專利名稱：產(chǎn)生碳?xì)浠衔锏姆椒ê徒M合物的制作方法
產(chǎn)生碳?xì)浠衔锏姆椒ê徒M合物
相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
本申請(qǐng)要求2008年5月16日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)第61/053955號(hào)的優(yōu)先權(quán)，在 此將其內(nèi)容全部并入。
發(fā)明背景
石油是地球上發(fā)現(xiàn)的、液體、氣體或固體形式的有限的天然資源。石油主要由 碳?xì)浠衔锝M成，碳?xì)浠衔镏饕商己蜌浣M成。石油還含有大量的處于不同形式的其 他元素，例如氮、氧或硫。
石油是寶貴資源，但是以相當(dāng)大的金融和環(huán)境代價(jià)對(duì)石油產(chǎn)品進(jìn)行開發(fā)。首 先，必須發(fā)現(xiàn)石油資源。石油勘探是耗資并有風(fēng)險(xiǎn)的投資?？碧缴钏馁M(fèi)用可以超過 1億美元。此外，不能保證這些井會(huì)含有石油。據(jù)估計(jì)，僅40%的鉆井成為產(chǎn)生商業(yè)碳 氫化合物的生產(chǎn)井。除經(jīng)濟(jì)費(fèi)用外，石油勘探存在嚴(yán)重的環(huán)境代價(jià)。例如近?？碧綌_亂 周圍海洋環(huán)境。
發(fā)現(xiàn)生產(chǎn)井后，必須以巨大代價(jià)從地球開采石油。在初次采收(primary recovery)中，地下的自然壓力足以開采約20%的井中石油。當(dāng)該自然壓力降低時(shí)，如果 經(jīng)濟(jì)上合算，則使用二次采收(secondrecovery)。通常，二次采收涉及通過例如水注射、 天然氣注射或氣舉等增加井壓。使用二次采油，采收到另外5%至15%的石油。一旦二 次采收方法不起作用，如果經(jīng)濟(jì)上合算，可以使用三次采收方法。三次方法涉及降低石 油的粘度以使其更易開采。使用三次采收方法，采收到另外5%至15%的石油。因此， 即使在最佳條件下，僅可以開采50%的井中石油。石油開采也存在環(huán)境代價(jià)。例如，石 油開采可以導(dǎo)致大量石油滲漏上升至表面。此外，近海鉆井涉及挖掘河床，這擾亂或破 壞周圍海洋環(huán)境。
因?yàn)槭偷V藏不是在地球各處均勻發(fā)現(xiàn)的，所以石油必須從石油產(chǎn)生區(qū)長距離 運(yùn)輸?shù)绞拖膮^(qū)。除運(yùn)輸費(fèi)用外，還存在大規(guī)模油泄漏的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)。
從地球開采的原油在天然形式時(shí)具有少數(shù)商業(yè)用途。其是具有不同長度和復(fù) 雜性的碳?xì)浠衔?例如，石蠟(或烷)、烯烴(或烯)、炔、環(huán)烷(napthenes)(或環(huán)烷 (cylcoalkanes))>脂肪族化合物、芳香族化合物等)的混合物。此外，原油含有其他有機(jī) 化合物(例如含有氮、氧、硫等的有機(jī)化合物)和雜質(zhì)(例如硫磺、鹽、酸、金屬等)。
因此，在商業(yè)上可以使用前，必須提煉并純化原油。由于其高能量密度及其便 利的可運(yùn)輸性，大部分石油被提煉為燃料，例如運(yùn)輸燃料(例如汽油、柴油、航空燃料 等)、燃用油、液化石油氣等。
原油還是用于產(chǎn)生石化產(chǎn)品的原材料的主要來源。兩類主要的來自石油的原材 料是短鏈烯烴(例如乙烯和丙烯)和芳香族化合物(例如苯和二甲苯異構(gòu)體)。這些原材 料來源于原油中較長鏈的碳?xì)浠衔?，這是通過以相當(dāng)大的費(fèi)用使用各種方法，例如催 化裂化、蒸汽裂化或催化重整，裂化原油。這些原材料用于制造不能直接從原油提煉的 石化產(chǎn)品，例如單體、溶劑、去垢劑或粘合劑。
來源于原油的原材料的一個(gè)實(shí)例是乙烯。乙烯被用于生產(chǎn)石化產(chǎn)品，例如聚乙烯、乙醇、氧化乙烯、乙二醇、聚酯、乙二醇醚、乙氧基化物、乙酸乙烯酯、1，2-二 氯乙烷、三氯乙烯、四氯乙烯、氯乙烯和聚氯乙烯。原材料的其他實(shí)例是丙烯，丙烯用 于生產(chǎn)異丙醇、丙烯腈、聚丙烯、氧化丙烯、丙烯二醇、乙二醇醚、丁烯、異丁烯、1， 3-丁二烯、合成橡膠、聚烯烴、α-烯烴、脂肪醇、丙烯酸、丙烯聚合物、氯化丙烯、 環(huán)氧氯丙烷和環(huán)氧樹脂。
然后，這些石化產(chǎn)品可以用于制造特種化學(xué)品，例如塑料、樹脂、纖維、橡 膠、藥品、潤滑劑或凝膠?？梢援a(chǎn)自石化材料的具體特種化學(xué)品為脂肪酸、碳?xì)浠?物(例如長鏈、支鏈、飽和的、不飽和的等)、脂肪醇、酯、脂肪醛、酮、潤滑劑等。
特種化學(xué)品具有很多商業(yè)用途。脂肪酸在商業(yè)上被用作表面活性劑，例如在去 垢劑和肥皂中。它們還可以被用作燃料中的添加劑、潤滑油、涂料、漆、蠟燭、色拉 油、起酥油、化妝品和乳化劑。此外，在橡膠產(chǎn)品中脂肪酸被用作促進(jìn)劑活性劑。脂肪 酸還可以被用作生產(chǎn)甲基酯、酰胺、胺、?；?、酐、乙烯酮二聚物以及過氧酸和酯的 原料。
碳?xì)浠衔锞哂泻芏嗌虡I(yè)用途。例如鏈較短的烷被用作燃料。甲烷和乙烷是天 然氣的主要成分。鏈較長的烷(例如5至16個(gè)碳)被用作運(yùn)輸燃料(例如汽油、柴油或航 空燃料)。具有多于16個(gè)碳原子的烷是燃油和潤滑油的重要組分。即使在室溫下為固體 的較長的烷也可以被用作，例如石蠟。含有約35個(gè)碳的烷見于用于路面(road surfacing) 的浙青中。此外，可以裂化較長鏈的烷以生產(chǎn)商業(yè)上有用的較短鏈的碳?xì)浠衔铩?br>
與短鏈烷類似，短鏈烯被用于運(yùn)輸燃料中。較長鏈的烯被用于塑料、潤滑劑和 合成潤滑劑中。此外，烯被用作生產(chǎn)醇類、酯、增塑劑、表面活性劑、叔胺、增強(qiáng)型采 油劑(enhanced oil revovery iigent)、脂肪酸、硫醇、烯基琥珀酸酐、環(huán)氧化物、氯化烷、 氯化烯、蠟、燃油添加劑和粘性流減阻劑。
脂肪醇具有很多商業(yè)用途。鏈較短的脂肪醇在化妝品和食品工業(yè)中，用作乳化 劑、潤滑劑和增稠劑。由于其兩性分子屬性，脂肪醇起非離子表面活性劑的作用，所述 非離子表面活性劑可用作去垢劑。此外，脂肪醇被用于蠟、樹膠、樹脂、藥物軟膏和 洗劑、潤滑油添加劑、紡織品抗靜電和整理劑、增塑劑、化妝品、工業(yè)溶劑和脂肪溶劑 中。
酯具有很多商業(yè)用途。例如作為替代燃料的生物柴油是由酯(例如脂肪酸甲基 酯、脂肪酸乙基酯等)組成。一些低分子量的酯是揮發(fā)性的，具有令人愉悅的氣味，這 使得它們可用作芳香劑或調(diào)味劑。另外，酯被用作漆、涂料和清漆的溶劑。此外，一 些天然存在的物質(zhì)，例如蠟、脂肪和油是由酯組成的。酯還被用作樹脂和塑料中的軟化 劑、增塑劑、滅火劑以及汽油和油中的添加劑。此外，酯可以用于制造聚合物、膠片、 紡織品、染料和藥品。
醛用于生產(chǎn)很多特種化學(xué)品。例如，醛用于生產(chǎn)聚合物、樹脂(例如膠木 (Bakelite))、染料、調(diào)味劑、增塑劑、香水、藥品和其他化學(xué)品。一些被用作溶劑、防 腐劑或消毒劑。一些天然和合成的化合物，例如維生素和激素是醛。此外，很多糖含有酸基。
酮在商業(yè)上被用作溶劑。例如，丙酮常常被用作溶劑，但其也是制造聚合物的 原材料。酮還用于漆、涂料、爆炸物、香水和紡織品加工中。此外，酮用于生產(chǎn)醇、烯、烷、亞胺和烯胺。
此外，原油是潤滑劑的來源。來自石油的潤滑劑通常由烯烴組成，特別是聚烯 烴和α-烯烴。潤滑劑可以從原油提煉或使用提煉自原油的原材料生產(chǎn)。
從原油獲得這些特種化學(xué)品需要大量的金融投資以及大量的能量。因?yàn)樵椭?的長鏈碳?xì)浠衔锍３１涣鸦援a(chǎn)生較小的單體，其也是低效的過程。這些單體然后被 用作生產(chǎn)更復(fù)雜的特種化學(xué)品的原材料。
除勘探、開采、運(yùn)輸和提煉石油的問題外，石油是有限的并逐漸減少的資源。 估計(jì)世界石油消耗為每年300億桶。據(jù)估計(jì)，以現(xiàn)有生產(chǎn)水平，世界石油儲(chǔ)量預(yù)計(jì)在 2050年前會(huì)耗竭。
最后，基于石油的燃料的燃燒釋放溫室氣體(例如二氧化碳)和其他形式的空氣 污染(例如一氧化碳、二氧化硫等)。隨著世界對(duì)燃料需求的增加，溫室氣體和其他形式 的空氣污染的排放也增加。大氣中溫室氣體的累積導(dǎo)致增加全球變暖。因此，除局部破 壞環(huán)境外(例如油泄漏、海洋環(huán)境的挖掘等)，燃燒石油還破壞全球環(huán)境。
由于石油所引起的內(nèi)在挑戰(zhàn)，存在對(duì)于不需要像石油一樣被勘探、開采、長距 離運(yùn)輸或大量提煉的可再生石油資源的需要。存在對(duì)于可以經(jīng)濟(jì)地生產(chǎn)而不會(huì)產(chǎn)生石油 工業(yè)和基于石油的燃料的燃燒所產(chǎn)生的類型的環(huán)境破壞的可再生石油資源?；谙嗨圃?因，還存在對(duì)于通常來自石油的化學(xué)品的可再生資源的需要。
發(fā)明_既述
本發(fā)明至少部分基于編碼碳?xì)浠衔锷锖铣啥嚯牡乃{(lán)細(xì)菌基因的鑒定。因 此，在一方面，本發(fā)明特征為產(chǎn)生醛的方法，所述方法包括在宿主細(xì)胞中產(chǎn)生包含SEQ ID NO 66、68、70、72、74、76、78、80或82的氨基酸序列的多肽或其變體，并從所 述宿主細(xì)胞分離所述醛。
在一些實(shí)施方案中，所述多肽包含與SEQ ID NO 66、68、70、72、74、76、 78、80或82具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、 至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至 少約98%或至少約99%的同一性的氨基酸序列。
在一些實(shí)施方案中，所述多肽包含具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代、添加、插入或 缺失的SEQ ID NO: 66、68、70、72、74、76、78、80或82的氨基酸序列。在一些實(shí) 施方案中，所述多肽具有還原酶活性。在其他實(shí)施方案中，所述多肽包含具有一個(gè)或多 個(gè)保守型氨基酸取代的SEQIDNO 66、68、70、72、74、76、78、80或82的氨基酸序 列。例如，所述多肽包含一個(gè)或多個(gè)以下保守型氨基酸取代例如丙氨酸、纈氨酸、亮 氨酸和異亮氨酸的脂肪族氨基酸被另一脂肪族氨基酸替換；絲氨酸被蘇氨酸替換；蘇氨 酸被絲氨酸替換；例如天冬氨酸和谷氨酸的酸性殘基被另一酸性殘基替換；諸如天冬酰 胺和谷氨酰胺的攜帶酰胺基的殘基被另一攜帶酰胺基的殘基替換；諸如賴氨酸和精氨酸 的堿性殘基被另一堿性殘基交換；以及諸如苯丙氨酸和酪氨酸的芳香族殘基被另一芳香 族殘基替換。在一些實(shí)施方案中，所述多肽具有約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、 15、20、30、40、50、60、70、80、90、100或更多的氨基酸取代、添加、插入或缺失。 在一些實(shí)施方案中，所述多肽具有還原酶活性。
在其他實(shí)施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO 54、55、56、57、58、59、60、61、62、63或64的氨基酸序列。在某些實(shí)施方案中，所述多肽具有還原酶活性。
在另一方面，本發(fā)明特征為產(chǎn)生醛的方法，所述方法包括在宿主細(xì)胞中表達(dá)多 核苷酸，所述多核苷酸包含與SEQ IDNO 65、67、69、71、73、75、77、79或81具有 至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至 少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少 約98%或至少約99%的序列同一性的核苷酸序列。在一些實(shí)施方案中，所述核苷酸序列 是SEQ ID NO: 65、67、69、71、73、75、77、79或81。在一些實(shí)施方案中，所述方法 還包括從所述宿主細(xì)胞分離所述醛。
在其他實(shí)施方案中，所述核苷酸序列與SEQ ID NO 65、67、69、71、73、75、77、79或81的互補(bǔ)物或其片段雜交，例如，在低嚴(yán)緊性、中嚴(yán)緊性、高嚴(yán)緊性或非 常高的嚴(yán)緊性條件下。
在其他實(shí)施方案中，所述核苷酸序列編碼包含以下的多肽(i)SEQIDNO: 66、68、70、72、74、76、78、80或82的氨基酸序列；或(ii)具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸取 代、添加、插入或缺失的SEQ ID NO 66、68、70、72、74、76、78、80或82的氨基 酸序列。在一些實(shí)施方案中，所述多肽包含具有一個(gè)或多個(gè)保守型氨基酸取代的SEQ ID NO: 66、68、70、72、74、76、78、80或82的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，所述 多肽具有還原酶活性。
在其他實(shí)施方案中，所述核苷酸序列編碼與包含SEQ ID NO: 66、68、70、 72、74、76、78、80或82的氨基酸序列的多肽具有相同生物活性的多肽。在一些實(shí)施 方案中，所述核苷酸序列是SEQ IDNO 65、67、69、71、73、75、77、79或81，或其 片段。在其他實(shí)施方案中，所述核苷酸序列與SEQ ID NO: 65、67、69、71、73、75、 77、79或81的互補(bǔ)物或其片段雜交，例如在低嚴(yán)緊性、中嚴(yán)緊性、高嚴(yán)緊性或非常高的 嚴(yán)緊性條件下。在一些實(shí)施方案中，所述生物活性是還原酶活性。
