專利名稱：具有減弱的Fc配體親和性的抗IFNAR1抗體的制作方法
具有減弱的Fc配體親和性的抗IFNAR1抗體本申請根據35 U.S.C. § 119(e)要求2008年2月8日提交的美國臨時申請號 61/006，962，2007年3月7日提交的美國臨時申請號61/034，618，以及2008年5月2日提 交的61/049，970的權益，其公開內容在此弓I入以供參考。
1.發明領域本發明涉及干擾素α受體I(IFNARl)特異性，且具有減弱的Fc配體親和力的分 離抗體和組合物。本發明還包括編碼這些抗體的核酸，互補核酸，載體，宿主細胞，以及制備 和使用它們的方法，包括治療性組合物、配方、給藥方法和裝置。2.
背景技術：
2. 1 干擾素I型干擾素(IFN) (IFNa , IFN^ , IFNco，IFN τ )是一類結構相關的細胞因 子，具有抗病毒、抗腫瘤和免疫調節作用(Hardy等(2001)Blood 97 473 ；Cutrone and Langer (2001) J. Biol. Chem. 276 17140) 人IFNa基因座具有兩個亞家族。第一亞家族 由14個非等位基因和4個具有至少80%同源性的假基因組成。第二亞家族all或ω 含有5個假基因和1個功能性基因，其與IFNa基因顯示70%的同源性(We is smarm和 Weber (1986)Prog. Nucl. Acid Res. Mol. Biol.，33 :251_300)。IFNa 亞型具有不同的特異 性活性，但具有相同的生物譜(Streuli 等，(1981)Proc. Natl. Acad. Sci. USA78 2848)和相 同的細胞受體(Agnet M.等，于〃白介素5" Ed. I. Gresser p. 1-22，Academic出版社，倫 敦，1983)。干擾素α亞型已被鑒定為具有下列名稱=IFNa 1，2a，2b，4，4b，5，6，7，8，10，14， 16，17，和 21。干擾素β (IFN^ )由單基因編碼，其與IFNa基因具有約50%的同源性。干擾素Υ由活化的淋巴細胞產生，它與α/β干擾素都不具有任何同源性，也不 與其受體反應。2. 1. 1干擾素受體所有人I型干擾素與細胞表面受體(IFNa受體，IFNAR)結合，該受體由兩個跨 膜蛋白 IFNARl 和 IFNAR2 組成(Uze 等，(1990)Cell 60 225 ；Novick 等，(1994)Cell 77 391)。IFNARl對于高親和性結合和IFNAR復合物的不同特異性是必要的(Cutrone等，2001 J.Bio Chem 276 (20) 17140-8)。雖然尚未鑒定出每種I型IFN亞型的功能區別，據信各 自可能顯示與IFNAR受體組件不同的作用，從而導致可能的不同信號傳遞結果(Cook等， (1996) J. Biol. Chem. 271 13448)。尤其是利用IFNARl和INFAR2突變型的研究顯示α和 β干擾素通過與各鏈作用不同而通過受體傳導不同的信號(Lewerenz等，(1998)J.Mol. Biol. 282 585)。2. 1.2干擾素的功能I型IFN的早期功能研究著力于對病毒干擾的天然防御(Haller等，(1981) J.Exp. Med. 154 199 ；Lindenmann 等，(1981)Methods Enzymo 1. 78 181)。然而，最近的研究暗示 I型IFN是在適應性免疫應答中有效的免疫調節細胞因子。特別是，I型IFN已顯示利用原初T細胞沿Thl途徑的分化(Brinkmann等，(1993) J. Exp. Med. 178 1655)來增強抗體 生產(Finkelman等，(1991) J. Exp. Med. 174 1179)和支持記憶T細胞的功能活性和存活 (Santini 等，(2000) J. Exp. Med. 191 1777 ；Tough 等，(1996) Science 272 :1947)。一些研究小組近來的工作提示，IFNa可增強樹突細胞(DC)的成熟或活 化(Santini,等，(2000) J. Exp. Med. 191 1777 ;Luft 等，(1998) J. Immunol. 161 1947 ； Luft 等，(2002) Int. Immunol. 14 367 ；Radvanyi 等，(1999) Scand. J. Immunol. 50 499)。另外，也描述了在許多自身免疫病中I型干擾素的表達增加(Foulis等，(1987) Lancet 2 1423 ；Hooks 等，(1982)Arthritis Rheum. 25 396 ；Hertzog 等，(1988)Clin. Immunol. Immunopatho1. 48 192 ；Hopkins 禾口 Meager(1988)Clin. Exp. Immunol. 73 88 ； Arvin 和 Miller(1984)Arthritis Rheum. 27 :582)。