開放連續模式的細胞培養的方法和裝置的制作方法

專利名稱：開放連續模式的細胞培養的方法和裝置的制作方法
開放連續模式的細胞培養的方法和裝置本申請涉及實施 開放連續模式的細胞培養。在細胞培養的教導中，傳統上區分為不連續培養方法和連續培養方法。在不連續培養技術中，用在母培養物中事先形成的培養物的一部分接種包含無菌 的生長培養基的培養容器。為了能夠重現相同的特征，通常將子培養物以給定的稀釋度進 行接種，隨后使它們完成與母培養物的生長周期相似的生長周期。在工業發酵的情況下，在 每個所涉及的循環中重現相同的培養條件是有用的，因為這使得能夠提前預測培養物到達 其終點的時刻，或者達到有利于回收由細胞合成或轉化的目的產物的生長階段的時刻。在研究領域中，子培養物之間的重現性是獲得可靠的和代表性的實驗數據所必需 的。為了獲得該重現性，通常使用合成培養基、相同的培養支持物和標準化的培養條件。因 此，在其中主要保持恒定的溫度和壓力的培養箱中，將培養物置于處于無菌條件下的封閉 容器中。還可以通過使用自動化培養箱來增加該重現性，所述自動化培養箱使得能夠例如 借助于機器人化臂來同步地接種培養物。該類型的培養箱可以采取在其內部溫度和壓力受 到精細調控的封閉的圍殼形式。一旦容器被接種，就將容器密封并在確定的持續時間期間 進行培養。在處于液體培養基中的不連續培養周期之中，已知細胞通過經歷不同的相繼生長 階段而演變。這些不同的生長階段相應于不同的生理學狀態，其隨著在時間過程中培養基 組分的演變而變化。通常，只要細胞在培養基中數目少，它們就利用最易同化的含碳底物， 并且優先進行使得它們活躍地分裂的生長代謝。當所述底物耗盡時，細胞開始借助于更特 異的酶來水解更復雜的底物，并開始激活使得能夠同化這些底物的更復雜的代謝途徑。從 而，細胞進入生存策略之中。通常，細胞合成儲備產物、酶和抗生素(其中某些具有工業價 值)正是在這一階段。在培養周期結束時，當培養基耗盡時，許多細胞死亡，而另一些細胞 則以生物膜、孢子或者適合于所涉及的細胞類別的任何其他休眠形式進行抵抗。在不連續模式中，對于給定的培養基和細胞類型，可能的是，由基本的物理化學參 數(例如細胞密度，PH，氧、碳或氮的比率)或者任何其他指示細胞生長階段的參數來確定 出在給定的時刻大多數細胞所處的生長階段。這是因為，如果培養基是均質的，全體細胞的 成長就是相對同步的。因而，可能的是，例如將細胞密度值與或多或少快的細胞生長期相聯 系，尤其是通過使用典型生長曲線。還可能的是，在顯微鏡下進行直接觀察以便由形態學標 準來確定生長階段。在文獻中已描述了這樣的實驗，所述實驗在于非常多次地相繼重現相同的不連續 模式的培養周期。這些實驗顯示，可以在非常長的時期內重現細胞而不改變細胞的特征， 也不改變細胞的特性(Lenski, R. E.禾口 Travisano，M. (1994) =Dynamics of adaption and diversification :A 10000-generation experimentwith bacterial populations, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91,6808—6814)。在連續培養技術中，相反地，培養物享有新鮮培養基或稀釋劑(即所述培養基的 組分)的有規律的供應，以便持久地維持細胞的生長。通常，培養基的稀釋根據預先選擇的制度來進行，所述制度可以是定期的或連續的。
將主要的連續培養制度區分為其中添加新鮮培養基以便將細胞密度維持恒定在 平均值附近的模式(恒濁器模式)，以及其中引入新鮮培養基或稀釋劑以便將物理化學參 數(pH，C/N比例...)維持在確定值附近的模式(恒化器模式)。自相矛盾地，文獻中所描述的在非常長的時期內維持連續培養的嘗試并不允許 與使用不連續培養技術一樣長期地維持細胞系(Dijkuizen，D. Ε. (1993) =Chemostats used for studying natural selection and adaptive evolution. Meth. Enzymo1. 224, 613-631)。這一狀況可以由下述事實來解釋在連續模式中，細胞相當快地達到不同的生 理學階段，并且不是全都處于相同的生長階段。毫無疑問，新鮮培養基的有規律的供應更加 擾亂了細胞的微環境并且不允許獲得完全均質的培養基。因此，在一定數目的代結束時，系 統地看到所謂的“稀釋抗性”靜止細胞變體的出現。這些變體表現為生物膜、絲狀體或休眠 形式(孢子、殼等等...)的形式。它們形成逃避開適應負荷和有時逃避開在培養基中所 使用的選擇試劑(抗生素或其他)的亞群。所有所描述的連續模式培養裝置都有利于靜 止變體的出現。這些變體占據了設備的內表面并且限制了其效率(Chao，L.和Ramsdell， G. (1985) :The effects of wall populat ions oncoexistence of bacteria in the liquid phase of chemostat cultures. J. Gen，Microbiol. 131，1229-1236)。具有恒定細 胞濃度的連續培養物(恒濁器模式)對于稀釋抗性變體的侵襲是特別敏感的。因此，在通 常允許少于200代的相對較短的時期內才可以對它們進行操縱。此外，在細胞生長速度升高的條件下進行的連續模式的培養有利于更大數目的自 發突變。這些條件顯示為對于形成對稀釋不敏感的、以生物膜形式進行成長的粘附變體來 說是特別有利的。鑒于這些各種各樣的困難，文獻中所公開的連續培養的方法和裝置很少用于工業 目的甚至科學目的。然而，很早就已認識到其潛力(Monod，J.(1950) =La technique de laculture continue. Theorie et applications, Ann. Ins t.Pasteur 79,390-410；Novick, A.禾口 Szilard, L. (1950) -description of the chemostat, science 112,715-716)。然而，現今，連續培養技術有了出乎意料的興趣恢復，這恰恰是因為，它們使得能 夠促進具有差異化生長的細胞變體的出現和選擇。因此，可以希望獲得在懸浮狀態下增殖 的細胞變體，或者相反地，獲得靜止的細胞變體。后者對于研究例如生物膜的生物學來說是 特別有用的。該選擇的原理是利用由連續模式的培養所促進的自發演變，以便在長期時間內選 擇優選地在懸浮狀態下演變的細胞變體，或者相反地，基本止處于靜止形式的細胞變體。不論它們是否是由于遺傳突變而產生的，在懸浮狀態下增殖的變體通常傾向于比 在培養基中存在的其他細胞更活躍地進行分裂，或者更好地利用培養基的資源。如果在長 時期內維持培養物，那么該群體內這些變體的頻率隨時間而增加，這使得能夠更容易地分 離出它們。根據該原則所選擇出的在懸浮狀態下增殖的變體通常對于來源于同一系的其他 細胞而言具有競爭優勢。因此，有用的是，例如改善現有的工業發酵方法(例如，以不連續培養模式進行的那些方法)的產率。
