專利名稱：腫瘤細胞惡性程度的評價方法
技術領域：
本發明涉及一種腫瘤細胞惡性程度的評價方法。具體而言，本發明涉及的方法是 從含有腫瘤細胞的試樣制備含受體酪氨酸激酶(receptor typetyrosine kinase,以下稱 “RTK”)的細胞膜級分，在有RTK活性抑制劑和無RTK活性抑制劑的條件下測定該細胞膜級 分中的RTK酶活性，通過比較所得結果評價腫瘤細胞惡性程度的方法。
背景技術：
細胞的細胞膜中存在被稱為RTK的激酶。已知這種激酶在細胞分化和增殖中發揮 著重要作用。作為RTK，已知有胰島素樣生長因子受體(IGFR)、血小板衍生的生長因子受體 (PDGFR)、人類表皮細胞生長因子受體(HER)、血管內皮細胞生長因子受體(VEGFR)等。根據迄今為止的研究，已發現某個特定的RTK會在某個特定的腫瘤細胞中過度表 達。比如已知HER中的一種——HER2在乳腺癌中基因和蛋白質的表達量增加。因此，一 般認為，通過調查乳腺癌患者的HER2的存在量可預測乳腺癌的復發可能性。據報告，作為 HER2抑制劑的抗體藥物赫賽汀(注冊商標；通用名曲妥珠單抗)對乳腺癌有治療效果。同樣，對其他RTK的基因和/或蛋白質的表達量與腫瘤細胞增殖和轉移的關系也 在進行研究。對RTK靶向的抑制藥劑抑制腫瘤細胞增殖的效果和抑制腫瘤細胞轉移的效果 也在進行研究。比如，Sirotnak 等(臨床癌癥研究(Clinical Cancer Research)，vol. 6， p. 4885-4892，2000 ；非專利文獻1)用RT-PCR法測定HER之一的HER1 (也稱“EGFR”)的基 因在肺癌和前列腺癌腫瘤細胞中的表達量(參照上述文獻的圖1)。并對HER1抑制劑易瑞 沙(Iressa)(注冊商標；通用名吉非替尼)對腫瘤細胞增殖的影響進行了研究(參考上 述文獻的圖3)。Sirotnak等人根據這些結果報告，HER1表達量最高的腫瘤細胞株(A-431) 的增殖因易瑞沙得到了最大程度的抑制。此結果顯示，越是HER1表達量多的腫瘤細胞，易 瑞沙抑制增殖的效果越高。對此，Ciardiello等(臨床癌癥研究(Clinical Cancer Research), vol. 7, p. 1459-1465,2001 ；非專利文獻2)表示，HER1的表達量與易瑞沙IC50(藥物抑制50%細 胞增殖的濃度(PM))未必一定相關。具體而言，HER1的表達量在MCF-7ADR、0VCAR-3和 SW480株中很高，在ZR-75-1和KAT0III株中很低(參考上述文獻的表1)。另一方面，易瑞 沙IC50的值在ZR-75-1和KAT0III株中和在MCF_7ADR、0VCAR_3和SW480株中一樣低(參 考上述文獻的表2)。因此可以知道，與HER1的表達量無關，這些細胞株被易瑞沙在同樣程 度上抑制了增殖。這些研究結果表明，像HER1這種RTK基因和/或蛋白質的表達量與RTK抑制劑對 腫瘤細胞增殖的抑制效果之間未必一定有相關關系。非專利文獻1 Francis M. Sirotnak等“抑制人類腫瘤異種移植的細胞毒性藥物， 在通過一種叫做ZD1839(易瑞沙)的表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑的合成后，其 功效明顯增強” (“Efficacy of Cytotoxic Agentsagainst Human Tumor Xenograftsls
4Markedly Enhanced By Coadministration of ZD1839(Iressa), a Inhibitor of EGFR Tyrosine Kinase”)，臨床癌癥研究(Clinical Cancer Research), vol. 6, p. 4885-4892, 2000非專利文獻2 :Ciardiello等“通過ZD1839 (易瑞沙)，一種選擇性表皮 生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑，來抑制增長因子的生成和人體內癌細胞的血管生 成，，(“Inhibition of Growth Factor Production andAngiogenesis in Human Cancer Cells by ZD1839(Iressa), a SelectiveEpidermal Growth Factor Receptor Tyrosine Kinase Inhibitor”)，臨床癌癥研究(Clinical Cancer Research), vol. 7, p. 1459-1465, 200
發明內容