對此研究最多的例子是與 IFNa 的升高水平有關的胰島素依賴性糖尿病(IDDM) (Foulis (1987))和系統性紅斑狼瘡 (SLE) (Hooks (1982)),以及IFN3可能起到了更重要的作用的類風濕性關節炎(RA) (Hertzog(1988)，Hopkins和 Meager(1988)，Arvin 和 Miller(1984)。另外，已報道施用干擾素α會使得患有牛皮癬和多發性硬化的病人疾病惡化，并 在先前沒有自身免疫病史的病人內誘導SLE樣的綜合征。干擾素α已顯示在正常小鼠中 誘導腎小球腎炎，并加速NZB/W小鼠中自身免疫病的發生。另外，IFNa治療在一些病例中 顯示導致不良副作用，包括發熱和神經疾病。因此，有抑制I型IFN活性對病人有利的病理 狀態，和存在有效抑制I型IFN活性的制劑的需求。2. 1.3抗體效應物功能抗體的Fc區與許多配體(在本文中也稱為“Fe配體”，這些配體包括但不限于與 抗體Fc區結合的因子，例如Fc受體和Clq)相互作用，賦予一系列稱作效應物功能的重 要功能，所述配體包括Fc受體和Clq。Fc受體介導抗體和免疫系統的細胞臂之間的通訊 (Raghavan 等，1996，Annu Rev Cell Dev Biol 12 :181_220 ;Ravetch 等，2001，Annu Rev Immunol 19:275-290)。在人中，該蛋白家族包括Fc γ RI (CD64)，包括同工型Fc γ RIA、 Fc γ RIB、禾口 Fc γ RIC ；Fc y RII (CD32)，包括同工型 Fc y RIIA, Fc yRIIB、禾口 Fc γ RIIC ；以 及 Fc γ RIII (CD16)，包括同工型 Fc y RIIIA 和 Fc y RIIB (Jefferis 等，2002，Immunol Lett 82 57-65)。這些受體通常具有介導與Fc結合的胞外域、跨膜區、和可能介導一些胞內信號 傳遞事件的胞內域。這些受體在各種免疫細胞中表達，包括單核細胞、巨噬細胞、嗜中性粒 細胞、樹突細胞、嗜曙紅細胞、肥大細胞、血小板、B細胞、大顆粒淋巴細胞、朗格漢斯細胞、天 然殺傷(NK)細胞和T細胞。Fc/Fc γ R復合物的形成將這些效應細胞募集到結合的抗原的 位點，通常導致胞內信號傳遞事件以及重要的后隨免疫應答，例如炎癥介體的釋放，B細胞 活化，內吞作用，吞噬作用，和細胞毒性攻擊。介導細胞毒性和吞噬細胞效應物功能的能力 是一種抗體破壞靶細胞的可能機制。細胞介導的反應(其中表達Fc γ R的非特異性細胞毒 性細胞識別靶細胞上結合的抗體，并隨之導致靶細胞裂解)稱作抗體依賴性細胞介導的細 胞毒性(ADCC) (Raghavan等，1996，Annu Rev Cell Dev Biol 12 181-220 ;Ghetie等，2000， Annu Rev Immunol 18 :739_766 ;Ravetch 等，2001， Annu Rev Immunol 19:275-290)。細 胞介導的反應(其中表達Fc γ R的非特異性細胞毒性細胞識別靶細胞上結合的抗體，并隨 之導致靶細胞的吞噬作用)被稱作抗體依賴性細胞介導的吞噬作用(ADCP)。另外，分子Fc 區上的重疊位點還控制補體介導的細胞非依賴性細胞毒性功能，這也被稱作補體依賴性細胞毒性(CDC)。2. 1. 4不同類型的人Fc γ R 人Fc γ R 分為三種不同類型Fc γ RI (CD64)、Fc γ RII (CD32)和 Fc γ RIII (CD16)。 Fc y RI是高親和性受體(Ka 10-8-10^)，同時與免疫復合物和單體IgG分子結合，而Fc 受體Fc YRII和Fc YRIII顯示的親和力較低(分別為< KT7IT1和2_3xl(T7) (Gessner J. Ε.等，1998，Annn Hematology 76 :231_48)。對于所有跨膜受體，通過FcyR的信號傳遞 是通過基于免疫受體酪氨酸的活化基序(ITAM)或基于免疫受體酪氨酸的抑制基序(ITIM) 而實現(Presta 2006, Adv Drug Deli Rev 58:640-656)。72kDa胞外糖蛋白FcyRI主要在髓樣細胞，例如單核細胞、巨噬細胞⑶4+祖細胞 上表達，可引起ADCC、內吞作用和吞噬作用應答(Siberil等，2006，J Immunol Lett 106 111-118)。40 kDa Fc γ RII受體組(A、B和C同工型)顯示胞外域，但不含活性信號轉導 域。這些受體通過胞質尾功能域的磷酸化傳播信號(Amigorena S.等，1992 Science. 256 1808-12)。FcyRIIA主要在單核細胞、巨噬細胞、嗜中性粒細胞和血小板上表達，而 Fc y RIIC受體僅在NK細胞中被鑒定出。這兩種受體顯示引發ADCC、內吞作用、吞噬作用和 炎癥介體釋放(Cassel 等，1993. Mol Immunol 30:451-60)。相反，Fc γ RIIB (Bi 禾Π B2 型) 受體在B細胞、肥大細胞、嗜堿性粒細胞、單核細胞、巨噬細胞、和樹突細胞上表達，并顯示 下調了 A和C同工型觸發的免疫應答。