中有功能的啟動子的，并被導入該核苷酸序列 在其中可表達的植物細胞中。將所述核苷酸序列以“反義取向”插入所述DNA分子中，這意 味著所述核苷酸序列的反向互補序列(有時也稱作非編碼鏈)能轉錄。在一個優選的實 施方案中，包含所述核苷酸序列的DNA分子或其一部分在植物細胞的基因組中穩定整合。 在另一個優選的實施方案中，包含所述核苷酸序列的DNA分子或其一部分包含在染色體復 制分子中。為了進一步說明，引用數份描述這種辦法的出版物(Green，P.J.等，Ann. Rev. Biochem. 55 :569-597 (1986) ；van der Kro1, A. R.等，Antisense Nuc. Acids&Proteins,第 I25 頁-第 141 頁(1"1) ；Abel,P. P.等，Proc. Natl. Acad. ki. USA 86 :6949-6952(1989)； Ecker, J. R.等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 :5372-5376 (Aug. 1986))。在包含上文剛剛所述DNA分子之一的轉基因植物中，與所述DNA分子中包含的核 苷酸序列對應的核苷酸序列的表達優選是降低的。優選的是，所述DNA分子中的核苷酸序 列與表達得到降低的核苷酸序列至少80%相同，更優選的是，它是至少90%相同的、仍更 優選至少95 %相同的、且最優選至少99 %相同的。同源重組在另一個優選的實施方案中，至少一個與本發明核苷酸序列對應的基因組 拷貝通過同源重組在植物的基因組中得到修飾，如I^aszkowski等，EMBOJournal 7 4021-26(1988)進一步說明的。這種技術利用同源序列通過本領域稱作同源重組的過程來 彼此識別和相互之間交換核苷酸序列的特性。同源重組可以在細胞中核苷酸序列的染色體 拷貝與通過轉化導入細胞中的核苷酸序列的引入拷貝之間發生。如此，在核苷酸序列的染 色體拷貝中精確地引入特定修飾。在一個實施方案中，本發明核苷酸序列的調控元件是經 過修飾的。此類調控元件易于通過使用本發明的核苷酸序列或其一部分作為探針篩選基因 組文庫來獲得。將現有的調控元件用不同的調控元件替換，如此改變核苷酸序列的表達，或 者將它們突變或缺失，如此消除核苷酸序列的表達。在另一個實施方案中，通過缺失核苷酸 序列的一部分或整個核苷酸序列或者通過突變來修飾核苷酸序列。本發明也涵蓋突變型 多肽在植物細胞中的表達。這種技術用于破壞內源植物基因的最新精化已有記載(Kempin 等，Nature389 :802-803(1997)及 Miao 和 Lam, Plant J.，7 :359-365(1995))。熟練技術人員知道如何以靶定的方式修飾基因組序列的許多可能的方法。這些 包括特別是如下的方法，諸如依靠靶向同源重組產生敲除突變體，例如通過產生終止密碼子來實現、讀碼框的移位等(Hohn B 和 Puchta H(1999)Proc Natl Acad Sci USA 96: 8321-8323)或依靠例如序列特異性重組酶或核酸酶來實現序列的靶向刪除或倒位。在另 一個優選的實施方案中，通過用由RNA連續區段與在末端具有雙重發夾帽的、雙鏈體構象 的DNA殘基構成的嵌合寡核苷酸轉化細胞，在核苷酸序列的染色體拷貝中引入突變。所述 寡核苷酸的另一項特征是例如在RNA殘基處存在2’-0_甲基化。所述RNA/DNA序列設計成 與本發明核苷酸序列的染色體拷貝排列且含有期望的核苷酸變化。例如，此技術進一步記 載于美國專利 5，501, 967 及 Zhu 等(1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 :8768_8773。核酶在另一個實施方案中，編碼本發明多肽的RNA受到對此類RNA特異性的催化性 RNA或核酶的切割。在轉基因植物中表達所述核酶，導致所述植物細胞中編碼本發明多肽 的RNA的量降低，如此導致所述細胞中積累的多肽的量降低。此方法進一步記載于美國專 利 4，987，071。顯性負突變體在另一個優選的實施方案中，改變了由本發明核苷酸序列編碼的多肽的活性。這 是通過在轉基因植物中表達所述蛋白質的顯性負突變體而實現的，導致內源蛋白質的活性 損失。適體在另一個實施方案中，通過在轉基因植物中表達特異性結合蛋白質的稱作適體的 核酸配體，抑制了本發明多肽的活性。適體優選通過SELEX(通過指數富集進行的配體系統 進化)方法來獲得。在SELEX法中，使具有隨機化序列區域的單鏈核酸的候選混合物與蛋 白質接觸，并將那些具有升高的對靶物的親和力的核酸與候選混合物的剩余物分開。擴增 分隔出來的核酸以生成配體富集混合物。數次重復后，得到了具有最佳的對多肽的親和力 的核酸，并用于在轉基因植物中表達。此方法進一步記載于美國專利5，270，163。鋅指蛋白還使用結合本發明核苷酸序列或其調控區的鋅指蛋白來改變所述核苷酸序列的 表達。優選的是，所述核苷酸序列的表達得到降低或提高。鋅指蛋白記載于例如Beerli等 (1998) PNAS 95 :14628-14633 ；WO 95/19431 ;W098/54311 ；或 WO 96/06166，通過述及將它 們都完整收入本文。dsRNA通過dsRNA干擾(RNAi)也獲得本發明核苷酸序列的表達變化。已經多次對動物和 植物生物體描述了依靠雙鏈RNA(“雙鏈RNA干擾”;dsRNAi)的基因調節方法(例如Matzke M A 等 U000)Plant Mol Biol 43 :401-415 ；Fire Α.等(1998)Nature 391:806-811; WO 99/32619 ；WO 99/53050 ；WO 00/68374 ；W000/44914；WO 00/44895 ；WO 00/49035 ；WO 00/63364，通過提及而將它們都完整收入本文)。在此明確提及指明的參考文獻中所描 述的過程和方法。dsRNAi方法基于如下現象，即同時導入基因轉錄物的互補鏈和輪廓鏈 (contour strand)以高度有效的方式抑制相應基因的表達。優選地，所引起的表型與相 應的敲除突變體的表型非常相似(ffaterhouse P M等(1998) ProcNatl Acad Sci USA 95 13959-64)。dsRNAi方法在降低標志物蛋白質表達上已經證明為特別有效且有利的。雙鏈RNA(dsRNA)分子在本發明范圍內優選地意指一種或多種核糖核酸序列，其30由于互補序列而在理論上(例如依照Watson和Crick的堿基對規則)和/或實際上(例如 由于體外和/或體內雜交實驗)能夠形成雙鏈RNA結構。雙鏈技術人員知道如下的實情， 即雙鏈RNA結構的形成代表平衡狀態。優選地，雙鏈分子與相應的解離形式的比率是至少 1比10，優選1 1，特別優選5 1，最優選10 1。本發明進一步涉及雙鏈RNA分子，其在導入植物生物體中(或導入自其衍生的細 胞、組織、器官或增殖材料中)時引起至少一種靶基因的表達降低。優選地，本文的用于降 低靶基因的表達的雙鏈RNA分子包含a) “有義” RNA鏈，其包含與靶基因的“有義” RNA轉 錄物的至少一部分基本上相同的至少一種核糖核苷酸序列，和b) “反義”RNA鏈，其在a)下 與RNA有義鏈基本上，優選完全互補。“基本上相同的”意指dsRNA序列與靶基因序列相比還可以具有插入、缺失而且還 有個別的點突變，然而引起表達的有效降低。抑制性dsRNA的“有義”鏈與靶基因核酸序列 的“有義” RNA轉錄物的至少一個部分之間(或靶基因的核酸序列的互補鏈的“反義”鏈之 間)的同源性(如下文中所定義的)優選是至少75%、優選至少80%、非常特別優選至少 90%、最優選100%。dsRNA與標志物蛋白質基因轉錄物之間的100%序列同一性為了引起靶基因表達 的有效降低不是絕對必要的。因此，該方法對于可由于遺傳突變、多態性或進化趨異而存在 的序列偏差是有利地耐受的。如此，有可能例如使用已經生成的自第一生物體的靶基因的 序列開始的dsRNA來抑制第二生物體中的靶基因表達。出于此目的，dsRNA優選地包括靶 基因轉錄物中與保守區對應的序列區域。所述保守區可以容易地源自序列比較。或者，“基本上相同的” dsRNA還可以定義為能夠與靶基因轉錄物的一部分雜交的 核酸序列。“基本上互補的”意指“反義” RNA鏈與此“有義” RNA鏈的互補物相比還可以具有 插入、缺失而且還有個別的點突變。“反義” RNA鏈與“有義” RNA鏈的互補物之間的同源性 優選是至少80 %，優選至少90 %，非常特別優選至少95 %，最優選100 %。靶基因核酸序列的““有義”RNA轉錄物的一部分”意指自靶基因核酸序列轉錄或可 轉錄的RNA或mRNA的片段。在此上下文中，片段具有優選地至少20個堿基、優選地至少50 個堿基、特別優選地至少100個堿基、非常特別優選地至少200個堿基、最優選地至少500 個堿基的序列長度。還包括完全可轉錄的RNA或mRNA。還包括如下的序列，諸如可以在人 工條件下自靶基因區域轉錄的那些序列，所述靶基因區域在其它情況中在天然條件下不轉 錄，諸如例如啟動子區域。dsRNA可以由一條或多條多核糖核苷酸鏈組成。天然地，為了實現相同的目的，還 有可能將多種在每種情況中包含上文定義的核糖核苷酸序列部分之一的個別dsRNA分子 導入細胞或生物體中。可以自兩個互補的、分開的RNA鏈開始或者優選地自單一、自身互補 的RNA鏈開始來形成雙鏈dsRNA結構。在此情況中，“有義” RNA鏈和“反義” RNA鏈優選以 反向“重復”形式彼此共價連接。