國際申請WO 00/34433描述了一種裝置，其用于實施使得能夠選擇在懸浮狀態下 增殖的變體的連續培養。該裝置裝配有兩個相互之間通過導管相連的培養容器，所述導管 使得能夠隨意地將第一個容器中所包含的培養物轉移至第二個容器，反之亦然。該導管裝 配有隨意開啟的閥門以便將培養物從一個容器轉入到另一個容器中。這兩個培養容器中的 每一個都通過獨立的流體管路來進料，該流體管路使得能夠不斷地更新每個容器內的培養 基和氣體。在該相當復雜的流體管路上，聯接有第二流體管路，其使得能夠借助于滅菌流 體來獨立地對這兩個培養容器中的每一個進行清潔和滅菌。因此，所述裝置被設計成能夠 將液體培養基中的培養物從第一個容器轉移到第二個容器中。當所述容器之一包含培養 物時，可以對另一個容器進行清潔和滅菌，反之亦然。在滅菌和清潔的過程中，掛在容器壁 上的靜止變體被去除，而在另一個容器中在懸浮狀態下增殖的細胞以連續培養方式進行維 持。該裝置被設計成以所需次數重復該操作。因此，理論上可能的是，通過避免靜止變體的 積累而在無限制的持續時間內保持連續培養。然而，從實踐上說，該裝置具有幾個主要缺點，其中尤其包括下列缺點-該裝置內容器的清潔和滅菌需要復雜的流體管路。該流體管路應當是完全密封 的以便維持適當的無菌水平。然而，在工業規模上重現這樣的流體管路是困難的，因為當增 加培養容器的體積時，系統運行所需的滅菌和洗滌液體的體積變得極其重要。由于等待去 污染，應當貯存這些流體，這造成升高的維護成本。此外，該系統的運行需要動用兩個貯槽 以用于有效的選擇性培養。這些因素限制了可以在相同的技術平臺上實施的培養的數目。-接近處于培養中的細胞是困難的，因為培養物維持在封閉的容器中。因為必須注 意流體管路的無菌，更加減少這種接近。因此，對培養物進行監測，特別是實時監測是困難 的。_由于需要借用流體管路和保持培養物的密閉，在培養物中引入不溶的、與所使用 的培養基不可混溶的或者與所使用的培養基難以混溶的物質也變得復雜。-難以調節該裝置的不同區室的壓力，這使得實際上不可能獲得該系統內恒定且 均勻的壓力。在這些條件下，培養的重現性受到影響。此外，可能突然發生流體管路中的過 壓，并因此干擾或中斷該裝置的運行。_培養物從一個培養容器向另一個培養容器中的轉入不允許進行靜止模式的培 養，因為這必然涉及懸浮細胞的重新接納和靜止變體的去除。國際申請W02005/083052描述了另一種裝置，其用于選擇在連續培養中在懸浮狀 態下增殖的變體。該裝置采取撓性管的形式，在該撓性管內部，在位于該管的上游和下游的 兩個緊固點之間生產培養物。培養基的更新通過提供新鮮培養基來進行，而相同體積的用 過的培養基的去除通過在緊固點之間管的移動來進行。緊固點的打開和關閉產生了蠕動效 應。在緊固點之間所引入的該管的新節段給予新鮮培養基并參與稀釋，而固著在壁上的靜 止突變體隨著在該管的用過的節段范圍內該管的移動而被去除。就培養物的體積和密閉而言，該裝置具有與前述的相同的限制。此外，看來難以通 過經該管的唯一的壁進行擴散來合適地確保氣體交換。根據本發明的方法和裝置是為了補救上面所描述的培養裝置的限制。本發明的目標是使得能夠連續培養細胞培養物，以便尤其是施行具有確定的生長階段的變體的選擇。根據本發明，這些培養在置于封閉的圍殼中的培養支持物和開放模式的培養容器之中進行。根據本發明，“培養容器”或“培養槽”是指培養基的容器，其通常用于與培養基直 接進行接觸。根據本發明，“培養支持物”是指包含培養容器和培養容器的支持物的全體。 根據本發明，下面所描述的培養支持物是特定的培養支持物。無論在該方法中使用的封閉的圍殼之內所使用和放置的培養容器是什么樣的，下 面所描述的連續細胞培養方法的特殊構造使得能夠容易接近以連續模式實現的培養物。下面所描述的根據本發明的培養支持物(置于根據本發明的裝置的圍殼內部)的 特殊構造使得能夠容易接近以連續模式實現的培養物。如此設計這些培養支持物，以便其 所包含的培養容器能夠隨意地替換，例如根據本發明的一個優選方面，當培養物聚積了太 多數目的靜止變體時。但是，在本發明的范圍內還可以考慮其他培養支持物和/或培養容 器，并且在根據本發明的方法中進行使用。在封閉的圍殼內的操作可以借助于機器人化操作臂來進行，這另外還大大地降低 了污染風險。根據本發明，存在于該裝置中的培養支持物和/或培養容器的數目可以通過簡單 地調整其中放置有它們的封閉的圍殼的尺寸來進行調配。因此，接連地或平行地一齊進行 數個培養是可能的。在本申請中所描述的方法和裝置以及使用該裝置的方法具有許多優點，其中可以 提及_這樣的可能性，即在無菌條件下，在液相中，在均勻的溫度和壓力下，懸浮培養單 細胞或寡細胞生物(需氧的或厭氧的，根據在封閉的圍殼內所存在的氣體混合物)。特別 是，在無攪拌下培養需要恒定照明和懸浮培養模式的光合作用微生物的可能性。-這樣的可能性，即以根據在培養物中直接測量的預先確定的物理化學參數(細 胞密度，PH，產物濃度...)而確定的細胞生長階段，在恒定的體積下，進行連續培養經過數 目眾多的代(并且在可以非常長的持續時間內)。-這樣的可能性，即測量對于在線檢查或監測培養物而言必需的各種參數(pH， P02，底物，產物...)。_這樣的可能性，即對培養物應用產生選擇壓力和能夠被調節的物理化學參數 (分子的供給，T°C，pH，···)。_這樣的可能性，即通過將培養物吸移和轉移到新的無菌培養容器中和/或替換 培養支持物，來以所需頻率將處于懸浮生長的生物量(屈從于稀釋)與固定化在培養系統 的任何壁上的生物量(對稀釋不敏感)相分開。-這樣的可能性，即通過排出在培養容器和/或支持物處存在的液相并用新鮮培 養基替換該液相，來選擇靜止變體(而不是在懸浮狀態下增殖的變體)，其中例如使固著在 支持物上的靜止變體重新懸浮。-這樣的可能性，即采用一次性使用或可循環使用的、用于單一用途的培養支持物 和/或培養容器和/或吸移材料。本發明的目標在于連續模式(通常開放的)的細胞培養的方法，其尤其使得能夠 選擇在懸浮狀態下增殖的細胞變體或以靜止方式的細胞變體。
根據本發明，“連續模式的培養”或“連續培養”是指在液體培養基中進行的培養， 其中更新所述培養基的一部分以便持久地將細胞維持于生長狀態。優選地，以未事先確定 的大的代數目，優選地超過100代，更優選地200代，更加優選地1000代，維持細胞。培養基或者其組分(稀釋劑)的更新可以持久地、有規律地或定期地進行。可以 就培養基的組成中所涉及的一種或數種成分，或者就這些成分的混合物的整體，來更新培 養基。一般地，更新培養基以使得至少大多數細胞，優選地至少50%的培養細胞，更優選地 其中的至少80%維持在懸浮狀態。根據本發明，更一般地，培養基為液體培養基。在下文中，不加區別地使用 術語“培養基”和“培養物”。“細胞”在本文中定義為小尺寸的生物實體，其包含由膜界定的細胞質并具有自主 繁殖的能力。細胞可以是真核細胞或原核細胞(動物的或植物的)。將微生物視為細胞。細菌、酵母和單細胞藻類是用于實施該發明的優選的細胞。“液體培養基”是指包含營養物質以及任選地其他組分例如選擇試劑(抗生素)的 液體混合物，在其中細胞可以進行增殖。“細胞變體”定義為不具有與在相同條件下培養的其母細胞相同的生理學特征的 子細胞。其中變體作為目標的生理學改變可以隨著遺傳修飾(點突變，遺傳物質的丟失或 獲得)而突然出現，但也可以由于壓力或者由于對培養細胞的行為可能具有持久影響的任 何其他因素而產生。根據本發明，不需要預先確定這些生理學改變。相反地，本發明的目標在于促進從 自發改變開始的細胞變體的出現，然后從這些變體中選擇已獲得了這樣的特性的那些，所 述特性賦予它們以相對于其他培養細胞而言的競爭優勢。通常，這些新的特性使得它們能 夠更快地增殖或者更好地利用培養基。可以根據兩種主要方式來選擇根據本發明的細胞變體-懸浮變體選擇出在液體培養物中的浮游生物式成長之中更具競爭力的變體。 在這種情況下，尋求去除的是靜止變體。-靜止變體選擇出這樣的變體，其固著、聚集、形成包囊或采取任何其他抵抗稀 釋的形式，例如以生物膜的形式。在這種情況下，尋求去除的是懸浮成長的變體。根據本發明的連續細胞培養的方法(其使得能夠選擇靜止的或在懸浮狀態下增 殖的細胞變體)的特征在于，所述方法包括一個或數個下列步驟，更通常地，下列步驟，通 過其a)用一種或數種活細胞接種包含在第一培養容器中的液體培養基，所述第一培養 容器在封閉的圍殼中維持開放；b)在所述培養基中，將所述細胞帶至確定的生長階段，該確定的生長階段相應于 給定的細胞密度或者相應于在培養基中所測量的物理化學參數；c)通過在所述培養容器中提供新鮮培養基或至少一種稀釋劑，使在步驟b)中所 達到的在培養基中的細胞密度或者所述物理化學參數的值維持明顯恒定；d)通過吸移從在C)中所獲得的培養物中抽取包含懸浮細胞的一部分培養基，以 便維持培養物的體積；e)將在d)中所獲得的培養基的一部分轉移到第二培養容器中，所述第二培養容器通常替換第一培養容器； f)取出，甚至除去具有其所包含的剩余培養物級分的所述第一培養容器；g)在該第二容器中進行數代培養之后，選擇在懸浮狀態下增殖的細胞和/或靜止 的細胞變體。