50 kDa Fc γ RIIIA在NK細胞、單核細胞、巨噬細胞和T淋巴細胞的一個亞組上表 達，激活ADCC、吞噬作用、內吞作用和細胞因子釋放(Gessner等)。Fc γ RIIIB同工型是有錨 定糖基磷酯酰肌醇(GPI)的外在膜蛋白，其與脫粒和反應性氧中間物的產生有關(Salmon J. Ε.等，1995 J Clin Inves 95:2877-85)。IgG分子也顯示對Fc γ R不同的同工型特異性。IgG3分子與所有FcR同工型強結 合。IgGl，在血液中最普遍的同工型，與所有Fc γ R結合，但與Fc y RIIA/B同工型的親和 力較低。IgG4與Fc YRI中等結合，而與Fc YRIIB的結合較弱。最后，IgG2僅與Fc γ RIIA 的一種等位形式(Fe y RIIA-H131)微弱結合(Siberil 等，2006，J Immunol Lett 106 111-118)。2. 1. 5 補體補體炎癥級聯反應是天然免疫應答的一部分，對于個體抵御感染的能力至關重 要。另一種重要Fc配體是補體蛋白Clq。Fc與Clq的結合介導稱作補體依賴性細胞毒性 (CDC)的過程(Ward等，1995，Ther Immunol 2:77-94中回顧)。Clq能結合6種抗體，雖然 與兩種IgG的結合已經足夠激活補體級聯反應。Clq與Clr和Cls絲氨酸蛋白酶形成復合 物，形成補體途徑的Cl復合物。2. 1. 6涉及Fc γ R結合的IgG區域和氨基酸殘基已廣泛研究了對不同Fc YR的人IgG結合位點的作圖。這些基于遺傳學改變的 IgG分子的研究鑒定出CH2結構域N-末端部分一段短的連續氨基酸殘基序列(234-238)直 接參與了與所有Fc γ R的結合。另外，殘基268、297、327和329可影響Fc γ R亞組的結合。 位于CH2和CH3結構域中的多個殘基也對Fc γ R結合有貢獻(Canfield SM.等，1991 J Exp Med 173 1483-91，Chappel MS.等，1991，Proc Nat Acad Sci USA 888 9036-40,GergelyJ.等，1990 FASEB J 4:3275-83)。2. 2抗體治療性相關毒性在許多情況下，免疫球蛋白Fc區介導的效應物功能的結合和刺激是非常有益 的。然而，在某些情況下降低或消除效應物功能可能更有益。這對于那些設計為對靶細 胞傳遞藥物(例如毒素和同位素)的抗體尤其如此；在這些靶細胞中，FC/FcyR介導的 效應物功能將健康免疫細胞引到有效致死載荷附近，導致正常淋巴組織與靶細胞一起耗 竭(Hutchins 等，1995，PNAS USA 92 :11980_11984 ;White 等，2001，Annu Rev Med 52: 125-145)。在這些情況下，使用很少募集補體或效應細胞的抗體將有極大的益處(見例如， Wu 等，2000，Cell Immunol 200 :16_26 ;Shields 等，2001，J. Biol Chem 276:6591-6604; U. S. 6，194，551 ；U. S. 5，885，573 和 PCT 出版物 W004/029207)。在其它例子中，例如，當以阻斷廣泛表達的受體與其同類配體的相互作用為目標 時，降低或消除所有抗體效應功能，以減少不良毒性是有利的。另外，當治療性抗體對許多 人組織顯示混雜結合時，明智之舉是限制效應物功能靶向到多組組織，以限制毒性。雖然 有許多缺乏特異性效應物功能的人免疫球蛋白亞類，不存在缺乏所有效應物功能的已知天 然存在的免疫球蛋白。另一種方法是工程改造或突變Fc區域中引起效應物功能的關鍵 殘基。例如，見 PCT 出版物 W02006076594，W0199958572, US20060134709, W02006047350, W02006053301，和U. S. 5，624，821，其在此完整引入以供參考。在許多疾病狀態的治療中使用單克隆抗體已有詳細記載。在抗體可觸發的眾多效 應物功能中，抗體治療的要求之一是它們特異性靶向感興趣的靶標。例如(但不限于)，通 過檢測感興趣組織的免疫組織化學(IHC)分析靶組織的特異性。重要的是治療劑僅僅與含 有感興趣靶標的組織結合。反之，會由于在非靶向位點引起不恰當的效應物功能活化而導 致該抗體治療產生高毒性。如果可以減少或消除效應物功能，就可避免治療劑廣泛結合的 危險。出于所有這些考慮，對于至少一種促進效應物功能的Fc配體具有減弱或消除的親和 力的抗體的需要仍然未被滿足。這樣的抗體會對慢性炎癥和自身免疫病的治療特別有用。本文中引用或討論的文獻應不被視為是本發明的現有技術。3.附圖簡述為了說明本發明，在圖中描述了本發明的一些實施方式。然而，本發明并不限于圖 中所述具體實施方式
的精確安排和手段。