如WO 99/53050中所描述的，例如，dsRNA還可以包含發夾結構，其通過由連接序 列(“接頭”;例如內含子)連接“有義”和“反義”鏈來得到。將優選給予自身互補的dsRNA 結構，因為它們僅需要RNA序列的表達，而且總是包含等摩爾比率的互補RNA鏈。優選地， 連接序列可以是內含子(例如馬鈴薯ST-LSl基因的內含子；Vancarmeyt G F等(1990)MolGen Genet220(2) :245-250)。編碼dsRNA的核酸序列可以包括別的元件，諸如例如轉錄終止信號或多聚腺苷酸化信號。舉例而言，可以以下列方式實現在細胞或植物中聚集(若想要的話)dsRNA的兩條 鏈a)用包含兩種表達盒的載體轉化細胞或植物，b)用兩種載體共轉化細胞或植物，所述 載體之一包含含有“有義”鏈的表達盒，而所述載體的另一種包含含有“反義”鏈的表達盒。 可以在細胞外部或內部啟動RNA雙鏈體的形成。可以在體內或在體外合成dsRNA。出于此目的，可以將編碼dsRNA的DNA序列插 入至少一種遺傳控制元件(諸如例如啟動子)控制下的表達盒中。多聚腺苷酸化不是必需 的，并且也不需要存在的任何用于啟動翻譯的元件。將優選給予靶向靶基因的dsRNA的表 達盒，其存在于轉化構建體或轉化載體上。出于此目的，優選地，將編碼靶向靶基因的dsRNA 的“反義”鏈和/或“有義”鏈或dsRNA的自身互補鏈的表達盒插入轉化載體中，并通過使用 下文所描述的方法來導入植物細胞中。穩定插入基因組中對本發明的方法可以是有利的， 但是不是絕對必要的。因為dsRNA引起長期效果，所以瞬時表達在許多情況中也是足夠的。 dsRNA也可以是要通過核酸序列表達的RNA的一部分，所述核酸序列要通過將其融合例如 至所述RNA的3’ -非翻譯部分來插入。可以以使每個細胞至少一個拷貝成為可能的量導入dsRNA。若合適的話，較高的量 (例如每個細胞至少5、10、100、500或1000個拷貝)可以引起更有效的降低。對于RNAi抑制BvPRR7，本發明人已經將cDNA片段諸如例如SEQ ID NO 1中所描 述的0. 6Kb片段裝配成組成型啟動子控制下的RNAi盒(參見實施例幻。合適的組成型啟 動子是例如，來自擬南芥的啟動子(Norris等，1993)、CaMV 35S啟動子、或任何其它 已知在糖用甜菜中促進組成性表達的啟動子。表達盒進一步含有合適啟動子控制下的選 擇標志基因。具體地，標志物基因編碼正向選擇標志物諸如磷酸甘露糖異構酶或木糖異構 酶。BvPRR7片段的反向重復由來自馬鈴薯MLSl基因的第二內含子分開(Eckes等，1986 ； Vancanneyt等，1990)以穩定化RNAi盒，而且還改善RNAi現象的效率(Wang和Waterhouse， 2001 ；Smith 等，2000)。DNA分子的插入(插入誘變)在另一個優選的實施方案中，將DNA分子插入本發明核苷酸序列的染色體拷貝或 其調節區中。優選地，此類DNA分子包含能夠在植物細胞中轉座的可轉座元件，諸如例如 Ac/Ds、Em/Spm、突變基因(mutator)。或者，所述DNA分子包含土壤桿菌T-DNA的T-DNA邊 界。所述DNA分子也可包含重組酶或整合酶識別位點，其可用于自植物細胞的染色體消除 所述DNA分子的一部分。還涵蓋使用T-DNA、轉座子、寡核苷酸或本領域技術人員知道的其 它方法進行的插入誘變方法。使用T-DNA和轉座子進行插入誘變的方法記載于Winkler 等(1989)Methods Mol. Biol. 82 129-136 及 Martienssen(1998)PNAS95 :2021-2026, 通過述及將它們完整收入本文。別的合適的方法是將無義突變導入內源靶基因中，例 如依靠將RNA/DNA寡核苷酸導入植物中來進行(zhu等Q000)Nat Biotechnol 18(5) 555-558)。也可以依靠DNA-RNA雜合物來產生點突變，所述DNA-RNA雜合物也稱為“嵌合 修復術(chimeraplasty) ”(Cole-Strauss 等(1999) Nucl Acids Res 27(5) :1323-1330 ； Kmiec(1999)Genetherapy American Scientist 87(3) :240_247)。32
缺失誘變在又一個實施方案中，本發明核酸分子的突變是在細胞或植物中的所述序列的基 因組拷貝中創建的，其通過缺失所述核苷酸序列或調節序列來實現。缺失誘變的方法是本 領域技術人員知道的。參見例如Miao等，(1995)PlantJ. 7 :359。也可以通過靶基因中的靶 向缺失來降低靶基因表達的活性或量，例如通過在識別序列處序列特異性誘導DNA雙鏈斷 裂以在靶基因核酸序列中或接近靶基因核酸序列處特異性誘導DNA雙鏈斷裂來實現。在又一個實施方案中，此缺失是在一大群植物中隨機創建的，其通過化學誘變或 輻射來實現，并且通過正向或反向遺傳學分離在本發明基因中具有缺失的植物。已知用快 中子或伽馬射線進行的輻射引起植物中的缺失突變(Silverstone等，(1998)Plant Cell, 10 :155-169 ；Bruggemann 等，(1996) Plant J. , 10 :755-760 ；Redei 禾口 Koncz，于 Methods in Arabidopsis Research, WorldScientific Press (1992)，第 16 頁-第 82 頁)。可以使用 PCR及基因組DNA合并集合在反向遺傳學策略中回收本發明基因中的缺失突變，正如在秀 麗線蟲(C. elegans)中所顯示的(Liu 等，(1999)，Genome Research，9 :859-867)。正向遺 傳學策略會涉及誘變顯示PTGS的系，接著對M2后代篩選PTGS的缺失。在這些突變體中會 預期有些突變體破壞了本發明的基因。這可通過使用來自這些突變體的基因組DNA進行的 本發明基因的Southern印跡或PCR來評估。在又一個實施方案中，在植物的每個細胞中改變本發明核苷酸序列的表達。這是 例如經由同源重組或通過染色體中的插入而得到的。這也是例如通過在能夠在植物的每一 個細胞中表達有義或反義RNA、鋅指蛋白或核酶的啟動子控制下表達有義或反義RNA、鋅指 蛋白或核酶而得到的。依照本發明的教導，例如如下所述，制備用于表達有義或反義RNA、鋅 指蛋白或核酶或用于過表達本發明核苷酸序列的構建體，并轉化入植物細胞中。組合應用也是想得到的。別的方法對于熟練技術人員是已知的，并且可以包括阻 止或停止靶基因的加工、由靶基因編碼的蛋白質或其mRNA的轉運、對核糖體附著的抑制、 對RNA剪接的抑制、降解靶基因RNA的酶的誘導和/或對翻譯延長或終止的抑制。因此，本發明還提供了與序列表的SEQ ID NO :1、4、5、6、7、8、9、10、53、或M中所 列序列對應的有義和反義核酸分子及其直向同系物。可以將與編碼SEQ ID NO :6所示多肽的核苷酸基本上相似的依照本發明的基因 和可讀框(包括任何相應的反義構建體)可操作連接至在植物宿主內有功能的任何啟動子 (包括依照本發明的啟動子序列或其突變體)。一旦完成，可以將包含表達盒或RNAi盒的本發明多核苷酸構建體動員入對于植 物轉化而言合適的載體(諸如例如二元載體)中，然后可以使用公知的轉化技術之一(諸 如例如土壤桿菌介導的轉化)將其動員至糖用甜菜。可以通過多種完全確立的技術來生成摻有且表達本發明核酸序列或dsRNA的轉 基因植物(或植物細胞或植物外植體或植物組織)。構建包含摻有依照本發明的和如本文 所述的核酸序列的表達盒或RNAi盒的本發明嵌合構建體后，可使用標準技術將該嵌合構 建體導入感興趣植物、植物細胞、植物外植體或植物組織。任選的是，可以再生植物細胞、網 狀物或組織以再生轉基因植物。所述植物可以是任何高等植物，包括裸子植物、單子葉植物 和雙子葉植物。合適的方案是可得的。對于豆科(Leguminosae)(苜蓿、大豆、三葉草、等)、 傘形科(Umbelliferae)(胡蘿卜、芹菜、歐洲防風)、十字花科(Cruciferae)(卷心菜、蘿卜、油菜籽、嫩莖花椰菜、等)、葫蘆科(Curcurbitaceae)(甜瓜和黃瓜)、禾本科(Gramineae) (小麥、玉米、稻、大麥、粟、等)、茄科(Solanaceae)(馬鈴薯、番茄、煙草、胡椒、等)、及各 種其它農作物。參見 Ammirato 等，編，(1984)Handbook of Plant Cell Culture—Crop Species,Macmillan Publ. Co.，New York,N. Y. ；Siimamoto 等(1989)Nature 338 :274276 ； Fromm等(1990)Bio/technol. 8 :833839 ；及 Vasil 等(1990)Bio/technol. 8 :429434 中記載 的方案。單子葉植物和雙子葉植物二者細胞的轉化和再生現在是常規的，而且從業人員會 確定最適宜的轉化技術的選擇。方法的選擇會隨要轉化的植物的類型而變化；本領域技術 人員會認識到特定方法對于指定植物類型的合適性。合適的方法可包括但不限于植物原 生質體的電穿孔；脂質體介導的轉化；聚乙二醇(PEG)介導的轉化；使用病毒進行的轉化； 植物細胞的顯微注射；植物細胞的微彈轟擊；真空滲透；和根癌土壤桿菌介導的轉化。植物轉化可以用單一 DNA分子或多種DNA分子(即共轉化)進行，而且這兩種技 術都適合于與本發明的嵌合構建體一起使用。用于植物轉化的許多轉化載體是可得的，而 且本發明的表達盒可以與任何此類載體一起使用。載體的選擇會取決于優選的轉化技術和 要轉化的靶物種。