發明要解決的課題本發明者們著眼于測定RTK的酶活性(以下稱“RTK活性”)，而非RTK的基因和蛋 白質的量——即表達量。因此，本發明的課題是提供一種根據RTK活性的測定結果評價腫 瘤細胞惡性程度的方法。解決問題的手段本發明提供一種評價腫瘤細胞惡性程度的方法，包括以下步驟(1)從含有腫瘤細胞的試樣中制備含有RTK的細胞膜級分(membrancefraction)，(2)使在步驟(1)獲得的細胞膜級分與RTK活性抑制劑接觸，(3)使在步驟(2)獲得的與RTK活性抑制劑接觸的細胞膜級分與與至少針對二種 RTK的底物接觸，通過測定被磷酸化的底物，測定在有第一 RTK活性抑制劑的情況下的RTK 活性(第一 RTK活性)，(4)使在步驟(1)獲得的細胞膜與在步驟(3)使用的底物同樣的底物接觸，而不 接觸第一 RTK活性抑制劑，通過測定被磷酸化的底物，測定在沒有RTK活性抑制劑情況下的 RTK活性(對照RTK活性)，(5)根據上述第一 RTK活性和對照RTK活性，評價有第一 RTK活性抑制劑情況下的 上述腫瘤細胞的惡性程度。發明效果按照本發明的方法，通過測定含腫瘤細胞的試樣的RTK活性，就可方便地評價在 RTK活性抑制劑存在的條件下腫瘤細胞的增殖能力、轉移能力等惡性程度。根據本發明的 方法，從患者身上采集腫瘤細胞，測定該腫瘤細胞的RTK活性，就可以在短時間內簡便地知 道該患者的癌癥惡性程度。因此易于獲得決定對患者的有效治療方針(如所用抗癌藥的種 類)等的指標。
圖1為顯示實施例1結果的雷達圖。圖2為顯示實施例1結果的雷達圖。圖3為關于細胞增殖能力的比較例1的結果圖。圖4為關于腫瘤大小的比較例2的結果圖。
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圖5為關于細胞生存能力的比較例3的結果圖。圖6為關于細胞VEGF分泌能力的比較例4的結果圖。圖7為關于細胞浸潤能力的比較例5的結果圖。圖8為關于細胞趨化能力的比較例6的結果圖。
具體實施例方式本發明者們著眼于測定RTK活性，而非RTK的基因和蛋白質的表達量。而且，本發 明者們還著眼于這樣的報告—RTK有很多種類， -RTK受配體的刺激而形成同型二聚體，進行信號傳遞。但是，RTK不僅如此，還形 成包括異型二聚體或四聚體在內的多聚體，這些都參與腫瘤細胞的增殖，—HER1和HER2以外的RTK也參與癌細胞增殖和/或轉移。因此，本發明者們認為，不僅測定特定的RTK(比如HER1和HER2)，也測定多種 RTK(如PDGFR、VEGFR等)的活性對于更正確地獲得有關腫瘤細胞增殖和轉移的信息是很 重要的。因此，本發明提供的方法用對至少二種RTK有特異性的底物測定有RTK活性抑制 劑時和沒有RTK活性抑制劑時的RTK活性，以此能夠測定多種RTK活性。在本說明書中，所謂“腫瘤細胞的惡性程度”包括腫瘤細胞的增殖能力、轉移能力 等。最好腫瘤細胞的惡性程度就是腫瘤細胞的增殖能力和/或轉移能力。上述“增殖能力” 包括細胞生存的能力、細胞通過增大其體積而生長的能力等。上述“轉移能力”包括腫瘤細 胞從原病灶移走，依附于其他組織和器官的能力、腫瘤細胞分泌VEGF(血管內皮細胞生長 因子)的分泌能力、腫瘤細胞的趨化性(游走性；腫瘤細胞移動的能力)及浸潤能力(腫瘤 細胞浸潤到組織的能力)等。在本說明書中，RTK是存在于細胞膜的受體型酪氨酸激酶，也稱跨膜型酪氨酸激 酶。RTK包括胰島素受體(IR)、胰島素樣生長因子受體(IGFR)、血小板衍生的生長因子受 體(PDGFR)、成纖維細胞生長因子受體(FGFR)、人類表皮細胞生長因子受體(HER)、血管內 皮細胞生長因子受體(VEGFR)等。這些受體分別已知有幾個亞族，比如HER已知有HER1、HER2、HER3、HER4等。在本發明的方法中，首先是從含有腫瘤細胞的試樣制備含有RTK的細胞膜級分。上述含有腫瘤細胞的試樣可以來源于生物體的樣本，也可以來源于培養細胞系腫 瘤細胞獲得的培養物。來自生物體的樣本比如有從生物體(患者)采集的組織(腫瘤組織、 器官組織、淋巴結組織、血液等)或體腔清洗液等。含有RTK的細胞膜級分的制備可以采取從含有上述腫瘤細胞的試樣中分離細胞 質的方法、即從細胞質分離出RTK結合的細胞膜級分的方法。最好方法中包括將上述腫瘤 細胞在適當的緩沖液(以下稱“均質化試劑”)中破碎，從所得破碎液中獲取非溶性級分，將 該非溶性級分和含有表面活性劑的增溶劑混合，從所得混合液中獲取可溶性級分。使用上述均質化試劑破碎獲得的破碎液用離心分離等適當方法可以區分出可溶 性級分(如上清)和非溶性級分(如沉淀物)。該可溶性級分包括來源于細胞質的蛋白質 等，該非溶性級分包括保持有各種RTK的細胞膜碎片。
