具有改善的木糖利用率的發酵單胞菌屬的制作方法

專利名稱：具有改善的木糖利用率的發酵單胞菌屬的制作方法
具有改善的木糖利用率的發酵單胞菌屬
相關申請的交叉引用
本專利申請要求提交于2008年3月27日的美國臨時申請61/039878的優先權， 該申請以引用方式并入本文。
政府權利聲明
本發明由美國政府支持，受與能源部簽署的合同號04-03-CA-702M和 DE-FC36-03G013146的約束。美國政府擁有本發明的必然權利。此外美國政府擁有本發明 的權利，受美國能源部與美國國家可再生能源實驗室即美國中西部研究所的分支機構簽署 的合同號DE-AC36-99G010337的約束。發明領域
本發明涉及微生物學和基因工程領域。更具體地講，描述了具有改善的木糖利用 率的發酵單胞菌屬(Zymomonas)菌株的基因工程化。
發明背景
通過微生物來生產乙醇提供了一種替代化石燃料的可供選擇的能源，因此成為當 前研究的重要領域。期望微生物能夠利用木糖作為碳源來生產乙醇以及其它有用的產物， 因為木糖是水解木質纖維質材料中的主要戊糖，因此能提供豐富可用的低成本碳底物。運 動發酵單胞菌和其它乙醇細菌天然不利用木糖，可通過導入基因將它們遺傳工程化以利用 木糖，導入的基因編碼1)木糖異構酶，該酶催化木糖轉化成木酮糖；幻木酮糖激酶，它將木 酮糖磷酸化以形成5-磷酸木酮糖；幻轉酮醇酶；和4)轉醛醇酶。
已經成功地對運動發酵單胞菌(Zymomonas mobilis)菌株進行了工程化以用 于木糖代謝(US 5514583、US 5712133、US 6566107、Μ)95Λ8476，Feldmann 等人(1992) Appl Microbiol Biotechnol 38 :354-361，Zhang 等人(1995) Science 267 :240-243)，并 且對棕櫚發酵細菌(ZymcAacter palmae)菌株進行了工程化以用于木糖代謝(Yanase等 人Q007)Appl. Environ. Mirobiol. 73 :2592-2599)。然而工程化的菌株通常在木糖上生長 和生產乙醇不如在葡萄糖上一樣好。工程化以利用木糖的菌株已經適應在木糖培養基上連 續傳代，導致菌株具有如美國專利7，223，575以及共有的和共同未決的美國專利申請公布 US20080286870所述的改善的木糖利用率。然而仍未確定該改善的遺傳基礎。
需要具有改善的木糖利用率的發酵單胞菌屬的遺傳工程化菌株和其它乙醇細菌。 申請人:已經發現了工程化以利用木糖并具有改善的木糖利用率的運動發酵單胞菌菌株的 遺傳改變，并且使用該發現以工程化具有改善的木糖利用率的菌株。發明內容
本發明涉及遺傳工程化以利用木糖的細菌菌株，該菌株用編碼木糖異構酶的嵌合 基因進行轉化，所述基因表達自改善的運動發酵單胞菌甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因啟動子 (Pgap) 0該菌株也用表達木酮糖激酶、轉醛醇酶和轉酮醇酶的基因進行轉化。改善的I^gap 引起比天然bap更高的表達，這引起與不具有用于表達木糖異構酶的改善的I^gap的菌株相比改善的木糖利用率。
本文所描述的是重組細菌菌株，該菌株選自包含通過轉化被導入的基因的發酵單 胞菌屬和發酵細菌屬(ZymcAacter)，所述基因包含
a)包含運動發酵單胞菌甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因啟動子的分離的核酸分子，所 述啟動子在選自-190位、-89位、或-190和-89位兩者的位置上具有堿基取代；其中所述位 置編號是相對于運動發酵單胞菌的CP4和ZM4菌株中的甘油醛-3-磷酸脫氫酶的天然ATG 翻譯啟始密碼子；所述啟動子是改善的I^gap ；和
b)可操作地連接的編碼木糖異構酶的分離的核酸分子。
通過上述轉化步驟導入的基因可以為嵌合基因，該嵌合基因包含用于提高I^gap 表達的突變。
本文也描述了對選自發酵單胞菌屬和發酵細菌屬的細菌菌株進行工程化的方法， 所述方法包括用基因如嵌合基因進行轉化，所述嵌合基因包含
a)包含運動發酵單胞菌甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因啟動子的分離的核酸分子，所 述啟動子在選自-190位、-89位、或-190和-89位兩者的位置上具有堿基取代；其中所述位 置編號是相對于運動發酵單胞菌的CP4和ZM4菌株中的甘油醛-3-磷酸脫氫酶的天然ATG 翻譯啟始密碼子；所述啟動子是改善的I^gap ；和
b)可操作地連接的編碼木糖異構酶的分離的核酸分子。
本文描述了對選自發酵單胞菌屬和發酵細菌屬的利用木糖的細菌菌株進行工程 化的另一種方法，所述方法包括任何順序的下述步驟
a)用表達轉醛醇酶和轉酮醇酶的基因或操縱子進行轉化；和