用于將構建體導入植物細胞宿主中的多種技術是可得的且本領域技術人員已知 的。這些技術一般包括采用根癌土壤桿菌或發根土壤桿菌作為轉化劑、脂質體、PEG沉淀、 電穿孔、DNA注射、直接DNA攝取、微彈轟擊、微粒加速、諸如此類進行的DNA轉化(參見例 如EP四5959和EP 138341)(見下文)。然而，可以用本發明的多核苷酸構建體轉化植物細 胞以外的細胞。關于植物表達載體和報告基因及土壤桿菌屬和土壤桿菌介導的基因轉移的 一般描述可見于Gruber等(1993)。可以將含有依照本發明的核酸序列的表達載體導入原生質體或完整的組織或分 離的細胞中。優選的是，將表達載體導入完整的組織中。培養植物組織的通用方法見于例 如Maki等，(1993)；及Wiillips等(1988)。優選的是，使用直接基因轉移方法將表達載體 導入玉米或其它植物組織中，諸如微彈介導的投遞、DNA注射、電穿孔等等。更優選的是，用 彈道裝置使用微彈介導的投遞將表達載體導入植物組織中。參見例如Tomes等(19%)。本 發明的載體不僅可用于結構基因的表達，而且可用于外顯子-捕獲克隆或啟動子捕獲規程 以檢測各種組織中的差異基因表達(Lindsey等，1993 ；Auch和Reth等)。特別優選使用土壤桿菌的二元型載體Ti和Ri質粒。Ti衍生載體轉化廣泛的 高等植物，包括單子葉植物和雙子葉植物，諸如大豆、棉、油菜、煙草、和稻(Pacciotti等， 1985 ；Byrne 等，1987 ；Sukhapinda 等，1987 ；Lorz 等，1985 ；Potrykus, 1985 ；Park 等，1985 ； Hiei等，1994)。T-DNA用于轉化植物細胞的用途得到了廣泛研究和詳細描述(EP 120516 ； Hoekema, 1985 ；Knauf等-，1983 ；及An等，1985)。為了導入植物中，可以將本發明的嵌合構 建體插入二元載體中，如實施例中所描述的。本領域技術人員會領會，方法的選擇可取決于要進行轉化的植物的類型，即單 子葉植物或雙子葉植物。合適的植物細胞轉化方法包括但不限于顯微注射(Crossway 等，1986)、電穿孔(Riggs等，1986)、土壤桿菌介導的轉化(Hinchee等，1988)、直接基因 轉移(Paszkowski等，1984)、和彈道微粒加速，其使用可自Agracetus, Inc. (Madison, Wis.)和BioRad (Hercules，Calif.)獲得的裝置進行(參見例如Sanford等，美國專利 No. 4，945，050 ；及 McCabe 等，1988)。還可參見 Weissinger 等，1988 ；Sanford 等，1987 (洋蔥)；Christou 等，1988(大豆)；McCabe 等，1988 (大豆)；Datta 等，1990 (稻)；Klein 等， 1988 (玉米)；Klein 等，1988 (玉米)；Klein 等，1988 (玉米)；Fromm 等，1990 (玉米)； 及 Gordon-Kamm 等，1990 (玉米)；Svab 等，1990 (煙草葉綠體)；Koziel 等，1993 (玉米)； Shimamoto等，1989(稻)；Christou等，1991 (稻)；歐洲專利申請EP 0332581 (鴨茅和其它 Pooideae) ；Vasil等，1993 (小麥)；Weeks等，1993 (小麥)。在一個實施方案中，采用用于 玉米的原生質體轉化方法(歐洲專利申請EP 0292435 ；美國專利No. 5，350，689)。本發明的主要焦點是糖用甜菜的轉化。用于轉化糖用甜菜的實驗規程是本領域技 術人員公知的，諸如使用糖用甜菜分生組織作為外植體材料的Chang等，2002所披露的或 如Joersbo等，1998所描述的。在一個優選的實施方案(如實施例3中所顯示的)中，可以將RNAi盒轉化入二年 生糖用甜菜基因型諸如例如G018中。對轉基因枝條檢查選擇標志的表達諸如例如PMI活 性(Joersbo等，1998)。使陽性枝條和非轉基因對照生根，并轉移至于18°C的溫室達兩周最 小值的馴化期，之后春化處理。一旦完善建立，將轉基因植物暴露于春化處理，其由于6°C恒 定溫度的14周期間和低人工光的12小時組成。在應用抽苔誘導性條件前，通過逐漸將溫 度從10提高至18°C來在氣候室中將春化的植物緩慢馴化2周。隨后，將植物移植入更大的 盆(2升)中，并監測抽苔，期間暴露于18°C的恒定溫度和17小時光/7小時黑暗的長日照 光周期。選出經轉化植物細胞或植物并種植至成熟后，鑒定那些顯示出感興趣性狀的植 物。所述性狀可以是任何上文所述那些性狀。另外，為了確認感興趣性狀是由于所導入的感 興趣核酸序列在依照本發明的調控性核苷酸控制下的表達，可使用Northern印跡、RT-PCR 或微陣列分析mRNA表達或使用免疫印跡或Western印跡或凝膠位移測定法分析蛋白質表 達，由此測定感興趣多肽或核酸序列的表達水平或活性。如此，本發明涉及植物細胞和組織、自此類細胞和組織衍生的植物、植物材料、自 此類植物衍生的后代和種子、及農業產品，包括可通過例如下文所述任一轉化方法得到的、 經過加工的植物產品。一旦將包含依照本發明核酸序列的依照本發明的和如本文所述的表達盒轉 化入特定植物物種中，可以使用傳統育種技術在該物種中繁殖或移入相同物種的其它 品種中，特別是包括商業性品種。本發明的優選植物包括裸子植物、單子葉植物、和 雙子葉植物，尤其是在農業上重要的農作物植物，諸如稻(rice)、小麥(wheat)、大麥 (barley)、黑麥(rye)、油菜(rape)、玉米(corn)、馬鈴薯(potato)、胡蘿卜(carrot)、甘 薯(sweet potato)、糖用舌甘菜(sugar beet)、菜豆(bean)、豌豆(pea)、菊苣(chicory)、 萵苣(lettuce)、甘藍(cabkige)、花椰菜(cauliflower)、嫩莖花椰菜(broccoli)、蕪菁 (turnip) ^ 卜(radish) 1 (spinach) ^ψτ (asparagus)(onion) >H (garlic) >子(eggplant)、胡椒(ρ 印 per)、序菜(celery)、胡蘿卜(carrot)、西葫聲(squash)、 南瓜(pumpkin)、夏南瓜(zucchini)、黃瓜(cucumber)、蘋果(apple)、梨(pear)、溫柏 (quince)、甜 jl (melon) 、ψ (plum) 、# Μ (cherry) 、Μ (peach)、油 Μ (nectarine)、胃 (apricot) > ^ (strawberry)、葡萄(grape)、覆盆子(raspberry) > 11 (blackberry) >(pineapple) ^； (avocado)(papaya)(mango) > (banana)(soybean)、煙草(tobacco)、番爺(tomato)、高梁(sorghum)禾口甘蔴(sugarcane)。35
工程化改造入上文所述轉基因植物中的遺傳特性通過有性生殖或營養生長而傳 遞，而且如此能在后代植物中維持和繁殖。一般而言，所述維持和繁殖利用開發用來適應特 定目的的已知農業方法，諸如耕耘、播種或收獲。也可以應用專用過程，諸如水培或溫室技 術。可進一步地在致力于開發具有改良特性(諸如對害蟲、除草劑、或壓力的耐受，改良的 營養價值，升高的產量，或引起倒伏或落粒損失減少的改良結構)的植物的植物育種中進 行依照本發明的轉基因植物的有利遺傳特性的使用。各種育種步驟的特征在于清楚限定的 人為干預，諸如選擇要雜交的系、指導親本系的授粉、或選擇適宜的后代植物。根據期望的 特性，采用不同的育種度量。相關技術是本領域公知的，包括但不限于雜交/近交/回交育 種、多系育種、品種混和(variety blend)、種間雜交、非整倍體技術、等。雜交技術還包括通 過機械、化學或生化手段進行的植物不育化，以生成雄性或雌性不育植物。不同系的花粉對 雄性不育植物的交叉授粉確保雄性不育而非雌性不育植物的基因組會一致地獲得這兩個 親本系的特性。如此，依照本發明的轉基因植物能用于改良植物系的育種，例如由于它們的 修飾遺傳特性而提高常規方法(諸如除草劑或殺蟲劑處理)的效率或容許免除所述方法。 或者，能得到具有改良壓力耐受的新農作物，即由于它們經過優化的遺傳“配備”，生成質量 比不能耐受相當的不利發育條件的產物要好的收獲產物。本領域技術人員會認可可以通過育種入包含不同轉基因或非轉基因基因型的其 它親本系(優選糖用甜菜植物系)中來基因滲入本發明的轉基因基因型。此不同轉基因或 非轉基因基因型可以是任何基因型，但是優選包含至少一種感興趣的性狀的基因型。例如， 可以將包含本發明轉基因基因型的糖用甜菜近交物與包含對已知感染糖用甜菜植物的不 同病毒有抗性的事件的轉基因基因型的糖用甜菜近交系雜交。所得的種子和后代植物會以 疊加形式具有延遲的抽苔的性狀和抗性性狀。例如，可以將具有本發明轉基因基因型的糖 用甜菜近交物與包含草甘膦抗性H7-1事件的轉基因基因型的糖用甜菜近交物(歐洲專利 申請EP-A1-1597373，通過提及而將其收入本文)雜交。所得的種子和后代植物具有抗性性 狀和延遲的抽苔的性狀兩者。也可以使用別的性狀，如除草劑抗性、疾病抗性或對病毒(即 如例如轉基因形式或來自常規來源(如冬青屬(Holly)或C48)的BNYVV的病毒或與BNYVV 不同的病毒)的抗性來與本發明的轉基因基因型疊加。會進一步認可的是，可以與本發明 的轉基因基因型進行其它組合或疊加，并且如此這些例子不應視為限制性的。