專利名稱：生產連續細胞系的方法
技術領域：
本發明涉及生產細胞系的方法。
背景技術：
細胞系已成為用于疫苗制造的有價值的工具。一些重要疫苗和病毒載體的生產 仍然在雞胚或雞胚原代成纖維細胞中進行。用于病毒復制的禽類原代組織由SPF(無特 定病原體)生產廠提供。SPF來源的組織昂貴，并且原料供應的質量通常難以控制。因 此，供應的不一致性和短缺是基于SPF蛋技術的最主要缺點。對于使用原代成纖維細胞 單層培養物的方法來說，同樣也是這樣。為了無限地增殖細胞系，需要將細胞永生化。 目前使用的大多數永生化細胞系是癌細胞或融合的雜交瘤細胞的后裔。但是，后一種技 術受到與骨髓瘤細胞融合的限制。不存在能夠產生不同類型的永生化細胞的通用技術。發明簡述本發明的目的是從不連續的細胞材料生產連續細胞。具體來說，目的是提供不 弓I入外來病毒基因的具有增殖潛力的連續細胞系。因此，本發明提供了一種用于生產連續細胞系的方法，所述方法包括提供動物 或人類的活細胞，用紫外光輻照所述細胞，增殖所述細胞，以及選擇在至少20次傳代后 能夠增殖的細胞作為連續細胞系的細胞。這樣的連續細胞系是能夠增殖并用于生物分子例如蛋白質的重組表達，或用于 制造病毒產品例如病毒抗原或完整病毒群，特別是用于疫苗接種目的的細胞的培養物。因此，本發明還提供了一種生產病毒的方法，所述方法包括提供可通過本發明 的方法獲得的連續細胞系的細胞，用所述病毒感染所述細胞，在所述細胞中增殖所述病 毒，以及收集所述病毒。另一方面，本發明提供了一種生產重組基因產物的方法，所述方法包括提供可 通過本發明的方法獲得的連續細胞系的細胞，用編碼所述基因產物的核酸轉染細胞，表 達所述基因產物，以及任選地收集所述基因產物。另一方面，本發明提供了可以通過一種方法獲得的連續細胞系，所述方法包括 提供動物或人類的活細胞，用有效劑量的紫外光輻照所述細胞，增殖所述細胞，以及選 擇在至少20次傳代后能夠增殖的細胞作為所述連續細胞系的細胞。
圖1顯示了 UV處理步驟的流程。圖2顯示了鵪鶉的連續細胞培養物。圖3顯示了生產鵪鶉連續細胞系的系統樹以及處理路線。圖4顯示了采用用于生產連續細胞的設置，UV劑量與輻照時間的相關性。發明詳述本發明提供了通過細胞的UV處理來生產連續細胞系。細胞系是由原代細胞培養物的一個或多個傳代培養物形成的細胞群。每輪傳
3代培養被稱為傳代。當細胞被傳代培養時，它們被稱為已被傳代。特定細胞群、或細 胞系，可以由它已被傳代的次數來表征。原代培養物是細胞從組織分離后的第一代培養 物。在第一次傳代培養后，細胞被描述為第二代培養物(一次傳代)。在第二次傳代培 養后，細胞變成第三代培養物(兩次傳代)，依此類推。本領域技術人員將會理解，在傳 代期間可能存在多次群體加倍；因此，培養物群體加倍的數量大于傳代次數。傳代之間 的時間中細胞的擴增(即群體加倍的數量)取決于許多因素，包括但不限于接種密度、基 底、培養基、生長條件和傳代之間的時間。培養可以通過接種細胞培養基，使細胞生長 至細胞形成匯合細胞培養物或連續的膜，并用一部分匯合細胞接種新的細胞培養基來進 行。然而，傳代是評估增殖能力的工具。一般來說，從組織分離到的細胞、包括未輻照 細胞，在它們達到不發生進一步增殖或細胞加倍的狀態之前，能夠傳代約10-20次。然 后細胞進入衰老狀態，不能從其獲得進一步的傳代培養。與此相反，連續細胞系在20次 以上傳代之后、例如在 22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、 50、55、60、65、70、75或80次以上傳代之后能夠增殖。現在，本發明人已經發現，這 種在第20次傳代后能夠傳代多次的連續細胞、特別是永生化細胞，可以通過用UV處理 改變細胞、即通過用有效劑量的UV光輻照這些細胞來獲得。本發明的術語“有效劑量 的UV光”是將非連續細胞系轉化成連續細胞系所需的輻照的量。