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可以通過比如離心分離等適當的方法將上述混合液區分為可溶性級分(如上清) 和非溶性級分(如沉淀物)。該可溶性級分包含被表面活性劑溶解(膠粒化)的、保持有各 種RTK的細胞膜，該非溶性級分含有非溶性蛋白質和DNA等。含有RTK的細胞膜級分最好所含RTK可以形成同型二聚體和異型二聚體這種多聚 體、在保持立體結構的狀態下保持在細胞膜中。最好這種RTK在保持在細胞膜中的狀態下 被表面活性劑膠粒化，分散在溶液中。如上所述，制備含有RTK的細胞膜級分可以測定腫瘤細胞所具有的各種RTK的酶活性。上述細胞破碎可以通過能將細胞膜斷成片的方法進行。比如一些眾所周知的方 法吸移管吸入排出、通過冷凍溶解破碎細胞、渦動攪拌器攪拌、用攪切器破碎、用杵加壓、 用超聲波處理裝置進行超聲波處理等。上述均質化試劑在破碎細胞時為防止RTK變性而使用。均質化試劑的pH以不 使RTK變性和失活、可以在穩定狀態下回收的范圍即可，無特別限定。均質化試劑的pH以 pH4. 0-9. 0 為宜，pH4. 5-8. 5 更好，最好是 pH 5. 0-8. 0。均質化試劑最好含有緩沖劑。緩沖劑有磷酸緩沖劑、醋酸緩沖劑、檸檬酸緩沖齊U、 MOPS (3-嗎啉代丙烷磺酸)、HEPES(2-[4-(2-羥乙基)_1_哌嗪]乙磺酸)、Tris (三羥甲基 氨基甲烷)、tricine(N-[三(羥基甲基)甲基]甘氨酸))等。上述增溶劑中所含表面活性劑無特別限定，只要能夠膠粒化已斷片化的細胞膜、 不使細胞膜中所含RTK分解和變性即可。帶電荷的表面活性劑有可能與RTK結合使其立 體結構發生變化，因此，最好使用不與RTK結合的非離子型表面活性劑。這種非離子型表 面活性劑比如可列舉出基本構造有十二烷基醚、十六烷基醚、十八烷基醚、p-t-辛基苯基 醚等的活性劑。具體而言，非離子型表面活性劑有乙基苯基聚乙二醇(NP-40，殼牌國際石 油有P艮公司(Shell International Petroleum Company Limited)的注冊商標)、曲拉通 (Triton)-X(聯合碳化化學品及塑料公司(Union Carbide Chemicals&PlasticsInc.)的注 冊商標)、吐溫(Tween) (ICI美國公司(ICIAmericasInc.)的注冊商標)、Brij (ICI美國公 司(ICIAmericas Inc.)的注冊商標)、Emulgen (花王的注冊商標)等。增溶劑中的表面活 性劑濃度以0. 05-5%為宜，0. 1-3%更好，最好是0. 1-1%。上述增溶劑最好含有與用于均質化試劑的緩沖劑同樣的緩沖劑。該增溶劑最好有 與均質化試劑同樣的PH值。上述均質化試劑和增溶劑也可以含有蛋白酶抑制劑、脫磷酸化酶抑制劑、防止SH 基氧化的試劑(以下稱“SH基穩定劑”)等。蛋白酶抑制劑可以用于防止RTK被細胞中所含蛋白酶分解。蛋白酶抑制劑比如 有諸如乙二胺四乙酸(EDTA)和乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA)那樣的金屬蛋白酶抑制 劑；苯甲基磺酰氟(PMSF)、胰朊酶抑制劑、胰凝乳朊酶等絲氨酸蛋白酶抑制劑；碘代乙酰胺 和E-64等半胱氨酸蛋白酶抑制劑等。這些蛋白酶抑制劑可單獨使用也可混合使用。也可以使用蛋白酶抑制劑混合液(SIGMA公司)那種事先將多種蛋白酶抑制劑混 合在一起的市場銷售品。脫磷酸化酶抑制劑可以用于防止RTK的活性因細胞內所含脫磷酸化酶而下降。脫 磷酸化酶抑制劑比如有正釩酸鈉(Na3VO4)、氟化納(NaF)和岡田酸等。脫磷酸化抑制劑既
7可單獨使用也可混合使用。SH基穩定劑可用于防止RTK失活。酶所具有的SH基被氧化，易于形成穩定的二硫 化物。二硫化物的形成會引起酶的立體結構發生變化，有時會成為酶失活的原因。用于防 止SH基的氧化的SH基穩定劑可以使用含有SH基的試劑。SH基穩定劑比如有二硫蘇糖醇 (DTT)、2_巰基乙醇、谷胱甘肽、半胱氨酸、同型半胱氨酸、輔酶A和二氫硫辛酸等。當SH基穩定劑為DTT時，上述均質化試劑和/或增溶劑中的SH基穩定劑濃度應 為0. 05 2mM，0. 07 1. 7mM更好，最好為0. 1 1. 5mM。比如，如果SH基穩定劑為2-巰 基乙醇,則以0. 1 15mM為宜，0. 3 13mM更好，最好為0. 5 12mM。使按以上所述制備的、含RTK的細胞膜級分與RTK活性抑制劑接觸。RTK活性抑制 劑只要能抑制RTK的活性即可，無特別限定。RTK活性抑制劑已知有與RTK的三磷酸腺苷 (ATP)結合位點結合的抑制劑(以下稱“ATP競爭抑制劑”或“ATP競爭RTK活性抑制劑”)、 與RTK的底物結合位點結合的抑制劑、與RTK胞外域(如配體結合位點)結合的抑制劑等。 最好RTK活性抑制劑是RTK的ATP競爭抑制劑。RTK的ATP競爭抑制劑比如有易瑞沙(阿斯利康公司)、格列衛(GLIVEC，NOVARTIS 公司)、特羅凱(tarceva, OSI 公司)、PD153035 (Calbiochem 公司)、AG1478 (Calbiochem 公司)、4557W(EGFR/ErbB-2抑制劑)(Calbiochem公司)、PDGF受體酪氨酸激酶抑制劑 III (Calbiochem公司)、VEGF受體酪氨酸激酶抑制劑III (Calbiochem公司)等。與RTK底物結合位點結合的抑制劑有酪氨酸磷酸化抑制劑(tyrphostin ； Calbiochem 公司)等。