在一些實(shí)施方案中，所述方法包括用重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，所述重組載體 包含與 SEQ ID NO: 65、67、69、71、73、75、77、79 或 81 具有至少約 70 %、至少 約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少 約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約 99%的序列同一性的核苷酸序列。在一些實(shí)施方案中，所述重組載體還包含可操作地連 接到所述核苷酸序列的啟動(dòng)子。在一些實(shí)施方案中，所述啟動(dòng)子是發(fā)育調(diào)節(jié)性、細(xì)胞器 特異性、組織特異性、誘導(dǎo)型、組成型或細(xì)胞特異性啟動(dòng)子。在具體實(shí)施方案中，所述 重組載體包含至少一個(gè)選自以下的序列(a)可操作地連接到所述核苷酸序列的調(diào)節(jié)序 列；(b)可操作地連接到所述核苷酸序列的選擇標(biāo)記；(C)可操作地連接到所述核苷酸序 列的標(biāo)記序列；(d)可操作地連接到所述核苷酸序列的純化部分；(e)可操作地連接到所 述核苷酸序列的分泌序列；和(f)可操作地連接到所述核苷酸序列的引導(dǎo)序列(targeting sequence) 在某些實(shí)施方案中，所述核苷酸序列被穩(wěn)定并入所述宿主細(xì)胞的基因組 DNA,并且所述核苷酸序列的表達(dá)受可調(diào)型啟動(dòng)子區(qū)的控制。
在本文所述的任何方面中，所述宿主細(xì)胞可以選自哺乳動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞、 昆蟲細(xì)胞、酵母細(xì)胞、真菌細(xì)胞、絲狀真菌細(xì)胞和細(xì)菌細(xì)胞。
在一些實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞是革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞。在其他實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞。
在一些實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞選自以下屬埃希氏菌屬CEscherichia)、 芽孢桿菌屬(Bacillus)、乳酸桿菌屬(Lactcybacillus)、紅球菌屬(Rhodococcus)、假 單胞菌屬(Pseudomonas)、曲霉屬(Aspergillus)、木霉屬(Trichoderma)、脈孢菌屬 (Neurospora)、鐮刀菌屬(Fusarium)、腐質(zhì)霉屬(Humicola)、根毛霉屬(Rhizomucor) > 克魯維酵母菌屬(Kluyveromyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、毛霉菌屬(Mucor)、蝕絲霉屬 (Myceliophtora)、青霉屬(Penicillium)、平革菌屬(Phanerochaete)、側(cè)耳屬(Pleurotus)、 栓菌屬(Trametes)、金黃孢子菌屬(Chrysosporium)、酵母屬M(fèi)accharomyces)、寡養(yǎng)單胞 菌屬(Stenotrophamonas)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)、耳口 氏酵母屬(Yarrowia)或 鏈霉菌屬(Streptomyces)。
在具體實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞為遲緩芽孢桿菌(Bacillus lentus)細(xì)胞、短芽 孢桿菌(Bacillusbrevis)細(xì)胞、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus)細(xì)胞、地衣 芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)細(xì)胞、嗜堿芽孢桿菌(Bacillusalkalophilus)細(xì)胞、凝結(jié) 芽孢桿菌(Bacillus coagulans)細(xì)胞、環(huán)狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)細(xì)胞、短小芽孢桿 菌(Bacilluspumilis)細(xì)胞、蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)細(xì)胞、克勞氏芽孢桿菌 (Bacillus clausii)細(xì)胞、巨大芽孢桿菌(Bacillusii^gaterium)細(xì)胞、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)細(xì)胞或解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)細(xì)胞。
在其他實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞為康氏木霉(Trichodermakoningii)細(xì)胞、綠色木 霉(Trichoderma viride)細(xì)胞、里氏木霉(Trichodermareesei)細(xì)胞、長枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)細(xì)胞、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)細(xì)胞、煙曲霉(Aspergillus fomigates)細(xì)胞、臭曲霉(Aspergillus foetidus)細(xì)胞、構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans) 細(xì)胞、黑曲霉(Aspergillus niger)細(xì)胞、米曲霉(Aspergillus oryzae)細(xì)胞、特異腐質(zhì) 霉(Humicola insolens)細(xì)胞、棉毛狀腐質(zhì)霉(Humicola lanuginose)細(xì)胞、混濁紅球菌 (Rhodococcusopacus)細(xì)胞、米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)細(xì)胞或米黑毛酶(Mucor michei)細(xì)胞。
仍然在其他實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞是淺青紫鏈霉菌Mtreptomyceslividans) 細(xì)胞或鼠灰鏈霉菌Mtreptomycesmurimis)細(xì)胞。在其他實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是放線菌 (Actinomycetes)細(xì)胞。
在一些實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞是CHO細(xì)胞、COS細(xì)胞、VERO細(xì)胞、BHK 細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、Cvl細(xì)胞、MDCK細(xì)胞、293細(xì)胞、3T3細(xì)胞或PC12細(xì)胞。
在具體實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞是大腸桿菌(E.coli)細(xì)胞、例如菌株B、菌株 C、菌株K或菌株W大腸桿菌細(xì)胞。
在其他實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞是藍(lán)細(xì)菌宿主細(xì)胞。在具體實(shí)施方案中，所 述藍(lán)細(xì)菌宿主細(xì)胞是表1中列出的細(xì)胞。
在一些實(shí)施方案中，所述醛是由所述宿主細(xì)胞分泌的。
在某些實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞超表達(dá)本文所述的底物。在一些實(shí)施方案 中，所述方法還包括用編碼本文所述酶的核酸轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，并且所述宿主細(xì)胞超表達(dá) 本文所述的底物。在其他實(shí)施方案中，所述方法還包括在至少一種本文所述的底物的存 在下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述底物是脂肪酸衍生物、?；鵄CP、脂肪酸、?；鵆oA(酰基輔酶A)、脂肪醛、脂肪醇或脂肪酯。
在一些實(shí)施方案中，所述脂肪酸衍生物底物是不飽和脂肪酸衍生物底物、單不 飽和脂肪酸衍生物底物或飽和脂肪酸衍生物底物。在其他實(shí)施方案中，所述脂肪酸衍生 物底物是直鏈脂肪酸衍生物底物、支鏈脂肪酸衍生物底物或包括環(huán)狀部分的脂肪酸衍生 物底物。
在一些實(shí)施方案中，所述脂肪酸衍生物是C3-C2Jg肪酸衍生物。例如，所述脂 肪酸衍生物是 c3、c4、c5、c6、c7、c8、c9、 ClO、Cn、Ci2、Ci3、Ci4、Ci5、Ci6、Ci7、 C18、C19、C20> C21 > C22> C23、Q4或<^5脂肪酸衍生物。在具體實(shí)施方案中，所述脂肪 酸衍生物底物是十四烷酰-ACP、十六烷酰-ACP、十六烯酰-ACP或十八烯酰-ACP。
在本文所述方面的某些實(shí)施方案中，所述醛是C3-Cm醛。例如，所述醛是C3、 C4、C5、C6 Λ C7、C8 Λ C9、ClO、Cn、Ci2、Ci3、C14 Λ Ci5、Ci6、Ci7、Ci8、C19 Λ C2o、 C21 > C22> C23、Q4或Q5醛。在一些實(shí)施方案中，所述醛是十四烷醛、十六烷醛、十六 烯醛、十八烷醛、十八烯醛、甲基十四烷醛、甲基十四烯醛、甲基十六烷醛、甲基十六 烯醛、甲基十八烷醛或甲基十八烯醛。
在一些實(shí)施方案中，所述醛是直鏈醛、支鏈醛或環(huán)狀醛。
在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括從宿主細(xì)胞或從培養(yǎng)基分離所述醛。
在另一方面，本發(fā)明特征為遺傳改造的微生物，其包含穩(wěn)定并入所述微生物的 基因組DNA的外源控制序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述控制序列被整合到多核苷酸的上 游，該多核苷酸包含與SEQ IDNO 65、67、69、71、73、75、77、79或81具有至少約 70%的序列同一性的核苷酸序列。在一些實(shí)施方案中，所述核苷酸序列與SEQ ID NO: 65、67、69、71、73、75、77、79 或 81 具有至少約 75%、至少約 80%、至少約 85%、 至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至 少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%的序列同一性。在一些實(shí)施方案中， 所述核苷酸序列是 SEQIDNO 65、67、69、71、73、75、77、79 或 81。
在一些實(shí)施方案中，所述多核苷酸對(duì)于所述微生物來說是內(nèi)源的。在一些實(shí)施 方案中，所述微生物相對(duì)于野生型微生物表達(dá)水平增高的醛。在一些實(shí)施方案中，所述 微生物是藍(lán)細(xì)菌(cyanobacterium)。
在另一方面，本發(fā)明特征為制造醛的方法，所述方法包括在適于基因表達(dá)的條 件下，培養(yǎng)本文所述的遺傳改造的微生物，并分離所述醛。
在另一方面，本發(fā)明特征為制造醛的方法，所述方法包括使底物與以下接觸 ⑴與SEQ ID NO: 66、68、70、72、74、76、78、80或82的氨基酸序列具有至少70% 的同一性的多肽或其變體；(ii)與 SEQIDNO: 65、67、69、71、73、75、77、79 或 81 具有至少70%的同一性的核苷酸序列所編碼的多肽或其變體；或(iii)包含SEQ ID NO 54, 55、56、57、58、59、60、61、62、63或64的氨基酸序列的多肽。在一些實(shí)施方案 中，所述多肽具有還原酶活性。
在一些實(shí)施方案中，所述多肽與SEQ ID NO 66、68、70、72、74、76、78、 80或82具有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少 約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約 99%的同一性。在一些實(shí)施方案中，所述多肽具有SEQ IDNO 66、68、70、72、74、76、78、80或82的氨基酸序列。
在一些實(shí)施方案中，所述多肽由與SEQ ID NO 65、67、69、71、73、75、77、79或81具有至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、 至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至 少約98%或至少約99%的序列同一性的核苷酸序列編碼。在一些實(shí)施方案中，所述多肽 由具有SEQ ID NO: 65、67、69、71、73、75、77、79或81的核苷酸序列編碼。
在一些實(shí)施方案中，所述生物底物是脂肪酸衍生物、?；鵄CP、脂肪酸、?；?CoA,脂肪醛、脂肪醇或脂肪酯。
在一些實(shí)施方案中，所述脂肪酸衍生物是C3-C2Jg肪酸衍生物。例如，所述脂 肪酸衍生物是 c3、c4、c5、c6、c7、c8、c9、 ClO、Cn、Ci2、Ci3、Ci4、Ci5、Ci6、Ci7、 C18、C19、C20> C21 > C22> C23、Q4或<^5脂肪酸衍生物。在具體實(shí)施方案中，所述脂肪 酸衍生物底物是十四烷酰-ACP、十六烷酰-ACP、十六烯酰-ACP或十八烯酰-ACP。
在某些實(shí)施方案中，所述醛是C3-Q5醛。例如，所述醛是C3、C4、C5、C6、 C7、C8 λ C9、Cio、C11 Λ Ci2、Ci3、Ci4、Ci5、Ci6、Ci7、Ci8、C19 Λ C2o、C2I Λ C22、C23、C24 或(^5醛。在一些實(shí)施方案中，所述醛是十四烷醛、十六烷醛、十六烯醛、十八烷醛、 十八烯醛、甲基十四烷醛、甲基十四烯醛、甲基十六烷醛、甲基十六烯醛、甲基十八烷 醛或甲基十八烯醛。