有效劑量的UV光的 范圍，從這種轉化所必需的最小劑量直到這些細胞所耐受的對細胞培養物整體沒有致死 結果的最大劑量。顯然，高于或低于有效劑量限度，不能獲得連續細胞系。本領域技術 人員在本文中獲得的信息和指導的基礎上，經常規的最適化過程就能容易地確定每個細 胞系的最適有效劑量。細胞可以是原代細胞或幾次傳代后能夠增殖的細胞。細胞系的培 養可以使用標準的細胞培養技術來進行，例如在T型瓶系統或轉瓶系統中，或在攪拌釜 或其他生物反應器形式中。在本發明的幾種實施方案中，培養物適合于并保持在無血清 條件下。在本申請中，術語“UV光”是指波長從10到400nm、特別是100到400nm的 紫外輻射。UV光可以選自UV C (100到280nm)、UV B (280到320nm)和UV A (320到 400nm)。在本發明的某些實施方案中，波長在200到300nm之間。可以使用光敏劑例 如嵌入到DNA中并被UV光活化的光敏劑來加速UV輻照的改變效應，盡管它們在本發 明的所有實施方案中不是必需的。在本發明的一個實施方案中，UV光是波長為約100到 約280nm的UV C。在本發明的另一個實施方案中，UV光具有約240到約290nm的波 長。在本發明的另一個實施方案中，約85%或85%以上的UV光具有約254nm的波長。不受任何理論的束縛，據信UV光改變細胞的遺傳物質，這引入了突變。盡管 這樣的改變一般能夠被細胞的修復機制修復，但某些改變可能保留。這些改變能夠引入 致死突變以及導致細胞永生化的變化。從UV輻照實驗，可以選擇導致顯著部分的細胞 永生化并能夠培養的最適劑量。在傳代后，據信只有能夠增殖的活細胞被選擇，預計它 們僅具有少量變化，其中至少一個變化導致了永生化。顯著部分的被輻照細胞將不被永 生化而是獲得了不同的變化，產生凋亡或壞死的細胞。但是，原則上說，對于獲得連續 細胞培養物來說，僅僅一個具有誘導永生化的變化的細胞就已足夠，因為該細胞將通過 本文描述的多輪傳代繼續增殖和存活。UV光發射可以是連續形式的UV光發射例如汞燈技術，或脈沖式UV光例如單色激光技術。所需UV強度可以通過組合兩個或以上燈來產生。至少兩個輻照步驟可以 組合，其間具有暫停。本發明的主題包含任何有效劑量的UV光，即使細胞改變成連續 增殖的任何劑量的UV光。有效劑量可以依賴于各種不同的本技術領域所公知的因素，例 如UV輻照室的物理參數，例如燈和室的尺寸和直徑、包含細胞的培養基與UV光源之間 的距離、室的材料的光吸收和反射性質。在本發明的具體實施方案中，細胞以單層、表 面上的一個細胞層的形式被輻照。同理，UV光的波長和強度以及細胞暴露于UV光的接 觸時間對于有效劑量來說也是關鍵的。此外，有效劑量還受細胞自身、含有病毒的培養 基及其光吸收性質的影響。在本發明的各種不同實施方案中，有效劑量足以改變樣品中 包含的至少 20%、30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%或 100% 的細胞，在其 他實施方案中，有效劑量足以將細胞改變到其中至少10%的細胞被改變成連續生長的水 平。10%到90%的細胞可以被輻照殺死。在本發明的某些實施方案中，含有細胞的樣品 被暴露于至少約 5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65 或 70mJ/cm2 的 有效劑量。在某些實施方案中，有效劑量高達約500、450、400、350、300、250、200、 180、150、130或105mJ/cm2。在本發明的具體實施方案中，UV劑量在約70到105mJ/ cm2之間。在某些實施方案中，這些劑量被UVC光使用。術語“約”是指通常的UV燈 不提供離散的單一波長UV光(如同激光那樣)，而是具有也發射附近波長的光的高斯形 狀的光譜的性質。在利用了某些這樣的燈的實施方案中，“約”是指波長值偏差10%。