與RTK胞外域結合的抑制劑有赫賽汀(Genentech公司)、愛必妥(Cetuximab ；英 克隆(ImClone)公司)、帕妥珠單抗(pertuzumab ；Genentech公司)等。上述接觸通常在溶液中進行。溶液中的RTK活性抑劑濃度可以根據該抑制劑的種類、底物的濃度、后述磷酸基 供應體(如ATP)等適當設定。比如當使用ATP競爭抑制劑作為RTK活性抑制劑時，抑制劑 的濃度可以設定為是磷酸基供應體(具體地說就是ATP)的濃度的0. 1 10倍。在本發明的方法中，讓與上述RTK活性抑制劑接觸的細胞膜級分與至少針對二種 RTK的底物接觸，通過測定磷酸化底物，測定有RTK活性抑制劑存在條件下RTK活性(第一 RTK活性)。該測定最好是混合上述細胞膜級分、上述底物和磷酸基供應體，測定被RTK活性 磷酸化的底物。通過此RTK介入的反應，磷酸基供應體的磷酸基被取入底物，測定磷酸化的 底物就可以測定RTK的活性。上述至少針對二種RTK的底物最好是對RTK種類特異性低的底物(以下稱“通用 底物”)或者對特定RTK特異性高的底物幾種組合在一起的底物混合物。用這種底物測定 RTK活性，可以測定試樣中所含數種RTK的活性。對特定RTK特異性高的底物，比如可以是對HERl特異性高的底物Grb2、髓鞘堿性 蛋白(MBP)、組朊 H2B (HH2B)、磷脂酶 C- γ 等。像 GST-EGFR 基板(GST-EGFR substrate) (Stratagene公司)這種市場出售的底物也可以作為對HERl有高特異性的底物使用。 GST-EGFR基板(GST-EGFR substrate)是谷胱甘肽_S_轉移酶(GST)和被HERl的酶活性磷 酸化的合成底物的融合蛋白質。
上述通用底物對RTK種類的特異性很低，即是針對多種RTK的底物。因此，合成 的通用底物最好是對RTK種類的特異性很低的眾所周知的合成肽。合成肽具體而言最好 是由含谷氨酸殘基和酪氨酸殘基的氨基酸序列組成，該合成肽比如有聚(Poly) (Glu4-Tyr) (生物素共軛(biotin conjugate), UPSTATE公司)這種市場銷售的合成肽。此外，合成 肽，如有Norio Sasaki 等，1985，生物化學雜志(The Journal of Biological Chemistry), Vol. 260，No. 17,9793 9804、Sergei Braun 等，1984，生物化學雜志(The Journal ofBiological Chemistry)，Vol. 259，No. 4，2051 2054 以及 Μ. Abdel-Ghany 等，1990，國 家禾斗學院項目(Proceeding of The National Academy ofScience), Vol. 87, 7061 7065 等文獻中作為酪氨酸激酶的底物列舉的合成肽。這些文獻記載的合成肽由含谷氨酸殘基 (Glu)和酪氨酸殘基(Tyr)的氨基酸序列組成，合成為Tyr被二種以上酪氨酸激酶磷酸化。上述合成肽的氨基酸序列具體而言可舉出以下序列由四個Glu和一個Tyr組成的序列重復二次以上形成的氨基酸序列(以后稱“氨 基酸序列a”)；由一個Glu和一個Tyr組成的序列重復二次以上形成的氨基酸序列(以后稱“氨 基酸序列b”)；由六個Glu、一個Tyr和三個氨基丙酸殘基(Ala)組成的序列重復二次以上形成的 氨基酸序列(以后稱“氨基酸序列c”)；由一個Glu、一個Tyr和一個Ala組成的序列重復二次以上形成的氨基酸序列(以 后稱“氨基酸序列d”)；由二個Glu、一個Tyr、六個Ala和五個賴氨酸殘基(Lys)組成的序列重復二次以 上形成的氨基酸序列(以后稱“氨基酸序列e”)。Tony Hunter，1982，生物化學雜志(The Journal of Biological Chemistry)，Vol. 257，No. 9,4843 4848 的文獻中，有報告說酸 性氨基酸殘基對酪氨酸激酶磷酸化Tyr很重要。因此，用含有大量酸性氨基酸殘基Glu的 氨基酸序列a和氨基酸序列c作為上述底物特別理想。上述磷酸基供應體如有腺苷三磷酸(ATP)、腺苷5’ -0-(3-硫代三磷酸) (ATP- γ S)、32P標記的腺苷5，-0-(3-三磷酸)(y- (32P) -ATP)、腺苷二磷酸(ADP)、腺苷單 磷酸(AMP)等。上述磷酸化底物的測定最好是從其他蛋白質分離出磷酸化底物，檢測該底物。為要從其他蛋白質分離出磷酸化底物，上述底物可以有親和標記。通過使用有親 和標記的底物和有可與親和標記結合的物質(以下稱“結合物”)的固相可以使從其他蛋白 質分離出磷酸化底物并加以回收這一操作變得很容易。具體而言，回收磷酸化底物與上述 固相的復合物，分解該復合物中的親和標記和固相所具有的結合物之間的結合，即可回收 底物。上述親和標記只要具有相應結合物、且不妨礙底物與RTK的結合和底物磷酸化即 可，無特別限定。親和標記比如可用多肽、半抗原等。