在一些實(shí)施方案中，所述醛是直鏈醛、支鏈醛或環(huán)狀醛。
在另一方面，本發(fā)明特征為由本文所述的任何方法或微生物所產(chǎn)生的醛。在 具體實(shí)施方案中，所述醛的S "C為約-15.4或更高。例如，所述醛的δ "C為約-15.4 至約-10.9，例如約-13.92至約-13.84。在其他實(shí)施方案中，所述醛的fMMC為至少約 1.003。例如，所述醛的至少約1.01或至少約1.5。在一些實(shí)施方案中，所述醛 的fMwC為約1.111至約1.124。
在另一方面，本發(fā)明特征為產(chǎn)生脂肪醇的方法，所述方法包括在宿主細(xì)胞中產(chǎn) 生包含SEQ ID NO: 66、68、70、72、74、76、78、80或82的氨基酸序列的多肽或其變 體，并且從所述宿主細(xì)胞分離所述脂肪醇。在一些實(shí)施方案中，所述脂肪醇由所述細(xì)胞 分泌。
在一些實(shí)施方案中，所述多肽包含與SEQ ID NO 66、68、70、72、74、76、78、80或82具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、 至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至 少約98%或至少約99%的同一性的氨基酸序列。
在一些實(shí)施方案中，所述多肽包含具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代、添加、插入或 缺失的SEQ ID NO: 66、68、70、72、74、76、78、80或82的氨基酸序列。在一些實(shí) 施方案中，所述多肽具有還原酶活性。在其他實(shí)施方案中，所述多肽包含具有一個(gè)或多 個(gè)保守型氨基酸取代的SEQIDNO 66、68、70、72、74、76、78、80或82的氨基酸序列。例如，所述多肽包含一個(gè)或多個(gè)以下保守型氨基酸取代諸如丙氨酸、纈氨酸、亮 氨酸和異亮氨酸的脂肪族氨基酸被另一脂肪族氨基酸替換；絲氨酸被蘇氨酸替換；蘇氨 酸被絲氨酸替換；諸如天冬氨酸和谷氨酸的酸性殘基被另一酸性殘基替換；諸如天冬酰 胺和谷氨酰胺的攜帶酰胺基的殘基被另一攜帶酰胺基的殘基替換；諸如賴氨酸和精氨酸的堿性殘基被另一堿性殘基交換；以及諸如苯丙氨酸和酪氨酸的芳香族殘基被另一芳香 族殘基替換。在一些實(shí)施方案中，所述多肽具有約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、 15、20、30、40、50、60、70、80、90、100或更多個(gè)氨基酸取代、添加、插入或缺失。 在一些實(shí)施方案中，所述多肽具有還原酶活性。
在其他實(shí)施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO 54、55、56、57、58、59、 60、61、62、63或64的氨基酸序列。在某些實(shí)施方案中，所述多肽具有還原酶活性。
在另一方面，本發(fā)明特征為產(chǎn)生脂肪醇的方法，所述方法包括在宿主細(xì)胞中表 達(dá)多核苷酸，所述多核苷酸包含與SEQ IDNO 65、67、69、71、73、75、77、79或 81具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約 91%,至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約 97%,至少約98%或至少約99%的序列同一性的核苷酸序列。在一些實(shí)施方案中，所述 核苷酸序列是SEQ ID NO 65、67、69、71、73、75、77、79或81。在一些實(shí)施方案 中，所述方法還包括從所述宿主細(xì)胞分離所述脂肪醇。
在其他實(shí)施方案中，所述核苷酸序列與SEQ ID NO 65、67、69、71、73、75、77、79或81的互補(bǔ)物或其片段雜交，例如，在低嚴(yán)緊性、中嚴(yán)緊性、高嚴(yán)緊性或非 常高的嚴(yán)緊性條件下。
在其他實(shí)施方案中，所述核苷酸序列編碼包含以下的多肽(i)SEQIDNO: 66、68、70、72、74、76、78、80或82的氨基酸序列；或(ii)具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸取 代、添加、插入或缺失的SEQ ID NO 66、68、70、72、74、76、78、80或82的氨基 酸序列。在一些實(shí)施方案中，所述多肽包含具有一個(gè)或多個(gè)保守型氨基酸取代的SEQ ID NO: 66、68、70、72、74、76、78、80或82的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，所述 多肽具有還原酶活性。
在其他實(shí)施方案中，所述核苷酸序列編碼與包含SEQ ID NO: 66、68、70、 72、74、76、78、80或82的氨基酸序列的多肽具有相同生物活性的多肽。在一些實(shí)施 方案中，所述核苷酸序列是SEQ IDNO 65、67、69、71、73、75、77、79或81，或其 片段。在其他實(shí)施方案中，所述核苷酸序列與SEQ ID NO: 65、67、69、71、73、75、 77、79或81的互補(bǔ)物或其片段雜交，例如，在低嚴(yán)緊性、中嚴(yán)緊性、高嚴(yán)緊性或非常高 的嚴(yán)緊性條件下。在一些實(shí)施方案中，所述生物活性是還原酶活性。
在一些實(shí)施方案中，所述方法包括用重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，所述重組載體 包含與 SEQ ID NO: 65、67、69、71、73、75、77、79 或 81 具有至少約 70 %、至少 約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少 約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約 99%的序列同一性的核苷酸序列。在一些實(shí)施方案中，所述重組載體還包含可操作地連 接到所述核苷酸序列的啟動(dòng)子。在一些實(shí)施方案中，所述啟動(dòng)子是發(fā)育調(diào)節(jié)性、細(xì)胞器 特異性、組織特異性、誘導(dǎo)型、組成型或細(xì)胞特異性啟動(dòng)子。在具體實(shí)施方案中，所述 重組載體包含至少一個(gè)選自以下的序列(a)可操作地連接到所述核苷酸序列的調(diào)節(jié)序 列；(b)可操作地連接到所述核苷酸序列的選擇標(biāo)記；(C)可操作地連接到所述核苷酸序 列的標(biāo)記序列；(d)可操作地連接到所述核苷酸序列的純化部分；(e)可操作地連接到所 述核苷酸序列的分泌序列；和(f)可操作地連接到所述核苷酸序列的引導(dǎo)序列。在某些實(shí)施方案中，所述核苷酸序列被穩(wěn)定地并入所述宿主細(xì)胞的基因組DNA，并且所述核苷 酸序列的表達(dá)受可調(diào)型啟動(dòng)子區(qū)的控制。
在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括在所述宿主細(xì)胞中表達(dá)編碼重組醇脫氫酶 的基因。
在本文所述的本發(fā)明的任何方面中，所述方法可以產(chǎn)生包含C6-C26脂肪醇的脂 肪醇。在一些實(shí)施方案中，所述脂肪醇包含C6、C7、C8> C9> c10> cn、c12、c13、c14、 C15、C16、C17、C18、C19、C2Q、C21 > C22> C23、C24、Q5 或 C26 脂肪醇。在具體實(shí)施方 案中，所述脂肪醇是1-癸烷醇、1-十二烷醇、1-肉豆蔻醇、1-十六烷醇、十八烯醇、 十四烯醇或十六烯醇。
在其他實(shí)施方案中，所述脂肪醇包含直鏈脂肪醇。在其他實(shí)施方案中，所述脂 肪醇包含支鏈脂肪醇。在其他實(shí)施方案中，所述脂肪醇包含環(huán)狀部分。
在一些實(shí)施方案中，所述脂肪醇是不飽和脂肪醇。在其他實(shí)施方案中，所述脂 肪醇是單不飽和脂肪醇。在其他實(shí)施方案中，所述脂肪醇是飽和脂肪醇。
在另一方面，本發(fā)明特征為由本文所述的任何方法或任何微生物所產(chǎn)生的脂肪 醇，或包含本文所述的任何方法或任何微生物所產(chǎn)生的脂肪醇的表面活性劑。
在一些實(shí)施方案中，所述脂肪醇的δ "C為約-15.4或更高。在某些實(shí)施方案 中，所述脂肪醇的δ 13C為約-15.4至約-10.9，或δ 13C為約-13.92至約-13.84。
在一些實(shí)施方案中，所述脂肪醇的fMWC為至少約1.003。在某些實(shí)施方案中， 所述脂肪醇的fMwC為至少約1.01或至少約1.5。在一些實(shí)施方案中，所述脂肪醇的fMwC 為約1.111至約1.124。
在另一方面，本發(fā)明特征為由SEQ ID NO 65、67、69、71、73、75、77、79或81的不多于約500個(gè)核苷酸組成分離的核酸。在一些實(shí)施方案中，所述核酸由SEQ ID NO: 65、67、69、71、73、75、77、79或81的不多于約300個(gè)核苷酸、不多于約350個(gè) 核苷酸、不多于約400個(gè)核苷酸、不多于約450個(gè)核苷酸、不多于約550個(gè)核苷酸、不多 于約600個(gè)核苷酸或不多于約650個(gè)核苷酸組成。在一些實(shí)施方案中，所述核酸編碼具 有還原酶活性的多肽。
在另一方面，本發(fā)明特征為由不多于約99%、不多于約98%、不多于約97%、 不多于約96%、不多于約95%、不多于約94%、不多于約93%、不多于約92%、不多于 約91%、不多于約90%、不多于約85%或不多于約80%的SEQ ID NO 65、67、69、71、73、75、77、79或81的核苷酸組成的分離的核酸。在一些實(shí)施方案中，所述核酸編 碼具有還原酶活性的多肽。
在另一方面，本發(fā)明特征為由SEQ ID NO 66、68、70、72、74、76、78、80 或82的不多于約200、不多于約175、不多于約150或不多于約100個(gè)氨基酸組成的分離的多肽。在一些實(shí)施方案中，所述多肽具有還原酶活性。
在另一方面，本發(fā)明特征為由不多于約99%、不多于約98%、不多于約97%、 不多于約96%、不多于約95%、不多于約94%、不多于約93%、不多于約92%、不多于 約91%、不多于約90%、不多于約85%或不多于約80%的SEQ ID NO 66、68、70、72、74、76、78、80或82的氨基酸組成的分離的多肽。在一些實(shí)施方案中，所述多肽具 有還原酶活性。
定義
在整個(gè)本說明書中，可以使用縮寫基因名稱或多肽名稱進(jìn)行引用，但是應(yīng)當(dāng)理 解到，該縮寫基因或多肽名稱表示基因或多肽的種類。這些基因名稱包括編碼相同多肽 和具有相同生理功能的同源多肽的所有基因。多肽名稱包括具有相同活性(例如催化相 同基礎(chǔ)化學(xué)反應(yīng)活性)的所有多肽。
本文引用的登錄號(hào)來自美國國立衛(wèi)生研究院(National Institute ofHealth, U.S.Α)所維護(hù)的NCBI數(shù)據(jù)庫(國家生物技術(shù)信息中心(NationalCenter for Biotechnology hiformation))。除非另作說明，登錄號(hào)按照截止到2009年四月的數(shù)據(jù)庫中提供的。
EC號(hào)由國際生物化學(xué)和分子生物學(xué)聯(lián)盟命名委員會(huì)(NomenclatureCommittee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (NC-IUBMB))(可獲取自 http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzvme/)制定。本文引用的EC號(hào)來自由東京大學(xué) 部分資助的京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomics)所維 護(hù)的KEGG配體數(shù)據(jù)庫。除非另作說明，EC號(hào)按照截止到2008年三月的數(shù)據(jù)庫中提供 的。
本文所用冠詞“a”和“an”是指該冠詞的一個(gè)或多于一個(gè)(即至少一個(gè))語 法對(duì)象。作為實(shí)例，“元件(an element)”表示一個(gè)元件或多于一個(gè)元件。
本文所用術(shù)語“約”表示給定數(shù)值的士20%的值。因此，“約60%”表示在 60士 (60 ^ 20% )之間的值(即48至70)。
如本文所用術(shù)語“醛”表示具有通式RCHO的碳?xì)浠衔?，所述RCHO特征為 不飽和羰基(C = O)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述醛是產(chǎn)生自脂肪酸或脂肪酸衍生物的 任何醛。在一個(gè)實(shí)施方案中，R基長度為至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、 12、13、14、15、16、17、18、19 或 20 個(gè)碳。
如本文所用的“醛生物合成基因”或“醛生物合成多核苷酸”是編碼醛生物合 成多肽的核酸。
如本文所用的“醛生物合成多肽”是作為醛的生物合成途徑的部分的多肽。這 些多肽可以作用于生物底物以產(chǎn)生醛。在一些情況下，所述醛生物合成多肽具有還原酶 活性。
如本文所用的術(shù)語“烷”表示僅含有單一碳-碳鍵的碳?xì)浠衔铩?br>
如本文所用的“烷生物合成基因”或“烷生物合成多核苷酸”是編碼烷生物合 成多肽的核酸。
如本文所用的“烷生物合成多肽”是作為烷的生物合成途徑的部分的多肽。這 些多肽可以作用于生物底物以產(chǎn)生烷。在一些情況下，所述烷生物合成多肽具有脫羰酶 活性。
如本文所用的“烯生物合成基因”或“烯生物合成多核苷酸”是編碼烯生物合 成多肽的核酸。
如本文所用的“烯生物合成多肽”是作為烯的生物合成途徑的部分的多肽。這 些多肽可以作用于生物底物以產(chǎn)生烯。在一些情況下，所述烯生物合成多肽具有脫羰酶 活性。
如本文所用的術(shù)語“減弱”表示削弱、降低或縮小。例如，可以通過修飾多肽來減弱多肽以降低其活性(例如，通過修飾編碼所述多肽的核苷酸序列)。