本領域技術人員還會認可可以用各種種子處理化學品(包括各種殺蟲劑和殺昆 蟲劑)處理包含本發明轉基因基因型的轉基因糖用甜菜種子以進一步提升本發明的抗性。可以使用本領域公認的育種技術在任何糖用甜菜近交物或雜種中基因滲入本發 明的轉基因基因型。植物育種的目的是在單一品種或雜種中組合多種想要的性狀。對于大 田作物，這些性狀可以包括對昆蟲和疾病(例如衍生自常規的來源，包括但不限于冬青屬 和C48)的抗性、對除草劑的耐受性、對熱和干旱的耐受性、較大的產率、和較好的農藝學質 量。通過許多作物的機械收獲，植物特征諸如萌發和直根建立、生長率、成熟、和根大小的一 致性是重要的。在另一方面，本發明提供了一種用于生成雜種種子的方法，具有延遲抽苔的表型 的糖用甜菜植物來自所述雜種種子。所述方法包括(a)提供具有延遲抽苔的表型的糖用 甜菜系，特別地依照本發明的轉基因糖用甜菜植物作為第一親本系，(b)提供具有不同基因 型的第二糖用甜菜系作為第二親本系；(c)容許步驟(a)的第一親本系的植物和步驟(b)的第二親本系的植物彼此傳粉，讓所述種子形成，并收獲所述雜種種子；其中收獲的雜種種 子是具有延遲抽苔的表型的糖用甜菜雜種植物的種子。在此方面的一個實施方案中，步驟 (a)中所提供的第一親本系是包含本發明的一種或多種或所有多核苷酸的近交糖用甜菜 系。在此方面的一個別的實施方案中，所述第二親本系選自下組(a)對至少一種影響糖用 甜菜的病毒諸如例如甜菜壞死黃脈病毒有抗性的近交糖用甜菜植物系；(b)對至少一種除 草劑有抗性的近交糖用甜菜植物系；和(c)具有對至少一種疾病的抗性的近交糖用甜菜植 物系。影響糖用甜菜的常見病毒和疾病和針對這些病毒或疾病的抗性的來源的例子是本領 域技術人員已知的。此外，對糖用甜菜使用的除草劑和針對這些除草劑的抗性的來源也是 本領域技術人員已知的。已經自花傳粉并為許多世代選擇類型的植物在幾乎所有基因基因座處變為純合 的，而且產生真實育種后代的一致群體。兩種不同純合品系之間的雜交產生在許多基因基 因座上可以為雜合的雜種植物的一致群體。在許多基因基因座處各為雜合的兩種植物的雜 交會產生在遺傳上不同且不會是一致的雜種植物的群體。本領域中已知的且在糖用甜菜植物育種程序中使用的植物育種技術包括但不限 于輪回選擇、回交、譜系育種、限制性長度多態性增強的選擇、遺傳標志增強的選擇和轉化。 糖用甜菜植物育種程序中糖用甜菜雜種的開發一般需要純合近交系的開發、這些品系的雜 交、和評估所述雜交。使用譜系育種和輪回選擇育種方法來從育種群體開發近交系。糖用 甜菜植物育種程序將來自兩種或更多種近交系或多種其它種質來源的遺傳背景組合成育 種集合，通過自交和選擇想要的表型自所述育種集合開發新的近交系。將新的近交物與其 它近交系雜交，并評估來自這些雜交的雜種以測定那些中哪些具有商業潛力。如糖用甜菜 植物育種程序中實施的植物育種和雜種開發是昂貴且費時的方法。譜系育種以兩種基因型的雜交開始，所述基因型的每一種可以具有另一種中缺乏 的或互補另一種的一種或多種想要的特征。若兩種初始親本不提供所有想要的特征，則可 以將其它來源包括入育種種群中。在譜系方法中，在連續世代中對卓越植株進行自交并選 擇。在隨后的世代中，雜合條件由于自花傳粉和選擇而為同質系(homogeneous line)所代 替。通常，在育種的譜系方法中，實施5個或更多個世代的自交和選擇F1 — F2 ；F2 — F3 ； F3 — F4 ；F4 — F5 ；等等。可以使用輪回選擇育種(例如回交)來改善近交系和使用那些近交物生成的雜 種。可以使用回交來將特定的想要性狀從一種近交物或來源轉移至缺乏所述性狀的近交 物。這可以如下實現，即例如首先將卓越的近交物(輪回親本)與供體近交物(非輪回親 本)雜交，所述供體近交物攜帶適合于所討論性狀的基因。然后將此雜交的后代返回與卓 越的輪回親本配對，接著對所得的后代選擇要自非輪回親本轉移的想要性狀。通過選擇想 要性狀的5個或更多個回交世代后，后代會在控制所轉移的特征的基因座方面為純合的， 但是對于基本上所有其它基因會像卓越的親本。然后自交最后的回交世代以給出所轉移的 基因方面的純育種后代。自含有所轉移的基因的近交物開發的雜種與自沒有轉移基因的相 同近交物開發的雜交基本上相同。也可以使用良種近交系，即純育種、純合近交系作為用于育種的起始材料或來源 群體，自此開發其它近交系。可以使用較早所描述的譜系育種和輪回選擇育種方法來開發 自良種近交系衍生的這些近交系。作為一個例子，在使用回交育種來創建這些在糖用甜菜37植物育種程序中衍生的品系時，可以使用良種近交物作為親本系或起始材料或來源群體， 而且可以充當供體或輪回親本。單雜交雜種源自于兩種近交系的雜交，所述近交系之每一種具有互補另一種的基 因型的基因型。第一代的雜種后代稱作F1。在糖用甜菜植物育種程序中的商業雜種開發 中，僅尋求Fl雜種植物。優選的Fl雜種比其近交親本更茁壯(vigorous)。可以在許多多 基因性狀中顯示此雜種活力或雜合優勢，包括增加的營養生長和增加的產率。糖用甜菜植物育種程序中糖用甜菜雜種的開發牽涉三個步驟(1)從多種種質集 合選擇植物來進行初始育種雜交；( 自交自育種雜交選定的植物達數個世代以產生一系 列近交系，它們雖然彼此不同，但是準確育種而且是高度一致的；并(3)將選定的近交系與 不同近交系雜交以產生雜種后代(Fl)。糖用甜菜中的近交方法過程中，品系的活力降低。活 力在雜交兩種不同近交系以產生雜種后代(Fl)時恢復。近交系的純合性和同質性的重要 結果是限定近交物對之間的雜種總會是相同的。一旦已經鑒定出給出卓越雜種的近交物， 可以無限地繁殖雜種種子，只要近交親本的同質性得到維持。在雜交兩種近交系以產生Fl后代時產生單雜交雜種。自成對雜交的四種近交系 (AXB和CXD)產生雙雜交雜種，然后再次雜交兩種Fl雜種(AXB)X(CXD)。自三種近交系產 生三系雜交雜種，其中雜交所述近交系的兩種(AXB)，然后將所得的Fl雜種與第三近交系 雜交(AXB)XC。由Fl雜種展現出的大量雜種活力在下一世代(^)中喪失。因此，來自雜種 的種子不用于定植苗(planting stock)。在雜種種子生成中，消除或滅活雌性親本的花粉生成是優選的。不完全除去或滅 活花粉提供自花傳粉的潛力。可能無意收獲這種疏忽地自花傳粉的種子并與雜種種子包裝 在一起。一旦種植種子，有可能鑒定并選擇這些自花傳粉的植物。這些自花傳粉的植物會 在遺傳上相當于用于生成雜種的雌性近交系。典型地，這些自花傳粉的植物可以由于其降 低的活力而鑒定和選擇。雌性自交通過其在生長和/或生殖特征方面活力較小的外觀來鑒 定。也可以經由分子標志分析來實現這些自花傳粉的品系的鑒定。然而，存在簡單且有效的傳粉控制系統，其通過在商業雜種種子生產中排除自花 傳粉來確保利用雜種優勢。若親本之一是自交不親和的(Si)、細胞質雄性不育(CMQ或細 胞核雄性不育(匪幻植物，其不能自花傳粉或不能產生花粉，則只會發生雜交傳粉。通過消 除雜交中一個親本品種的花粉，植物育種人員確信獲得一致質量的雜種種子，只要親本是 一致質量的，并且育種人員進行單雜交。細胞質雄性不育(CMQ是母體遺傳現象，其遺傳決 定子位于細胞質細胞器，即線粒體的基因組中。此類植物在其產生功能性花粉粒的能力上 受到嚴重損害。CMS系統的恢復系基因是顯性核基因，其抑制細胞質的雄性不育效果。CMS 植物中雄性不育的表達是隱性核基因與雄性不育特異性胞質基因組之間的不相容性的結果。在一個優選的實施方案中，應用CMS系統以產生本發明的雜種糖用甜菜植物。在 此類系統中，使用雄性不育CMS系作為雌性親本，其由作為雄性親本使用的雄性能育系傳 粉。依照本發明的延遲抽苔的性狀可以存在于CMS雄性不育(雌性)親本系或雄性能育 (雄性)親本系或者甚至兩者中。優選地，在雄性不育側保持延遲抽苔的性狀以避免經由由 雄性親本脫落的含有該性狀的花粉引起的GM污染。如本領域技術人員容易顯而易見的，上文僅是那些期望將本發明的轉基因基因型基因滲入其它糖用甜菜系中的人可獲得本發明近交物的多種方式中的一些。其它手段是本 領域技術人員可獲得的和已知的，并且上述例子僅是例示性的。一般地，用于雜種生成的第二親本系也可以是具有延遲抽苔的表型的糖用甜菜 植物系，如例如本發明的糖用甜菜植物。優選地，用于生成雜種種子的第一親本系和第二 親本系基于遺傳上多種多樣的背景。遺傳距離可以通過使用分子標志測量，如例如記載于 Knaak(1996)的。然而，第二親本系也可以是糖用甜菜近交物，其包含感興趣的另一性狀，如 例如但不限于草甘膦抗性的(例如含有H7-1事件，如歐洲專利申請EP-A1-1597373中所描 述的，通過提及而將其收入本文)。所得的雜種種子會含有延遲的抽苔和除草劑草甘膦的 疊加性狀。第二親本系中還可以包含別的性狀，如除草劑抗性、疾病抗性或針對來自常規來 源(如冬青屬或C48)的BNYVV或與BNYVV不同的病毒的抗性以在雜種種子中與本發明的 轉基因基因型疊加。會進一步認可可以與本發明的轉基因基因型進行其它組合或疊加，并 且如此這些例子不應視為限制性的。本發明的另一個優選的實施方案涉及具有延遲抽苔的表型的糖用甜菜植物的雜 種種子。在本發明的一方面，所述雜種種子是通過本發明的用于生成具有延遲抽苔的表型 的糖用甜菜植物的糖用甜菜雜種種子的方法生成的。此類方法是本領域技術人員已知的。 在本發明的又一方面，提供了具有延遲抽苔的表型的雜種糖用甜菜植物，其是通過種植本 發明的雜種種子生成的。優選地，此雜種植物完全不抽苔，即顯示對春化響應的完全抑制。 本發明的進一步優選的實施方案涉及本發明所述雜種糖用甜菜植物的一部分。優選地，所 述部分選自下組種子、胚、小孢子、合子、原生質體、細胞、胚珠、花粉、直根、子葉、提取物或 樣品。