對于上面的根據本發明的方法或者對于下面所描述的根據本發明的方法，在根據 本發明的步驟c)中，不排除，在所述培養容器中提供新鮮培養基或至少一種稀釋劑也可以 是同時提供新鮮培養基和至少一種稀釋劑。通常，關于“至少一種稀釋劑”，一種(單一的) 稀釋劑是優選的，但是也可能使用數種稀釋劑而不偏離本發明的范圍。根據本發明，在封閉的圍殼中的所有培養容器通常是相同的，但也可能的是，在同 一圍殼內培養容器是彼此不同的或者屬于數種不同的類型。根據該方法，可能分開地或同時地選擇在懸浮狀態下增殖的細胞變體以及靜止的 變體。當更特別地希望選擇在懸浮狀態下增殖的變體時，可以更具體地以下面的方式來 進行。根據本發明的連續細胞培養的方法(其使得能夠選擇在懸浮狀態下增殖的細胞變 體)的特征可以在于，所述方法包括下列步驟a)用一種或數種活細胞接種包含在第一培養容器中的液體培養基，所述第一培養 容器在封閉的圍殼中維持開放；b)在所述培養基中，將所述細胞帶至確定的生長階段，該確定的生長階段相應于 給定的細胞密度或者相應于在培養基中所測量的物理化學參數；c)通過在所述培養容器中提供新鮮培養基或至少一種稀釋劑，使在步驟b)中所 達到的培養物的細胞密度或者所述物理化學參數的值維持明顯恒定；d)通過吸移抽取包含懸浮細胞的一部分培養基，以便維持培養物的體積；e)將其中細胞處于懸浮狀態的在d)中所獲得的培養物的一部分轉移到替換第一 培養容器的第二培養容器中；f)取出具有其所包含的剩余培養物級分的所述第一培養容器；g)在該第二容器中進行數代培養之后，選擇在懸浮狀態下增殖的細胞。根據該方面，在步驟f)中與容器一起被除去的培養物級分通常由靜止變體組成。 步驟f)是取出步驟，或者除去步驟，或者取出或除去步驟。當更特別地希望選擇靜止變體時，可以以下面的方式來進行a)用一種或數種活細胞接種包含在第一培養容器中的液體培養基，在所述第一培 養容器中放置有至少一種固體表面，優選地板，所述第一培養容器在封閉的圍殼中維持開 放；b)在該經接種的培養基中，將所述細胞帶至確定的生長階段，該確定的生長階段 相應于給定的細胞密度或者相應于在培養物中所測量的物理化學參數；c)通過在所述培養容器中提供新鮮培養基或至少一種稀釋劑，使在步驟b)中所 達到的培養物的細胞密度或者所述物理化學參數的值維持明顯恒定；d)通過吸移從在C)中所獲得的培養物中抽取包含懸浮細胞的一部分培養基，以 便維持培養物的體積；e)將在其上沉積有在d)中所獲得的培養物的一部分的所述固體表面轉移到替換第一培養容器的第二培養容器中； f)取出具有其所包含的剩余培養物級分的所述第一培養容器；g)在數代培養之后，選擇固著在所述固體表面上的靜止的細胞變體。根據本發明的該方面，在步驟f)中與容器一起除去的培養物級分最經常地相應 于其中存在有大部分的在懸浮狀態下增殖的細胞的液體級分。步驟f)是取出步驟，或者除 去步驟，或者取出或除去步驟。更特別地，本發明的該實施方式涉及固體表面。這些固體表面向靜止的細胞變體 提供了在選擇過程中進行固著的可能性。固體表面可以具有各種不同形式，例如板、珠或顆 粒。它們可以由無機的或有機的各種不同材料(塑料的、金屬的、玻璃的、礦物的、復合的) 構成。塑料材料例如聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚乙烯、聚丙烯、聚氨酯及其衍生物是優選的。所 述表面可以經物理或化學處理。可以將它們懸浮在培養基中，鉤掛或放置在培養容器的底 部。優選地，固體表面被設計成能夠通過培養容器的開口而取出，并置于包含例如新鮮培養 基的新的培養容器中。根據該方法的一個優選實施方案，所述固體表面由經處理以避免細胞粘附的材料 構成。這是因為，該方法可以包括這樣的步驟，在該步驟中測試各種不同的表面以便確定這 些表面中的哪個允許靜止變體的更好的或更少的粘附。在這方面，該方法對于選擇限制細 胞粘附的材料以調制出例如限制污染的外科手術材料如導管可以是特別有用的。相反地， 該方法對于選擇這樣的材料可以是有用的，所述材料有利于在假體或醫學植入物的調制中 所尋求的細胞定居(生物發生表面)。有利地，根據本發明的方法使得能夠選擇出處于預先確定的生長階段的細胞變 體。這是因為，根據所述方法的步驟b)，優先地在培養基中將細胞帶至這樣的生長階 段，所述生長階段由細胞密度或在培養基中可測量的物理化學參數(例如PH、溶解氧的量、 有效碳或有效氮等)來確定或者與之相關聯。為了達到該“確定的”生長階段，可以利用以實驗方式或由文獻數據開始事先建立 的典型生長曲線。通常在以不連續模式進行的培養的基礎上建立這些曲線。它們使得能夠 將細胞密度或培養基的物理化學參數與在給定的時刻大多數培養細胞所處的生理學狀態 聯系起來。本領域技術人員已知，細胞在培養周期過程中經過不同的生理學狀態，這些生理 學狀態尤其與培養基在某些底物方面的耗盡相關，特別是當不更新培養基時。這些生理學 狀態通常表示細胞對于其環境的適應。根據本發明的一個優選方面，可測量的物理化學參數的特定值是固定的，例如細 胞密度值，其已知作為確定目的酶分泌的參數。該方法規定，在培養基接種后，細胞進行成 長直至達到該固定值。當達到該臨界值時，開始進行連續模式的培養，以便例如保持恒定的 細胞密度。因此，可能的是，盡可能長時間地將細胞維持在所希望的生理學狀態下，這使得 能夠例如延長其間細胞將會分泌目的產物的時期。根據本發明，細胞培養通常以開放模式來進行，這有利于進行干預和抽取，其是維 持于恒定的所選物理化學參數的值所要求的。這意味著，被選擇用于實施該方法的培養容 器最經常地具有足夠寬和使用方便的開口，優選地朝上或朝向頂部，以便能夠有利地引入對于實施通過吸移來抽取培養基或者實施借助于探針的直接測量而言所必需的材料。“頂 部”通常是指相對于水平基面(可以是地面)而言的培養容器的最高點。
因此，根據本發明的一個優選實施方案，該方法的特征在于，所述培養容器在其頂 部維持開放，并且在其開口周圍連續地施加氣流，例如無菌空氣氣流。在這方面，本方法區別于現有技術中所描述的連續或半連續模式的培養方法，現 有技術中所描述的那些方法在封閉的容器中進行，這不允許建立培養基的實時監測。因此，根據本發明的方法使得能夠選擇出在預先確定的生長階段處維持的，甚至 同步化的細胞變體。這對于選擇例如短暫地合成目的產物(例如酶或抗生素)的細胞變體 是特別有用的。因此，細胞變體的選擇可以通過重現其中細胞合成目的產物的條件來實現。 因此，根據本發明的方法特別適于改善在發酵方法中所使用的工業株，尤其是在半連續模 式(即其間培養基以固定的持續時間進行更新的模式)下所使用的那些。不管是選擇懸浮變體還是選擇靜止變體，本發明的一個特別的方面在于，實施前 面所描述的方法以在無限制的持續時間內合成目的產物，其中將細胞維持在對于合成所述 產物來說最佳的生長階段。通常，在封閉的圍殼中實施根據本發明的方法，所述封閉的圍殼的尺寸可以根據 使用者的需要、培養物的數目和體積而變化。更特別地，根據本發明的一個實施方案，a)至f)這些不同的步驟在封閉的圍殼中 進行。在圍殼中，壓力和溫度可以維持恒定在所希望的值。在培養容器是開放的情況下， 培養物通常處于與在圍殼中所施加的壓力同樣的壓力下。因此，通常消除了在現有技術的 密閉的系統中所遇的局部過壓的風險。所述圍殼還使得能夠檢查培養物的氣體環境，這在于厭氧條件下進行培養的情況 下是特別有用的。該培養方法最經常地規定，借助于鼓泡裝置(例如以導入到培養容器中的通氣桿 形式，其通常通過所述容器的開口)在加壓下將無菌氣體(例如無菌空氣)注入到細胞的 培養基中。該氣體注入使得能夠進行培養基的通氣、通過氣升(通過鼓泡而實現的攪動) 而進行的所述培養基的均質化，并且有助于在圍殼內部維持一定的氣體壓力。根據該方法，所述圍殼優選地由無菌氣流經過。根據所選擇的培養條件，該氣流可 以由氣體(例如氮氣)或者氣體混合物(例如空氣)構成。優選地，在打開的培養容器開 口的周圍施加無菌氣流，以便使污染物遠離該區域并因此降低污染的風險。該氣流還使得 能夠平衡圍殼內的壓力。對于封閉的圍殼的所有容器，無菌氣流的流通條件最經常地是相同的。為了系統的更大效率，通常如此地施加氣流(其優選地是層流)要么從培養容器 的上端至下端，要么從培養容器的下端至上端，通常在所述培養容器的外部。下面所描述的 根據本發明的裝置是其中從培養容器的上端至下端施加(或引導)無菌氣流的裝置。更優選地，在培養容器的周圍，特別是在所述容器的開口周圍加快氣流，從而在培 養容器的低處部分處產生壓降。為了局部地獲得該壓降，可以將培養容器置于在其底部配 備有氣流的抽吸和排出工具的朝上開放的密閉箱中。因而，可以在位于培養容器和所述密 閉箱的內壁之間的體積中局部地獲得壓降。