如本文所用的術(shù)語“生物柴油”表示可以作為來源于石油的柴油的替代品的生 物燃料。生物柴油可以以被稱為“純(neat)”生物柴油的純品形式或作為以任何濃度與 基于石油的柴油的混合物用于內(nèi)燃柴油發(fā)動(dòng)機(jī)。生物柴油可以包括酯或碳?xì)浠衔?，?如醛和烷。
如其中所用的術(shù)語“生物燃料”是指來源于生物量的任何燃料。生物燃料可以 替代基于石油的燃料。例如，生物燃料包括運(yùn)輸工具燃料(例如汽油、柴油、噴氣燃料 (jet fuel)等)、燃用燃料和發(fā)電燃料。生物燃料是可再生能源。
如本文使用，術(shù)語“生物量”是指來源于生物材料的碳源。生物量可以被轉(zhuǎn)變 為生物燃料。生物量的一個(gè)示例性來源是植物物質(zhì)。例如，玉米、甘蔗或柳枝稷可以 用作生物量。生物量的另一非限制性實(shí)例是動(dòng)物物質(zhì)，例如牛糞。生物量還包括來自工 業(yè)、農(nóng)業(yè)、林業(yè)和家庭的廢品。可以用作生物量的這些廢品的實(shí)例是發(fā)酵廢渣、秸稈、 無用雜物、污水、垃圾和剩余食物。生物量還包括例如碳水化合物(例如單糖、二糖或 多糖)的碳源。
如本文所用的短語“碳源”是指適于用作原核或簡單真核細(xì)胞生長的碳的來源 的底物或化合物。碳源可以是不同形式的，包括但不限于聚合物、碳水化合物、酸、 醇、醛、酮、氨基酸、肽和氣體(例如CO和CO2)。這些包括，例如各種單糖，例如葡 萄糖、果糖、甘露糖和半乳糖；寡糖，例如低聚果糖和低聚半乳糖；多糖，例如木糖和 阿拉伯糖；二糖，例如蔗糖、麥芽糖和松二糖；纖維素原料，例如甲基纖維素和羧甲基 纖維素鈉；飽和或不飽和脂肪酸酯，例如琥珀酸酯、乳酸酯和醋酸酯；醇，例如乙醇或 其混合物。碳源還可以是光合作用的產(chǎn)物，包括但不限于葡萄糖。優(yōu)選的碳源是生物 量。另一優(yōu)選的碳源是葡萄糖。
如本文所用的“降低濁點(diǎn)的添加劑”是添加到組合物以減少或降低溶液的濁點(diǎn) 的添加劑。
如本文所用的短語“液體的濁點(diǎn)”表示溶解的固體不再完全可溶的溫度。在該 溫度下，固體開始作為第二相沉淀，給予液體渾濁的外觀。在石油工業(yè)中，濁點(diǎn)是指這 樣的溫度在該溫度下固化物質(zhì)或其他重碳?xì)浠衔镌谠汀⑻釤捰突蛉剂现薪Y(jié)晶以形 成渾濁的外觀。固化物質(zhì)的存在影響該液體的流動(dòng)特性、該液體堵塞燃料過濾器、噴嘴 的傾向等、固化物質(zhì)在冷表面(例如管道或熱交換器污垢)上的聚積以及該液體與水的乳 化特性。
如果兩個(gè)序列的每個(gè)堿基都匹配(即能夠形成Watson Crick堿基對(duì))，則核苷酸 序列與另一核苷酸序列是“互補(bǔ)的”。術(shù)語“互補(bǔ)鏈”在本文中與術(shù)語“互補(bǔ)物”互 換使用。核酸鏈的互補(bǔ)物可以是編碼鏈的互補(bǔ)物或非編碼鏈的互補(bǔ)物。
如本文所用的術(shù)語“足以允許表達(dá)的條件”表示允許宿主細(xì)胞產(chǎn)生諸如本文所 述的多肽、醛或烷的所需產(chǎn)物的任何條件。合適的條件包括，例如發(fā)酵條件。發(fā)酵條件 可以包含很多參數(shù)，例如溫度范圍、通氣水平和培養(yǎng)基組分。這些條件中每一個(gè)單獨(dú)地 并聯(lián)合地允許宿主細(xì)胞生長。示例性培養(yǎng)基包括培養(yǎng)液或膠。通常，所述培養(yǎng)基包括諸 如葡萄糖、果糖、纖維素等的碳源，該碳源可以直接被宿主細(xì)胞代謝。此外，培養(yǎng)基中 可以使用酶以便于動(dòng)員(例如淀粉或纖維素的解聚為可發(fā)酵的糖) 和隨后碳源的代謝。
為了確定條件是否足以允許表達(dá)，可以將宿主細(xì)胞培養(yǎng)例如約4、8、12、24、 36或48小時(shí)。培養(yǎng)中和/或培養(yǎng)后，可以獲取樣品并分析樣品以確定該條件是否允許表 達(dá)。例如，可以測試樣品或宿主細(xì)胞在其中生長的培養(yǎng)基中的宿主細(xì)胞的所需產(chǎn)物的存 在。當(dāng)測試產(chǎn)物的存在時(shí)，可以使用諸如但不限于TLC、HPLC> GC/FID、GC/MS、 LC/MS、MS的檢測。
應(yīng)當(dāng)理解到，本文所述的多肽可以具有另外的對(duì)于多肽功能沒有本質(zhì)影響的保 守型或非必需氨基酸取代。特定取代是否會(huì)被允許(即不會(huì)不利地影響例如脫羧酶活性 的所需生物性質(zhì))，可以按照Bowie et al.，Science(1990) 247 13061310中所述進(jìn)行測 定?！氨Ｊ匦桶被崛〈笔前被釟埢痪哂邢嗨苽?cè)鏈的氨基酸殘基所替代的取代。 具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基的家族在本領(lǐng)域中已有定義。這些家族包括具有以下側(cè)鏈的 氨基酸堿性側(cè)鏈(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側(cè)鏈(例如天冬氨酸、谷氨 酸)、不帶電荷的極性側(cè)鏈(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨 酸、半胱氨酸)、非極性側(cè)鏈(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙 氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分枝側(cè)鏈(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳香族 側(cè)鏈(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。
如本文所用的“控制元件”表示轉(zhuǎn)錄控制元件?？刂圃▎?dòng)子和增強(qiáng) 子。術(shù)語“啟動(dòng)子元件”、“啟動(dòng)子”或“啟動(dòng)子序列”是指作為激活基因表達(dá)的開 關(guān)發(fā)揮功能的DNA序列。如果基因被激活，認(rèn)為其被轉(zhuǎn)錄或參與轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄涉及由基 因合成mRNA。因此，啟動(dòng)子充當(dāng)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件并且還提供基因轉(zhuǎn)錄為mRNA的起始 位點(diǎn)?？刂圃c參與轉(zhuǎn)錄的細(xì)胞蛋白特異性相互作用(Maniatis etal，Science 236 1237， 1987)。
如本文所用的術(shù)語“酯合酶”表示能夠產(chǎn)生脂肪酯的肽。更具體而言，酯合酶 是將硫酯轉(zhuǎn)變?yōu)橹觉サ碾?。在?yōu)選的實(shí)施方案中，所述酯合酶將硫酯(例如?；鵆oA) 轉(zhuǎn)變?yōu)橹觉ァ?br>
在可選的實(shí)施方案中，酯合酶使用硫酯和醇作為底物產(chǎn)生脂肪酯。酯合酶能夠 使用短和長鏈硫酯作為底物。此外，酯合酶能夠使用短和長鏈醇作為底物。
酯合酶的非限制性實(shí)例是蠟合酶、蠟酯合酶、?；鵆oA:醇轉(zhuǎn)酰酶、?；D(zhuǎn)移 酶和脂肪酰輔酶A 脂肪醇?；D(zhuǎn)移酶。示例性的酯合酶被分在酶分類號(hào)EC 2.3.1.75 中。示例性的GenBank登錄號(hào)提供于圖40中。
如本文使用，術(shù)語“脂肪酸”表示具有通式RCOOH的羧酸。R表示脂肪族基 團(tuán)，優(yōu)選地表示烷基。R可以包含約4到約22個(gè)碳原子。脂肪酸可以為飽和的、單不 飽和的或多不飽和的。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述脂肪酸由脂肪酸生物合成途徑產(chǎn)生。
如本文所用的術(shù)語“脂肪酸生物合成途徑”表示產(chǎn)生脂肪酸的生物合成途徑。 所述脂肪酸生物合成途徑包括脂肪酸酶，所述脂肪酸酶可以按照本文所述經(jīng)改造產(chǎn)生脂 肪酸，并且在一些實(shí)施方案中可以與其他酶一起表達(dá)以產(chǎn)生具有所需碳鏈特征的脂肪 酸。
如本文所用的術(shù)語“脂肪酸衍生物”表示部分地產(chǎn)生于生產(chǎn)宿主生物體的脂肪 酸生物合成途徑的產(chǎn)物?！爸舅嵫苌铩边€包括部分地產(chǎn)生于酰基ACP或?；鵄CP 衍生物的產(chǎn)物。所述脂肪酸生物合成途徑包括脂肪酸合酶酶類，所述脂肪酸合酶酶類可以按照本文所述經(jīng)改造產(chǎn)生脂肪酸衍生物，并且在一些實(shí)施例中可以與其他酶一起表達(dá) 以產(chǎn)生具有所需碳鏈特征的脂肪酸衍生物。示例性的脂肪酸衍生物包括，例如脂肪酸、 ?；鵆oA、脂肪醛、短和長鏈醇、碳?xì)浠衔?、脂肪醇和?例如蠟、脂肪酸酯或脂肪 酯)。
如本文所用的術(shù)語“脂肪酸衍生酶”表示在脂肪酸衍生物的產(chǎn)生中可以被表達(dá) 或超表達(dá)的所有酶。這些酶在本文統(tǒng)稱為脂肪酸衍生酶。這些酶可以是脂肪酸生物合 成途徑的一部分。脂肪酸衍生酶的非限制性實(shí)例包括脂肪酸合酶、硫酯酶、酰基CoA合 酶、?；鵆oA還原酶、醇脫氫酶、醇?；D(zhuǎn)移酶、脂肪醇形成?；鵆oA還原酶、酯合 酶、醛生物合成多肽和烷生物合成多肽。脂肪酸衍生酶將底物轉(zhuǎn)變?yōu)橹舅嵫苌?。?一些實(shí)施例中，所述底物可以是被脂肪酸衍生酶轉(zhuǎn)變?yōu)椴煌闹舅嵫苌锏闹舅嵫?生物。
如本文所用的術(shù)語“脂肪醇形成肽”表示能夠催化?；鵆oA轉(zhuǎn)變?yōu)橹敬嫉?肽，包括脂肪醇形成?；鵆oA還原酶(FAR，EC111.*)、?；鵆oA還原酶(EC 1.2丄50) 或醇脫氫酶(EC1.L1.1)。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解到，一些脂肪醇形成肽還會(huì)催 化其他反應(yīng)。例如，除脂肪酸外，一些?；鵆oA還原酶肽會(huì)接受其他底物。因此，還 包括這些非特異性肽。編碼脂肪醇形成肽的核酸序列是本領(lǐng)域已知的，并且這些肽是可 公開獲取的。示例性的GenBank登錄號(hào)提供于圖40中。
如本文所用的“脂肪酸酶”表示參與脂肪酸生物合成的任何酶。脂肪酸酶可以 在宿主細(xì)胞中表達(dá)或超表達(dá)以產(chǎn)生脂肪酸。脂肪酸酶的非限制性實(shí)例包括脂肪酸合酶和 硫酯酶。
如本文所用的術(shù)語“脂肪酯”表示酯。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，脂肪酯是產(chǎn)生自 脂肪酸的任何酯，例如脂肪酸酯。在一個(gè)實(shí)施方案中，脂肪酯含有A側(cè)(即連接于羧基 氧的碳鏈)和B側(cè)(即包含母體羧基的碳鏈)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，當(dāng)所述脂肪酯來 源于脂肪酸生物合成途徑時(shí)，A側(cè)由醇貢獻(xiàn)，并且B側(cè)由脂肪酸貢獻(xiàn)。任何醇可以用于 形成脂肪酯的A側(cè)。例如，所述醇可以來自脂肪酸生物合成途徑?？蛇x地，所述醇可以 通過非脂肪酸生物合成途徑產(chǎn)生。此外，所述醇可以是外源提供的。例如，在脂肪酯是 由生物體產(chǎn)生的情況下，所述醇可以提供在發(fā)酵液(fermentation broth)中?？蛇x地，例 如在脂肪酯是由還產(chǎn)生醇的生物體產(chǎn)生的情況下，諸如脂肪酸或乙酸的羧酸可以是外源 提供的。
包含A側(cè)或B側(cè)的碳鏈可以是任何長度。在一個(gè)實(shí)施方案中，酯的A側(cè)的長度 為至少約1、2、3、4、5、6、7、8、10、12、14、16或18個(gè)碳。酯的B側(cè)的長度為至 少約4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、對(duì)或洸個(gè)碳。A側(cè)和/或B側(cè)可以是直 鏈或支鏈。支鏈可以具有一個(gè)或多個(gè)分支點(diǎn)。此外，支鏈可以包括環(huán)狀分支。而且， A側(cè)和/或B側(cè)可以是飽和的或不飽和的。如果是不飽和的，A側(cè)和/或B側(cè)可以具有 一個(gè)或多個(gè)不飽和點(diǎn)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，脂肪酯是生物合成產(chǎn)生的。在該實(shí)施方案中，首先脂肪酸 被“活化”?！盎罨摹敝舅岬姆窍拗菩詫?shí)例是?；鵆oA、?；鵄CP和?；姿猁}。 ?；鵆oA可以是脂肪酸生物合成或降解的直接產(chǎn)物。此外，?；鵆oA可以由游離脂肪 酸、CoA或三磷酸腺苷(ATP)合成。產(chǎn)生?；鵆oA的酶的實(shí)例是?；鵆oA合酶。
在脂肪酸被活化后，其可以被容易地轉(zhuǎn)移到接受體親核體。示例性的親核體為 醇、硫醇或磷酸鹽。
在一個(gè)實(shí)施方案中，脂肪酯是蠟。蠟可以來自長鏈醇和長鏈脂肪酸。在另一實(shí) 施方案中，所述脂肪酯可以來自脂肪?；蝓ズ痛?。在另一實(shí)施方案中，所述脂肪酯是 脂肪酸硫酯，例如脂肪酰輔酶A(CoA)。在其他實(shí)施方案中，所述脂肪酯是脂肪酰基泛 酸酯、?；d體蛋白(ACP)或脂肪磷酸酯。脂肪酯具有很多用途。例如，脂肪酯可以 被用作生物燃料。
如本文所用的“現(xiàn)代碳比例(fraction of modern carbon)”或“fM”與分別由 稱為草酸標(biāo)準(zhǔn)HOxI和HOxII的國家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究院(Nationalhistitute of Standards and Technology(NIST))標(biāo)準(zhǔn)參考物6RMs) 4990B和4990C所定義的具有相同意義?；径?義涉及0.95倍的WC/12C同位素比例HOxI (參考AD 1950)。這粗略地等于衰變校正的工 業(yè)革命前樹木(!decay-corrected pre-Industrial Revolution wood)。對(duì)于現(xiàn)今生命生物圈(植 物物質(zhì))而言，fM約為1.1。