圖1A. 3F11VH的核酸(SEQ ID No 7)和氨基酸(SEQ ID No 8)序列比對，其中CDR 區如上劃線所示。圖IB. 3F11 VK的核酸(SEQ ID No 9)和氨基酸(SEQ ID No 10)序列比對，其中 ⑶R區如上劃線所示。圖2A. 4G5 VH的核酸(SEQ ID No 17)和氨基酸(SEQ ID No 18)序列比對，其中 ⑶R區如上劃線所示。圖2B. 4G5 VK的核酸(SEQ ID No 19)和氨基酸(SEQ ID No 20)序列比對，其中 ⑶R區如上劃線所示。圖3A. 11E2 VH的核酸(SEQ ID No 27)和氨基酸(SEQ ID No 28)序列比對，其中 ⑶R區如上劃線所示。圖3Β· 11E2 VK的核酸(SEQ ID No 29)和氨基酸(SEQ ID No 30)序列比對，其中⑶R區如上劃線所示。圖4A. 9D4 VH的核酸(SEQ ID No 37)和氨基酸(SEQ ID No 38)序列比對，其中 ⑶R區如上劃線所示。圖4B. 9D4 VK的核酸(SEQ ID No 39)和氨基酸(SEQ ID No 40)序列比對，其中 ⑶R區如上劃線所示。圖5. 9D4重鏈恒定區的氨基酸序列比對。箭頭表示氨基酸取代(未修飾到修飾 的)，以提高穩定性并降低對至少一種Fc配體的親和力。圖6A.用不同抗-IFNARl抗體處理的人腦組織的免疫組織化學染色圖譜。當與人 腦組織一起孵育時，與4G4和MDX-1333抗體相比，9D4抗體顯示較低的染色圖譜。圖6B.用不同抗-IFNARl抗體處理的人單核細胞的免疫組織化學染色圖譜。作為 陽性對照，測試了各種抗-IFNARl抗體與人單核細胞的反應性。圖7.抗-IFNARl抗體9D4在基于細胞的STAT活化實驗中抑制IFNa信號傳導。 用抗體9D4處理抑制響應干擾素α刺激的STAT1/3/4酪氨酸磷酸化，如用市售STAT抗體 進行蛋白質印跡分析所測定的。圖8.抗-IFNARl抗體封閉不同濃度的pDC細胞衍生I型IFN的信號傳遞。提供 的是在使用從3個獨立供體純化的I型IFN上清液的熒光酶報道實驗中抗體9D4封閉IFN 信號傳遞的IC50值。包括了各純化的I型干擾素上清液中IFNa ,IFN^、和IFNco的相對量。圖9A，B，C.抗-IFNARl抗體9D4，9D4-DM(雙突變)，和9D4_TM(三突變)顯示相 似的結合特征。提供了代表未修飾9D4抗體和2種修飾的抗體9D4-DM和9D4-TM的數據。 修飾的抗體顯示與未修飾抗體類似的IFNARl結合特征。圖10A.抗-IFNARl抗體9D4與可溶性干擾素α受體(sIFNaRl)結合。提供了 顯示9D4與可溶性干擾素α受體的劑量依賴性結合的平衡結合數據。圖10B. 9D4對人PBMC的Kd測定。提供了通過與人PBMC結合測定的9D4解離常數。圖11.抗-IFNARl抗體抑制熒光酶報道實驗中的IFNa誘導的信號傳遞。包括未 修飾和修飾抗體的抗-IFNARl抗體對封閉熒光酶報道實驗系統中的白細胞IFN信號傳遞顯 示相似的IC50值。圖12A.9D4(未修飾)和修飾的9D4抗體等電點的測定。提供的是IEF凝膠，其記 錄9D4WT (未修飾)、9D4-DM和9D4-TM抗體的相對pi值。 圖12B. 9D4 (未修飾)和修飾的9D4熱熔解溫度的測定。提供的是記錄9D4WT (未 修飾)、9D4-DM和9D4-TM抗體的相對熔解點(Tm)的溶解曲線。圖13.抗-IFNAR抗體的預防性處理阻止了 Adv-IFNa誘導的蛋白尿。用對照 載體、Adv-IFN α，Adv-IFN a +同種型對照預處理處理小鼠，在9周內分析Adv-IFN a + 抗-IFNAR預處理的蛋白尿。用抗-IFNAR預處理的小鼠在IFNa攻擊后不顯示蛋白尿。圖14.用抗-IFNAR抗體預防性處理阻止了血液中IFNa反應性基因(IFIT1， IFI44, CXCLl 1, IFI202b, CXCL19, CXCL9)上調。用抗-IFNAR抗體預處理的小鼠與用對照病 毒、PBS或同種型IgG對照預處理的小鼠相比，在受到腺病毒編碼的IFNa攻擊后不顯示所 選IFNa反應性基因的上調。提供了來自通過Adv-IFNα感染進行IFNa誘導3周后的小鼠血樣中的已知響應IFN α的6種基因的相對表達。圖15Α，B.用抗-IFNAR抗體預防性處理阻止了 INFa誘導的自身抗體產生。用 抗-IFNAR抗體預處理的小鼠與用對照病毒、PBS或同種型IgG對照預處理的小鼠相比，在 受到腺病毒編碼的IFNa攻擊后不顯示自身抗體生產增加。提供了來自通過Adv-IFNα感 染進行IFN α誘導6周后的小鼠血樣中的抗-dsDNA和抗_SSA/Ro的濃度。圖16A，B.用抗-IFNAR抗體預防性處理阻止了腎臟中的細胞因子上調。用 抗-IFNAR抗體預處理的小鼠與用對照病毒、PBS或同種型IgG對照預處理的小鼠相比，在受 到腺病毒編碼的IFNa 5攻擊后不顯示腎臟中細胞因子上調。提供了來自通過Adv-IFNα 5 感染進行IFNa誘導6周后的小鼠腎臟樣本中的IP-10和IL-18的測量值。圖17.用抗-IFNAR抗體預防性處理阻止了 IFN誘導的自身抗體產生。提供了來 自小鼠血清的抗-核抗原(ANA)抗體的相對滴度。