具體而言，可以使用GST、組氨酸、麥 芽糖結合蛋白質、FLAG肽(SIGMA公司)、Myc標記、血凝素(HA)標記、鏈球菌(Str印)標記 (IBA GmbH公司)、生物素、親和素和鏈親和素等。有上述親和標記的底物比如可以是上述底物和上述親和標記進行化學結合的產 物。或者，當親和標記是多肽時，也可以將含有編碼底物和親和標記的融合蛋白質的重組基因的載體導入宿主，回收宿主產生的融合蛋白質進行使用。對于與上述親和標記相應的結合物，沒有特別限定，只要是能與親和標記可逆性 結合的物質即可，如有谷胱甘肽、鎳、直鏈淀粉、抗FLAG抗體(SIGMA公司)、抗Myc抗體、 抗 HA 抗體、Str印-Tactin (IBA GmbH 公司)等。上述固相只要是能與上述結合物結合的載體即可，無特別限定。固相材質如有多 糖類、塑料、玻璃等。固相的形態如微球(Beads)、凝膠等。固相具體來說如有瓊脂糖凝膠 球、瓊脂糖球、磁性微球、玻璃微球、硅凝膠等。這些固相也可填充到柱中使用。親和標記與有結合物的固相的組合舉例如下當選擇GST為親和標記時，固相可以用谷胱苷肽瓊脂糖凝膠球(以下稱“谷胱苷肽 球”)。在此組合情況下的具體的RTK活性測定比如可如下進行。使與RTK活性抑制劑接觸 過的細胞膜級分與GST所結合的底物接觸，在此加入谷胱苷肽球，獲得磷酸化底物結合的 谷胱苷肽球。回收此谷胱苷肽球后，添加還原型谷胱苷肽，則得以分解GST與谷胱苷肽球的 結合，回收底物。或者先讓GST結合的底物與谷胱苷肽球接觸，獲得該底物與谷胱苷肽球的復合 物。讓已與RTK活性抑制劑接觸的細胞膜級分與該復合物接觸并將其回收。在此添加還原 型谷胱苷肽，分解GST和谷胱苷肽球的結合，也可以回收到底物。如果選擇組氨酸作為親和標記，則有結合物的固相可以用鎳瓊脂糖球。組氨酸與 鎳的結合比如可以用甘氨酸-HCl等酸或咪唑分離。若選麥芽糖結合蛋白質作為親和標記，則有結合物的固相可以用直鏈淀粉磁球。 麥芽糖結合蛋白質與直鏈淀粉的結合可以添加游離的直鏈淀粉來分解。如果選FLAG肽作為親和標記，則有結合物的固相可以用FLAG親和凝膠(SIGMA公 司)。FLAG肽與FLAG親和凝膠的結合比如可以用甘氨酸-HCl等酸或3XFLAG肽(SIGMA 公司)來分解。如果選Myc標記作為親和標記，則有結合物的固相可以用結合了抗Myc抗體的瓊 脂糖球。如果選擇HA標記作為親和標記，則有結合物的固相可以用結合了抗HA抗體的瓊 脂糖球。Myc標記和抗Myc抗體的結合、HA標記和抗HA抗體的結合都可以通過例如添加酸 或堿使蛋白質變性來使之分解。此時，最好選擇可以將變性的蛋白質還原的酸或堿，具體而 言，如酸可用鹽酸等，堿可用苛性鈉等。如果選擇Str印標記作為親和標記，則有結合物的固相可以用Str印-Tactin固相 凝膠柱(IBA GmbH公司)。Str印標記和Str印-Tactin的結合比如可以用與鏈親和素可逆 性反應的脫硫生物素來分解。也可以在讓RTK與上述底物接觸后，在回收磷酸化的底物之前用加熱處理、冷卻 處理或添加EDTA等酶抑制劑等處理停止酶反應。酶反應再進行下去有可能造成各個試樣 的測定結果參差不齊，如上所述停止酶反應，可以避免出現這種情況。最好讓標記物結合到如上所述從固相分離出來的、磷酸化的底物，通過檢測該標 記物，來測定磷酸化的底物。標記物如有熒光物質、酶、放射性同位素等，但不限于此。熒光 物質如有熒光素、香豆素、曙紅、菲繞啉、芘、若丹明等。酶如有堿性磷酸酶、過氧化物酶等。
10放射性同位素如有 32P、33P、131I、125I、3H、14C、35S 等。如果以酶為標記物，上述檢測可以通過檢測與這些酶的底物反應產生的顯色來實 現。當酶是堿性磷酸酶時，底物可以是氯化硝基四氮唑藍(NBT)和5-溴-4-氯-3-吲哚基 磷酸鹽(BCIP)的混合物等。如果酶是過氧化物酶(PO)，底物則可以是二氨基聯苯胺(DAB)。磷酸化底物與標記物的結合可以采用通常的方式。比如可以使用有標記物并能夠 與磷酸化底物特異性結合的抗體(以下稱“磷酸化底物識別抗體”)，使標記物與磷酸化底 物結合。磷酸化底物與標記物的結合還可以使用磷酸化底物識別抗體和能與該磷酸化底 物識別抗體結合且有標記物的抗體(以下稱“二次抗體”)。此時，通過磷酸化底物識別抗 體和二次抗體可以將標記物結合到磷酸化底物。磷酸化底物和標記物的結合還可以使用磷酸化底物識別抗體、有生物素的二次抗 體和有標記物的親和素。此時可以通過磷酸化底物識別抗體、二次抗體、生物素和親和素使 標記物結合到磷酸化底物。二次抗體可以有親和素，生物素可以有標記物。磷酸化底物和標記物的結合還可以使用有生物素的磷酸化底物識別抗體和有標 記物的親和素或用有親和素的磷酸化底物識別抗體和有標記物的生物素。使用以上標記物，檢測該標記物產生的信號，以此可檢出磷酸化底物，測定RTK活 性。上述磷酸化底物識別抗體和二次抗體可以是用眾所周知的方法制備的的抗體。獲 得抗體的方法，比如有從接種抗原進行免疫的動物血液獲得、重組基因獲得等。該抗體可以 是多克隆抗體或單克隆抗體中任意一種，也可以是抗體的碎片及其誘導體。