可以按照以下計(jì)算兩個(gè)序列之間“同源性”。序列以最佳比較目的進(jìn)行比對(duì) (例如，可以在第一和第二氨基酸或核酸序列之一或兩者中引入空位用于最佳比對(duì)，并且 為了比較目的可以忽略非同源序列)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，用于比較目的的而比對(duì)的參 考序列長度為參考序列長度的至少約30%、優(yōu)選地至少約40%、更優(yōu)選地至少約50%、 更優(yōu)選地至少約60%并且更優(yōu)選地至少約70%、至少約80%、至少約90%或約100%。 然后比較位于對(duì)應(yīng)氨基酸位置或核苷酸位置的氨基酸殘基或核苷酸。當(dāng)?shù)谝恍蛄兄械奈?置被與第二序列中對(duì)應(yīng)位置相同的氨基酸殘基或核苷酸占據(jù)時(shí)，則分子在該位置是相同 的(如本文所用的，氨基酸或核酸“同一性”等同于氨基酸或核酸“同源性”)。兩個(gè) 序列之間的同一性百分比是序列所共享的相同位置數(shù)的函數(shù)，這考慮到空位數(shù)和每個(gè)空 位的長度，為了兩個(gè)序列的最佳比對(duì)需要引入空位。
可以使用數(shù)學(xué)算法完成序列的比較和兩個(gè)序列之間同源性百分比的測定。在 優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用以下測定兩個(gè)氨基酸序列之間的同源性百分比Needleman和 Wunsch(1970)、J.Mol.Biol.48 444 453的算法，其被并入GCG軟件包中的GAP程序 中，使用Blossum 62矩陣或PAM250矩陣，以及16、14、12、10、8、6或4的空位權(quán)重 和1、2、3、4、5或6的長度權(quán)重。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用以下測定兩個(gè)核苷酸 序列之間的同源性百分比GCG軟件包中的GAP程序，使用NW^apdna.CMP矩陣以及 40、50、60、70或80的空位權(quán)重和1、2、3、4、5或6的長度權(quán)重。特別優(yōu)選的參數(shù)組 (和如果操作者不確定應(yīng)當(dāng)應(yīng)用哪些參數(shù)確定分子是否在要求的同源性限制內(nèi)而應(yīng)該使用 的參數(shù)組)是具有12的空位罰分、4的空位延伸罰分和5的移碼空位罰分的Blossum 62 評(píng)分矩陣。
如本文所用的“宿主細(xì)胞”是用于產(chǎn)生本文所述的產(chǎn)物(例如本文所述的醛或 烷)的細(xì)胞?？梢愿脑焖拗骷?xì)胞以表達(dá)或超表達(dá)所選擇的基因或具有所選擇的基因的減 弱的表達(dá)。宿主細(xì)胞的非限制性實(shí)例包括植物、動(dòng)物、人、細(xì)菌、酵母或絲狀真菌細(xì) 胞。
如本文所用的術(shù)語“在低嚴(yán)緊性、中嚴(yán)緊性、高嚴(yán)緊性或非常高的嚴(yán)緊性條件 下雜交”描述用于雜交和洗滌的條件。進(jìn)行雜交反應(yīng)的指導(dǎo)可以見于Current Protocols19in Molecular Biology (現(xiàn)代分子牛物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)),John Wiley & Sons，N.Y. (1989)， 6.3.1-6.3.6。該參考資料中描述了水性和非水性方法并且可以使用任一方法。本文涉 及的具體雜交條件如下1)低嚴(yán)緊性雜交條件在約45°C下、在6X氯化鈉/檸檬酸鈉 6SC)中，然后是在至少50°C下、在0.2XSSC、0.1% SDS中洗滌兩次(對(duì)于低嚴(yán)緊性條 件，洗滌溫度可以升至55°C) ； 2)中嚴(yán)緊性雜交條件在約45°C下在、在6XSSC中，然 后是在60°C的0.2XSSC、0.1% SDS中洗滌一次或多次；3)高嚴(yán)緊性雜交條件在約45°C 的6XSSC中，然后是在65°C下、在0.2XSSC、0.1 % SDS中洗滌一次或多次；以及優(yōu) 選地4)非常高嚴(yán)緊性雜交條件為65°C的0.5M磷酸鈉、7%SDS，然后是在65°C下、在 0.2XSSC、1% SDS中洗滌一次或多次。除非另作規(guī)定，非常高的嚴(yán)緊性條件(4)是優(yōu) 選的條件。
本文中涉及諸如DNA或RNA的核酸所用的術(shù)語“分離的”是指分別從所述核 酸的天然來源中存在的其他DNA或RNA中隔離的分子。此外，“分離的核酸”包括核 酸片段，例如不是天然存在的片段。本文所用的術(shù)語“分離的”還指從其他細(xì)胞蛋白分 離的多肽，并且包括純化的內(nèi)源多肽和重組多肽兩者。當(dāng)核酸或多肽是通過重組DNA技 術(shù)產(chǎn)生時(shí)，本文使用的術(shù)語“分離的”還指基本上游離于細(xì)胞物質(zhì)、病毒物質(zhì)或培養(yǎng)基 的核酸或多肽。當(dāng)核酸或多肽是化學(xué)合成時(shí)，本文所用的術(shù)語“分離的”還指基本上游 離于化學(xué)前體或其他化學(xué)品的核酸或多肽。
如本文所用的“細(xì)胞中的基因表達(dá)水平”是指由所述細(xì)胞中基因編碼的 mRNA、前體mRNA新生轉(zhuǎn)錄物、轉(zhuǎn)錄加工中間體、成熟mRNA和/或降解產(chǎn)物的水平。
如本文所用的術(shù)語“微生物”表示來自古菌域、細(xì)菌域和真核域的原核和真核 微生物種類，后者包括酵母和絲狀真菌、原生動(dòng)物、藻類或高等原生生物。如本文所用 的術(shù)語“微生物細(xì)胞”表示來自微生物的細(xì)胞。
如本文所用的術(shù)語“核酸”是指多核苷酸，例如脫氧核糖核酸(DNA)以及適當(dāng) 情況下，指核糖核酸(RNA)。該術(shù)語還包括產(chǎn)生自核苷酸類似物的RNA或DNA的類 似物，以及適用于所述實(shí)施方案的單鏈(有義或反義)和雙鏈多核苷酸、EST、染色體、 cDNA、mRNA 禾口 rRNA。
如本文所用的術(shù)語“可操作地連接”表示所選擇的核苷酸序列(例如編碼本文 所述的多肽)與啟動(dòng)子接近以允許所述啟動(dòng)子調(diào)節(jié)該選擇的核苷酸序列的表達(dá)。此外， 按照轉(zhuǎn)錄和翻譯的方向，所述啟動(dòng)子位于所述選擇的核苷酸序列的上游?！翱刹僮鞯剡B 接”表示將核苷酸序列和調(diào)節(jié)序列連接以便當(dāng)合適的分子(例如轉(zhuǎn)錄激活蛋白)與調(diào)節(jié)序 列結(jié)合時(shí)允許基因表達(dá)。
本文所用術(shù)語“或”表示術(shù)語“和/或”并且與術(shù)語“和/或”交換使用，除 非上下文明確表示并非如此。
如本文所用的“超表達(dá)”表示在細(xì)胞中以高于對(duì)應(yīng)野生型細(xì)胞中正常表達(dá)濃度 的濃度表達(dá)核酸、多肽或碳?xì)浠衔锘蚴怪槐磉_(dá)。例如，當(dāng)在重組宿主細(xì)胞中多肽以 與其在相同種類的非重組宿主細(xì)胞中的濃度相比更高的濃度存在時(shí)，所述多肽在所述重 組宿主細(xì)胞中能夠“超表達(dá)”。
如本文所用的“分配系數(shù)”或“P”定義為化合物在有機(jī)相中的平衡濃度除以在水相中(例如發(fā)酵液)平衡時(shí)的濃度。在本文所述的兩相系統(tǒng)的一個(gè)實(shí)施方案中，生 產(chǎn)過程中所述有機(jī)相是由醛或烷形成的。但是，在一些實(shí)施例中，可以例如通過提供辛 烷層來提供有機(jī)相以便于產(chǎn)物分離。當(dāng)描述兩相系統(tǒng)時(shí)，化合物的分配特性可以描述為 logP。例如，IogP為1的化合物會(huì)10 1分配到有機(jī)相。IogP為-1的化合物會(huì)1 10 分配到有機(jī)相。通過選擇合適的發(fā)酵液和有機(jī)相，具有高IogP值的醛或烷在發(fā)酵容器中 也會(huì)分離到有機(jī)相中，即使處于很低的濃度。
如本文所用的術(shù)語“純化(purify)，，、“純化的(purified)，，或“純化 (purification) ”表示通過例如分離或隔離從分子的環(huán)境中移除或分離所述分子?！盎?上純化的”分子為至少約60%、優(yōu)選地至少約75%以及更優(yōu)選地至少約90%游離于與其 相關(guān)的其他組分。如本文所用的這些術(shù)語還指從樣品中去除污染物。例如，污染物的去 除可以導(dǎo)致樣品中醛或烷的百分比增加。例如，當(dāng)醛或烷在宿主細(xì)胞中產(chǎn)生時(shí)，可以通 過去除宿主細(xì)胞蛋白純化醛或烷。純化后，樣品中醛或烷的百分比增加。
術(shù)語“純化(purify)，，、“純化的(purified)，，或“純化(purification)，，不需要絕 對(duì)純。它們是相對(duì)的術(shù)語。因此，例如當(dāng)醛或烷在宿主細(xì)胞中產(chǎn)生時(shí)、純化的醛或純化 的烷是基本與其他細(xì)胞組分(例如核酸、多肽、脂質(zhì)、碳水化合物或其他碳?xì)浠衔?隔 離的醛或烷。在另一實(shí)施例中，純化的醛或純化的烷制劑是這樣的制劑，在該制劑中， 所述醛或烷基本游離于例如可能存在于后續(xù)發(fā)酵的那些污染物。在一些實(shí)施方案中，當(dāng) 樣品重量的至少約50%是由醛或烷組成時(shí)，所述醛或烷是純化的。在其他實(shí)施方案中， 當(dāng)樣品重量的至少約60%、70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 98%或99%或更多 是由醛或烷組成時(shí)，所述醛或烷是純化的。
如本文使用，術(shù)語“重組多肽”是指通過重組DNA技術(shù)產(chǎn)生的多肽，其中通常 將編碼所表達(dá)的多肽或RNA的DNA插入合適的表達(dá)載體，并且所述表達(dá)載體接下來用于 轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞以產(chǎn)生所述多肽或RNA。
如本文所用的術(shù)語“基本相同”(或“基本同源”)是用于指含有足夠數(shù)量的 與第二氨基酸或核苷酸序列相同或等同的(例如具有相似側(cè)鏈，例如保守氨基酸取代)氨 基酸殘基或核苷酸的第一氨基酸或核苷酸序列，這樣所述第一和第二氨基酸或核苷酸序 列具有相似活性。
如本文所用的術(shù)語“合酶”表示催化合成過程的酶。如本文所用的術(shù)語合酶包 括合酶、合成酶和連接酶。
如本文所用的術(shù)語“轉(zhuǎn)染”表示將核酸(例如通過表達(dá)載體)通過核酸介導(dǎo)的 基因轉(zhuǎn)移引入到受體細(xì)胞。
如本文所用的“轉(zhuǎn)化”是指這樣的過程，在該過程中，細(xì)胞的基因型由于細(xì)胞 攝入外源核酸而改變。這可以導(dǎo)致表達(dá)重組形式的RNA或多肽的轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。在由轉(zhuǎn) 移的基因反義表達(dá)的情況下，天然存在形式的多肽的表達(dá)被破壞。
如本文使用，“轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白”是便于一種或多種化合物移入和/或移出細(xì)胞器和/ 或細(xì)胞的多肽。
如本文所用，多肽X的“變體”是指具有多肽X的氨基酸序列的多肽，其中一 個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被改變。所述變體可以具有保守型改變或非保守型改變。使用本領(lǐng) 域熟知的計(jì)算機(jī)程序，例如LASERGENE軟件(DNASTAR)，可以找到確定哪些氨基酸殘基可以被取代、插入或缺失而不影響生物活性的指導(dǎo)。
在用于多核苷酸序列的情況下，術(shù)語“變體”可以包括與基因或其編碼序列的 多核苷酸序列相關(guān)的多核苷酸序列。該定義還可以包括，例如“等位基因”變體、“剪 接”變體、“物種”變體或“多態(tài)性”變體。剪接變體可以與參考多核苷酸具有顯著的 同一性，但是由于在mRNA加工中的可選的外顯子剪接，會(huì)通常具有更多或更少的多核 苷酸數(shù)。對(duì)應(yīng)的多肽可以具有另外的功能結(jié)構(gòu)域或結(jié)構(gòu)域缺失。物種變體是在物種之間 彼此不同的多核苷酸序列。得到的多肽通常會(huì)具有顯著的相對(duì)于彼此的氨基酸同一性。 多態(tài)性變體是在給定物種的個(gè)體之間特定基因的多核苷酸序列中的變異。
如本文所用，術(shù)語“載體”是指能夠轉(zhuǎn)運(yùn)另一核酸的核酸分子，所述核酸分子 連接到所述另一核酸。一種有用的載體是附加體(即能夠染色體外的復(fù)制的核酸)。有 用的載體是能夠自主復(fù)制和/或表達(dá)與其連接的核酸的那些載體。能夠指導(dǎo)基因的表達(dá) 的載體在本文被稱為“表達(dá)載體”，所述載體被可操作地連接到所述基因。通常，在重 組DNA技術(shù)中有用的表達(dá)載體經(jīng)常是“質(zhì)粒”的形式，所述“質(zhì)?！蓖ǔＪ侵冈谄漭d 體形式時(shí)不與染色體結(jié)合的環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)。在本說明書中，因?yàn)橘|(zhì)粒是最通常使用的 載體形式，所以“質(zhì)?！焙汀拜d體”是交換使用的。但是，還包括發(fā)揮等同功能并隨 后至今成為本領(lǐng)域已知的表達(dá)載體的這些其他形式。
除非另外限定，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員通 常理解的具有相同的意義。盡管與本文所述的那些方法和材料相似或等同的方法和材料 可以用于本發(fā)明的實(shí)踐或測試，仍然在下文描述了合適的方法和材料。本文提及的所有 出版物、專利申請(qǐng)、專利和其他參考資料通過引用全文并入。如有沖突，以包括定義在 內(nèi)的本說明書為準(zhǔn)。此外，材料、方法和實(shí)施例僅是舉例說明并不意圖限制。
根據(jù)下文的詳細(xì)描述和權(quán)利要求，本發(fā)明的其他特征和優(yōu)勢會(huì)清晰。
附圖簡述
