專利名稱：增強對稻瘟病菌的抗性的基因以及該基因的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及增強對稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)的抗性的基因以及該基因的 應用。更具體地說，本發明涉及能夠增強對稻瘟病菌的抗性的Pi5-1蛋白和Pi52蛋白、編 碼這些蛋白的基因、包括些基因的重組體載體、用該重組體載體轉化的植物、植物的種子、 通過在植物中表達所述基因以增強對植物病原菌的抗性的方法、抗所述蛋白的抗體、以及 包括能夠增強對植物病原菌的抗性的基因的組合物。
背景技術：
天然免疫應答是植物和動物存活的關鍵。該應答由用病原體識別受體(PRRs ；也 叫模式識別受體或抗病性蛋白)對與病原體相關分子模式(PAMPs)(也指微生物相關分子 模式)或無毒力蛋白(Avr)的檢測所介導。在動物體中，細胞質內的PRRs家族介導凋亡 和防護病原體入侵關鍵的炎癥反應，所述細胞質內的PRRs家族包括結合核苷酸的寡聚結 構域(NOD)。植物體也含有一系列的細胞內PRR蛋白，稱為NB-LRR(結合核苷酸的-富含 亮氨酸的重復單位)R蛋白，它們與動物的NOD蛋白結構相似。這些植物NB-LRR蛋白的特 征是由N-端卷曲螺旋(CC)或Toll/白介素-1受體(TIR)結構域、中心NB結構域以及 C-端 LRR 結構域(Hammond-Kosack 禾口 Jones (1997) Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48 575-607)組成的三結構域結構，以及典型的識別病原體來源的Avr蛋白(也叫效 應器)(Van der Biezen 和 Jones (1998) Trends Biochem. Sci. 23 :454_456)。稻瘟病是水稻最具破壞性的疾病之一，在種植水稻的世界各地均有發生。到目 前為止已鑒定了超過70個的對不同地理位置的稻瘟病病原體的稻瘟病菌(rice blast pathogen Magnaporthe oryzae)的分離株具有抗性的稻瘟病抗性基因(Ballini等(2008) Mol. Plant Microbe Interact. 21 :859_868)。例如，Pib對大部分的稻瘟病菌的日本分離 株具有很強的抗性(Wang等(1999)PlantJ. 19 :55_64)。相反，Pi37對稻瘟病菌的日本分離 株僅具有部分抗性，但對稻瘟病菌的中國分離株具有完全的抗性。因此，需要分離多個抗性 基因，以充分認識抗稻瘟病的分子基礎。通過標記輔助的育種或通過轉基因方法，這些基因 的特性將促進農業上的有用的水稻品種的發展。迄今為止，共9個稻瘟病抗性基因已被克隆和表征Pib、Pita、Pi9、Pi2和Piz_t、 Pi-d2、Pi36、Pi37、以及Pikm。除了 Pi_d2 (非-RD受體樣激酶)之外，這些基因都編碼 NB-LRR型蛋白。這些克隆的稻瘟病抗性基因的不同的特征已經被觀察到。Pib蛋白包括重 復的NB區域。Pita缺乏典型的LRR，但包括由不同長度的不完全重復所組成的富亮氨酸 結構域(LRD)。在Pita的LRD發現單個的氨酸差異，以區分易感等位基因(susceptible alleles)的抗性。等位基因Pi2和Piz_t在三個連續的LRRs內顯示8個氨基酸差異，這 些殘基決定了抗性的特異性。Pi9基因與Pi2和Piz-t基因高度相似，位于染色體6上的 相同區域。Pikm-介導的抗性需要兩個相鄰NB-LRR基因Pikml-TS和Pikm2-TS。在這些克 隆的R基因中，只有Pita被發現與相應的稻瘟病曲霉菌無毒力蛋白AvrPita相互作用。因 而，由NB-LRR型蛋白介導的防御信號在水稻中的表征較弱。
3
據報道，Pi5對從韓國和菲律賓收集的許多稻瘟病曲霉菌的分離株具有抗性 (Wang等(1994) Genetics 136:1421-1434)。為了獲得對Pi5_介導的稻瘟病抗性的分子 基礎進一步理解，我們使用了基于圖譜的方法來分離Pi5基因組區域。我們先前在RIL260 水稻品種中把Pi5插入到染色體9短臂的170-kb的區間內(Jeon等(2003) Molecular Genetics and Genomics 269 :280_289)。根據韓國專利申請No. 10-0764563，描述了用于誘導植物疾病抗性的基因、包括該 基因的載體和由該載體獲得的轉化株。此外，根據韓國專利申請No. 10-0701302，描述了分 離自野生水稻的植物疾病抗性ogpr 1基因、該基因的氨基酸序列和使用該基因得到的轉 化株。然而，上述的基因與本發明的基因是不同的。
發明內容
本發明是考慮到上述需求而進行的。具體來說，為了進一步縮小新的圖譜種群 (mapping polulation)中的Pi5抗性基因座，通過對有抗性的基因組區域的序列的分析， 確定了兩種類型的CC-NB-LRR基因，作為Pi5的候選基因。此外，生產了表達一個或兩個上 述候選基因的轉基因水稻株，并表征了它們抗稻瘟病曲霉菌的表型。為了解決上述問題，本發明提供了對稻瘟病曲霉菌具有增強抗性的Pi5_l和 Ρ 5-2蛋白。此外，本發明還提供了編碼所述蛋白的基因。此外，本發明還提供了包括所述基因的重組體載體。此外，本發明還提供了用所述重組體載體轉化的植物和該植物的種子。此外，本發明還提供了通過在植物中表達所述基因以增強對植物病原體抗性的方法。此外，本發明還提供抗所述蛋白的抗體。此外，本發明還提供了一種組合物，該組合物含有用于增強對植物病原體的抗性 的基因。根據本發明，基于Pi5_l基因和Pi5_2基因間的協同作用，增強了對植物病原體 (特別是稻瘟病曲霉菌)的抗性。