也可以將這些 抗體二種以上混合起來使用。抗體碎片及其誘導體如有Fab碎片、F(ab’)碎片、？(油)2碎 片、sFv 碎片等(Blazar 等，1997，免疫學雜志(Journal of Immunology), 159 5821-5833 及Bird等，1988，科學(Science)，242 :423_426)等。抗體的類型可以是IgG、IgM等。檢測磷酸化底物的方法可根據標記物種類適當選擇。例如，當標記物是熒光物或 酶時，可用免疫印跡法檢測磷酸化底物。將SDS-PAGE等電泳分離的磷酸化底物印跡到膜 上，在含有磷酸化底物識別抗體的緩沖液中培養該膜，使該抗體與磷酸化底物結合，再讓有 標記物的二次抗體與磷酸化底物識別抗體結合，通過檢測此標記物即可測定磷酸化底物。 當磷酸化底物有上述親和標記時，可以使用該親和標記分離磷酸化底物，通過狹線印跡法 取代免疫印跡法，和用免疫印跡法時同樣地測定磷酸化底物。當標記物是熒光物時，也可以將含磷酸化底物的溶液裝入試管，加入有熒光物的 磷酸化底物識別抗體并使其與磷酸化底物結合，測定熒光強度，以此檢測磷酸化底物。如果標記物是酶，則可以用酶聯免疫吸附法(ELISA法)檢測磷酸化底物。ELISA 法含直接吸附法和夾心法。直接吸附法是一種包括將磷酸化底物直接吸附于固相的方法，如將磷酸化底物吸 附于固相表面，使含酶的磷酸化底物識別抗體與磷酸化底物結合，用酶的底物使磷酸化底 物識別抗體含有的所述酶顯色，檢測該顯色即可。夾心法是一種用識別磷酸化底物不同位點的二種磷酸化底物識別抗體檢測磷酸 化底物的方法。這種方法比如可以讓磷酸化底物識別抗體結合到固相(以后稱“固相抗 體”)，讓磷酸化底物與固相抗體結合。讓含有酶的磷酸化底物識別抗體(以后稱“標記抗
11體”)與該磷酸化底物結合，該標記抗體所具有的酶與該酶的底物發生反應而顯色，檢測該 顯色即可。如果標記物為放射性同位素，則可以用放射線免疫分析法(RIA)檢測磷酸化底 物。具體而言，可以使有放射性同位素的磷酸化底物識別抗體與磷酸化底物結合，用閃爍計 數器等測定放射線，檢測磷酸化底物。本發明的方法中所包含的測定沒有RTK活性抑制劑情況下的RTK活性(對照RTK 活性)的步驟除不讓上述細胞膜級分與上述RTK活性抑制劑接觸這一點外，均與上述第一 RTK活性的測定步驟相同。本發明的方法包括根據上述第一 RTK活性和對照RTK活性評價在有RTK活性抑制 劑條件下的腫瘤細胞惡性程度的步驟。上述評價步驟最好根據述第一 RTK活性和對照RTK活性，算出腫瘤細胞所含RTK 活性的相對值，通過比較該相對值和閾值(以下將詳述)來評價在有RTK活性抑制劑條件 下的該腫瘤細胞的惡性程度。上述相對值應為最好是第一 RTK活性和對照RTK活性的差或第一 RTK活性除以對 照RTK活性的商(第一 RTK活性/對照RTK活性)，最好是第一 RTK活性除以對照RTK活性 的商。上述所謂閾值可以根據RTK活性抑制劑種類和腫瘤細胞種類適當設定。閾值比如 可以用已在臨床上評價過其惡性程度的腫瘤細胞和某種特定RTK活性抑制劑，按照與本發 明方法同樣的方法測定第一 RTK活性和對照RTK活性，通過計算其相對值求出。在上述評價步驟中，當上述相對值為從對照RTK活性減去第一 RTK活性的差時，比 較相對值和閾值，如果相對值高于閾值，則可以評價為在RTK抑制劑存在的條件下腫瘤細 胞惡性程度低。當上述相對值為第一 RTK活性除以對照RTK活性的商(第一 RTK活性/對 照RTK活性)時，比較相對值和閾值，如果相對值低于閾值，則可以評價為在RTK抑制劑存 在的條件下腫瘤細胞惡性程度低。本發明的方法最好還包括以下步驟(a)讓含有從含有上述腫瘤細胞的試樣制備的RTK的細胞膜級分與不同與第一 RTK活性抑制劑的第二 RTK活性抑制劑接觸；(b)讓在步驟(a)獲得的與上述第二 RTK活性抑制劑接觸的細胞膜級分與在上述 第一 RTK活性測定中使用的底物同樣的底物接觸，通過測定磷酸化底物，測定在有上述第 二 RTK活性抑制劑情況下的RTK活性(第二 RTK活性)。在本發明測定第二 RTK活性的方法中，評價步驟是根據第一 RTK活性、第二 RTK活 性和對照RTK活性評價在有各種RTK活性抑制劑情況下的腫瘤細胞的惡性程度。上述第一 RTK活性抑制劑和第二 RTK活性抑制劑的組合，可以從上面列舉的PTK 活性抑制劑中任意選擇，最好是從上述RTK的ATP競爭抑制劑的例示中選擇數種。上述評價步驟最好包括以下步驟(a)根據上述第一 RTK活性和上述對照RTK活性，算出關于上述腫瘤細胞所具有的 RTK活性的第一相對值；(b)根據上述第二RTK活性和上述對照RTK活性，算出關于上述腫瘤細胞所具有的 RTK活性的第二相對值；