圖IA是海洋原綠球菌(Prochlorococcus marinus) CCMP1986細(xì)胞產(chǎn)生的碳?xì)浠?物的GC/MS追蹤。圖IB是圖IA的7.55分鐘時(shí)的峰的質(zhì)量裂解譜(mass fragmentation pattern)。
圖2A是點(diǎn)狀念珠藍(lán)細(xì)菌(Nostoc punctiforme)PCC73102細(xì)胞產(chǎn)生的碳?xì)浠衔?的GC/MS追蹤。圖2B是圖2A的8.73分鐘時(shí)的峰的質(zhì)量裂解譜。
圖3A是無類囊體藍(lán)細(xì)菌(Gloeobaceter violaceus) ATCC29082細(xì)胞產(chǎn)生的碳?xì)浠?合物的GC/MS追蹤。圖3B是圖3A的8.72分鐘時(shí)的峰的質(zhì)量裂解譜。
圖4A是集胞藍(lán)細(xì)菌Mynechocystic sp.)PCC6803細(xì)胞產(chǎn)生的碳?xì)浠衔锏腉C/ MS追蹤。圖4B是圖4A的7.36分鐘時(shí)的峰的質(zhì)量裂解譜。
圖5A是集胞藍(lán)細(xì)菌Mynechocystis sp.) PCC6803野生型細(xì)胞產(chǎn)生的碳?xì)浠衔锏?GC/MS追蹤。圖5B是具有S110208和sll0209基因缺失的集胞藍(lán)細(xì)菌PCC6803細(xì)胞產(chǎn)生 的碳?xì)浠衔锏腉C/MS追蹤。
圖6A是大腸桿菌MG1655野生型細(xì)胞產(chǎn)生的碳?xì)浠衔锏腉C/MS追蹤。圖 6B 是表達(dá)細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌 Mynechococcus elongatus) PCC7942YP_400611 (Synpcc7942_l5 94) (SEQ ID NO 65)的大腸桿菌MG1655細(xì)胞產(chǎn)生的碳?xì)浠衔锏腉C/MS追蹤。
圖7 是表達(dá)藍(lán)絲菌(Cyanothece sp.) ATCC51142 cce_1430 (ΥΡ_001802846) (SEQID NO 69)的大腸桿菌細(xì)胞產(chǎn)生的碳?xì)浠衔锏腉C/MS追蹤。
圖8A 是表達(dá)細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌 PCC7942 YP_400611 (Synpcc7942_1594) (SEQ ID NO 65)和細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌 PCC7942YP_40061(KSynpcc7942_1593) (SEQ ID NO 1)的 大腸桿菌細(xì)胞產(chǎn)生的碳?xì)浠衔锏腉C/MS追蹤。圖8B描述圖8A在6.98分鐘時(shí)的峰和 十五烷的質(zhì)量裂解譜。圖8C描述圖8A在8.12分鐘時(shí)的峰和8-十七烯的質(zhì)量裂解譜。
圖9 是表達(dá)細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌 PCC7942 YP_4006lKSynpcc7942_1594) (SEQ ID NO 65)和點(diǎn)狀念珠藍(lán)細(xì)菌 PCC73102 Npun02004178 (ZP00108838) (SEQ ID NO 5)的 大腸桿菌MG1655細(xì)胞產(chǎn)生的碳?xì)浠衔锏腉C/MS追蹤。
圖10 是表達(dá)細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌 PCC7942 YP_400611 (Synpcc7942_1594) (SEQ ID NO 65)和集胞藍(lán)細(xì)菌 PCC6803 sll0208 (NP 442147) (SEQ IDNO 3)的大腸桿菌 MG1655細(xì)胞產(chǎn)生的碳?xì)浠衔锏腉C/MS追蹤。
圖11 是表達(dá)細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌 PCC7942 YP_400611 (Synpcc7942_l594) (SEQ ID NO 65)和念珠藍(lán)細(xì)菌(Nostoc sp.)PCC7210 alr5283 (NP 489323) (SEQ ID NO 7)的大腸 桿菌MG1655細(xì)胞產(chǎn)生的碳?xì)浠衔锏腉C/MS追蹤。
圖12 是表達(dá)細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌 PCC7942 YP_4006lKSynpcc7942_1594) (SEQ ID NO 65)和密碼子優(yōu)化的海濱藍(lán)藻菌(Acaryochloris marina) MBICl 1017 AM1_4041 (YP_001518340) (SEQ ID NO 46)的大腸桿菌MG1655細(xì)胞產(chǎn)生的碳?xì)浠?物的GC/MS追蹤。
圖13 是表達(dá)細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌 PCC7942 YP_4006lKSynpcc7942_1594) (SEQ ID NO: 65)和密碼子優(yōu)化的細(xì)長嗜熱聚球藍(lán)細(xì)菌(Thermosynechococcuselongatus)BP-I tlll313(NP_682103) (SEQ IDNO 47)的大腸桿菌MG1655細(xì)胞產(chǎn)生的碳?xì)浠衔锏腉C/MS追蹤。
圖14 是表達(dá)細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌 PCC7942 YP_4006lKSynpcc7942_1594) (SEQ ID NO 65)和密碼子優(yōu)化的聚球藍(lán)細(xì)菌Mynechococcus sp.) JA-3-3AbCYA_0415 (YP_473897) (SEQ ID NO 48)的大腸桿菌 MG1655 細(xì)胞產(chǎn)生的碳?xì)?化合物的GC/MS追蹤。
圖15 是表達(dá)細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌 PCC7942 YP_400611 (Synpcc7942_l594) (SEQ ID NO 65)和無類囊體藍(lán)細(xì)菌 PCC7421 gll3146 (NP 926092) (SEQ IDNO 15)的大腸桿菌 MG1655細(xì)胞產(chǎn)生的碳?xì)浠衔锏腉C/MS追蹤。
圖16 是表達(dá)細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌 PCC7942 YP_4006lKSynpcc7942_1594) (SEQ ID NO 65)和密碼子優(yōu)化的海洋原綠球菌MIT9313 PMT1231 (NP895059) (SEQ ID NO 49) 的大腸桿菌MG1655細(xì)胞產(chǎn)生的碳?xì)浠衔锏腉C/MS追蹤。
圖17 是表達(dá)細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌 PCC7942 YP_400611 (Synpcc7942_l594) (SEQ ID NO 65)和海洋原綠球菌 CCMP1986 PMM0532 (NP 892650) (SEQID NO 19)的大腸桿 菌MG1655細(xì)胞產(chǎn)生的碳?xì)浠衔锏腉C/MS追蹤。
圖18 是表達(dá)細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌 PCC7942 YP_4006lKSynpcc7942_1594) (SEQ ID NO 65)和密碼子優(yōu)化的海洋原綠球菌NATL2A PMN2A_1863 (YP_293054) (SEQ ID NO: 51)的大腸桿菌MG1655細(xì)胞產(chǎn)生的碳?xì)浠衔锏腉C/MS追蹤。
圖19 表達(dá)細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌 PCC7942 YP_400611 (Synpcc7942_1594) (SEQ ID23NO 65)和密碼子優(yōu)化的聚球藍(lán)細(xì)菌 RS9917 RS9917_09941 (ΖΡ_01079772) (SEQ ID NO: 52)的大腸桿菌MG1655細(xì)胞產(chǎn)生的碳?xì)浠衔锏腉C/MS追蹤。
圖20 是表達(dá)細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌 PCC7942 YP_400611 (Synpcc7942_l594) (SEQ ID NO 65)和密碼子優(yōu)化的聚球藍(lán)細(xì)菌 RS9917 RS9917_12945 (ΖΡ_01080370) (SEQ ID NO 53)的大腸桿菌MG1655細(xì)胞產(chǎn)生的碳?xì)浠衔锏腉C/MS追蹤。
圖21 是表達(dá)細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌 PCC7942 YP_400611 (Synpcc7942_l594) (SEQ ID NO: 65)和藍(lán)絲菌 ATCC51142 cce_0778(YP_001802195MSEQ IDNO : 27)的大腸桿菌 MG1655細(xì)胞產(chǎn)生的碳?xì)浠衔锏腉C/MS追蹤。
圖22 是表達(dá)細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌 PCC7942 YP_4006lKSynpcc7942_1594) (SEQ ID NO 65)和藍(lán)絲菌 PCC7425 Cyan7425_0398 (YP_002481151) (SEQID NO 29)的大腸桿 菌MG1655細(xì)胞產(chǎn)生的碳?xì)浠衔锏腉C/MS追蹤。
圖23 是表達(dá)細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌 PCC7942 YP_4006lKSynpcc7942_1594) (SEQ ID NO 65)和藍(lán)絲菌 PCC7425 Cyan7425_2986 (YP_002483683) (SEQID NO 31)的大腸桿 菌MG1655細(xì)胞產(chǎn)生的碳?xì)浠衔锏腉C/MS追蹤。
圖 24A 是表達(dá)海洋原綠球菌 CCMP1986 PMM0533 (NP_892651) (SEQID NO 71)的大腸桿菌MG1655細(xì)胞產(chǎn)生的碳?xì)浠衔锏腉C/MS追蹤。圖MB是表達(dá)海洋原 綠球菌 CCMP1986 PMM0533(NP_892651) (SEQ IDNO 71)和海洋原綠球菌 CCMP1986 PMM0532 (NP_892650) (SEQ IDNO 19)的大腸桿菌MG1655細(xì)胞產(chǎn)生的碳?xì)浠衔锏?GC/MS追蹤。
圖25A是大腸桿菌MG1655 Δ fadE lacZ::Ptrc ‘tesA-fadD細(xì)胞產(chǎn)生的碳?xì)浠衔?的GC/MS追蹤。圖25B是表達(dá)細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942YP_400611 6ynpcc7942_1594) (SEQ ID NO 65)和海濱藍(lán)藻菌 MBIC11017AM1_4041 (YP_001518340) (SEQ ID NO 9) 的大腸桿菌MG1655 Δ fadElacZ::Ptrc ‘tesA-fadD細(xì)胞產(chǎn)生的碳?xì)浠衔锏腉C/MS追蹤。
圖26A 是表達(dá)集胞藍(lán)細(xì)菌 PCC6803 sll0209 (NP_442146) (SEQ IDNO 67)的 大腸桿菌MG1655 Δ fadE lacZ::Ptrc ‘tesA-fadD細(xì)胞產(chǎn)生的碳?xì)浠衔锏腉C/MS追 蹤。圖 ^B 是表達(dá)集胞藍(lán)細(xì)菌 PCC6803 sll0209(NP_442146) (SEQ ID NO 67)和集 胞藍(lán)細(xì)菌 PCC6803 sll0208 (NP_442147) (SEQ ID NO 3)的大腸桿菌 MG1655 Δ fadE lacZ::Ptrc ‘tesA-fadD細(xì)胞產(chǎn)生的碳?xì)浠衔锏腉C/MS追蹤。
圖27A是表達(dá)恥垢分枝桿菌(M.sn^gmatis)菌株MC2 155MSMEG_5739 (YP_889972) (SEQ ID NO 85)的大腸桿菌 MG1655 Δ fadElacZ::Ptrc ‘tesA-fadD細(xì)胞產(chǎn)生的碳?xì)浠衔锏腉C/MS追蹤。圖27B 是表達(dá)恥垢分枝桿菌菌株MC2 155 MSMEG_5739 (YP_889972) (SEQ IDNO 85)和點(diǎn) 狀念珠藍(lán)細(xì)菌 PCC73102 Npun02004178 (ΖΡ_00108838) (SEQID NO 5)的大腸桿菌 MG1655 Δ fadE lacZ::Ptrc ‘tesA-fadD細(xì)胞產(chǎn)生的碳?xì)浠衔锏腉C/MS追蹤。
圖觀是大腸桿菌MG1655AfadElacZ::Ptrc ‘tesA-fadD細(xì)胞產(chǎn)生的碳?xì)浠?物的圖示，所述細(xì)胞單獨(dú)表達(dá)恥垢分枝桿菌菌株MC2 155MSMEG_5739 (YP_889972) (SEQ ID NO : 85)或表達(dá)恥垢分枝桿菌菌株 MC2 155 MSMEG_5739 (YP_889972) (SEQ ID NO : 85)與以下的組合念珠藍(lán)細(xì)菌 PCC7120 alr5283 (SEQ ID NO : 7)、點(diǎn) 狀念珠藍(lán)細(xì)菌 PCC73102Npun02004178 (SEQ ID NO : 5)、海洋原綠球菌 CCMP1986PMM0532 (SEQID NO 19)、無類囊體藍(lán)細(xì)菌 PCC7421 gll3146 (SEQ ID NO 15)、聚球 藍(lán)細(xì)菌 RS9917_0994KSEQ IDNO 23)、聚球藍(lán)細(xì)菌 RS9917_12945 (SEQ IDNO 25)或 海濱藍(lán)藻菌 MBIC11017AM1_404KSEQIDNO 9)。