b)用表達木糖異構酶和木酮糖激酶的基因或操縱子進行轉化，其中所述木糖異 構酶表達自運動發酵單胞菌甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因啟動子，所述啟動子在選自-190 位、-89位、或-190和-89位兩者的位置上具有堿基取代；其中所述位置編號是相對于運動 發酵單胞菌的CP4和ZM4菌株中的甘油醛-3-磷酸脫氫酶的天然ATG翻譯啟始密碼子；所 述啟動子是改善的I^gap。
本文也描述了從包含木糖的培養基中生產乙醇的方法，所述方法包括在培養基中 培養選自發酵單胞菌屬和發酵細菌屬的重組細菌菌株，所述菌株包含通過轉化導入的嵌合 基因，所述嵌合基因包含
a)包含運動發酵單胞菌甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因啟動子的分離的核酸分子，所 述啟動子在選自-190位、-89位、或-190和-89位兩者的位置上具有堿基取代；其中所述位 置編號是相對于運動發酵單胞菌的CP4和ZM4菌株中的甘油醛-3-磷酸脫氫酶的天然ATG 翻譯啟始密碼子；所述啟動子是改善的I^gap ；和
b)可操作地連接的編碼木糖異構酶的分離的核酸分子。
此外，本文所述的重組細菌菌株選自發酵單胞菌屬和發酵細菌屬，并且經工程 化以表達木糖異構酶，表達水平為產生至少約0. 1微摩爾產物/毫克蛋白/分鐘，這通 過使20 μ L細胞游離提取物在30°C下在反應混合物中反應而進行測定，所述混合物包含 0. 256mM NADH, 50mM木糖，IOmM MgSO4, IOmM三乙醇胺，和lU/mL山梨醇脫氫酶，其中D-木 酮糖是產物。
附圖簡述和序列描述
可通過下列發明詳述、附圖、以及結合作為本專利申請一部分的序列描述更全面 地理解本發明的多個實施方案。


圖1示出轉酮醇酶(A)、轉醛醇酶(B)、木糖異構酶(C)、和木酮糖激酶(D)的酶檢 測分析方法。
圖2是在用I^gapxylAB轉化的T2C、T3CJ4C、和T5C品系中的木糖異構酶(XI)和 木酮糖激酶(XK)的活性的示意圖。
圖3是在用I^gapxylAB轉化的T2C、T3C、T4C、和T5C品系中的轉醛醇酶(TAL)和 轉酮醇酶(TKT)的活性的示意圖。
圖4是選擇的適合利用木糖菌落的％理論乙醇產量和％木糖利用率的示意圖。
圖5是適合利用木糖的菌株在具有5%葡萄糖(RMG)的RM(豐富培養基)中生長 50代之前和之后，在具有5%木糖(RMX5%)的RM上生長70小時時的生長示意圖。
圖 6 示出以下質粒圖譜(Α)ρ^188 ； (B)p^l88/aadA ；和(C)pZB188/ aadA-GapXylA ；以及(D)大腸桿菌木糖異構酶表達盒I^gapXyIA的示意圖。
圖7示出以下質粒的圖譜(A) pM0D -2-<MCS> ； (B) pMOD-連接子；和(C) pMOD-連 接子-Spec。
圖8示出質粒pLDHSp-9ffff的圖譜。
圖9示出質粒pMOD-連接子-Spec-80IGapXylA的圖譜。
圖 10 示出以下質粒的圖譜(A)pM0D-連接子-Spec_801GapXylA ;(B)pZB188/ aadA-GapXylA ；禾卩(C) p^l88/aadA_801GapXylA。
圖11示出包含I^gap-大腸桿菌木糖異構酶表達質粒(X1、X2和X2)的三個菌株和 包含對照質粒(C1、C2和C3)的三個菌株在包含木糖的培養基中的生長曲線(0D600對時 間)圖。
圖12示出ZW641、ZW658、X1和Cl菌株在包含木糖的無奇放線菌素培養基中的生 長曲線(0D600對時間)圖，(A)為在線性比例上作的圖，而⑶為在對數比例上作的圖。
圖13示出具有整合801Pgap-XylA(#8-2、#8-4、#8-5)的三個菌株和具有整合 641Pgap-XylA(#6-l、#6-3、#6-5)的三個菌株與菌株ZW658進行比較的生長曲線(0D600對 時間)圖，(A)為在線性比例上作的圖，而⑶為在對數比例上作的圖。
表3是木糖異構酶HMM序列譜。表3以電子方式附上并以引用方式并入本文。
根據下面的發明詳述和附帶的序列描述可以更充分地理解本發明，下面的發明詳 述和所附的序列描述形成了本申請的一部分。
下面的序列遵照 37C. F. R. 1. 821-1. 825("Requirements for Patent Applications Containing Nucleotide Sequences and/or Amino Acid Sequence Disclosures-the Sequence Rules”(對含有核酸序列和/或氨基酸序列公開的專利申請的要求-序列規則))， 并且符合 World Intellectual Property Organization (世界知識產權組織，WIP0)ST.25 標 準(1998)以及EPO和PCT的序列表要求(規貝丨J 5. 2和49. 5 (a-bis)以及Administrative hstructions (行政指令)的第208節和附錄C)。用于核苷酸和氨基酸序列數據的符號和格 式遵循在37C. F. R. § 1. 822中示出的規則。