依照本發明的另一方面，提供了檢測生物學樣品中本發明的核酸序列或嵌合構建 體的存在的方法。所述方法包括(a)將包含DNA的樣品與引物對接觸，所述引物對在用于 與來自攜帶本發明核酸序列或嵌合構建體的糖用甜菜的基因組DNA的核酸擴增反應時產 生診斷本發明糖用甜菜的擴增子；(b)實施核酸擴增反應，由此生成擴增子；并(C)檢測所 述擴增子。可以通過本領域中公知的任何手段(包括但不限于熒光的、化學發光的、放射線 學的、免疫學的等)來進行擴增的檢測。在意圖使用雜交作為用于擴增特定序列以生成擴 增子的手段的情況中，意圖通過本領域中公知的任何手段的擴增子生成和檢測指示與一種 靶序列(其中利用一種探針或引物)，或者多種序列(利用兩種或更多種探針或引物)的預 期雜交。進一步涵蓋用于生產糖的方法，其中加工本發明的糖用甜菜植物、或其細胞或組 織、生物學樣品或提取物以生產糖。此外，本發明提供了糖，其是通過本發明的生產糖的方 法生產的。用于生產糖的方法可以是本領域技術人員已知的用于生產糖的任何常規方法。另一個優選的方面涉及一種用于生產一種或多種選自下組的生物燃料的方法乙 醇、沼氣和/或生物柴油，其通過加工本發明的轉基因糖用甜菜植物、或其細胞或組織、或 生物學樣品或提取物以生成一種或多種生物燃料來進行。生物燃料可以是通過植物材料的 需氧或厭氧發酵生成的任何生物燃料。通過需氧發酵獲得的生物燃料的非限制性例子是生 物乙醇。可以通過厭氧發酵獲得的生物燃料包括但不限于沼氣和/或生物柴油。需氧和/ 或厭氧發酵的方法是本領域技術人員已知的。本發明進一步涵蓋選自下組的生物燃料乙 醇、沼氣和/或生物柴油，如通過本發明的用于生產一種或多種生物燃料的方法所生成的。39
在另一個優選的方面，本發明提供了多核苷酸標志物，其在B基因座處或極其接 近B基因座處，特別地在標志物MP0176和GJOl上游IcM距離處定位，而且與標志物GJ131 共分離(M5hring S.等，2004 ；Gaafar R. M.等，2005)(圖 5)。本發明進一步涉及糖用甜菜基因組中鑒定的多核苷酸標志物，包括其變體和衍生 物，所述多核苷酸標志物是基于核酸序列開發的，所述核酸序列可獲自糖用甜菜中顯示與 抽苔基因(B基因)相關表型完美共分離的基因組DNA區，且其中所述標志物容許區分一年 生與二年生基因型或展現出二年生或一年生表型的糖用甜菜植物的植物分組內的不同單 元型。在一個優選的實施方案中，本發明的多核苷酸標志物具有自本發明的和如上文所描 述的一種或多種核酸序列可獲得的核酸序列。優選地，本發明的多核苷酸標志物進一步包 含一個或多個多態性，特別是基于SNP、SSR、或至少一個核苷酸的缺失或插入的多態性，但 是特別是基于SNP的多態性，該多態性診斷B基因座處的B等位基因。優選地，此類多核苷 酸標志物能夠檢測本文中列為SEQ ID NO :8的所述基因組序列的不同等位基因中存在的 和表7-1 (圖10中進一步描繪的)和表7-2 (圖10中進一步描繪的)中所顯示的多種SNP 的至少一種，其中所述多核苷酸標志物能夠區分不同等位基因，特別地區分一年生和二年 生糖用甜菜系。在一個優選的實施方案中，本發明的多核苷酸標志物能夠檢測至少一種選 自下組的SNP，該組包括列為SEQ ID NO 8的序列的位置#224、#351, #615、#897、#1082、 #1841、#1915、#2334、#11592、#12316、#12490、或 #12544 處的和如表 7-1 (圖 10 中進一步 描繪的)和表7-2(圖11中進一步描繪的)中所顯示的SNP。本發明的別的方面涉及一組 多核苷酸標志物，其包含本發明的和上文所描述的眾多多核苷酸標志物。在此上下文中，術 語“眾多”指一組超過一個的多核苷酸標志物，其優選地由兩種、三種或更多種標志物組成。在本發明的一方面，可以開發并使用本文中沒有明確公開的標志物或甚至還要鑒 定的標志物。基于本申請中所提供的信息，對于技術人員會有可能鑒定或開發本文中沒有 明確公開的但是在遺傳學上與抽苔基因或B基因緊密連鎖的，或優選地位于抽苔基因或B 基因內的或與本文中所公開的標志物連鎖的標志物。技術人員知道其它標志物可以在篩選 測定法和標志物輔助選擇中提供至少相等的效用。例如，可開發基于自測序PCR產物(其是自一年生和二年生植物擴增的)表征的 SNP的分子標志物，優選終點TaqMan 。在這里，會實施數次PCR擴增，以覆蓋所述基因的 完整序列。然后在不同一年生和二年生遺傳背景內測試新的分子標志，以評估分子測試的 穩健性。在一個實施方案中，分子標志是通過PCR擴增的DNA片段，例如SSR標志物或RAPD 標志物。在一個實施方案中，擴增DNA片段的存在或缺失指示性狀自身的或該性狀的特定 等位基因的存在或缺失。在一個實施方案中，擴增DNA片段的長度差異指示性狀的特定等 位基因的存在，并如此能夠區分性狀的不同等位基因。在本發明的一個具體實施方案中，使用簡單序列重復(SSR)標志物來鑒定親本植 物和/或其祖先，以及自所述親本植株雜交產生的后代植株中的本發明相關等位基因。本領域技術人員知道可利用的數種別的方法或辦法，它們能用于鑒定和/或開發 與B基因區連鎖不平衡的和/或與B基因區連鎖的和/或位于B基因區中的標志物，以及 呈現負責二年生基因型的實際原因突變的標志物。本領域技術人員知道的辦法包括但不限 于
-在雜交辦法中使用已公開的序列/標志物來鑒定感興趣區域中的其它序列本 文中公開的引物序列和/或能使用本文中公開的引物序列測定的標志物/基因序列(或其 部分)可用作(雜交)探針，用于自基因組核酸樣品和/或RNA或cDNA樣品或樣品合并物 分離標志物側翼的和/或與B基因區連鎖的和/或與B基因區有關的和/或對B基因區特 異性的核酸序列/基因(例如篩選基因組資源，像BAC文庫或gDNA或cDNA文庫篩選)；-在PCR辦法中使用已公開的序列/標志物來鑒定感興趣區域中的其它序列可 使用本文中公開的引物序列和/或標志物/可使用本文中公開的引物序列測定的(候選) 基因序列(或其部分)作為(PCR)擴增引物自基因組核酸樣品和/或RNA或cDNA樣品或 樣品合并物擴增QTL區側翼的和/或與QTL區連鎖的和/或與QTL區有關的和/或對QTL 區特異性的核酸序列/基因，所述樣品是或不是自特定植物組織和/或在植物特定處理后 且自糖用甜菜或原則上具有足夠同源性的任何其它生物體分離的；-在PCR辦法中使用已公開的序列/標志物來鑒定感興趣區域中的其它序列在 為標志物序列設計內部引物并用于進一步測定B基因區內的和/或與所述性狀遺傳連鎖的 和/或有關的別的側翼序列/基因后，能測定一種或多種標志物的核苷酸序列/基因；-在作圖和/或比較作圖辦法中使用已公開的序列/標志物來鑒定同一區域中的 標志物(在其它圖上定位B基因)基于本文中公開的位置信息和/或標志物信息，可通過 遺傳作圖辦法，最終(如果早就需要的話)通過在(高密度)遺傳圖和/或集成遺傳或共 有圖上定位已公開標志物(通過遺傳作圖或基于各圖間共有標志物的外推)，鑒定任何類 型的標志物。可鑒定和/或獲得與已公開標志物和/或B基因區遺傳連鎖的和/或位于已 公開標志物和/或B基因區附近的早就知道的標志物和/或新的標志物，并最終用于B基 因(精細)作圖和/或B基因克隆和/或MAS育種應用；-在“計算機”辦法中使用已公開的序列/標志物來鑒定B基因區中的別的序列/ 標志物/(候選)基因可以在“計算機”方法中使用本文中公開的引物序列和/或可使用 本文中公開的引物序列或基于連鎖標志物測定的標志物/(候選)基因序列(或其部分) 來對序列或蛋白質數據庫(例如BLAST)搜索與本文所述性狀遺傳連鎖的和/或與本文所 述性狀有關的和/或位于B基因區中的(別的)側翼和/或同源序列/基因和/或等位基 因多樣性(基因組和/或cDNA序列二者或甚至蛋白質，二者都源自辣椒和/或任何其它生 物體)；-在物理作圖辦法(在物理圖或基因組序列上定位B基因)中使用已公開的序列 /標志物可以在原則上具有足夠同源性的任何生物體的物理圖和/或(完整)基因組序 列上定位本文中公開的引物序列和/或可使用本文中公開的引物序列或使用與本文中公 開的標志物遺傳連鎖的和/或位于B基因區中的其它標志物測定的標志物/基因序列(或 其部分)來鑒定在B基因(精細作圖)和/或B基因克隆和/或MAS育種應用中可應用的 (候選)序列/標志物/基因；-使用已公開的序列/標志物在其它(物理)圖或基因組上定位B基因(物種 間)可以在比較基因組或syntheny作圖辦法中使用本文中公開的引物序列和/或可使用 本文中公開的引物序列測定的標志物/基因序列(或其部分)來鑒定同系物區和同系物和 /或直向同系物序列/與B基因區遺傳連鎖的和/或位于B基因區中的且在B基因(精細 作圖)和/或B基因克隆和/或MAS育種應用中可應用的(候選)基因；