優選地，無菌空氣從上至下經過位于密閉箱的內壁和培養容器之間的體積，并且它在培養容器的底部排出到圍殼外。如此，污染物在所述體積中被捕獲并被帶向密閉箱的 低處部分。因此，它們不進入培養容器的內部，該培養容器稍微處于過壓狀態，這尤其是因 為在培養基中通過鼓泡來進行氣體的供給。另一個實施方案包括加快從培養容器的下端至上端的無菌氣流。根據本發明的一個優選實施方案，在置于同一個圍殼中的數個培養支持物中同時 進行數個培養。“數個”是指至少兩個。當在同一個圍殼中同時進行不同的培養時，無菌氣流對于避免交叉污染來說是特 別有用的。根據上面所描述的方法的一個優選的方面，在進行步驟g)之前，重復上面的步驟 a)至f) 一次或數次。根據本發明的一個實施方案，在步驟C)中在培養物中的明顯恒定的細胞密度的 維持通過下述方式來實現用新鮮培養基稀釋培養物，從而在培養容器中保持恒定的培養 基體積。在選擇懸浮變體的情況下，可以通過用無菌移液管進行吸移來實現將包含懸浮細 胞的培養基移注到第二培養容器中。吸移操作優選地借助于位于封閉的圍殼內的機器人化 臂來進行。通常，將用過的第一培養容器從它可能所屬的培養支持物上取下。在所有情況下， 借助于閘來將該第一培養容器撤出到封閉的圍殼之外。該閘使得能夠將圍殼內部的壓力和 無菌狀態維持穩定。通常，除去撤出的容器。可以將處于操作運行中的培養容器置于恒溫隔間(alWole)中，即置于其壁維持 在所希望的溫度下的開放的圍殼中，它們使得能夠調節細胞培養物的溫度。根據一個優選 的方面，密閉箱本身是恒溫的并且充當隔間。這是因為，該箱的壁之一可以包含加熱工具， 從而使得能夠調節放置在所述箱的內部體積中的物品的溫度。在培養容器周圍存在有恒溫 隔間的情況下，當然應當包含有在培養容器和密閉箱內壁之間的空間，就像在恒溫罩和密 閉箱之間的空間一樣。優選地，根據本發明的培養支持物和/或培養容器是用于單一用途的，并且與圍 殼內部的機器人化操作相容。這是因為，本發明優選地規定，該方法的至少某些(即數個) 步驟借助于一個或數個使得能夠在圍殼內部進行移動的自動化臂來進行。優選地，所述圍 殼在該方法的各個不同步驟過程中保持封閉。根據本發明，通常以超過IO2的代數目，優選地超過IO4的代數目，更優選地超過 IO6的代數目，和更加優選地超過IOki的代數目，將細胞連續地進行培養，而無需朝向外部 環境(直接)打開圍殼。優選地，開放連續模式的根據本發明的培養方法借助于特別適于此的培養裝置來 實施。本發明還涉及使得能夠施行開放連續模式的細胞培養的培養支持物，其特征在 于，所述培養支持物包含-至少一個在其頂部開放的培養容器，其適合于包含液體培養基；-至少一個朝上開放的密閉箱，其中容納所述培養容器；
-所述培養容器和所述密閉箱之間的空間，其適合于讓氣流在容器的開口周圍，在 培養容器和密閉箱內壁之間從上至下地流通；和-抽出所述氣流的工具，其位于密閉箱的下部部分處。優選地，所述抽出氣流的工具是讓氣流例如空氣通過的一個或數個孔。 在一個實施方案中，培養支持物呈現為可拆卸的組件的形式，其中數個所述密閉 箱集合在一起，在這些密閉箱中容納至少一個所述培養容器。優選地，密閉箱的所述下部部分鑲嵌在基座上，所述基座裝配有抽出在培養容器 和密閉箱壁之間流通的所述氣流的補充工具，例如與真空泵相連的管子，或者一個或數個 氣體分配工具。根據本發明的培養支持物可以包含至少一個調節所述密閉箱的內部體積的溫度 的工具，所述調節所述密閉箱的內部體積的溫度的工具優選地是包括在所述密閉箱的至少 一個壁中的加熱電阻。根據本發明的培養支持物包含至少一個將空氣注入到包含在所述容器中的培養 基之中的工具，例如一個或數個通氣桿。根據本發明的培養支持物包含至少一個光學測量存在于培養容器所包含的培養 基中的細胞的密度的工具。根據本發明的培養支持物可以包含至少一個為自養模式的微生物培養產生光的 工具，其位于所述培養容器和所述密閉箱的內壁之間的空間中，或者包括在所述密閉箱的壁中。最后，本發明涉及使得能夠進行開放模式的連續細胞生長的細胞培養裝置，其特 征在于，所述裝置包含_ 圍殼；-產生經過所述圍殼的無菌氣流的工具；-一個或數個如前面所描述的根據本發明的培養支持物，其安放在所述圍殼中，并 且使得能夠施行開放模式的細胞培養。所述細胞培養裝置可以包含至少一個更新培養基的工具，其置于所述圍殼內部。所述細胞培養裝置可以包含至少一個適于替換包含在培養支持物中的培養容器 的培養容器。所述細胞培養裝置的特征可以在于將該產生無菌氣流的工具置于圍殼的上部部 分處，以便所述無菌氣流從培養支持物的上端流向下端。所述細胞培養裝置還可以包含至少一個在所述培養容器底部的抽出無菌氣流的 工具，所述抽出無菌氣流的工具優選地在位于培養支持物的培養容器和密閉箱之間的空間 中產生壓降。所述抽出工具可以與至少一個適于抽吸環繞在培養容器開口周圍的空氣的空 氣抽吸工具相聯合。所述細胞培養裝置的特征可以在于該更新培養基的工具包含將培養容器的一部 分內容物移注至排出區的工具。所述細胞培養裝置的特征可以在于該更新培養基的工具包含將新鮮培養基從位 于圍殼內部的儲庫移注至培養容器的工具。該移注工具優選地包含移液管和抽吸在所述移液管中的新鮮或用過的培養基的工具。所述細胞培養裝置還可以包含至少一個向圍殼外部輸出該移注工具和/或至少 一個培養容器的工具，所述輸出工具優選地包含閘。所述細胞培養裝置的特征可以在于它包含至少一個將空氣注入到培養物中的工具。所述細胞培養裝置的特征可以在于它包含至少一個適于在圍殼內部施行移動的
自動化臂。所述細胞培養裝置的特征可以在于該圍殼是封閉的。所述細胞培養裝置可以包含數個安放在所述圍殼中的培養支持物，以便平行地施 行數個開放模式的細胞培養。所述細胞培養裝置的特征可以在于它使得能夠實施根據本發明的方法。通過閱讀下列附圖，將會更好地理解本發明，其中

圖1示意性地顯示了第一種根據本發明的培養支持物，以透視形式；圖2示意性地顯示了第二種根據本發明的培養支持物，以透視形式；圖3示意性地顯示了用于如圖2中所顯示的培養支持物的包含隔間的可拆卸的組 件，以相關于圖4而言的III-III切面形式；圖4顯示了圖3的包含隔間的可拆卸的組件，以俯視形式；圖5示意性地和部分地顯示了根據本發明的細胞培養裝置，以透視形式；圖6至10各自示意性地顯示了在封閉的圍殼(未顯示)中根據本發明的連續細 胞培養方法的運作規劃，其使用任一種培養支持物，每個圖相應于該運作的特定步驟，-圖7顯示了細胞培養的初始步驟；-圖8顯示了培養容器的更換步驟；和-圖9顯示了培養基的抽取步驟；和-圖10顯示了用于分析的微量樣品的抽取步驟。圖1示意性地顯示了第一種根據本發明的培養支持物。其朝上開放，適合于包含 液體培養基。支持物1包含容納于朝上開放的密閉箱2中的培養容器6，在所述密閉箱中容納所 述培養容器。將培養容器置于恒溫罩3中，該恒溫罩根據本發明是任選的。可以給培養基(以裝滿形式顯示，點繪，在圖1中)供給氣體，例如空氣，最經常地 在加壓下，通過在此由通氣桿4(以例如鼓泡棒(carme de bullage)的形式)構成的鼓泡 裝置。借助于臂5而得到支承的該桿4，通過培養容器6的開口而垂直伸入到其中存在有培 養基的培養容器6之中。臂5可以進行垂直運動以將桿4的下部末端定位在培養容器6中 的所希望的地方。圖1中指向下端的空心箭頭象征著無菌氣流，例如無菌空氣，其從上至下地流通 并且穿過位于密閉箱2的內壁和恒溫罩3之間的空間或體積7。無菌氣流通過數個排出孔 8而排出。排出孔8代表了抽出氣流的工具，并且位于密閉箱2的下部部分處，優選地在底 部。培養容器6可以是小玻璃瓶(fiole)、細頸瓶(bouteille)或錐形瓶(Erlen)型的 任何類型的朝上開放的容器。優選的是，培養容器6可以自定位并且容易地從密閉箱2中