SEQ ID NO 1是來自運動發酵單胞菌的CP4菌株的ZmPgap的核苷酸序列。
SEQ ID NO :2是來自運動發酵單胞菌的ZM4菌株的ZmPgap的核苷酸序列。
SEQ ID NO 3是來自pZB4的ZmPgap的核苷酸序列，它也位于菌株ZW641和 的I^gapxylAB操縱子中。
SEQ ID NO 4是來自菌株ZW658的改善的I^gap的核苷酸序列。
SEQ ID NO 5是來自菌株8b的改善的I^gap的核苷酸序列。
SEQ ID NO 6是在Pgap的pZB4突變體中的具有-190 (ZW658)和-89 (8b)突變的 改善的I^gap的核苷酸序列。
SEQ ID NO 7是在I^gap的CP4突變體中的具有來自ZW658的-190突變的改善的 Pgap的核苷酸序列。
SEQ ID NO 8是在I^gap的CP4突變體中的具有來自8b的-89突變的改善的I^gap 的核苷酸序列。
SEQ ID NO 9是在Pgap的CP4突變體中的具有-190 (ZW658)和-89 (8b)突變的 改善的I^gap的核苷酸序列。
SEQ ID NO 10是在I^gap的ZM4突變體中的具有來自ZW658的-190突變的改善 的I^gap的核苷酸序列。
SEQ ID NO 11是在I^gap的ZM4突變體中的具有來自8b的-89突變的改善的I^gap 的核苷酸序列。
SEQ ID NO 12是在Pgap的ZM4突變體中的具有-190 (ZW658)和-89 (8b)突變的 改善的I^gap的核苷酸序列。
SEQ ID NO 13和14是用于擴增包含來自pZB4的甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因啟 動子O^gap)的DNA片段的引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO 15和16是用于擴增包含來自pZB4的tal編碼區的DNA片段的引物 的核苷酸序列。
SEQ ID NO 17和18是用于擴增包含來自I^gap和tal片段的I^gaptal的DNA片 段的引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO 19和20是用于擴增包含來自pZB 186的IoxP: :Cm的DNA片段的引 物的核苷酸序列。
SEQ ID NO :21是pMODPgaptaltktCm質粒的全長核苷酸序列。
SEQ ID NO 22和23是用于擴增在接納pMODPgaptaltktCm的轉化體中包含tal和 tkt編碼區的31Λ DNA片段的引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO J4是pMODPgapxyIABCm質粒的全長核苷酸序列。
SEQ ID NO 25 和 26 是用于擴增來自具有 pMODPgapxyIABCm 的 T2C、T3C、T4C 和 T5C整合子的1.61Λ PgapxylA DNA片段的引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO 27和28是用于擴增包含來自ZW641和ZW658的Pgap的DNA片段的 引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO 29-31是用于對來自ZW641和ZW658的I^gap進行測序的引物的核苷 酸序列。
SEQ ID NO 32和33是用于擴增包含Speclr-盒的DNA片段的引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO 34是木糖異構酶表達盒I^gapXylA的全長核苷酸序列。
SEQ ID NO 35和36是用于替代pM0D2_<MCS>中的不同多克隆位點的寡核苷酸的7核苷酸序列。
SEQ ID NO 37和38是用于擴增來自菌株ZW801-4和ZW641的PgapxylA區域 的引物的核苷酸序列，該序列用于插入PMOD-連接子-Spec以分別生成質粒pMOD-連接 子-Spec-80IGapXylA 和 pMOD-連接子-Spec_641GapXylA。
SEQ ID NO :39和40是用于擴增包含來自《(L4和8b的Pgap的DNA片段的引物 的核苷酸序列。
SEQ ID NO 41是用于對來自《(L4和8b的I^gap進行測序的引物的全長核苷酸序 列。
魁
SEQ ID 號:T總