用抗-IFNAR抗體預處理的小鼠與用對 照病毒、PBS或同種型對照預處理的小鼠相比，在IFN攻擊后顯示較低的ANA血清滴度。圖18.抗體介導的SLE血漿抑制介導了樹突細胞發育。提供了 5個獨立實驗的結 果，其中衍生自SLE病人的IFN與抗-IFNARl抗體9D4 —起保溫，然后加到人單核細胞中。 抗-IFNARl抗體9D4的存在抑制了衍生自SLE病人的IFN在分化單核細胞中誘導樹突細胞 標記⑶8和⑶123的能力。圖19.抗-IFNARl抗體抑制用白細胞干擾素刺激的單核細胞中⑶38、⑶123、和 ⑶86的表達。如受控刺激表達的抑制百分數所示，抗-IFNARl抗體9D4，9D4-DM和9D4-TM 在分化的單核細胞中顯示對⑶38，⑶123和⑶86的表達具有相似的抑制圖譜。圖20.修飾的抗-IFNARl抗體與未修飾的抗-IFNARl抗體相比，顯示對Fc受體 Fc y Rl的結合下降。在ELISA實驗中分析抗-IFNARl抗體9D4 (未修飾)、9D4_DM(修飾的) 和9D4-TM(修飾的)與固定在平板上的Fc γ Rl的結合能力。作為Fc受體結合的陽性對照， 使用無關未修飾的抗體(對照抗體)。圖21，A，B，C.修飾的抗-IFNARl抗體與未修飾的抗-IFNARl抗體相比，顯示對Fc 受體Fc YRIIIA結合下降。在ELISA實驗形式中分析了固定在平板上的未修飾抗-IFNARl 抗體9D4(A)、修飾的抗-IFNARl抗體9D4_DM(B)和9D4_TM(C)與游離Fc y RIIIA的結合能 力。圖22，Α，B, C.修飾的抗-IFNARl抗體顯示與Fc受體Fc y RIIIA的結合下降。在 ELISA實驗形式中分析了游離的未修飾抗-IFNARl抗體9D4(A)、修飾的抗-IFNARl抗體 9D4-DM(B)和9D4-TM(C)與固定在平板上的Fc γ RIIIA的結合能力。圖23Α-Ε. SLE病人血清中IFN亞型的中和。如報道實驗所測定的，抗-IFNARl抗體 MDX-1333，9D4-WT 和 9D4-TM 抑制了 α 10 (A)，白細胞干擾素(B)，α 2b (C)，ω (D)，和 β (E) 的IFN介導的信號傳遞。圖24.抗-IFNARl抗體中和來自SLE病人的I型干擾素。通過報道實驗，抗-IFNARl 抗體9D4與對照(非相關抗體)相比，抑制I型干擾素介導的信號傳遞。圖25A-D.抗-IFNAR抗體抑制PBMC細胞中IFN α誘導的pDC群。通過細胞表位 表達測試，抗-IFNAR抗體阻止脾臟(A)、淋巴結(B)、外周血(C)和骨髓⑶中異位腺病毒 誘導的干擾素α表達所誘導的PDC細胞提高。圖 26.通過 BIACore 分析測定抗-IFNARl 抗體 9D4-WT，9D4-DM,和 9D4-TM 與 Fc 受體Fc γ RI的結合分析。簡單說，將抗-IFNARl抗體固定，加入游離Fc y RI測定親和性。如示 蹤測定的，修飾的抗體9D4-DM和9D4-TM與未修飾的9D4-WT抗體相比，顯示對游離Fc y Rl 的親和力較低。圖 27A-C.通過 BIACore 分析測定抗-IFNARl 抗體 9D4-WT，9D4-DM 和 9D4-TM 與 Fc 受體Fc y RI的結合分析。簡單說，使游離抗-IFNARl抗體通過固定的Fc y RI來測定親和 性。如示蹤測定的，修飾的抗體9D4-DM(B)和9D4-TM(C)與未修飾的9D4-WT (A)抗體相比， 顯示對結合的Fc y Rl的親和力較低。圖28.抗-IFNAR抗體抑制腎臟中的IFNa反應性基因誘導。簡單說，如Taqman 實驗測定的，與對照小鼠相比，加速(accelerated)狼瘡小鼠模型中用抗-IFNAR抗體處理 阻止了腎臟中IFNa異位表達介導的6種基因(ICAM1, VCAM1,CXCL9,CXCL10,^P IFIT1)的 誘導。圖29.抗-IFNAR抗體抑制加速狼瘡小鼠模型中抗_dsDNA抗體的產生。簡單說， 異位表達IFN α和用抗-IFNAR抗體處理的小鼠聚積的抗-dsDNA抗體水平與類似感染并用 IgG對照抗體處理的小鼠并不相似。圖30.抗-IFNAR抗體能在加速狼瘡小鼠模型的治療背景下減少蛋白尿。(A)簡單 說，異位表達IFNa的小鼠發生狼瘡樣癥狀，例如蛋白尿。在治療性研究中，一旦達到閾值 蛋白尿評分，對小鼠施用抗-IFNAR抗體。在5周中，每半周施用抗-IFNAR抗體、PBS或對 照IgG。抗-IFNAR抗體處理組與僅用PBS或對照IgG處理組相比，顯示在實驗過程中蛋白 尿的嚴重性下降。圖31.抗-IFNAR抗體能在加速狼瘡小鼠模型的治療背景下提高存活。(A)簡單 說，異位表達IFNa的小鼠在發生狼瘡樣癥狀(例如蛋白尿)后的8周時存活率下降。在 治療性研究中，一旦達到閾值蛋白尿評分，對小鼠施用抗-IFNAR抗體。在5周中，每半周施 用抗-IFNAR抗體、PBS或對照IgG。5周后，停止抗體治療，對所有三個處理組跟蹤死亡率。 抗-IFNAR抗體處理組與僅用PBS或對照IgG處理組相比，顯示低得多的死亡率，后兩者在 9周后都完全死亡。圖32.表示含有L234F/L235E/P331S突變的Fc-TM晶胞的不對稱單元內含物。