16撤出。如在圖1中所顯示的，選擇在高度上不超出密閉箱2的壁的培養容器6是有利的。設計了其流通可以被組織成從培養支持物1的上端至下端的無菌氣流，以便在由 密閉箱2的內壁所界定的培養容器6的開口周圍產生無菌屏障。可以通過在密閉箱2的下部部分處產生壓降來加快該氣流，例如通過將排出孔8 與抽吸工具相連。優選地，密閉箱2的下部部分被設計成鑲嵌在基座上，所述基座裝配有抽出所述 無菌氣流的補充工具，例如與真空泵相連的管子。在需要的情況下，所述基座可以裝配有一 個或數個對于實施連續模式的培養方法來說有用的收集或分配氣流的工具。圖2示意性地顯示了第二種根據本發明的培養支持物1'，以透視形式。培養支持物Γ包含存在于密閉箱2'(在此以透明形式顯示)中的培養容器 6'。培養容器6'和密閉箱2'兩者都朝上開放。培養容器6'能夠自定位并且容易地從 密閉箱2'中撤出，因為它在高度上不超出密閉箱2'的壁。培養容器6'包含培養基11。在培養容器6'和密閉箱2'的內壁之間確定出了空間7'，所述體積7'能夠由 氣流從下至上地穿過。在此沒有顯示排出所述無菌氣流的工具，但它們是數個位于密閉箱 2'的底部中的孔。將兩個光學測量存在于培養基中的細胞的密度的工具9與透明的培養容器6'彼 此布置在一起，并且在空間7'中。在培養容器6'的內部，存在有垂直的內壁10。它使得通過通氣桿4以“氣升”方 式注入到培養基11中的氣體能夠更好地進行流通。圖3和4顯示了根據本發明的優選的培養支持物1"，其采取可拆卸的組件12的 形式，所述可拆卸的組件包含六個隔間或區室，24、25、26、27、28和29，其中插入有密閉箱 16。圖4以俯視形式顯示了組件12，和圖3以III-III橫切面(參見圖4)形式顯示了組件 12。組件12包含四個自身包含壁10的培養容器6'，每個所述培養容器容納于組件 12的隔間25、26、28和29中。可以將每個培養容器6'手工放置在隔間中。組件12優選 地由一整塊材料制成。實際上，組件12呈現為這樣的形式，就好像數個在圖2中所顯示的 并在前面所描述的培養支持物1'處于通過其密閉箱2'的外壁而連結在一起的狀態。隔 間在其周圍裝配有壁，從而形成密閉箱16。氣體分配工具，即包含在通氣構件13中的收集器和過濾器，通過各通氣桿4進行 延伸，以達到每個培養容器6'。從上至下經過培養支持物1"的無菌氣流由空心箭頭來象 征，而向培養基進行供給的氣體的路徑由實心箭頭和氣泡來表示。當將組件12置于封閉的 圍殼中時，無菌氣流的該流通(優選地，持久的)確保了每個培養容器6'的密閉。該培養 組件12可以通過在其整體中所整合入的加熱電阻的存在來保持恒溫。通過排出工具14在每個包含培養容器6'的隔間的底部排出無菌氣流，所述排出 工具采取用于與空氣抽吸工具例如真空泵相連接的管子的形式。在其低處中心部分處，組件12優選地包含收集和分配通氣用氣體的主管 (rampe)。這些氣體通過可拆卸的彎管4而被送往每個培養容器6‘的內部，所述可拆卸的 彎管在末端處終止于伸入到培養容器6'中的通氣桿4，并且可以在安裝培養容器6'之 后，在連接器位置處手工安置在分配主管上。這些彎管于低處位置處將氣體帶入到每個培養容器6'中，以便造成“氣升”，其用于確保培養基中氧、二氧化碳或其他氣體的供應以及 確保培養基的均勻混合。發光側板或照明板15在側面布置在兩個隔間25和26中，以使得能夠培養光合作 用微生物。優選地，板15是可拆卸的和是使得能夠培養光合作用微生物的產生光的板，并 且位于培養容器6'和密閉箱16的內壁之間的空間中，或者包括在密閉箱16的壁中。優選 地，借助于發光二極管(LED)來產生光，其波長根據所涉及的微生物的光合色素來進行選 擇。根據所使用的LED的類型，發射出的光可以相應于白光或各種不同波長的光。此 外，根據LED的運行模式，可實現頻閃照明制度。這種照明可能性使得能夠培養諸如原核或 真核微觀藻類的光合作用微生物，更特別地以自養模式，尤其是通過將照明與在引入到培 養物中的通氣和混合用氣體之中使用CO2相聯合。“自養模式”是指這樣的培養，其中細胞通過進行無機物質(例如以二氧化碳的形 式)的還原以及通過吸取培養基中的無機鹽而產生有機物質。對于該合成來說所必需的能 量來自光，正如在例如光合作用的情況下一樣。因此，根據本發明的培養支持物使得能夠在需要的情況下，在根據本發明的方法 的每個步驟中連續地對細胞進行照明。根據一個非代表性的變化形式，產生光的工具還可以采取板的形式，所述板形成 密閉箱的壁的全部或部分。根據本發明的一個特別的方面，產生光的工具是具有下列功能的UV燈或二極管 要么通過在使用之前或之后進行照射來使密閉箱的內部體積去污染，要么在選擇方法過程 中在培養細胞上產生突變。將光學測量工具9(其為測量培養基的濁度的叉形物)成對插入到隔間24、25、26、 27,28和29中每一個隔間的低處部分，以便監測存在于這些隔間中的培養基的細胞密度的演變。以前面所描述的組件12形式的培養支持物具有有利于實施根據本發明的連續培 養方法的益處。這是因為，在開始操作運行之前，可以在無菌的圍殼中準備和放置數個培 養容器6'。在圍殼內部分配主管與氣體供應系統的銜接通過在將組件安放在根據本發明 的培養裝置的特殊底座上時進行快速連接來實現，所述培養裝置此外可以容納數個這些組 件。同樣地，規定，所必需的電連接(加熱，檢測器，照明)在將組件放置到底座上時通過簡 單的接通來進行。這樣的組件有利于操作運行前的裝卸，并且后來使得能夠減少在實施該 培養方法過程中在封閉的圍殼內部進行的自動化移動。因而，該裝置可以在更長的持續時 間內自動運轉。根據本發明的一個優選實施方案，所述培養裝置是自動裝置，其可以包含許多具 有六個槽的可拆卸的組件12 (可以從1至100個進行變動)。每個組件12可以進行手工包 裝，滅菌，然后引入到在為此準備的底座上的自動裝置中。當安裝組件12時，選擇性培養方 法可以如此而開始，即填充培養容器，對其進行接種，然后根據已經描述的方法以恒定體積 進行連續培養。因此，可能的是，平行地進行大量的連續培養，其中每個組件12可以是一個 獨立實驗的場所。當培養物需要轉移(例如因為靜止變體的積累變得太多)時，將組件12的第一培養容器的培養物體積吸移和轉移至同一個組件的第二培養容器。當組件12的所有培養容 器都已被使用時，可以將培養物轉移到可用的另一個組件12的培養容器中，而完全使用過 的組件可以用新的經包裝的組件進行替換，所述新的組件裝配有六個新的無菌培養容器。此外，使用裝配有以組件的形式的培養支持物的裝置還使得能夠簡化移液、稀釋 和轉移的機器人化操作。根據本發明的裝置可以在10個、20個或至少40個組件，即60個、120個或至少240 個槽中，同時進行單一微生物物種或給定的微生物聚生體的選擇性培養，以達到可達1200、 2400或至少4800mL的總培養體積。如此，同樣多地增加了獲得給定的突變體的概率。該增 加對于具有復雜基因組的細胞或者對于緩慢生長的物種的細胞而言是特別令人感興趣的。圖5顯示了根據本發明的連續培養裝置100。圍殼17(其當裝置100處于操作運 行中時是封閉的)是建議的，但沒有完全顯示。裝置100包含數個如圖1中所顯示的培養支持物1、圍殼17和產生經過所述圍殼 17的無菌氣流的工具23。培養支持物1在圍殼17中平行地運轉。圍殼17由能夠在該空 間的三維尺度中移動、安裝在軌道上的機器人化臂19走過。該機器人化臂19配備有使得 能夠更新培養基的轉移移液管20、稀釋移液管21和操作鉗22。圍殼17的大小并不是限定的，這使得能夠在置于同一個圍殼17中的相同或不同 的數個培養支持物1中同時進行數個培養。穿過圍殼17的無菌氣流用從工具23而來的空心箭頭來表示，所述工具23位于圍 殼17的高處，以使得所述無菌氣流從培養支持物1的上端流向下端。經過圍殼17的無菌 氣流通過位于培養支持物1的底部處的孔8而排出到圍殼17外。優選地，設計了抽出氣流的工具，以便在位于同一個培養支持物18的培養容器1 和密閉箱2之間的空間中產生負壓。通常，將其與適于抽吸環繞在培養容器開口周圍的氣 流的氣流抽吸工具(例如真空泵(未顯示)，其例如位于圍殼17的底之下)相聯合。圖6至10各自示意性地顯示了在封閉的圍殼(未顯示)中根據本發明的連續細 胞培養方法的運作規劃，其使用任一種培養支持物，每個圖相應于闡明了該運作的特定步 驟的功能示意圖，-圖7顯示了細胞培養的初始步驟；-圖8顯示了培養容器的更換步驟；和-圖9顯示了培養基的抽取步驟；和-圖10顯示了用于分析的微量樣品的抽取步驟。圖6至10在下面的實施例中進行描述。下面的實施例的目的在于描述根據本發明的自動培養裝置(稱為“BED”)的運轉。 所述裝置是根據本發明的優選的裝置，其對于在本申請中所要求保護的發明不產生任何限 制。