(c)將步驟(a)和(b)算出的各相對值與其對應的各閾值進行比較，據此評價在有 RTK活性抑制劑情況下腫瘤細胞的惡性程度。上述第一相對值和第二相對值應當是第一 RTK活性或第二 RTK活性和對照RTK活 性的差、或者是第一 RTK活性或第二 RTK活性除以對照RTK活性的商(第一 RTK活性或第 二 RTK活性/對照RTK活性)，最好是第一 RTK活性或第二 RTK活性除以對照RTK活性的商。決定上述閾值時的方式可以與本發明中測定第一 RTK活性和對照RTK活性的方式 相同。如此，用多種RTK活性抑制劑評價腫瘤細胞的惡性程度，可以進行更精密的全面 的評價。以此可以更確切地獲得指標，并據此指標決定對患者的有效的治療方針(比如所 用抗癌藥的種類)等，有可能使臨床上的治療選擇更加廣泛。實施例下面以實施例更詳細地說明本發明，但本發明不受這些實施例所限定。(至少針對二種RTK的底物)使用了聚(Glu4_Tyr)(生物素共軛(biotinconjugate)，UPSTATE 公司)作 為至少針對二種RTK的底物。此聚(Glu4-Tyr)是一種對跨膜型酪氨酸激酶種類特異性 很低的底物，具體而言，是由四個谷氨酸殘基和一個酪氨酸殘基構成的序列重復5次而 形成的氨基酸序列所構成的肽和生物素的融合蛋白質(以下稱“生物素-聚(Glu、Tyr) [Biotin-Poly(Glu、Tyr)]底物”)。實施例1 :ATP競爭抑制劑對RTK的影響在本實施例中，不是從培養腫瘤細胞中提純RTK，而是制備含有RTK的細胞膜級 分。使所得細胞膜級分與RTK活性抑制劑——ATP競爭RTK抑制劑接觸或不接觸，用上述 生物素"聚(Glu、Tyr)底物測定RTK活性。(制備細胞膜級分)將13 種培養細胞(A-431、KF、MDA-MB-468、RMUG-L, BT-474、ES2、MDA-MB453、 SK-Br-3、SNG-S、K-562、MDA-MB-231、MCF7 和 T47D)分別與 Iml 均質化試劑(含 20mM HEPES ρΗ7· 4,0. 2%蛋白酶抑制劑(PI)、10 %甘油、200 μ MNa3VO4、和50mMNaF)混合，用杵加壓來 破壞細胞膜，制備細胞破碎液。離心分離(20000Xg、20分鐘)所得細胞破碎液，棄上清， 回收沉淀物。在回收的沉淀物中添加增溶劑(含20mM HEPES pH7. 4,1% NP40.0. 2% PI, 10%甘油、200μΜ Na3VO4、和50mM NaF)并混合，用杵加壓使細胞膜可溶化，進行離心分離 (20000Xg、20分鐘)。回收上清作為細胞膜級分，調制至總蛋白質量為40μ g/ml后，將該 細胞膜級分用于以下實驗。A-431為來源于鱗狀細胞癌的培養細胞，由此細胞制備的細胞膜級分稱為細胞膜 級分A-431。KF是來源于卵巢癌的培養細胞，由此細胞制備的細胞膜級分稱為細胞膜級分KF。MDA-MB-468是來源于乳腺癌的培養細胞，由此細胞制備的細胞膜級分稱為細胞膜 級分 MDA-MB-468。RMUG-L是來源于卵巢癌的培養細胞，由此細胞制備的細胞膜級分稱為細胞膜級分 RMUG-L0
13
BT-474是來源于乳腺癌的培養細胞，由此細胞制備的細胞膜級分稱為細胞膜級分 BT-474。ES2是來源于卵巢癌的培養細胞，由此細胞制備的細胞膜級分稱為細胞膜級分 ES2。MDA-MB-453是來源于乳腺癌的培養細胞，由此細胞制備的細胞膜級分稱為細胞膜 級分 MDA-MB-453。SK-Br-3是來源于乳腺癌的培養細胞，由此細胞制備的細胞膜級分稱為細胞膜級 分 SK-Br-3。SNG-S是來源于子宮癌的培養細胞，由此細胞制備的細胞膜級分稱為細胞膜級分 SNG-S。K-562是來源于白血病的培養細胞，由此細胞制備的細胞膜級分稱為細胞膜級分 K-562。MDA-MB-231是來源于乳腺癌的培養細胞，由此細胞制備的細胞膜級分稱為細胞膜 級分 MDA-MB-231。MCF7是來源于乳腺癌的培養細胞，由此細胞制備的細胞膜級分稱為細胞膜級分 MCF7。T47D是來源于乳腺癌的培養細胞，由此細胞制備的細胞膜級分稱為細胞膜級分 T47D。(生物素-聚(Glu、Tyr)底物結合到ELISA板)ELISA試驗用板使用的是親和素包被板[具有SuperBlock封閉緩沖液的 NeutrAvidin HBC 白色96 孔板(NeutrAvidin HBC White 96-ffell Plates WithSuperBlock Blocking Buffer (PIERCE 公司))]。首先用 TBS-T (含 25mM Tris、150mM NaCl 和 0.05% Tween-20)清洗該板的各孔三遍。再將50 μ 1含上述生物素-聚(GliuTyr)底物的底物溶 液1(含lyg/ml的生物素-聚(GliuTyr)底物的TBS)注入各孔，邊輕搖，邊在25 °C培養1 小時30分鐘。培養后各孔用TBS-T清洗三遍。如此使生物素-聚(GliuTyr)底物結合到 ELISA板的孔的表面。用此ELISA板進行以下酶反應。(RTK與ATP競爭抑制劑接觸)本例使用了 ATP競爭RTK活性抑制劑PD153035(HER1抑制劑)(Calbiochem公司)、 AG1478 (HER1 抑制劑)(Calbiochem 公司)、4557W(HER1/HER2 抑制劑)(Calbiochem 公司)、 PDGF受體酪氨酸激酶抑制劑III (以下稱“PDGFR抑制劑” )(Calbiochem公司)和VEGF受 體酪氨酸激酶抑制劑III(以下稱“VEGFR抑制劑”)(Calbiochem公司)。還使用了對非受 體型酪氨酸激酶Src的ATP競爭抑制劑Src抑制劑(inhibi tor)(以下稱“Src抑制劑”) (Calbiochem公司)。各抑制劑的結構式如下。[化1]