-使用已公開的序列/標志物來選擇適宜的個體，容許通過遺傳辦法鑒定感興趣 區域中的標志物可使用本文中公開的引物序列和/或標志物來選擇具有不同/對比B基 因等位基因的個體。可使用遺傳關聯辦法(geneticassociation approach)和/或大批分 離子分析(bulk segregant analysis, BSA ;Michelmore等，1991)來鑒定特定感興趣區域 (B基因區)中的和/或與所述性狀關聯的或遺傳連鎖的標志物/基因；或-使用已公開的信息來搜索(位置)候選基因可使用已公開的信息來鑒定位置 和/或功能候選基因，其可以與所描述的性狀相關和/或遺傳連鎖。在本發明的另一個具體實施方案中，使用基于單核苷酸多態性的標志物來鑒定親 本植物和/或其祖先，以及自所述親本植株雜交產生的后代植株中的本發明相關等位基 因。糖用甜菜的商業性種子生產大多在法國南部和意大利北部進行。在這兩個地區， 一年生雜生甜菜的存在能在種子生產中引起花粉污染，導致商業性種子中有一年生植物。 這是客戶不能接受的，而且因此在收獲種子后立即在沒有野生甜菜的地區(諸如阿根廷) 種植所有批次的商業性種子。不對植物春化，而且通過利用抽苔者的存在來鑒定污染有一 年生植物的種子批次。因此，依照本發明的多核苷酸標志物可用于各批商業性種子的質量控制(這通過 對商業性二年生糖用甜菜種子篩選一年生污染物來進行)及在育種程序中鑒定一年生植 物/ 二年生植物(這使用一年生性狀來加速育種過程，或在一起引入一年生性狀與遺傳變 異新來源時)。如此可開發基于依照本發明的且如本文中所描述的基因序列的不同測定法，并用 于對植物材料篩選一年生等位基因的存在或缺失。過去，已經開發了能用于遺傳作圖、基因克隆、標志物輔助植物育種及用于基因組 指紋術和調查遺傳關系的分子標志技術。遺傳標志物基于基因組區域的核苷酸序列中的 DNA多態性開發，而且能通過限制酶或依靠兩個引發位點來檢測。有數種類型的分子標志物可用于基于標志物的選擇，包括限制性片段長度多態性 (RFLP)、多態性DNA的隨機擴增(RAPD)、擴增限制性片段長度多態性(AFLP)、簡單序列重復 (SSR)和多核苷酸多態性(SNP)。不同類型標志物的信息內容可以是不同的，這取決于用于獲得標志物數據的方法 和關于標志物評分的群體。例如，并非總是可能區分在純合條件中存在的基因組片段與雜 合片段。在雜合群體中，像F2，共顯性標志物(像限制性片段長度多態性)(RFLP，Botstein 等，1980)和共顯性評分的擴增片段長度多態性(AFLP，Vos等，19%)產生比顯性標志物 (像隨機擴增多態性DNA) (RAPD, Welsh和McCleland，1990)和顯性評分的AFLP要多的信 息。RFLP是共顯性的，而且能夠鑒定獨特基因座。RFLP涉及使用限制酶在特定短限制性位 點(源自重復或位點間缺失或限制性位點處突變的多態性)處切割染色體DNA。AFLP要求用限制酶消化細胞DNA，之后使用PCR和引物中的選擇性核苷酸來擴增 特定片段。憑借此方法，可測量多至100個多態性基因座，而且每項測試只要求相對較少的 DNA樣品。用于實現跨越植物基因組多態性區域的核苷酸片段的此類擴增的最優選方法采 用聚合酶鏈式反應(“PCR”)(Mullis等，1986)，其使用包括能夠與以雙鏈形式限定多態性的近端序列雜交的反向引物和正向引物的引物對。與RFLP不同，基于PCR的技術只要求少量(大約10% )的DNA作為模板通過PCR 擴增生成大量的靶序列。一種此類基于PCR的技術是RAPD，其利用低嚴格性聚合酶鏈式反應(PCR)擴增， 使用具有任意序列的單一引物來生成無名DNA片段的株特異性種類。該方法只要求很少的 DNA樣品，且分析大量的多態性基因座。然而，受到眾多反應條件、顯性方式的繼承、和群體 特異性影響的短引物的不可預測的表現是RAPD的主要缺點。微衛星、或簡單序列重復(SSR)、簡單序列長度多態性(SSLP)、短串聯重復(STR)、 簡單序列基序(SSM)、和序列靶微衛星(STM)代表一類廣泛分布于整個真核生物基因組中 的重復序列。重復數目和長度的變異是多態性的一個來源，甚至在密切相關的個體間。SSR 分析基于選擇性擴增的這些(短重復)序列來檢測簡單序列重復中的變異。此類微衛星序 列可容易地使用側翼基因座特異性寡核苷酸作為引物通過PCR來擴增，并檢測DNA長度多 態性(Litt 和 Luty，1989 ；Weber 和 May, 1989)。單一核苷酸位置處導致替代、缺失或插入的突變產生多核苷酸多態性或SNP，其在 人類中每1. 3kb發生一次(Cooper等，1985 ；Kwok等，1996)。大多數此類型多態性只具有 兩種等位基因，也稱作雙等位基因基因座。基于SNP的定位克隆可加速疾病性狀和有效量 生物學信息突變的鑒定(Wang等，1998)。可使用有效選出點突變的PCR延伸測定法來檢測SNP。該規程只要求每份樣品少 量DNA。使用PCR進行的SNP檢測測定法的三種廣泛使用的類型是切割擴增多態性序列 (cleaved amplified polymorphic sequences，CAPS)(Konieczny 禾口 Ausubel，1993 ;Thiel 等，2004)、衍生 CAPS (dCAPS) (Michaels 和 Amasino，1998 ；Neff 等，1998)、和單鏈構象多態 t生(single strand conformaionpolymorphism, SSCP) (Orita 等，1989)。CAPS多態性指由SNP或INDEL引起的限制性片段長度差異，其是通過由基因座特 異性寡核苷酸引物生成的PCR擴增子中的限制性內切核酸酶識別位點創建或消除的。如下 實施CAPS測定法，即用一種或多種限制酶消化基因座特異性PCR擴增子，然后在瓊脂糖或 聚丙烯酰胺凝膠上將經過消化的DNA分開。dCAPS是CAPS技術的改良，通過利用錯配的PCR引物，其容許檢測大多數單核苷酸 變化。使用該方法時，通過含有一處或多處相對于模板DNA的錯配的引物，將包含SNP的限 制酶識別位點引入PCR產物。然后對以此方式修飾的PCR產物進行限制酶消化，并通過所 得限制性樣式確定SNP的存在或缺失。SSCP技術在非變性凝膠上將變性雙鏈DNA分開，并如此容許單鏈DNA的二級結構 及分子量決定凝膠泳動率。ARMS (擴增不應性突變系統)-PCR觀程( 等，2001)涉及使用單一 PCR來進行 SNP基因分型(Fan等，2003 ；Chiapparino等，2004)。使用四引物(采用兩對引物)在單一 PCR反應中擴增SNP的兩種不同等位基因。可采用備選方法來擴增此類片段，諸如“連接酶鏈式反應”(“LCR”)(Barany, F.， 1991)，其使用兩對寡核苷酸探針來指數擴增特定靶物。每對寡核苷酸的序列選擇成容許該 對與靶物同一條鏈的相鄰序列雜交。所述雜交為模板依賴性連接酶形成底物。與PCR—樣， 所得產物如此在后續循環中充當模板，并且獲得期望序列的指數擴增。43
可以用具有多態性位點同一條鏈的近端和遠端序列的寡核苷酸實施LCR。在一個 實施方案中，任一寡核苷酸設計成包含多態性的實際多態性位點。在這樣的一個實施方案 中，反應條件選擇成使得所述寡核苷酸只能在靶分子含有或缺少與所述寡核苷酸上存在的 多態性位點互補的特定核苷酸的情況中連接到一起。或者，寡核苷酸可以選擇成使得它們 不包含多態性位點(參見Segev, PCT申請WO 90/01069)。可采用的另一種方法是“寡核苷酸連接測定法”(“OLA”)(Landegren等，1988)。 OLA方案使用設計成能夠與靶物單鏈上的相鄰序列雜交的兩種寡核苷酸。像LCR—樣，OLA 特別適合于點突變的檢測。然而，與LCR不同，OLA導致靶序列的“線性”而非指數擴增。Nickerson等，1990記載了組合PCR和OLA屬性的核酸檢測測定法(Nickerson等， 1990)。在此方法中，使用PCR來實現靶DNA的指數擴增，然后使用OLA進行檢測。在需要 多個分開的加工步驟之外，與此類組合有關的一個問題是它們繼承了與PCR和OLA有關的 所有問題。基于在存在具有所得“二寡核苷酸”序列的核酸的情況中兩個(或更多個)寡核 苷酸的連接由此擴增二寡核苷酸的方案也是已知的(Wu和Wallace，1989)，而且可容易地 適應本發明的目的。在本發明的又一個實施方案中，使用基于至少一個核苷酸的缺失或插入 (“INDEL”)的標志物來鑒定親本植物和/或其祖先，以及自所述親本植株雜交產生的后代 植株中的本發明相關等位基因。可以基于依照本發明的和如上文所述的多核苷酸的序列來 開發這些標志物。具體地，依照本發明的標志物可用于等位區分測定法，特別地用于區分展現出二 年生基因型的糖用甜菜植株的植物分組內的不同單元型的測定法。所述測定法基于一組 探針多核苷酸，其包含與例如通過PCR擴增可獲得的BvPRR7基因的亞區域互補的兩種不 同探針分子，所述PCR擴增基于如分別在SEQ ID N0:13和SEQ ID NO :14中給定的正向引 物PRR7 (Tl) -F和反向引物PRR7 (Tl) -R,所述探針分子僅相差一個堿基錯配，并且是探針 PRR7 (Tl)-VIC (SEQ ID NO 15)和 (Tl)-FAM (SEQ ID NO :16)。進一步優選的組是與探 針 PRR7(T6)-VIC(SEQ ID NO :51)和 PRR7 (T6)-FAM (SEQ ID NO :52) —起的如 SEQ ID NO: 49中所描述的正向引物PRR7 (T6) -F和如SEQ ID NO 50中所描述的反向引物PRR7 (T6) -R, 以及與探針 rr22 (Tl)-VIC (SEQ ID NO :57)和 lr22 (Tl)-FAM(SEQ ID NO :58) —起的如 SEQ ID NO :55中所描述的正向引物lr22 (Tl)-F和如SEQ ID NO :56中所描述的反向引物 lr22(Tl)-R0優選地，此類測定法(其中采用一組探針多核苷酸)包含至少兩種不同探針分子， 其相差至少一種錯配(one mismatch)，特別地相差位于相鄰位點處的兩個或更多個錯配， 但是特別地相差一個單錯配，其中第一探針分子，特別地經標記的探針分子，更特別地用第 一熒光染料和猝滅劑標記的探針分子代表一種等位基因，而第二探針分子，特別地經標記 的探針分子，更特別地用第二熒光染料和猝滅劑標記的探針分子(其與第一染料不相同) 代表另一等位基因，且其中使用所述探針多核苷酸組來區分兩種等位變體。