圖^A是I型核糖核酸酶還原酶亞基β蛋白R(shí)NRi^的三維結(jié)構(gòu)展示。圖^B 是海洋原綠球菌ΜΙΤ9313 PMT1231 (NP_895059) (SEQ ID NO 17)的三維結(jié)構(gòu)的展示。 圖^C是海洋原綠球菌MIT9313 PMT1231 (NP_895059) (SEQ ID NO 17)的活性位點(diǎn)三維結(jié)構(gòu)的展示。
圖 30A 是表達(dá)點(diǎn)狀念珠藍(lán)細(xì)菌 PCC73102 Npun02004178 (ΖΡ_00108838) (SEQ ID NO 5)的大腸桿菌MG1655細(xì)胞產(chǎn)生的碳?xì)浠衔锏腉C/MS追蹤。圖30B是表達(dá)點(diǎn) 狀念珠藍(lán)細(xì)菌 PCC73102Npun02004178(ZP 00108838) Y123F 變體的大腸桿菌 MG1655 細(xì) 胞產(chǎn)生的碳?xì)浠衔锏腉C/MS追蹤。圖30C是表達(dá)點(diǎn)狀念珠藍(lán)細(xì)菌PCC73102Npun020 04178 (ΖΡ_00108838) Y126F變體的大腸桿菌MG1655細(xì)胞產(chǎn)生的碳?xì)浠衔锏腉C/MS追S示ο
圖31 描述了使用點(diǎn)狀念珠藍(lán)細(xì)菌 PCC73102 Npun02004178 (ZP_00108838) (SEQ ID NO 6)和十八烷醛(A) ； Npun02004178(ZP_00108838) (SEQ ID NO 6)、十八烷 醛、菠菜鐵氧還蛋白還原酶和NADPH(B)；十八烷醛、菠菜鐵氧還蛋白、菠菜鐵氧還蛋 白還原酶和 NADPH(C)；或 Npun02004178(ZP_00108838MSEQ ID NO 6)、菠菜鐵氧 還蛋白和菠菜鐵氧還蛋白(D)，體外產(chǎn)生的碳?xì)浠衔锏腉C/MS追蹤。
圖32 描述了 使用點(diǎn)狀念珠藍(lán)細(xì)菌 PCC73102 Npun02004178 (ΖΡ_00108838) (SEQ ID NO 6), NADPH、十八烷醛和(A)菠菜鐵氧還蛋白和菠菜鐵氧還蛋白還 原酶；(B)點(diǎn)狀念珠藍(lán)細(xì)菌 PCC73102Npun020036^ (ΖΡ_00109192) (SEQ ID NO 88)和點(diǎn)狀念珠藍(lán)細(xì)菌 PCC73102 Npun02001001 (ZP_00111633) (SEQ ID NO 90)； (C)Npun02003626(ZP_00109192) (SEQ ID NO 88)和點(diǎn)狀念珠藍(lán)細(xì)菌 PCC73102 Npun02003530(ZP_00109422) (SEQ ID NO 92)；或(D)Npun020036^ (ZP_00109192) (SEQ ID NO 88)和點(diǎn)狀念珠藍(lán)細(xì)菌 PCC73102 Npun02003123 (ZP_00109501) (SEQ ID NO 94)，體外產(chǎn)生的碳?xì)浠衔锏腉C/MS追蹤。
圖33A是使用十八酰CoA、 細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942 YP_400611 (Synpcc7942_1594) (SEQ ID NO 66)、NADH 和 Mg2+ 體外產(chǎn)生的碳?xì)浠衔?的GC/MS追蹤。圖33B是使用十八酰CoA、細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942YP_400611 Myn pcc7942_1594) (SEQ ID NO 66)、NADPH 和 Mg2+ 體外產(chǎn)生的碳?xì)浠衔锏?GC/MS 追 蹤。圖33C是使用十八酰CoA、細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌卩07942￥ _40061167叩(^7942_1594) (SEQ ID NO 66)和NADPH體外產(chǎn)生的碳?xì)浠衔锏腉C/MS追蹤。
圖34A是使用十八酰CoA、標(biāo)記的NADPH、細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942 YP_400611 (Synpcc7942_l 594) (SEQ ID NO 66)和未標(biāo)記的 NADPH 體外產(chǎn)生的碳?xì)?化合物的GC/MS追蹤。圖34B是使用十八酰CoA、標(biāo)記的NADPH、細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌 PCC7942 YP_400611 (Synpcc7942_1594) (SEQ ID NO 66)禾Π S44」H)NADPH 體外產(chǎn)生 的碳?xì)浠衔锏腉C/MS追蹤。圖34C是使用十八酰CoA、標(biāo)記的NADPH、細(xì)長聚球 藍(lán)細(xì)菌 PCC7942 YP_400611 (Synpcc7942_1594) (SEQ ID NO 66)和 R-0」H) NADPH 體 外產(chǎn)生的碳?xì)浠衔锏腉C/MS追蹤。
圖35是由Che-9培養(yǎng)基中的表達(dá)細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942YP_400611 6ynpcc7 942_1594) (SEQ IDNO 65)的大腸桿菌MG1655 Δ fadE細(xì)胞所產(chǎn)生的無細(xì)胞上清中碳?xì)?化合物的GC/MS追蹤。
圖36是由Che-9培養(yǎng)基中的表達(dá)細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942YP_400611 6ynpcc7 942_1594) (SEQ ID NO 65)和點(diǎn)狀念珠藍(lán)細(xì)菌 PCC73102 Npun02004178 (ZP_00108838) (SEQ ID NO 5)的大腸桿菌MG1655 Δ fadE細(xì)胞所產(chǎn)生的無細(xì)胞上清中碳?xì)浠衔锏?GC/MS追蹤。
圖37 是表達(dá)念珠藍(lán)細(xì)菌 PCC7120 alr5283 (NP_489323) (SEQ IDNO 7)和念珠藍(lán) 細(xì)菌 PCC7120 alr5284 (NP_489324) (SEQ ID NO 81)的大腸桿菌 MG1655 細(xì)胞產(chǎn)生的碳 氫化合物的GC/MS追蹤。
圖38是來自宏基因組數(shù)據(jù)庫的細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942 YP_400610 (Synpcc7942_1593) (SEQ ID NO 1)的同系物的實(shí)例列表。
圖39是來自宏基因組數(shù)據(jù)庫的細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942 YP_400611 (Synpcc7942_1594) (SEQ ID NO 65)的同系物的實(shí)例列表。
圖40是鑒定出可以被表達(dá)、超表達(dá)或減弱以增加特定底物的產(chǎn)生的各種基因的 表。
詳細(xì)描述
本發(fā)明提供了從例如?；鵄CP、脂肪酸、?；鵆oA、脂肪醛的底物或脂肪醇底 物(例如PCT/US08/058788中所述的，在此通過引用特別并入)產(chǎn)生醛、脂肪醇和碳?xì)?化合物(例如烷、烯和炔)的組合物和方法。此類醛、烷和烯作為生物燃料(例如汽油、 柴油、噴氣燃料等的替代品)、特種化學(xué)品(例如潤滑劑、燃料添加劑等)或用于后續(xù)化 學(xué)轉(zhuǎn)變(例如，燃料、聚合物、塑料、紡織品、溶劑、粘合劑等)的原料是有用的。本 發(fā)明部分地基于參與醛、烷和烯生物合成的基因的鑒定。
這些烷和烯生物合成基因包括，例如細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌 PCC7942Synpcc7942_1593 (SEQ ID NO 1)、集胞藍(lán)細(xì)菌 PCC6803 sll0208 (SEQ IDNO 3)、點(diǎn)狀念珠藍(lán)細(xì)菌 PCC73102 Npun02004178 (SEQ ID NO 5)、念珠藍(lán)細(xì)菌 PCC 7120 alr5283 (SEQ ID NO : 7)、海濱藍(lán)藻菌 MBICl 1017AM 1_4041 (SEQ ID NO : 9)、細(xì)長嗜 熱聚球藍(lán)細(xì)菌 BP-I tlll313 6EQ IDNO : 11)、聚球藍(lán)細(xì)菌 JA-3-3A CYA_0415 (SEQ ID NO: 13),無類囊體藍(lán)細(xì)菌 PCC7421 gll3146(SEQ IDNO : 15),海洋原綠球菌 MIT9313 PM 123 (SEQ ID NO 17)、狹義的海洋原綠球菌 pastoris 亞種(Prochlorococcusmarinus subsp.pastoris str.) CCMP1986 PMM0532 (SEQ ID NO 19)、狹義的海洋原綠球菌 (Prochlorococcus marinus str.)NATL2A PMN2A_1863 (SEQ ID NO 21)、聚球藍(lán)細(xì)菌 RS9917 RS9917_09941 (SEQ ID NO : 23)、聚球藍(lán)細(xì)菌 RS9917 RS9917_12945 (SEQ ID NO 25)、藍(lán)絲菌 ATCC51142cce_0778 6EQ ID NO : 27)、藍(lán)絲菌 PCC7245 Cyan7425DRAFT_1220(SEQIDNO 29)、藍(lán)絲菌 PCC7245 cce_0778 NEQ ID NO : 31)、 多變魚腥藍(lán)細(xì)菌(Anabaena variabilis) ATCC29413 YP_323043 (Ava_2533) (SEQ ID NO 33)和細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌 PCC6301 YP_170760 (syc0050_d) (SEQ ID NO 35)。其他烷和烯 生物合成基因在表1和圖38中列出。
醛生物合成基因包括，例如細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942Synpcc7942_1594(SEQID NO 65)、集胞藍(lán)細(xì)菌 PCC6803 sll0209 (SEQ IDNO 67),藍(lán)絲菌 ATCC51142 cce_1430 (SEQ ID NO 69)、狹義的海洋原綠球菌 pastoris 亞種 CCMP1986 PMM0533 (SEQ ID NO 71)、無類囊體藍(lán)細(xì)菌 PCC7421 NP_96091 (gll3145) (SEQ ID NO 73)、點(diǎn)狀念珠藍(lán)細(xì)菌PCC73102 ΖΡ_00108837 (Npun02004176) (SEQ ID NO 75)、 多變魚腥藍(lán)細(xì)菌ATCC29413 YP_323044 (Ava_2534) (SEQ ID NO 77)、細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌 PCC6301 YP_170761 (syc0051_d) (SEQ ID NO 79)和念珠藍(lán)絲菌 PCC7120 alr5284 (SEQ ID NO 81)。其他醛生物合成基因在表1和圖39中列出。
使用本文所述的方法，使用一個(gè)或多個(gè)本文所述的醛、烷和/或烯生物合成基 因或多肽或所述基因或多肽的變體，利用宿主細(xì)胞或無細(xì)胞方法，可以制備醛、脂肪 醇、烷和烯。
表1.藍(lán)細(xì)菌基因組中醛和烷生物合成基因同系物
藍(lán)細(xì)菌烷生物合成基因醛生物合成基因登錄號(hào)%ID登錄號(hào)%ID細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌PCC 7942YP_400610100YP—400611100細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌PCC 6301ΥΡ_170760100YP_170761100原型彳效稍藍(lán)細(xì)菌(Microcoleus chthonoplastes)FCC 7420EDX7501977EDX7497870極大節(jié)旋藍(lán)細(xì)菌04廠iArcw/^.ra maxima) CS-328EDZ9496378EDZ9496868林氏藍(lán)細(xì)菌(丄ywg^ya sp.) PCC 8106ΖΡ_0161957577ΖΡ0161957469泡沐節(jié)球藍(lán)細(xì)菌{Nodularia spumigena) CCY9414ΖΡ_0162809677ΖΡ_0162809570紅海束毛藍(lán)細(xì)菌(Thichodesmium erythraeum) IMSlOlΥΡ—72197976ΥΡ_72197869銅綠微囊藍(lán)細(xì)菌(MicracjKyto aeruginosa) NIES-843ΥΡ00166032375ΥΡ00166032268銅綠微囊藍(lán)細(xì)菌PCC 7806CA09078074CA09078167念珠藍(lán)細(xì)菌(iVostoc sp.) PCC 7120ΝΡ_48932374ΝΡ_48932472Nostoc azollae 0708EEG0569273EEG0569370多變魚月星藍(lán)細(xì)菌ATCC 29413ΥΡ32304374ΥΡ_32304473Crocosphaera watsonii WH 8501ΖΡ_0051470074ΖΡ0051692067集胞藍(lán)細(xì)菌PCC 6803ΝΡ—44214772ΝΡ_44214668聚球藍(lán)細(xì)菌PCC 7335EDX8680373EDX8787067藍(lán)絲菌ATCC 51142ΥΡ_00180219573ΥΡ_00180284667藍(lán)絲菌CCYOl 10ΖΡ_0172857872ΖΡ_0172862068點(diǎn)狀念珠藍(lán)細(xì)菌PCC 73102ΖΡ—0010883872ΖΡ_0010883771海濱藍(lán)藻菌MBIC11017ΥΡ00151834071ΥΡ00151834166藍(lán)絲菌PCC 7425ΥΡ00248115171ΥΡ00248115270藍(lán)絲菌PCC 8801ΖΡ—0294145970ΖΡ0294271669細(xì)長嗜熱聚球藍(lán)細(xì)菌BP-1ΝΡ_68210370ΝΡ_68210270聚球藍(lán)細(xì)菌JA-2-3B’a(2-13)ΥΡ47863968ΥΡ—47863863聚球藍(lán)細(xì)菌RCC307YPOO122784267YPOO122784164聚球藍(lán)細(xì)菌WH 7803ΥΡ_00122437768YPOO122437865聚球藍(lán)細(xì)菌WH 8102ΝΡ 89782970NP一89782865聚球藍(lán)細(xì)菌WH 7805ΖΡ_0112321468ΖΡ_0112321565未培養(yǎng)的海洋A型聚球藍(lán)細(xì)菌GOM 3012ABD9637670ABD9637565聚球藍(lán)細(xì)菌JA-3-3AbΥΡ_47389768YP 一4 73 8 9662