在輻照或傳代之前或之后，能夠對細胞系進行進一步選擇，以滿足質量控制標 準例如無菌性、不含支原體污染、不含外來病毒污染和/或通過用于檢測反轉錄酶活性 存在的F-Pert測試，以及本技術領域中選擇細胞系用于醫學生物技術應用時使用的其他 質量控制標準。在這種意義上，“不含”應該被理解為污染被降低到低于當前質量測試 步驟的檢測極限。因為本發明的技術不使用病毒載體或導入反轉錄病毒就能夠產生連續 細胞系，因此本發明的細胞系通常不具有任何反轉錄酶活性，正如可以通過用于反轉錄 酶活性的測定方法所測試的。但是，出于例如在細胞系中生產病毒或蛋白質的目的，可 以通過分子工程技術將這種反轉錄病毒活性特異性地引入本發明的細胞系。細胞系可以是任何真核細胞的，特別是較高等生物體的，例如魚類、禽類、爬 行類、兩棲類或哺乳類細胞以及甚至昆蟲和植物細胞的細胞系。某些實施方案利用了哺 乳動物細胞例如倉鼠、小鼠、大鼠、狗、馬、牛、靈長類或人類；其他實施方案利用了 禽類細胞例如雞、鴨、金絲雀、鸚鵡、鵪鶉、駝鳥、鴯鹋、火雞或鵝的細胞。一般來 說，任何鳥類物種可以作為本發明中使用的禽類細胞的來源。在某些實施方案中，利用 馴養得較少的物種(例如鵪鶉或鴯鹋)以避免原種組織被更常見馴養物種(例如雞)中流 行的病毒的潛在污染，是有利的。被輻照細胞可以來自任何類型的組織。在某些實施方案中，組織源自于胚胎。 在許多實施方案中，使用一種以上類型組織的混合培養物，正如可以通過分解組織或多 個組織所獲得的。在其他實施方案中，細胞來自胚胎的臍帶。被輻照細胞可以來自、或 組織可以來自或包括例如內皮細胞、上皮細胞、多能或全能干細胞、胚胎干細胞、神經 元細胞、腎細胞、肝細胞、肌肉細胞、結腸細胞、白細胞、肺細胞、卵巢細胞、皮膚細 胞、脾細胞、胃細胞、甲狀腺細胞、血管細胞、胰腺細胞和/或它們的前體細胞及其組
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在許多實施方案中，細胞在輻照過程或培養過程中附著于表面。在表面上培養 特別適合于內皮細胞，細胞可以由此進一步選擇以滿足其他質量標準，例如它們形成單 層的能力，如果UV劑量引入了過多損傷性改變的話，這種能力可能受到妨礙。在這種 表面上，細胞可以形成單層。具體來說，細胞在微載體上培養或輻照。或者，細胞可以 在懸液中輻照或培養或進行兩者。最初在表面上輻照或培養的細胞，后來可以適用于在 懸浮培養中生長。另一方面，本發明提供了一種生產病毒的方法，所述方法包括提供可通過本發 明的方法獲得的連續細胞系的細胞，用所述病毒感染所述細胞，在所述細胞中增殖所述 病毒，以及收集所述病毒。在本發明中，將要生產的病毒選自具有正義或反義的，連續的或分段的單鏈或 雙鏈(DNA)基因組的有包膜或無包膜的DNA或RNA病毒。病毒可以選自桿狀病毒、 痘病毒、腺病毒、乳多空病毒、細小病毒、嗜肝DNA病毒、冠狀病毒、黃病毒、披膜病 毒、星狀病毒、小核糖核酸病毒、反轉錄病毒、正粘病毒、線狀病毒、副粘病毒、彈狀 病毒、沙粒病毒和布尼亞病毒。在本發明的某些實施方案中，病毒選自有包膜病毒，包 括黃病毒、披膜病毒、反轉錄病毒、冠狀病毒、線狀病毒、彈狀病毒、布尼亞病毒、正 粘病毒、副粘病毒、沙粒病毒、嗜肝DNA病毒、皰疹病毒和痘病毒。在其他實施方案 中，病毒是有包膜病毒例如流感病毒包括流感病毒A、B或C、西尼羅病毒、痘苗病毒、 修飾的痘苗病毒或羅斯河病毒。在本發明的其他實施方案中，病毒選自有包膜的RNA病 毒，包括黃病毒、披膜病毒、反轉錄病毒、冠狀病毒、線狀病毒、彈狀病毒、布尼亞病 毒、正粘病毒、副粘病毒和沙粒病毒。在具體實施方案中，病毒是MVA(修飾的痘苗病 毒安卡拉)、TBE(蜱媒的腦炎)病毒、黃熱病病毒、西尼羅病毒、新加勒多尼亞病毒或 流感病毒。在收集步驟后，可以通過任何已知的用于病毒滅活的手段使病毒滅活，例如在 美國專利
發明者曼弗雷德·賴特爾, 沃爾夫岡·蒙特, 西蒙·馮菲爾克斯, 西蒙·費格爾 申請人:巴克斯特醫療保健股份有限公司, 巴克斯特國際公司