突 變P331以紅色表示。一個鋅離子被兩個空間上靠近的組氨酸殘基螯合。與297結合的糖 基是根據其電子密度建模的。圖33.動力學圖像顯示9D4-TM的內化。在37°C CO2溫箱內用1 μ M CFSE對THP-I 細胞染色10分鐘，然后在冰上用1 μ g/ml AleXa647-9D4_TM染色1小時。除去未結合的染 料后，細胞在37°C保溫所示時間(0，15，30和60分鐘)，采集細胞圖像。圖34.抗-IFNARl抗體9D4-TM在體外實驗中不顯示CDC活性。該圖中所示的是 CDC實驗的結果，以確定9D4-TM抗體引起CDC活性的能力。如所示，9D4-TM抗體與陽性對 照抗體相比，不顯示任何⑶C活性。對于非相關對照抗體R347，⑶C活性也不可檢測。簡單 說，表達IFNARl抗原的細胞與陽性對照、9D4-TM或R347 —起保溫。一系列洗滌后，加入新 鮮人血清。用LDH釋放實驗測定補體依賴性細胞毒性(CDC)。4.術語術語“干擾素α ”，“ IFNa 〃，“ IFNa"，“ IFNA〃和 “IFN alpha”可互換使 用，應指干擾素α基因座的功能性基因編碼的IFNa蛋白質，其與IFNa 1 (GenBank登錄號NP_076918或GenBank登錄號NM_024013編碼的蛋白)具有75%或以上的序列相同性。 IFNa 亞型的例子包括 IFNa 1，a 2a, α 2b, α 4，α 4b α 5，α 6，α 7，α 8，α 10，α 13，α 14， α 16，α 17和α 21。術語“干擾素α，，，“ IFNa “，和“IFN α ”應包括各種IFNa亞型的 重組形式，以及天然存在的制備物，其包含IFNa蛋白，例如白細胞IFN和淋巴母細胞IFN。術語〃干擾素α 受體-1〃，‘‘ IFNARl 〃 ‘‘ IFNAR-I,‘‘和〃 IFNAR-1 抗原〃可 互換使用，包括人IFNAR-I的變體、同工型、種系同源物，以及與IFNAR-I具有至少一個共同 表位的類似物。因此，本發明的人抗體在一些實施方式中可與來自除人以外的其它物種的 IFNAR-1，或與人IFNAR-I結構相關的其它蛋白質(例如人IFNAR-I同源物)交叉反應。在 其它實施方式中，抗體可以對人IFNAR-I完全特異，不顯示物種或其它類型的交叉反應性。 人IFNAR-I的完整cDNA序列具有GenBank登錄號NM_000629。如本文所用的術語“保守序列修飾”應包括不影響或改變含氨基酸序列的抗體結 合特性的氨基酸修飾。這樣的保守修飾包括氨基酸取代、添加和缺失。可通過本領域已知 的標準技術，例如定點誘變和PCR介導的誘變在本發明的抗體中引入修飾。保守氨基酸取 代是其中氨基酸殘基被具有類似側鏈的氨基酸殘基取代的那種。例如，相似極性的一種或 多種氨基酸功能上是等價的，并在肽的氨基酸序列內導致沉默改變。中性和用更小的殘基 替換一殘基的取代也可被認為是“保守取代”，即使殘基是不同組的(例如用更小的異亮氨 酸取代苯丙氨酸)。具有相似側鏈的氨基酸殘基家族已被本領域確定。表1顯示了保守性 氨基酸取代家族的幾個非限制性例子。表1 保守性氨基酸取代家族
權利要求
一種IFNAR1特異性的修飾的IgG類單克隆抗體，其特征在于，所述抗體在Fc區內包含至少一個氨基酸取代，所述取代選自L234F，L235E，和P331S，所述氨基酸如Kabat中列出的EU索引編號，所述抗體與未修飾抗體相比，顯示對至少一種Fc配體的親和力下降。
2.如權利要求1所述的抗體，其特征在于，所述抗體屬于IgGl或IgG4亞類。
3.如權利要求2所述的抗體，其特征在于，所述抗體是IgGl類分子。
4.如權利要求3所述的抗體，其特征在于，所述抗體包含氨基酸取代P331S。
5.如權利要求3所述的抗體，其特征在于，所述抗體包含氨基酸取代L234F和L235E。
6.如權利要求3所述的抗體，其特征在于，所述抗體具有氨基酸取代L234F，L235E和 P331S。
7.如權利要求3所述的抗體，其特征在于，所述抗體是IgG4類分子。
8.如權利要求7所述的抗體，其特征在于，所述抗體包含Fc區氨基酸取代L235E。
9.如權利要求7所述的抗體，其特征在于，所述抗體還在Fc區包含氨基酸取代S228P。
10.如權利要求1-9任一所述的抗體，其特征在于，所述抗體包含選自表2的至少一個 互補決定區(⑶R)。
11.如權利要求1-10任一所述的抗體，其特征在于，所述抗體包含a.人重鏈可變區CDRl，包含SeqID NO 31 ；b.人重鏈可變區⑶R2，包含SeqID NO 32 ；c.人重鏈可變區⑶R3，包含SeqID NO 33 ；d.人輕鏈可變區⑶Rl，包含SeqID NO 34 ；e.人輕鏈可變區CDR2，包含SeqID NO 35 ；和f.人輕鏈可變區CDR3，包含SeqID NO :36。
12.如權利要求1-10任一所述的抗體，其特征在于，所述抗體包含a.人重鏈可變區CDRl，包含SeqID NO 1 ；b.人重鏈可變區CDR2，包含SeqID NO 2 ；c.人重鏈可變區CDR3，包含SeqID NO 3 ；d.人輕鏈可變區⑶Rl，包含SeqID NO 4 ；e.人輕鏈可變區CDR2，包含SeqID NO 5 ；和f.人輕鏈可變區CDR3，包含SeqID NO :6。