權利要求
一種評價腫瘤細胞惡性程度的方法，包括以下步驟(1)從含有腫瘤細胞的試樣中制備含有受體酪氨酸激酶(RTK)的細胞膜級分；(2)使在步驟(1)獲得的細胞膜級分與第一RTK活性抑制劑接觸；(3)使在步驟(2)獲得的與RTK活性抑制劑接觸的細胞膜級分與至少針對二種RTK的底物接觸，通過測定被磷酸化的底物，測定在有第一RTK活性抑制劑情況下的RTK活性(第一RTK活性)；(4)使在步驟(1)獲得的細胞膜與和步驟(3)同樣的底物接觸，而不接觸第一RTK活性抑制劑，通過測定被磷酸化的底物，測定在沒有RTK活性抑制劑情況下的RTK活性(對照RTK活性)；(5)根據所述第一RTK活性和對照RTK活性，評價在有第一RTK活性抑制劑情況下的所述腫瘤細胞的惡性程度。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于 所述步驟(1)包含(la)在緩沖液中破碎腫瘤細胞的步驟；(lb)從步驟(la)所得破碎液中獲取非溶性級分的步驟；(lc)在步驟(lb)所得非溶性級分中添加含有表面活性劑的增溶劑并加以混合的步驟；(Id)從步驟(lc)所得混合液中獲取可溶性級分的步驟。
3.根據權利要求1或2中任一項所述的方法，其特征在于在所述步驟(3)和(4)中 的底物是多種對特定RTK特異性高的底物組合在一起的底物混合物或是對RTK種類特異性 低的底物。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于所述對RTK種類特異性低的底物包括由 含有谷氨酸殘基和酪氨酸殘基的氨基酸序列所構成的肽。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟(2)中的RTK活性抑制劑是針 對RTK的三磷酸腺苷(ATP)競爭抑制劑。
6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于 所述步驟(5)包括以下步驟(5a)根據所述第一 RTK活性和所述對照RTK活性，算出所述腫瘤細胞具有的RTK活性 的相對值；(5b)通過比較步驟(5a)算出的相對值和閾值，評價在有RTK抑制劑情況下所述腫瘤細 胞的惡性程度。
7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于所述相對值是所述第一 RTK活性除以所述對照RTK活性所得商，當所述相對值低于所述閾值時，評價在有RTK抑制劑情況下所述腫瘤細胞的惡性程度低。
8.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述腫瘤細胞的惡性程度指所述腫瘤細 胞的增殖能力和/或轉移能力。
9.根據權利要求1所述的方法，其特征在于還包括步驟(6)，使在所述步驟(1)制備 的細胞膜級分與不同于所述第一 RTK活性抑制劑的第二 RTK活性抑制劑接觸；步驟(7)，使在步驟(6)獲得的與第二RTK活性抑制劑接觸的細胞膜級分與同于所述步 驟(3)的底物接觸，通過測定被磷酸化的底物，測定在有第二 RTK活性抑制劑情況下的RTK 活性(第二 RTK活性)；所述步驟(5)根據所述第一 RTK活性、第二 RTK活性和對照RTK活性，評價在有RTK抑 制劑情況下所述腫瘤細胞的惡性程度。
10.根據權利要求9所述的方法，其特征在于所述步驟(5)還包括以下步驟 (5a’ )根據所述第一 RTK活性和所述對照RTK活性，算出關于所述腫瘤細胞所具有的 RTK活性的第一相對值；(5b’ )根據所述第二 RTK活性和所述對照RTK活性，算出關于所述腫瘤細胞所具有的 RTK活性的第二相對值；(5c’ )通過將在步驟(5a’ )和(5b’ )算出的各相對值與各閾值進行比較，評價在有 RTK抑制劑情況下所述腫瘤細胞的惡性程度。
全文摘要
本發明提供一種評價腫瘤細胞的惡性程度的方法，該方法是從含有腫瘤細胞的試樣中制備含有受體酪氨酸激酶(RTK)的細胞膜級分，在有及沒有RTK活性抑制劑情況下測定此細胞膜的RTK的酶活性，通過比較所得結果來評價腫瘤細胞的惡性程度。
文檔編號C12N9/12GK101981203SQ200980111398
公開日2011年2月23日 申請日期2009年3月23日 優先權日2008年3月28日
發明者倫崇, 佐藤淳, 石原英干, 能登谷 申請人:希森美康株式會社