28
權(quán)利要求
1.產(chǎn)生醛的方法，所述方法包括在宿主細(xì)胞中產(chǎn)生包含SEQIDNO 66、68、70、 72、74、76、78、80或82的氨基酸序列的多肽或其變體，并從所述宿主細(xì)胞分離所述醛。
2.產(chǎn)生醛的方法，所述方法包括在宿主細(xì)胞中產(chǎn)生多肽并從所述宿主細(xì)胞分離所述 醛，所述多肽包含與SEQ ID NO 66、68、70、72、74、76、78、80或82具有至少約 70%同一性的氨基酸序列。
3.產(chǎn)生醛的方法，所述方法包括在宿主細(xì)胞中產(chǎn)生多肽，所述多肽包含具有一個(gè)或 多個(gè)氨基酸取代、添加、插入或缺失的SEQ ID NO 66、68、70、72、74、76、78、80 或82的氨基酸序列，其中所述多肽具有還原酶活性。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其中所述多肽包含具有一個(gè)或多個(gè)保守型氨基酸取代的 SEQ ID NO 66、68、70、72、74、76、78、80 或 82 的氨基酸序列。
5.產(chǎn)生醛的方法，所述方法包括在宿主細(xì)胞中表達(dá)多核苷酸并從所述宿主細(xì)胞分離 所述醛，所述多核苷酸包含與SEQ IDNO 65、67、69、71、73、75、77、79或81具有 至少約70%的序列同一性的核苷酸序列。
6.產(chǎn)生醛的方法，所述方法包括在宿主細(xì)胞中表達(dá)多核苷酸，所述多核苷酸與SEQ ID NO 65、67、69、71、73、75、77、79或81的核苷酸序列的互補(bǔ)物或其片段雜交， 其中所述多核苷酸編碼與包含IDNO : 66、68、70、72、74、76、78、80或82的多肽具 有相同生物活性的多肽。
7.如權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中所述多肽或所述多核苷酸來自 藍(lán)細(xì)菌。
8.產(chǎn)生醛的方法，所述方法包括用重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞并從所述宿主細(xì)胞分離所 述醛，所述重組載體包含與SEQ ID NO 65、67、69、71、73、75、77、79或81具有至 少約70%的序列同一性的核苷酸序列。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述重組載體還包含可操作地連接到所述核苷酸序 列的啟動(dòng)子。
10.如權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中所述宿主細(xì)胞選自哺乳動(dòng)物 細(xì)胞、植物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、酵母細(xì)胞、真菌細(xì)胞、絲狀真菌細(xì)胞和細(xì)菌細(xì)胞。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其中所述宿主細(xì)胞是大腸桿菌(E.coli)細(xì)胞。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述大腸桿菌細(xì)胞是菌株B、菌株C、菌株K或 菌株W大腸桿菌細(xì)胞。
13.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述宿主細(xì)胞產(chǎn)生由所述重組載體的核苷酸序列 所編碼的多肽。
14.如權(quán)利要求10所述的方法，其中所述醛由所述宿主細(xì)胞分泌。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述醛包含C13-C21醛。
16.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述醛選自十四烷醛、十六烷醛、十六烯醛、 十八烷醛、十八烯醛、甲基十四烷醛、甲基十四烯醛、甲基十六烷醛、甲基十六烯醛、 甲基十八烷醛和甲基十八烯醛。
17.如權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，還包括在至少一種所述多肽或所 述核苷酸序列編碼的多肽的生物底物的存在下，培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述底物是脂肪酸衍生物。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述脂肪酸衍生物是C14-C22脂肪酸衍生物。
20.如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述脂肪酸衍生物選自十四烷酰-ACP、十六烷 酰-ACP、十六烯酰-ACP、十八烯酰-ACP及它們的衍生物。
21.遺傳改造的微生物，其包含穩(wěn)定并入所述微生物的基因組DNA中位于多核苷酸 的上游的外源控制序列，所述多核苷酸包含與SEQ IDNO 65、67、69、71、73、75、 77、79或81具有至少約70%的序列同一性的核苷酸序列，其中所述微生物相對(duì)于野生型 微生物產(chǎn)生水平增高的醛。
22.如權(quán)利要求21所述的微生物，其中所述微生物是藍(lán)細(xì)菌。
23.產(chǎn)生醛的方法，所述方法包括在適于基因表達(dá)的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求21所述的微 生物。
24.通過權(quán)利要求1-20和23所述方法的任一方法產(chǎn)生的醛。
25.如權(quán)利要求24所述的醛，其中所述醛的δ13C為約-15.4或更大。
26.如權(quán)利要求24所述的醛，其中所述醛的fM14C為至少約1.003。
27.制造醛的方法，所述方法包括使底物與以下接觸(i)包含SEQIDNO : 66、 68、70、72、74、76、78、80或82的氨基酸序列的多肽或其變體；或者(ii)與SEQ ID NO: 65、67、69、71、73、75、77、79或81具有至少70 %的同一性的核苷酸序列所編 碼的多肽或其變體。
28.如權(quán)利要求27所述的方法，其中所述醛包含C13-C21醛。
29.如權(quán)利要求27所述的方法，其中所述醛選自十四烷醛、十六烷醛、十六烯醛、 十八烷醛、十八烯醛、甲基十四烷醛、甲基十四烯醛、甲基十六烷醛、甲基十六烯醛、 甲基十八烷醛和甲基十八烯醛。
30.如權(quán)利要求29所述的方法，其中所述底物選自十四烷酰-ACP、十六烷酰-ACP、 十六烯酰-ACP、十八烯酰-ACP及它們的衍生物。
31.產(chǎn)生醛的方法，所述方法包括在宿主細(xì)胞中產(chǎn)生包含SEQIDNO 54、55、56、 57、58、59、60、61、62、63或64的氨基酸序列的多肽，其中所述多肽具有還原酶活 性。
32.如權(quán)利要求31所述的方法，其中所述多肽來自藍(lán)細(xì)菌。
33.如權(quán)利要求31或32所述的方法，其中所述宿主細(xì)胞選自哺乳動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì) 胞、昆蟲細(xì)胞、酵母細(xì)胞、真菌細(xì)胞、絲狀真菌細(xì)胞和細(xì)菌細(xì)胞。
34.如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述宿主細(xì)胞是大腸桿菌細(xì)胞。
35.如權(quán)利要求31所述的方法，其中所述醛由所述宿主細(xì)胞分泌。
36.如權(quán)利要求31所述的方法，其中所述醛包含C13-C21醛。
37.如權(quán)利要求36所述的方法，其中所述醛選自十四烷醛、十六烷醛、十六烯醛、 十八烷醛、十八烯醛、甲基十四烷醛、甲基十四烯醛、甲基十六烷醛、甲基十六烯醛、 甲基十八烷醛和甲基十八烯醛。
38.如權(quán)利要求31-37中任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，還包括在至少一種所述多肽的 生物底物的存在下，培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞。
39.如權(quán)利要求38所述的方法，其中所述底物是脂肪酸衍生物。
40.如權(quán)利要求39所述的方法，其中所述脂肪酸衍生物選自十四烷酰-ACP、十六烷 酰-ACP、十六烯酰-ACP、十八烯酰-ACP及它們的衍生物。
41.制造醛的方法，所述方法包括使底物與包含SEQID NO 54、55、56、57、58、 59、60、61、62、63或64的氨基酸序列的多肽接觸，其中所述多肽具有還原酶活性。
42.如權(quán)利要求41所述的方法，其中所述醛包含C13-C21醛。
43.如權(quán)利要求42所述的方法，其中所述醛選自十四烷醛、十六烷醛、十六烯醛、 十八烷醛、十八烯醛、甲基十四烷醛、甲基十四烯醛、甲基十六烷醛、甲基十六烯醛、 甲基十八烷醛和甲基十八烯醛。
44.如權(quán)利要求41所述的方法，其中所述底物是脂肪酸衍生物。
45.如權(quán)利要求44所述的方法，其中所述底物選自十四烷酰-ACP、十六烷酰-ACP、 十六烯酰-ACP、十八烯酰-ACP及它們的衍生物。
46.產(chǎn)生脂肪醇的方法，所述方法包括在宿主細(xì)胞中產(chǎn)生包含SEQIDNO 66、68、 70、72、74、76、78、80或82的氨基酸序列的多肽或其變體，并從所述宿主細(xì)胞分離所 述脂肪醇。
47.產(chǎn)生脂肪醇的方法，所述方法包括在宿主細(xì)胞中產(chǎn)生多肽并且從所述宿主細(xì)胞分 離所述脂肪醇，所述多肽包含與SEQ IDNO 66、68、70、72、74、76、78、80或82具 有至少約70%的同一性的氨基酸序列。
48.產(chǎn)生脂肪醇的方法，所述方法包括在宿主細(xì)胞中表達(dá)多核苷酸并從所述宿主細(xì)胞 分離所述脂肪醇，所述多核苷酸包含與SEQ ID NO : 65、67、69、71、73、75、77、79 或81具有至少約70%的序列同一性的核苷酸序列。
49.產(chǎn)生脂肪醇的方法，所述方法包括用重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞并從所述宿主細(xì)胞分 離所述脂肪醇，所述重組載體包含與SEQ ID NO : 65、67、69、71、73、75、77、79或 81具有至少約70%的序列同一性的核苷酸序列。
50.如權(quán)利要求46-49中任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，還包括在所述宿主細(xì)胞中表達(dá) 編碼重組醇脫氫酶的基因。
51.如權(quán)利要求50所述的方法，其中所述脂肪醇由所述宿主細(xì)胞分泌。
52.如權(quán)利要求50所述的方法，其中所述脂肪醇包含C6-C26脂肪醇。
53.如權(quán)利要求50所述的方法，其中所述脂肪醇是1-癸烷醇、1-十二烷醇、1-肉豆 蔻醇、1-十六烷醇、十八烯醇、十四烯醇或十六烯醇。
54.如權(quán)利要求50所述的方法，其中所述脂肪醇包含直鏈脂肪醇。
55.如權(quán)利要求50所述的方法，其中所述脂肪醇包含支鏈脂肪醇。
56.如權(quán)利要求50所述的方法，其中所述脂肪醇包含環(huán)狀部分。
57.如權(quán)利要求50所述的方法，其中所述脂肪醇是不飽和脂肪醇。
58.如權(quán)利要求50所述的方法，其中所述脂肪醇是單不飽和脂肪醇。
59.如權(quán)利要求50所述的方法，其中所述脂肪醇是飽和脂肪醇。
60.分離的核酸，其由SEQ ID NO: 65、67、69、71、73、75、77、79 或 81 的不多 于500個(gè)核苷酸組成。
61.分離的核酸，其由不多于90%的 SEQ IDNO 65、67、69、71、73、75、77、79 或81的核苷酸組成。
62.如權(quán)利要求60或61所述的核酸，其中所述核酸編碼具有還原酶活性的多肽。
63.分離的多肽，其由SEQ ID NO: 66、68、70、72、74、76、78、80 或 82 的不多 于200個(gè)氨基酸組成。
64.分離的多肽，其由不多于90%的 SEQ IDNO 66、68、70、72、74、76、78、80 或82的氨基酸組成。
65.如權(quán)利要求63或64所述的分離的多肽，其中所述多肽具有還原酶活性。
全文摘要
本為描述了用于產(chǎn)生諸如醛、烷和烯的碳?xì)浠衔锏慕M合物和方法。某些碳?xì)浠衔锟捎糜谏锶剂稀?br>
文檔編號(hào)C12N9/88GK102027109SQ200980117664
公開日2011年4月20日 申請(qǐng)日期2009年5月18日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月16日
發(fā)明者安德里亞斯·席爾默, 謝恩·布魯貝克, 馬修·路德 申請(qǐng)人:Ls9公司