13.如權利要求1-10任一所述的抗體，其特征在于，所述抗體包含a.人重鏈可變區⑶Rl，包含SeqID NO 11 ；b.人重鏈可變區⑶R2，包含SeqID NO 12 ；c.人重鏈可變區⑶R3，包含SeqID NO 13 ；d.人輕鏈可變區⑶Rl，包含SeqID NO: 14;e.人輕鏈可變區CDR2，包含SeqID NO 15 ；和f.人輕鏈可變區CDR3，包含SeqID N0:16。
14.如權利要求1-10任一所述的抗體，其特征在于，所述抗體包含a.人重鏈可變區⑶Rl，包含SeqID NO 21 ；b.人重鏈可變區CDR2，包含SeqID NO 22 ；c.人重鏈可變區CDR3，包含SeqID NO 23 ；d.人輕鏈可變區CDRl，包含SeqID NO 24 ；e.人輕鏈可變區CDR2，包含SeqID NO 25 ；和f.人輕鏈可變區CDR3，包含SeqID NO :26。
15.如權利要求1-10任一所述的抗體，其特征在于，所述抗體包含a.人重鏈可變區，包含SeqID No 38的氨基酸序列；和b.人輕鏈可變區，包含SeqID No :40的氨基酸序列。
16.如權利要求1-10任一所述的抗體，其特征在于，所述抗體包含a.人重鏈可變區，包含SeqID No 8的氨基酸序列；和b.人輕鏈可變區，包含SeqID No 10的氨基酸序列。
17.如權利要求1-10任一所述的抗體，其特征在于，所述抗體包含a.人重鏈可變區，包含SeqID No 18的氨基酸序列；和b.人輕鏈可變區，包含SeqID No :20的氨基酸序列。
18.如權利要求1-10任一所述的抗體，其特征在于，所述抗體包含a.人重鏈可變區，包含SeqID No 28的氨基酸序列；和b.人輕鏈可變區，包含SeqIDNo :30的氨基酸序列。
19.如權利要求1-18任一所述的抗體，其特征在于，所述抗體包含SeqID No :41的輕 鏈恒定區序列。
20.如權利要求1-18任一所述的抗體，其特征在于，所述抗體包含SeqID No :42的重 鏈恒定區。
21.如權利要求1-18任一所述的抗體，其特征在于，所述抗體包含具有SEQID No 41 的氨基酸序列的輕鏈恒定區和具有Seq ID No :42的氨基酸序列的重鏈恒定區。
22.如權利要求19-21任一所述的抗體，其特征在于，所述抗體包含重鏈氨基酸序列， 所述重鏈氨基酸序列包含等位變異，所述等位變異是至少一個或多個選自如EU索引編號 系統所定義的214，221，356和358的位點。
23.如前任一權利要求所述的抗體，其特征在于，所述抗體選自人抗體、人源化抗體、 嵌合抗體、細胞內抗體和合成抗體。
24.一種分離的核酸，其特征在于，包含編碼上述權利要求任一所述的抗體的多核苷酸 序列。
25.如權利要求24所述的核酸，其特征在于，所述核酸是可復制載體。
26.如權利要求25所述的核酸，其特征在于，所述多核苷酸序列與啟動子可操縱性連接。
27.一種宿主細胞，其特征在于，包含權利要求25或26所述的載體或經所述載體轉化。
28.一種轉基因小鼠，其特征在于，包含人免疫球蛋白重鏈和輕鏈轉基因，其中所述小 鼠表達權利要求1-23任一所述的抗體。
29.一種用權利要求28所述的小鼠制備的雜交瘤，其特征在于，所述雜交瘤產生所述 抗體。
30.一種藥物組合物，其特征在于，包含權利要求1-23任一所述的抗體和藥物學上可 接受的賦形劑。
31.一種治療與免疫失調有關的病況或疾病的方法，其特征在于，包括對有需要的對象3施用有效量的權利要求30所述的組合物。
32.如權利要求31所述的方法，其特征在于，所述疾病是I型干擾素介導的疾病。
33.如權利要求32所述的方法，其特征在于，所述I型干擾素是干擾素a。
34.如權利要求33所述的方法，其特征在于，所述I型干擾素介導的疾病與I型干擾素受體有關。
35.如權利要求31所述的方法，其特征在于，所述疾病或失調是AIDS的HIV感染。
36.如權利要求31所述的方法，其特征在于，所述疾病或失調是系統性紅斑狼瘡。
37.如權利要求31所述的方法，其特征在于，所述疾病或失調是斯耶格倫氏綜合征。
38.如權利要求31所述的方法，其特征在于，所述疾病或失調是肌炎。
39.如權利要求31所述的方法，其特征在于，所述疾病或失調是炎性肌炎。
40.如權利要求31所述的方法，其特征在于，所述疾病或失調是多發性肌炎。
41.如權利要求31所述的方法，其特征在于，所述疾病或失調是皮肌炎。
42.如權利要求31所述的方法，其特征在于，所述疾病或失調是包涵體肌炎。
43.如權利要求31所述的方法，其特征在于，所述疾病或失調是青少年肌炎。
44.如權利要求31所述的方法，其特征在于，所述疾病或失調是特發性炎性肌炎。
45.如權利要求31所述的方法，其特征在于，所述疾病或失調是血管炎。
46.如權利要求31所述的方法，其特征在于，所述疾病或失調是肉樣瘤病.