實施例在封閉的圍殼(未顯示)中根據本發明的連續細胞培養方法的運作規劃使用任一 種培養支持物，更確切地說，培養支持物類型，每個圖相應于闡明了根據本發明的連續培養 裝置的運作的特定步驟的功能示意圖，所述根據本發明的連續培養裝置以這樣的形式，其
19包含-四個培養支持物I1U2U3和I4，每個培養支持物包含單個密閉箱2”22、23和24以 及單個培養容器6'2、6' 3和6' 4。每個培養支持物配備有用于與無菌通氣桿(或 鼓泡棒)相連接的鼓泡用臂51、52、53和54，，通氣桿(未顯示)的貯存庫1、42、43和44，以 及棄出培養容器的閘IS1US2US3* 184。可能的是，在一個變化形式中考慮，圖注I1U2U3 和I4代表可拆卸的組件12類型的培養組件，其包含數個(例如2個、4個、6個...)培養 容器。-無菌培養容器的儲庫(或貯存庫)SR。-轉移移液管的儲庫(或貯存庫)SPT。_用于添加新鮮培養基的稀釋移液管的儲庫(或貯存庫)SPD0-無菌的稀釋劑或培養基的貯存庫SMCD。-用于向圍殼外輸出樣品的取樣閘SE。-棄出移液管和被污染的材料的閘SEPM。-分析站的間SA，其使得能夠引入材料或試劑或者其他以便進行測量。-在長度方向上走過圍殼的多功能鉸接臂，其中該臂在三維尺度上移動的區域由 區域D19來標明。轉移移液管通常具有接近培養容器容積的容積，即最經常地20至30mL，并且用于 將大部分培養基從一個培養容器轉運到另一個培養容器中。稀釋移液管則通常具有小得多 的容積，例如最經常地2至3mL。箭頭和Txy類型(其中χ為圖的編號，和y為關于所述圖的路徑的編號)的圖注指 明了在培養開始時(圖6)、在稀釋的操作過程中(圖7)、在更換培養容器的操作過程中(圖 8)、在抽取培養物樣品的操作過程中(圖9)以及在抽取用于在封閉的圍殼內進行分析的培 養物樣品的操作過程中(圖10)鉸接臂的行程。裝置BED的運轉基礎運轉周期1° )培養的初始步驟操作者在該裝置的圍殼內將下列裝載器(chargeur)/承載器(portoir)安裝在各 自的貯存區中-無菌的培養槽(或培養容器)，_無菌的轉移移液管，_無菌的稀釋移液管，-無菌的鼓泡棒或通氣桿，其用于與鼓泡用臂5ρ52、53*54相連接。操作者在該細胞培養裝置中將包含不同稀釋劑的封閉的無菌儲器安裝在各自的 貯存區中。操作者打開包含不同稀釋劑的儲器。操作者在自動機器中在專用位置處安裝包含純培養物n° 1的封閉的無菌培養容
ο操作者打開所述培養容器。多功能自動化鉸接臂在儲器SR中抓住在其承載器上的槽(圖6，路徑1 ;T61)，并將它轉運至專用于該培養的培養支持物(圖6，路徑2 ；T62)。在圖6中所顯示的情況下，第一 個培養支持物I1在培養槽或容器6'工中用純培養物n° 1來進行填充，隨后相繼地，如下 面所說明的，從一個培養支持物開始，通過借助于轉移移液管進行轉移，其他三個培養支持 物12、I3和I4在相應的培養槽或容器6' 2、6' 3和6' 4中用培養基來進行填充。多功能自動化鉸接臂刺穿培養容器(無菌的槽)的保護膜。多功能自動化鉸接臂在儲器SPT中抽取在其承載器上的轉移移液管(圖6，路徑 3 ；T63)。配備有轉移移液管的多功能自動化鉸接臂抽取在包含培養物的管中的培養物 (圖 6，路徑 4;Τ64)。多功能自動化鉸接臂將培養物轉運至相應的支持物并在培養容器中清空轉移移 液管(圖6，路徑5;Τ65)。鼓泡用自動化鉸接臂抽取無菌鼓泡棒，隨后將該無菌鼓泡棒安放在培養容器中 (圖6，路徑6 ；T66)。鼓泡用自動化鉸接臂開啟氣體供給。2。)連續制度的培養自動裝置收到由位于培養支持物中的檢測器給出的起動信號。所述檢測器是經程 序化的，以便監測物理化學參數并且當達到該參數的臨界值時發出信號。從而，自動化鉸接臂在相應的儲器SPD中抽取無菌的稀釋移液管(圖7，路徑1 ；
T71) O自動化鉸接臂抽取確定體積的稀釋劑n° 1，隨后抽取無菌空氣氣泡以在轉運過 程中維持無菌狀態(圖7，路徑2 ；T72)。自動化鉸接臂重復該操作η次，以抽取所希望的體積的η個稀釋劑。多功能自動化鉸接臂將稀釋移液管轉運至相應的支持物并在培養槽中清空稀釋 移液管(圖7，路徑3;Τ73)。多功能自動化鉸接臂安放下稀釋移液管以便排出多余的體積。多功能自動化鉸接臂排出多余的體積，2種排出模式是可能的a)要么，多功能自動化鉸接臂將稀釋移液管安放在培養物中并抽取確定體積的培 養物，隨后吸進空氣氣泡，或者b)要么，多功能自動化鉸接臂將稀釋移液管安放于在培養槽中的確定高度處(相 應于所希望的培養體積)并吸進所有過量的培養體積，隨后吸進空氣氣泡。多功能自動化鉸接臂將包含多余培養物的稀釋移液管轉運至起著最近的液體排 出站/垃圾箱的作用(以維持無菌狀態)的棄出閘上面，并且在所述棄出閘181、182、183或 IS4中清空稀釋移液管的內容物(圖7，路徑4 ;T74)。同樣地，多功能自動化鉸接臂將空的稀釋移液管轉運至起著最近的固體排出站/ 垃圾箱的作用(以維持無菌狀態)的棄出閘上面，并且在所述棄出閘^、^、風或…中 棄去稀釋移液管(圖7，路徑4 ；T74)。3° )槽的更換要么在確定的時間周期結束時，要么在檢測出生物膜后，自動裝置檢測到更換培 養容器的起動信號。多功能自動化鉸接臂在儲器SR中抓住在其承載器上的槽，并將它轉運至專用于該培養的暫時位置(圖8，路徑1和2 ；T81和T82)。自動化鉸接臂在儲器SPT中抽取無菌的轉移移液管(圖8，路徑3 ；T83)。鼓泡用自動化鉸接臂關閉氣體供給，并從培養物中拿出用過的鼓泡棒。鼓泡用自動化鉸接臂在起著最近的固體排出站/垃圾箱的作用(以維持無菌狀 態)的棄出閘中棄去用過的鼓泡棒，并且在所述棄出閘岡、182、IS3或IS4中棄去用過的棒。自動化鉸接臂抽取培養物。多功能自動化鉸接臂將包含培養物的轉移移液管轉運至在專用于該培養的暫時 位置中的新的槽，并且在該新的培養槽中清空轉移移液管(圖8，路徑4 ;T84)。多功能自動化鉸接臂將空的轉移移液管轉運至起著最近的固體排出站/垃圾箱 的作用(以維持無菌狀態)的棄出閘上面，并且在所述棄出閘岡、182、IS3或IS4中棄去轉 移移液管(圖7，路徑4 ；T74)(圖8，路徑5 ；T85)。鼓泡用自動化鉸接臂抽取無菌的鼓泡棒(圖8，路徑6 ；T86)。鼓泡用自動化鉸接臂將該無菌的鼓泡棒安放在培養槽中。鼓泡用自動化鉸接臂開啟氣體供給。培養容器經棄出閘而被棄去(圖8，路徑7 ；T87)。4° )懸浮成長的微生物的選擇在如圖1中所顯示的培養支持物中，在培養容器(一次性使用的塑料槽)中進行培養。當需要時(形成了生物膜)，該一次性使用的培養容器可以有規律地用新的無菌 容器來替換，通過如上面所描述的機器人化臂的動作。培養裝置的全視圖例如在圖5中給出。當更換槽時，所述臂確保在培養槽交換期間將培養基泵送到無菌移液管中，隨后 將該培養基重新置于新的無菌槽中(容器交換功能)。此外，該機器人化臂還確保吸移一部分培養物和用相同體積的新鮮培養基來替換 所抽取的體積的功能(稀釋功能)，稀釋頻率可以由實驗者來確定(恒化器)或者通過培養 物的細胞密度來指導(恒濁器)。