描述SEQID NO 肽SEQID NO: 編碼區
權利要求
1.選自發酵單胞菌屬和發酵細菌屬的重組細菌菌株，所述重組細菌菌株包含通過轉化 導入的嵌合基因，所述嵌合基因包含a)包含運動發酵單胞菌甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因啟動子的分離的核酸分子，所述啟 動子在選自-190位、-89位、或-190和-89位兩者的位置上具有堿基取代；其中所述位置 編號是相對于運動發酵單胞菌的CP4和ZM4菌株中的甘油醛-3-磷酸脫氫酶的天然ATG翻 譯起始密碼子；所述啟動子是改善的I^gap ；和b)可操作地連接的編碼木糖異構酶的分離的核酸分子。
2.權利要求1的重組菌株，其中所述堿基取代是a)在-190位，T取代G ；和b)在-89位，T取代C。
3.權利要求2的重組菌株，其中所述改善的I^gap包含選自下組的序列SEQID NO :4、 5、6、7、8、9、10、11、和 12。
4.權利要求1的重組菌株，所述重組菌株附加地用表達木酮糖激酶、轉醛醇酶和轉酮 醇酶的基因進行了轉化。
5.權利要求1的重組菌株，其中所述嵌合基因還包含可操作地連接的編碼木酮糖激酶 的分離的核酸分子，形成操縱子。
6.權利要求1的重組菌株，其中當使用Pfam序型HMM查詢表3中給出的xylA家族蛋 白時，所述木糖異構酶是具有小于或等于3 X 10,的E值參數的蛋白，并且具有四個催化位 點殘基組氨酸討、天冬氨酸57、谷氨酸181、和賴氨酸183，所述位置編號是參照白色鏈霉 菌木糖異構酶序列(SEQ ID NO =X)。
7.權利要求1的重組菌株，其中所述木糖異構酶具有的氨基酸序列與選自下組的序列 具有 90% 的氨基酸同一性=SEQ ID NO ；42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、 70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、和 104。
8.對選自發酵單胞菌屬和發酵細菌屬的細菌菌株進行工程化的方法，所述方法包括用嵌合基因進行轉化，所述嵌合基因包含a)包含運動發酵單胞菌甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因啟動子的分離的核酸分子，所述啟 動子在選自-190位、-89位、或-190和-89位兩者的位置上具有堿基取代；其中所述位置 編號是相對于運動發酵單胞菌的CP4和ZM4菌株中的甘油醛-3-磷酸脫氫酶的天然ATG翻 譯起始密碼子；所述啟動子是改善的I^gap ；和b)可操作地連接的編碼木糖異構酶的分離的核酸分子。
9.對選自發酵單胞菌屬和發酵細菌屬的利用木糖的細菌菌株進行工程化的方法，所述 方法包括任何順序的下述步驟a)用表達轉醛醇酶和轉酮醇酶的基因或操縱子進行轉化；和b)用表達木糖異構酶和木酮糖激酶的基因或操縱子進行轉化，其中所述木糖異構酶表 達自運動發酵單胞菌甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因啟動子，所述啟動子在選自-190位、-89 位、或-190和-89位兩者的位置上具有堿基取代；其中所述位置編號是相對于運動發酵單 胞菌的CP4和ZM4菌株中的甘油醛-3-磷酸脫氫酶的天然ATG翻譯起始密碼子；所述啟動 子是改善的I^gap。
10.生產乙醇的方法，所述方法包括在包含木糖的培養基中培養權利要求1的重組細菌菌株； 保持在任何系統中適于乙醇生產的發酵條件， 由此促使權利要求1的培養的重組細菌菌株將木糖轉化成乙醇。
11.選自發酵單胞菌屬和發酵細菌屬的、經工程化以表達木糖異構酶的重組細菌菌 株，所述木糖異構酶的表達水平為產生至少約0. 1微摩爾產物/毫克蛋白/分鐘，這通 過使20 μ L細胞游離提取物在30°C下在反應混合物中反應而進行測定，所述混合物包含 0. 256mM NADH，50mM木糖，IOmM MgSO, IOmM三乙醇胺，和lU/mL山梨醇脫氫酶，其中D-木酮 糖是產物。
全文摘要
通過導入嵌合木糖異構酶基因以工程化的發酵單胞菌屬菌株，所述基因包含運動發酵單胞菌甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因的突變型啟動子。所述啟動子引導木糖異構酶的提高表達，此外當所述菌株經工程化表達木酮糖激酶、轉醛醇酶和轉酮醇酶時，獲得木糖的改善利用。
文檔編號C12N1/20GK102037120SQ200980111059
公開日2011年4月27日 申請日期2009年3月25日 優先權日2008年3月27日
發明者C·麥卡欽, L·陶, L·麥科爾, M·A·弗蘭登, M·張, P·G·凱米, P·V·維塔寧, Y·張, Y-C·仇 申請人:可持續能源聯盟有限責任公司, 納幕爾杜邦公司