可以采用另外 兩種不同的熒光標記物，其熒光可以容易區別。例如，用第一熒光染料(如例如FAM)標記 第一探針，而用第二熒光染料(如例如VIC)標記第二探針。在本發明的此類測定法的一個 優選的實施方案中，另外用包含對二年生等位基因特異性的序列的經第二熒光標記的探針分子探查上文所描述的本發明等位區分測定法的步驟b)中所獲得的擴增片段。在此測定 法中，第一探針的染料熒光升高僅指示一年生等位基因的存在。此測定法中所使用的兩種 染料優選是VIC和FAM。一般地，本發明的測定法優選地采用兩種引物(即一對依照本發明 的引物)和至少一種針對一年生等位基因的探針。可以進一步采用第二探針，其是針對二 年生等位基因的探針。在本發明的另一方面，提供了如下的方法，其牽涉可以特異性區分一年生植物和 二年生植物，并且如此可以用于例如種子批次的質量控制的標志物。具體地，本發明涉及一種測定法，該測定法基于一組探針多核苷酸，其包含與例 如通過PCR擴增可獲得的BvPRR7基因的亞區域互補的兩種不同探針分子，所述PCR擴增 基于如分別在SEQ ID N0:13和SEQ ID NO 14中給定的正向引物PRR7 (Tl)-F和反向弓丨 物PRR7(T1)-R，所述探針分子僅相差一個堿基錯配，并且是探針PRR7(T1)-VIC(SEQ ID NO 15) ^P PRR7 (Tl)-FAM(SEQID NO :16)。進一步優選的組是與探針 PRR7 (T6)-VIC (SEQ ID NO 51)和 PRR7 (T6) -FAM(SEQ ID NO :52) 一 起的如 SEQ ID NO :49 中所描述的正 向引物PRR7(T6)-F和如SEQ ID NO :50中所描述的反向引物PRR7 (T6)-R，以及與探針 rr22(Tl)-VIC(SEQ ID NO :57)禾口 lr22 (Tl) _FAM(SEQ ID NO :58) 一起的如 SEQ ID NO :55 中所描述的正向引物lr22 (Tl)-F和如SEQ ID NO :56中所描述的反向引物lr22 (Tl)-R。在另一方面，本發明提供了一種用于在商業種子中鑒定一年生污染物的方法。優 選地，此方法包括使用本發明的和本文中所描述的基于標志物的等位區分測定法。以下實施例僅意圖例示本發明的一個或多個優選的實施方案，并且不應解釋為限 制本發明的范圍。實施例以下實施例提供了例示性實施方案。根據本公開內容和本領域一般技術水平，技 術人員會領會以下實施例意圖僅作為例示性的，而且可采用眾多變化、改良、和改變而不背 離當前要求保護的主題的范圍。實施例1 糖用甜菜PRR7基因的表征實施例1. 1 來自糖用甜菜的推定PRR7同系物的定位基于用于鑒定和表征糖用甜菜中推定抽苔控制基因的候選基因方法，憑借使用 BLAST進行的同源性搜索將編號CV301305的EST序列鑒定為PRR7的推定甜菜同系物。SEQ ID NO :1顯示了 EST CV301305的核苷酸序列。相應的氨基酸序列顯示了假應答調控物接受 者(PRR，pfam00072)或信號接受者(REC，cd00156)域的部分存在(圖1)，其是在晝夜節律 鐘中都起關鍵作用的PRR基因家族的一種標志(Nakamichi等，2005)。圖2顯示了 CV301305 與其最密切的擬南芥同系物PRR7的氨基酸序列比對，后者已經被描述成溫度敏感性晝夜 節律系統的一個成分(Nakamichi等，2007 ；Salome和McClung 2005)。已知晝夜節律鐘在 植物中控制數個發育過程，包括開花時間控制(Imaizumi和Kay，2006 ；Zhou等，2007)。基于上述觀察結果，使用擬南芥PRR7基因(分別為AT5G(^810和匪120359)與 BvPRR7糖用甜菜EST(CV301305)基因組序列和mRNA之間的比對，推導部分甜菜PRR7片段 的推定基因結構，這揭示了數個推定內含子區的存在(圖3)。在使用基因組甜菜DNA作為模 板時，涵蓋第三推定內含子區的引物PRR7-F和PRR7-R(SEQ ID NO 2和3)產生大約0. 51Λ45的擴增產物。用于擴增反應的PCR條件如下初始變性95°C 5分鐘，接著35個擴增循環30 秒 95"C、30 秒 60°C和 30 秒 72°C，再接著 5 分鐘 72"C。在來自 AppliedBiosystems Inc. 的GeneAMP PCR系統9600儀器上使用來自hvitrogenCorporation的鉬Taq DNA聚合酶 和相應反應混合物如供應商所推薦的那樣運行PCR實驗。對PCR產物的序列分析得以重建 BvPRR7基因片段內含子3周圍的基因組序列，并證實了長度為四6堿基對的內含子的存在 (SEQ ID NO 4)。在一組(包括15種二年生和1種一年生系)糖用甜菜親本系間對BvPRR7基因的 基因組片段擴增和測序。所有二年生系展現BvPRR7單態性，因為只觀察到兩種不同單元 型一種二年生等位基因和一種一年生等位基因(表1)。為了在對一年生習性分離的群體 中定位BvPRR7，開發了一種使用端點TaqMmi 技術靶向第160位SNP(SEQ iD NO 4)的測定法。表2總結了為靶向第160位SNP的PRR7(T1) TaqMan 測定法設計的引物和探針 的核苷酸序列；依照制造商的推薦，該反應體系進一步包括來自Applied Biosystems Inc. 的TaqMan 通用 PCR 大師級混合物，No AmpErase UNG Ox)。使用 ABIPRISM 7700 序 列檢測儀儀器，如下實施PCR擴增95°C 10分鐘，接著40個循環95°C 15秒和60°C 1分鐘。 使用序列檢測系統Sequence Detection System) 2. 0軟件實施端點測量。表1 在1種一年生和15種二年生糖用甜菜系之間對跨越內含子3的BvPRR7基 因片段觀察的多態性。SEQ ID NO 4 位置87160406單元型#1TTG一年生單元型#2CCA二年生標題行(header row)標示BvPRR7基因片段的基因組序列(如SEQ ID NO 4中所 描述的)處的核苷酸位置。標題為“單元型#1”和“單元型#2”的行表示一組16種品系間 觀察的2種單元型。表2 與用于SNP#160基因分型的TaqMan測定法PRR7(T1)對應的引物和探針的 核苷酸序列前體名稱核苷酸序列(5’至3’)SEQ ID NO PRR7 (Tl)-GAGGTGTCACAGTGTAAGTGTCT13PRR7 (Tl)-RAAAGACTGCTACACGAACCACTAAG14PRR7 (Tl)-FAMFAM-CTGATGAAAAGCTG-MGB-NFQ16PRR7 (Tl)-VICVIC-CTGATGGAAAGCTG-MGB-NFQ1546
使用上述PRR7(T1)測定法，在自一年生系與對第160位SNP而言多態性的二年生 系之間的雜交衍生的198個個體的F2群體中定位了 BvPRR7基因。BvPRR7位于染色體II， 在GJ131標志物下游大約IcM處(圖4)，即已知含有關于不依賴春化的開花的B基因的一 個區域(M6hring等，2004 Aaafar等，2005)。PRR7(T1)測定法的結果顯示了 B基因預測 基因型與BvPRR7基因基因型之間的完全匹配。B基因的基因型是基于自個別F2植株衍生 的F3群體關于不依賴春化的開花的表型評估預測的。表3總結了包含最靠近的重組事件 的9個后代植株個體的B基因區細微圖的圖形顯示。其定位位置與其與溫度敏感性晝夜節 律有關的生物學功能的組合(&ι1οπι 和McClung，2005)顯然使得BvPRR7成為B基因的強 候選物。表3 多種標志物的基因型，包括在B基因的任一側顯示重組事件的9個F2植物 間的B基因周圍的raR7(Tl)定位。PRR7(T1)以及927(T2)標志物顯示了與B基因的預測 基因型完美匹配。B基因的基因型基于自F2植物個體衍生的F3群體的表型評估。(B-二 年生等位基因；A-—年生等位基因；H-對于一年生等位基因雜合的)
權利要求
1.一種核酸序列，其a)與如下的核酸序列具有至少70%的序列同一性；或b)包含如下核酸序列的至少15個連續核苷酸；或c)在嚴格條件下與如下的核酸序列雜交所述核酸序列選自如SEQ ID而1、4、5、6、7、8、9、10、53或討之任一項中所列的核酸 序列的組。
2.依照權利要求1的核酸序列，其中所述核酸序列包含如SEQID NO :1、4、5、6、7、8、9、 10、53、或M之任一項中所列的核酸序列。
3.依照權利要求2的核酸序列，其中所述核酸序列包含如SEQID NO :8中所描述的核 酸序列，其中所述序列包含一個或多個核酸取代、缺失、或添加，如表7-1 ((圖10中描繪的) 和表7-2(圖11中描繪的)中所顯示的，其中表7-1(圖10中描繪的)和表7-2(圖11中 描繪的)中顯示的多態性分別代表SEQ ID NO :8中所描述的序列的18種一年生和2種二 年生等位基因。
4.多肽，其是由依照權利要求1至3中任一項的核酸序列編碼的。
5.依照權利要求4的多肽，其具有選自下組的氨基酸序列如SEQID NO 11或12中 所描述的氨基酸序列。
6.嵌合構建體，其包含表達盒，所述表達盒包含在調節元件控制下，優選地在植物中有 功能的調節元件控制下的依照權利要求1至3中任一項的核酸序列。
7.依照權利要求6的嵌合構建體，其進一步包含選擇標志基因，其容許在選擇方法中 區分經轉化的和未轉化的植物材料。
8.依照權利要求6或7的嵌合構建體，其中為BvPRR7基因表達的轉基因下調提供所述 嵌合構建體。