任何牽涉與培養物接觸的有形物品(通氣管，轉移移液管，稀釋用錐形頭)在每次 使用后都用新的無菌物品進行替換。將容器(=培養槽)置于使得能夠保持在受控溫度下的培養的恒溫金屬罩中。該 罩配備有一個或數個叉形物(不同波長的發射器/接收器)，其使得能夠測量槽中的細胞密 度(可見的，IR)，以及某些吸收性分子的濃度。培養槽和恒溫罩位于密閉箱中，在所述密閉箱內部，無菌氣流(例如無菌空氣)在 該罩和該槽周圍持久地流過，以便實現所述槽的恒定的無菌密閉(參見圖1)。如此，只有那些以懸浮模式成長(并因此經歷稀釋)的微生物在選擇性條件下在 長期時間內維持生長。由于使用了一次性使用的用于單一用途的槽和附屬配件并且沒有復雜的流體管 路，該系統不需要復雜和長時間的滅菌操作。該系統的所有布置好的槽都是有功能的，并且確保選擇性培養物的成長。此外，該系統使得能夠引導培養物，要么以具有蒸發補償的恒定的且具恒定體積的稀釋程度，要么以沒有蒸發補償的可變的稀釋程度，要么以具有蒸發補償的可變的稀釋程度。通過機器人化臂的動作來精細控制液相的分子供應的可能性使得能夠設想對于 眾多數目的組成成分而言精確調節對培養物所施加的選擇壓力，而無需增加流體管路的專
用支管。此外，添加難以操作的產品(例如乙酸，其是揮發性的和反應性的)也是可能的， 而不必須通過復雜的流體管路來運輸該產品。此外，該系統還使得能夠設想添加固體顆粒例如固定化在藻酸鹽珠上的細胞、與 水不可混溶的液體以及各種不可能在復雜的流體管路中在水相中實際運送的添加物。此外，小體積的等分部分的抽取可以在培養的任何時候以無菌方式通過機器人化 臂來進行，以便轉移至系統BED外部的任何類型的分析設備(HPLC，PCR, ELISA，MS...)，并 且在那里可以對結果進行整合以檢查當前的培養。此外，該系統還使得能夠根據微生物培養的需求的需要而使用各種不同形式的培養槽。5° )以生物膜形式成長的微生物的選擇前面所描述的裝置使得能夠通過機器人化臂在培養槽中添加各種不同材料的板， 以便選擇以生物膜形式成長的細胞。可以保留固著在這些板上的培養物級分，而取出包含懸浮細胞的培養基并用新鮮 培養基進行替換。同樣地，覆蓋有生物膜的板可以借助于機器人化臂而移動到新的無菌培 養容器中。以此方式，可能的是，選擇出這樣的細胞變體，其發展出固著在支持物上或者聚集 從而形成諸如生物膜的結構的能力。任選的補充動作1° )添加試劑在該情形下可以考慮任何類型的試劑，例如化學產品、生物化學產品(蛋白質、 DNA等)、生物產品(細胞懸浮液)等等。 自動機器檢測到添加試劑的起動信號。自動化鉸接臂抽取無菌試劑的微量移液管。自動化鉸接臂將該無菌試劑的微量移液管轉運至包含所希望的試劑的儲器。自動化鉸接臂抽取確定的相對于總培養體積而言可忽略的體積的試劑(例如， 25 μ L的試劑)，隨后抽取無菌空氣氣泡。多功能自動化鉸接臂將包含試劑的微量移液管轉運至相應的培育箱，并在培養槽 中清空稀釋移液管。多功能自動化鉸接臂通過在微量移液管中的吸進和推出循環來漂洗微量移液管的壁。多功能自動化鉸接臂將試劑的微量移液管轉運至固體成分排出站/垃圾箱上面， 并且在所述固體成分排出站中棄去試劑的微量移液管。2° )常規的樣品抽取操作者在取樣站或等分取樣站SE中安裝無菌管。
23
操作者拔出在取樣站或等分取樣站SE中的該無菌管的塞子。自動機器檢測到稀釋的起動信號和抽取的起動信號。以差不多的步驟，自動機器進行如在前面部分中于第2° )節中所描述的稀釋多 功能自動化鉸接臂將包含多余培養物的稀釋移液管轉運至站SE上面，并且在開放的無菌 管中卸下稀釋移液管的內容物(圖9，路徑3;Τ94)。操作者重新塞住在站SE中的該無菌管。操作者重新關閉該抽取管，并通過取樣閘SE來回收培養基。3° )緊急的樣品抽取操作者在取樣站SE中安裝無菌管。操作者拔出在取樣站SE中的該無菌管的塞子。自動機器檢測到抽取的起動信號。自動化鉸接臂在儲器SPD中抽取無菌的稀釋移液管(圖9，路徑1 ；T91)。自動化鉸接臂將該無菌的稀釋移液管轉運至所涉及的培養物(圖9，路徑2 ；T92)。自動化鉸接臂抽取確定體積(例如2mL)的培養基，隨后抽取空氣氣泡。多功能自動化鉸接臂將包含培養物樣品的稀釋移液管轉運至取樣站上面，并且在 開放的無菌管中卸下稀釋移液管的內容物(圖9，路徑3 ；T93)。多功能自動化鉸接臂將用過的稀釋移液管轉運至固體成分排出站/垃圾箱上面， 并且在所述固體成分排出站中棄去稀釋移液管(圖9，路徑4 ；T94)。操作者重新塞住在取樣站中的無菌管。操作者重新關閉該抽取管，并回收培養物的等分試樣。4° )用于分析的微量樣品的抽取自動機器檢測到抽取用于分析的微量樣品的起動信號。自動化鉸接臂在儲器SEPD中抽取無 的微量移液管(圖10，路徑1 ；T皿)。自動化鉸接臂將該無菌的微量移液管轉運至所涉及的培養物(圖10，路徑2 ； Tl02)。自動化鉸接臂抽取確定的微量體積(例如10 μ L)的培養物，隨后抽取空氣氣泡。多功能自動化鉸接臂將包含培養物樣品的微量移液管轉運至分析站SE上面，并 且在分析臺中在屬于該樣品的位置處卸下微量移液管的內容物(圖10，路徑3 ;Τ103)。多功能自動化鉸接臂將用過的微量移液管轉運至棄出移液管和被污染的材料的 閘SEPM(其起著固體成分排出站/垃圾箱的作用)上面，并且在所述閘SEPM中棄去微量移 液管(圖10，路徑4;Τ104)。
權利要求
連續細胞培養的方法，其使得能夠選擇靜止的或在懸浮狀態下增殖的細胞變體，其特征在于，所述方法包括下列步驟a)用一種或數種活細胞接種包含在第一培養容器中的液體培養基，所述第一培養容器在封閉的圍殼中維持開放；b)在所述培養基中，將所述細胞帶至確定的生長階段，該確定的生長階段相應于給定的細胞密度或者相應于在培養基中所測量的物理化學參數；c)通過在所述培養容器中提供新鮮培養基或稀釋劑，使在步驟b)中所達到的在培養基中的細胞密度或者所述物理化學參數的值維持明顯恒定；d)通過吸移從在c)中所獲得的培養物中抽取包含懸浮細胞的一部分培養基，以便維持培養物的體積；e)將在d)中所獲得的培養基的一部分轉移到第二培養容器中；f)取出具有其所包含的剩余培養物級分的所述第一培養容器；g)在該第二容器中進行數代培養之后，選擇在懸浮狀態下增殖的細胞和/或靜止的細胞變體。
2.連續細胞培養的方法，其使得能夠選擇在懸浮狀態下增殖的細胞變體，其特征在于， 所述方法包括下列步驟a)用一種或數種活細胞接種包含在第一培養容器中的液體培養基，所述第一培養容器 在封閉的圍殼中維持開放；b)在所述培養基中，將所述細胞帶至確定的生長階段，該確定的生長階段相應于給定 的細胞密度或者相應于在培養基中所測量的物理化學參數；c)通過在所述培養容器中提供新鮮培養基或至少一種稀釋劑，使在步驟b)中所達到 的培養物的細胞密度或者所述物理化學參數的值維持明顯恒定；d)通過吸移抽取包含懸浮細胞的一部分培養基，以便維持培養物的體積；e)將其中細胞處于懸浮狀態的在d)中所獲得的培養物的一部分轉移到替換第一培養 容器的第二培養容器中；f)取出具有其所包含的剩余培養物級分的所述第一培養容器；g)在該第二容器中進行數代培養之后，選擇在懸浮狀態下增殖的細胞。
3.連續細胞培養的方法，其使得能夠選擇靜止的細胞變體，其特征在于，所述方法包括 下列步驟a)用一種或數種活細胞接種包含在第一培養容器中的液體培養基，在所述第一培養容 器中放置有至少一種固體表面，優選地板，所述第一培養容器在封閉的圍殼中維持開放；b)在該經接種的培養基中，將所述細胞帶至確定的生長階段，該確定的生長階段相應 于給定的細胞密度或者相應于在培養基中所測量的物理化學參數；c)通過在所述培養容器中提供新鮮培養基或至少一種稀釋劑，使在步驟b)中所達到 的培養物的細胞密度或者所述物理化學參數的值維持明顯恒定；d)通過吸移從在c)中所獲得的培養物中抽取包含懸浮細胞的一部分培養基，以便維 持培養物的體積；e)將在其上沉積有在d)中所獲得的培養物的一部分的所述固體表面轉移到替換第一 培養容器的第二培養容器中；f)取出具有其所包含的剩余培養物級分的所述第一培養容器；g)在數代培養之后，選擇固著在所述固體表面上的靜止的細胞變體。