47.如權利要求31所述的方法，其特征在于，所述疾病或失調選自炎性腸病、多發性化、自身免疫性甲狀腺炎、類風濕性關節炎、胰島素依賴性糖尿病、腎小球腎炎、和移植物抗宿主病。
48.如權利要求31所述的方法，其特征在于，所述疾病或失調是牛皮癬或其導致的病況。
49.如權利要求31所述的方法，其特征在于，所述疾病或失調是移植排斥或移植物抗宿主病。
50.如權利要求31所述的抗體，其特征在于，所述疾病或失調選自格雷夫癥、橋本氏 甲狀腺炎、克羅恩氏病、牛皮癬、牛皮癬性關節炎、交感神經性眼炎、自身免疫性卵巢炎、自 身免疫性睪丸炎、自身免疫性淋巴增生綜合征、抗磷脂綜合征、斯耶格倫氏綜合征、硬皮病、 艾迪生病、多內分泌腺缺陷綜合征、Guillan-Barre綜合征、免疫性血小板減少性紫癜、惡 性貧血、重癥肌無力、原發性膽汁性肝硬化、混合性結締組織病、白癜風、自身免疫性葡萄膜 炎、自身免疫性溶血性貧血、自身免疫性血小板減少癥、乳糜瀉、皰疹樣皮炎、自身免疫性肝 炎、天皰瘡、尋常天皰瘡、落葉型天皰瘡、大皰性類天皰瘡、自身免疫性心肌炎、自身免疫性 血管炎、斑禿、自身免疫性動脈粥樣硬化、貝切特氏病、自身免疫性脊髓病、自身免疫性血友 病、自身免疫性間質性膀胱炎、自身免疫性尿崩癥、自身免疫性子宮內膜異位、復發性多發 軟骨炎、強直性脊柱炎、自身免疫性蕁麻疹、皮肌炎、密勒_費雪綜合征、IgA腎病、肺出血腎 炎綜合征、和妊娠皰疹。
51.如權利要求31-50任一所述的方法，其特征在于，還包括施用至少一種手段，所述 手段選自光療、糖皮質激素、潑尼松、NSAIDS、血漿去除術、免疫抑制劑、氨甲蝶呤、視黃酸、 硫鳥嘌呤、霉酚酸酯、反丁烯二酸酯、環磷酰胺、咪唑硫嘌呤、環孢素、和免疫球蛋白。
52.如權利要求31-51任一所述的方法，其特征在于，還包括施用至少一種藥物，選自阿法賽特(AMEVIVE )、依那西普(ENBREL, )、阿達木單抗(HUMIRA )、英夫利昔單 抗(REMICADE )、貝利單抗(LYMPH0STATB )、利妥昔單抗(RITUXAN )、和依法珠單抗 (RAPTIVA )。
53.一種晶體，其特征在于，包含人IgG Fc區，其中所述人IgG Fc區包含至少一個氨基 酸取代，選自如Kabat中列出的EU索引編號的L234F、L235E和P331S，其中所述片段與未 修飾的Fc區相比，顯示對至少一種Fc配體的親和力下降。
54.如權利要求53所述的晶體，其特征在于，所述人IgGFc區包含氨基酸取代L234F、 L235E 和 P331S。
55.如權利要求53所述的晶體，其特征在于，它是衍射質量的。
56.如權利要求53所述的晶體，其特征在于，它是天然晶體。
57.如權利要求53所述的晶體，其特征在于，具有a=50.18±0.2入，b=147.30±0.2A5 和c=75.47 ±0.2 A的正交單元晶胞。
58.如權利要求53所述的晶體，其特征在于，具有C222i的空間群。
59.一種修飾的單克隆抗體，其特征在于，所述抗體在Fc區中包含如Kabat所述的EU 索引號編號的氨基酸取代L234F，L235E和P331S，其中所述抗體與未修飾抗體相比，顯示對 至少一種Fc配體的親和力下降。
60.一種融合蛋白，其特征在于，包含修飾的Fc區，其中所述Fc區包含如Kabat所述的 EU索引編號的氨基酸取代L234F，L235E和P331S，其中所述Fc區與Fc區相比，顯示對至少 一種Fc配體的親和力下降。
61.一種制備權利要求1-23或59任一所述的抗體的方法。
62.如權利要求1-23或59任一所述的抗體，其特征在于，所述抗體是內化抗體。
63.如權利要求60所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白是內化融合蛋白。
64.如權利要求63所述的蛋白質，其特征在于，所述融合蛋白與IFNARl特異性結合。
65.如權利要求1-23、59或62任一所述的抗體，其特征在于，與所述未修飾的抗體相 比，所述抗體顯示減弱或消除的抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)。
66.如權利要求1-23、59或62任一所述的抗體，其特征在于，所述抗體與所述未修飾的 抗體相比，顯示減弱或消除的補體介導的細胞毒性(CDC)。
67.如權利要求1-23、59或62任一所述的抗體，其特征在于，與所述未修飾的抗體相 比，所述抗體顯示減弱或消除的ADCC和⑶C。
全文摘要
本發明提供了對Fc受體和/或配體親和力下降的抗-IFNAR1抗體，以及制備和使用這些抗體的方法。
文檔編號C12P21/08GK101952454SQ200980104557
公開日2011年1月19日 申請日期2009年2月6日 優先權日2008年2月8日
發明者A·科伊爾, H·吳, P·基納, R·西波蒂 申請人:米迪繆尼有限公司