9.依照權利要求8的嵌合構建體，其用于BvPRR7基因表達的轉基因下調，其中所述嵌 合構建體包含編碼dsRNA的核酸分子序列，所述dsRNA能夠靶向通過轉錄編碼B基因蛋白， 優選地BvPRR7蛋白的DNA序列而生成的mRNA以進行降解。
10.依照權利要求9的嵌合構建體，其中編碼所述dsRNA的核酸分子具有至少21個核 苷酸的長度，而且與所述BvPRR7基因的編碼序列的至少一部分，優選地與依照權利要求1 至3中任一項的核酸序列基本上相同。
11.依照權利要求9或10的嵌合構建體，其中編碼所述dsRNA的核酸分子具有在組成 型啟動子，優選地來自擬南芥的啟動子的控制下的如SEQID NO 1中所描述的核苷酸 序列。
12.依照權利要求9至11中任一項的嵌合構建體，其進一步包含來自馬鈴薯MLSl基 因的第二內含子的序列。
13.植物轉化載體和/或植物表達載體，其包含依照權利要求6至12中任一項的嵌合 構建體。
14.依照權利要求13的植物表達載體，其是包含依照權利要求6至12中任一項的嵌合 構建體的RNAi表達載體。
15.依照權利要求14的RNAi表達載體，其中所述RNAi表達載體包含圖11中所顯示的 嵌合構建體。
16.植物細胞，其包含依照權利要求6至12中任一項的嵌合構建體或依照權利要求13 至15中任一項的載體。
17.依照權利要求16的植物細胞，其是糖用甜菜植物的植物細胞。
18.具有延遲抽苔的表型的轉基因植物，優選糖用甜菜植物或其細胞、組織或種子，各 包含依照權利要求16或17的植物細胞或依照權利要求6至12中任一項的嵌合構建體或 依照權利要求1至3中任一項的核酸序列，其中所述轉基因植物特別是糖用甜菜植物表達 所述dsRNA，從而延遲特別是抑制抽苔，并且所述植物展現出延遲抽苔的表型，優選為非抽 苔表型。
19.轉基因植物，特別是糖用甜菜植物，其是自依照權利要求18的細胞、組織或種子生 成的。
20.一種生成雜種種子的方法，可以自所述雜種種子種植具有受調控的抽苔的表型的 植物特別是糖用甜菜植物，所述方法包括下列步驟a.提供具有受調控的抽苔的表型的植物系特別是糖用甜菜系，特別是依照權利要求 18或19的轉基因糖用甜菜植物作為第一親本系；b.提供具有不同基因型的第二植物系，特別是糖用甜菜系作為第二親本系；其中步驟a)或步驟b)的所述親本系之一是雄性不育cms系，且其中另一親本系是雄 性能育，并c.容許所述雄性能育親本系的植物傳粉給第二雄性不育親本系的花，讓所述種子形 成，并收獲所述雜種種子；其中收獲的雜種種子是具有延遲抽苔的表型的雜種植物，特別是糖用甜菜雜種植物的 種子。
21.依照權利要求20的生成雜種種子特別是糖用甜菜雜種種子的方法，其中所述雄性 不育CMS糖用甜菜親本系是近交糖用甜菜系，其包含依照權利要求1至3中任一項的核酸 或其片段。
22.具有延遲抽苔的表型的植物特別是糖用甜菜植物的雜種種子。
23.依照權利要求22的雜種種子，其中所述種子是通過權利要求20或21的方法生成的。
24.具有延遲抽苔的表型的雜種植物特別是雜種糖用甜菜植物，其是通過種植權利要 求22或23的雜種種子生成的。
25.植物部分，其選自下組種子、胚、小孢子、合子、原生質體、細胞、胚珠、花粉、直根、 子葉、提取物或生物學樣品，它們衍生自依照權利要求18或19的轉基因糖用甜菜植物或其 種子或依照權利要求22或23的雜種植物或其種子。
26.依照權利要求1至3中任一項的核酸序列或其片段用于轉化植物細胞特別是糖用 甜菜植物細胞的用途。
27.轉化植物細胞特別是糖用甜菜植物細胞的方法，包括使用依照權利要求1至3中 任一項的核酸序列或依照權利要求6至12中任一項的嵌合構建體或依照權利要求13至15 中任一項的載體。
28.依照權利要求18或19的轉基因植物、依照權利要求M的雜種植物、或依照權利要 求25的植物部分在選自下組的方法中的用途糖生產的方法、需氧發酵的方法和厭氧發酵的方法，特別是在糖生產的方法中的用途。
29.用于生產糖的方法，其中加工依照權利要求18、19、對或25中任一項的糖用甜菜植 物、或其細胞或組織以生產糖。
30.自依照權利要求18、19、對或25中任一項的糖用甜菜植物、或其細胞或組織生成的糖。
31.多核苷酸標志物，其中所述標志物是基于核酸序列開發的，所述核酸序列可獲自糖 用甜菜中顯示與抽苔基因(B基因)相關表型完美共分離的基因組DNA區，且其中所述標志 物容許區分一年生與二年生基因型或區分展現出二年生或一年生表型的糖用甜菜植物的 植物分組內的不同單元型(haplotypes)。
32.依照權利要求31的多核苷酸標志物，其中所述核酸序列可獲自依照權利要求1至 3中任一項的核酸序列。
33.依照權利要求31或32的多核苷酸標志物，其進一步包含一個或多個多態性，特別 是基于SNP、SSR、或至少一個核苷酸的缺失或插入的多態性，但是特別是基于SNP的多態 性，該多態性診斷B基因座處的B等位基因。
34.依照權利要求33的多核苷酸標志物，其能夠檢測如SEQID NO :8所列的所述基因 組序列的不同等位基因中存在的和如表7-1(圖10中描繪的)和表7-2(圖11中描繪的) 中所顯示的多種SNP的至少一種，其中所述多核苷酸標志物能夠區分不同等位基因，特別 是區分一年生和二年生糖用甜菜系。
35.依照權利要求34的多核苷酸標志物，其能夠檢測至少一種選自下組的SNP，該組包 括如 SEQ ID NO 8 所列的序列的位置 #224、#351、#615、#897、#1082、#1841、#1915、#2334、 #11592、#12316、#12490、或#12544處的和如表7-1(圖10中描繪的)和表7-2 (圖11中描 繪的)中所顯示的SNP。
36.多核苷酸標志物組，其包含權利要求31至35中任一項的多個多核苷酸標志物。
37.引物對，其由正向引物和反向引物組成，所述引物能夠與糖用甜菜基因組DNA中顯 示與抽苔基因(B基因)完美共分離的基因組區域內的核苷酸序列退火。
38.依照權利要求37的引物對，其與依照權利要求1至3中任一項的核酸序列退火，并 擴增依照權利要求31至35中任一項的多核苷酸或其信息部分，其中所述多核苷酸包含一 個或多個多態性，特別是一個或多個診斷B基因座處的B等位基因且容許區分一年生和二 年生基因型的多態性。
39.依照權利要求38的引物對，其選自下組a.引物對，其與BvPPR7的第三內含子中如SEQID NO 6中所描述的核苷酸序列退火， 并自包含多態性特別是包含位置#87處的C/T SNP和/或位置#160處的C/T SNP和/或 位置#406處的A/G SNP的多態性的所述區域擴增信息片段；b.弓丨物對，其與如SEQID NO :8所列的核苷酸序列退火，并自包含多態性的所述序列 擴增信息片段，所述多態性選自基于所述序列的不同等位基因中存在的SNP的多態性，如 表7-1 (圖10中描繪的)和表7-2 (圖11中描繪的)中所顯示的。
40.依照權利要求39的引物對，其包含a.如SEQ ID NO :49中所描述的正向引物PRR7(T6)-F和如SEQ ID NO :50中所描述的 反向引物PRR7(T6)-R，用于擴增包含SNP#2334的片段；或b.如SEQID NO 13中所描述的正向引物PRR7 (Tl)-F和如SEQ ID NO: 14中所描述的 反向引物PRR7 (Tl) -R,用于擴增包含SNP#160的片段；或c.如SEQID NO :55中所描述的正向引物lr22(Tl)-F和如SEQ ID NO :56中所描述的 反向引物lr22(Tl)-R。
41.依照權利要求31至36中任一項的多核苷酸標志物、依照權利要求36的多核苷酸 標志物組、或依照權利要求37至40中任一項的引物對在等位區分測定法中的用途，所述等 位區分測定法用于鑒定糖用甜菜植物中與一年生有關的等位基因的缺失或存在。
42.用于鑒定糖用甜菜植物中與一年生有關的等位基因的缺失或存在的等位區分測定 法，其容許區分一年生和二年生植物，其中使用依照權利要求31至36中任一項的多核苷酸 標志物、依照權利要求36的多核苷酸標志物組、或依照權利要求37至40中任一項的引物 對。
43.依照權利要求42的等位區分測定法，其包含下列步驟a.自要分析的糖用甜菜植物獲得基因組DNA的樣品，b.使用依照權利要求37至40中任一項的引物對自所述樣品或基因組DNA擴增片段，并c.分別比較所擴增的片段與已知與二年生表型有關但與一年生表型無關的等位序列。
44.依照權利要求42或43的等位區分測定法，其中在步驟c)中用包含對一年生等位 基因特異性的序列的經第一熒光標記的探針分子探查步驟b)中獲得的擴增片段，且其中 所述第一探針的染料熒光的升高指示一年生等位基因的存在。
45.依照權利要求44的等位區分測定法，其中另外用包含對二年生等位基因特異性的 序列的經第二熒光標記的探針分子探查步驟b)中獲得的擴增片段，且其中所述第一探針 的染料熒光的升高僅指示一年生等位基因的存在。
46.一種在商業種子中鑒定一年生污染物的方法，其使用依照權利要求42至45中任一 項的基于標志物的等位區分測定法來進行。
全文摘要
本發明涉及具有延遲抽苔的表型的轉基因糖用甜菜植物。本發明進一步涉及多核苷酸，其在糖用甜菜基因組內與抽苔基因或B基因緊密連鎖，而且可以用于區分一年生與二年生基因型或展現出二年生基因型的糖用甜菜植株的植物分組內的不同單元型。
文檔編號C12N15/82GK102057045SQ200980121061
公開日2011年5月11日 申請日期2009年5月25日 優先權日2007年5月23日
發明者托馬斯·克拉夫特, 皮埃爾·平, 約翰尼斯·J·L·吉倫 申請人:先正達參股股份有限公司