4.根據權利要求3的方法，其特征在于，所述固體表面由經處理以避免細胞粘附的材 料構成。
5.根據權利要求1至4中任一項的方法，其特征在于，所述培養容器在其頂部維持開 放，并且在其開口周圍連續地施加氣流，例如無菌空氣氣流。
6.根據權利要求1至5中任一項的方法，其特征在于，從培養容器的上端至下端施加無 菌氣流。
7.根據前一項權利要求的方法，其特征在于，通過在培養容器周圍產生壓降來維持從 上至下的無菌氣流。
8.根據權利要求7的方法，其特征在于，在所述培養容器的底部將無菌氣流排出到圍 殼外。
9.根據權利要求1至8中任一項的方法，其特征在于，至少a)至f)這些不同的步驟在 封閉的圍殼中進行。
10.根據權利要求1至9中任一項的方法，其特征在于，在進行步驟g)之前，重復步驟 a)至f) 一次或數次。
11.根據權利要求1至10中任一項的方法，其特征在于，在步驟c)中在培養物中的明 顯恒定的細胞密度的維持通過下述方式來實現用新鮮培養基稀釋培養物，從而在培養容 器中保持恒定的培養基體積。
12.根據權利要求1至11中任一項的方法，其特征在于，通過用無菌移液管進行吸移來 實現將包含懸浮細胞的培養基移注到第二培養容器中。
13.根據權利要求1至12中任一項的方法，其特征在于，借助于閘來將用過的第一培養 容器撤出到封閉的圍殼之外。
14.根據權利要求1至13中任一項的方法，其特征在于，將處于操作運行中的培養容器 置于使得能夠調節細胞培養物的溫度的恒溫隔間中。
15.根據權利要求1至14中任一項的方法，其特征在于，在置于同一個圍殼中的數個培 養支持物中同時進行數個培養。
16.根據權利要求1至15中任一項的方法，其特征在于，有規則地進行培養物的取樣。
17.根據權利要求1至16中任一項的方法，其特征在于，所述培養支持物或所述培養容 器用于單一用途。
18.根據權利要求1至17中任一項的方法，其特征在于，借助于導入到培養容器中的鼓 泡裝置向培養中的細胞注入氣體。
19.根據權利要求1至18中任一項的方法，其特征在于，該方法的數個步驟借助于一個 或數個使得能夠在圍殼內部進行移動的自動化臂來進行。
20.根據權利要求1至19中任一項的方法，其特征在于，以超過IO2的代數目，優選地 超過IO4的代數目，更優選地超過IO6的代數目，和更加優選地超過IOw的代數目，將細胞連 續地進行培養，而無需朝向外部環境打開圍殼。
21.根據權利要求1至20中任一項的方法，其特征在于，將所述方法應用于自養微生物 的培養，并且所述培養在所述方法的不同步驟期間得到照明。
22.使得能夠施行開放連續模式的細胞培養的培養支持物(18)，其特征在于，所述培 養支持物包含-至少一個在其頂部(6)開放的培養容器(1)，其適合于包含液體培養基； -至少一個朝上開放的密閉箱(2)，其中容納所述培養容器(1)； _所述培養容器(1)和所述密閉箱(2)之間的空間(7)，其適合于讓氣流在容器的開口 周圍，在培養容器(1)和密閉箱(2)內壁之間從上至下地流通；和 _抽出所述氣流的工具(8)，其位于密閉箱(2)的下部部分處。
23.根據權利要求22的培養支持物，其特征在于，所述抽出氣流的工具是讓氣流通過 的一個或數個孔(8)。
24.根據權利要求22或23的培養支持物，其特征在于，所述培養支持物呈現為可拆卸 的組件(12)的形式，其中數個所述密閉箱集合在一起，在這些密閉箱中容納至少一個所述 培養容器(1)。
25.根據權利要求22至24之一的培養支持物，其特征在于，密閉箱(2)的所述下部部 分鑲嵌在基座上，所述基座裝配有抽出在培養容器(1)和密閉箱(2)壁之間流通的所述氣 流的補充工具(14)，例如與真空泵相連的管子，或者一個或數個氣體分配工具。
26.根據權利要求22至25之一的培養支持物，其特征在于，所述培養支持物還包含 -至少一個調節所述密閉箱(2)的內部體積的溫度的工具(3)。
27.根據權利要求26的支持物，其特征在于，所述調節所述密閉箱的內部體積(7)的溫 度的工具是包括在所述密閉箱(2)的至少一個壁中的加熱電阻。
28.根據權利要求22至27中任一項的培養支持物，其特征在于，所述培養支持物還包含-至少一個將空氣注入到包含在所述容器中的培養基之中的工具，例如一個或數個通 氣桿⑷。
29.根據權利要求22至28中任一項的培養支持物，其特征在于，所述培養支持物還包含-至少一個光學測量存在于培養容器(1)所包含的培養基中的細胞的密度的工具(9)。
30.根據權利要求22至29中任一項的培養支持物，其特征在于，所述培養支持物還包含-至少一個為自養模式的微生物培養產生光的工具(15)，其位于所述培養容器和所述 密閉箱(2)的內壁之間的空間中，或者包括在所述密閉箱的壁中。
31.使得能夠進行開放模式的連續細胞生長的細胞培養裝置，其特征在于，所述裝置包含-圍殼(17)；-產生經過所述圍殼的無菌氣流的工具(23)；-一個或數個根據權利要求22至30中任一項的培養支持物(18)，其安放在所述圍殼 (17)中，并且使得能夠施行開放模式的細胞培養。
32.根據權利要求31的細胞培養裝置，其特征在于，所述裝置還包含 -至少一個更新培養基的工具，其置于所述圍殼內部。
33.根據權利要求31或32的細胞培養裝置，其特征在于，所述裝置還包含-至少一個適于替換包含在培養支持物(18)中的培養容器的培養容器(1)。
34.根據權利要求31至33中任一項的裝置，其特征在于，將該產生無菌氣流的工具 (23)置于圍殼(17)的上部部分處，以便所述無菌氣流從培養支持物(18)的上端流向下端。
35.根據權利要求31至34中任一項的細胞培養裝置，其特征在于，所述裝置還包含-至少一個在所述培養容器底部的抽出無菌氣流的工具(8)。
36.根據權利要求35的裝置，其特征在于，該抽出無菌氣流的工具(8)在位于培養支持 物(18)的培養容器⑴和密閉箱(2)之間的空間(7)中產生壓降。
37.根據權利要求35或36的裝置，其特征在于，所述抽出工具(8)與至少一個適于抽 吸環繞在培養容器開口(6)周圍的空氣的空氣抽吸工具相聯合。
38.根據權利要求32至37中任一項的裝置，其特征在于，該更新培養基的工具包含將 培養容器的一部分內容物移注至排出區的工具(20)。
39.根據權利要求32至38中任一項的裝置，其特征在于，該更新培養基的工具包含將 新鮮培養基從位于圍殼(17)內部的儲庫移注至培養容器的工具(20)。
40.根據權利要求38或39的裝置，其特征在于，該移注工具包含移液管(20)和抽吸在 所述移液管中的新鮮或用過的培養基的工具。
41.根據權利要求31至40之一的裝置，其特征在于，所述裝置還包含-至少一個向圍殼外部輸出該移注工具(20)和/或至少一個培養容器的工具。
42.根據權利要求41的裝置，其特征在于，所述輸出工具包含閘。
43.根據權利要求31至42中任一項的裝置，其特征在于，所述裝置包含至少一個將空 氣注入到培養物中的工具(4，21)。
44.根據權利要求31至43中任一項的裝置，其特征在于，所述裝置包含至少一個適于 在圍殼內部施行移動的自動化臂(19)。
45.根據權利要求31至44中任一項的裝置，其特征在于，該圍殼(17)是封閉的。
46.根據權利要求31至45中任一項的裝置，其特征在于，所述裝置包含數個安放在所 述圍殼中的培養支持物，以便平行地施行數個開放模式的細胞培養。
47.根據權利要求30至46中任一項的裝置，其特征在于，所述裝置使得能夠實施根據 權利要求1至21中任一項的方法。
全文摘要
本發明涉及開放連續模式的細胞培養的應用，使得能夠選擇靜止的或在懸浮狀態下增殖的細胞變體的方法，培養支持物，以及適于實施該方法的裝置。
文檔編號C12M1/08GK101965394SQ200980105991
公開日2011年2月2日 申請日期2009年2月20日 優先權日2008年2月21日
發明者B·庫德拉, P-Y·柴斯納奧, Y·比奧尤安 申請人:Eco解決方案公司