圖1顯示了 RIL260/IR50種群的Pi5基因座的染色體定位。(上)在RIL260/C039 和RIL260/M202的標記C1454和S04G03間，顯示出170-kb的Ρ 5抗性基因組區域。(下) 在RIL260/IR50種群中確定的Pi5區域中8個罕見的重組體的示意圖。相關的分子標記 間顯示斷裂點。空白條表示假定的RIL260基因組，黑條表示IR50基因組，陰影條表示在 兩個基因組間的區域是雜合的。粗箭頭表示通過圖譜種群分析定界的攜帶有Pi5基因座的 130-kb的最小區間。確定了每個系F3子代對稻瘟病曲霉菌P06-6的抗性，R，抗性；S，易感 性；R/S，分離系(segregating line)。圖2顯示了 RIL260和Nipponbare品種中Pi5基因座的基因組序列比較。顯示了 兩個基因組的由RiceGAAS確定的預測的ORFs。NB-LRR基因，Ρ 5-1等位基因，以及Pi5_2 和Pi5-3基因用黑色箭頭表示。在RIL260中缺失的Pi5-lNipponbare等位基因的N-端區域用綠色顯示。推測的轉座子(putative transposons)和假定的基因(hypothetical genes)分別用藍箭頭和灰箭頭表示。有數字的空白箭頭預測編碼下列蛋白1、推測的真 核的翻譯起始因子；2、推測的GTP-結合蛋白；3、推測的四氫葉酸酯合成酶；4、推測的醛糖 1-表異構酶；5、推測的組蛋白H5 ；6、推測的冷休克-DEAD-盒蛋白A ;7和10、錨蛋白樣蛋 白；8和9、含重復HGffP的蛋白。紅虛線表示RIL260和Nipponbare ORFs的高相似度(> 90%)。細線表示很少或沒有同源性的染色體區域。箭頭表示轉錄的方向。RIL260DNA序 列的間隙(gap)用虛線框表示。圖3顯示了對轉基因水稻株的分析。(A)與稻瘟病曲霉菌P06-6接種后2天， Ρ 5-1, Ρ 5-2和PiS-l/PiSjF:轉基因水稻株的PT-PCR分析。水稻Actinl基因被用于作 為這些反應的內部對照。(B)與稻瘟病曲霉菌P06-6接種后7天，Pi5-l，Pi5-2，和Pi5-1/ 卩士5-2&轉基因株的疾病癥狀。(C)來源于對稻瘟病曲霉菌P06-6感染有反應的Pi5-l-63/ Ρ 5-2-74 F1子代的轉基因株的F2子代的基因組DNA PCR分析和疾病反應。抗性品種(攜 帶Pi5的RIL260)和易感品種(缺失Pi5基因的Dongjin(DJ))用作對照。圖4顯示了 Pi5_l和Pi5_2的基因組結構，以及他們的基因產物。外顯子以淺灰 色框表示，內含子以粗線表示。5'-及3'-非翻譯區(UTR)以深黑框表示。ATG和TGA 分別表示翻譯起始密碼子和翻譯終止密碼子，數字顯示氨基酸位置。圖5和6分別顯示了 Pi5_l蛋白和Pi5_2蛋白的氨基酸序列。這兩種蛋白都含有 卷曲螺旋(CC)、核苷酸結合部位(NB)、富含亮氨酸的重復單位(LRR)、以及C-端區域(CT)。 用加下劃線的斜體字表示的Pi5_l的31-67位氨基酸和Pi5-2的26-87位氨基酸包括CC基 序。以NB蛋白為特征的保守的內部基序(即P-環、激酶-2、RNBS-B、GLPL、RNBS-D和MHDV 結構域)用下劃線和粗體表示。在許多NB-LRR蛋白的LRR中發現的保守的xLDL基序也是 加下劃線的。圖7顯示了對用稻瘟病曲霉菌P06-6接種的RIL260品種的Pi5基因和PBZl基因 的RT-PCR分析。在病原體接種后0、4、12、24、48和72小時，從RIL260葉組織制備的cDNAs 用于試驗。水稻Actinl基因被用作內部對照。
具體實施例方式為了實現上述發明目的，本發明提供了能增強對稻瘟病曲霉菌抗性的Pi5_l和 Ρ 5-2蛋白。在這方面，每種Pi5-1和Pi5-2蛋白不能獨立地增強對稻瘟病曲霉菌的抗性。 相反，對稻瘟病曲霉菌抗性的增強只有通過Pi5-1和Pi5-2蛋白間的協同作用而獲得。本發明的Pi5_l和Pi5_2蛋白的范圍包括具有從水稻分離的SEQ IDNO :1或SEQ ID NO :2表示的氨基酸序列的蛋白和上述蛋白的功能等價物。術語“功能等價物”是指氨 基酸殘基的替換或缺失的結果，所述功能等價物與SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2代表的氨 基酸序列具有至少70%、優選至少80%、更優選至少90%、仍然更優選95%的同源性，因 此，所述功能等價物表示與由SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2表達的蛋白具有基本上相同的 生物學活性的蛋白。術語“基本上相同的生物學活性”是指植物對稻瘟病曲霉菌增強的抗 性。本發明還提供了編碼上述Pi5_l和Pi5_2蛋白的基因。本發明中，Pi5_l和Pi5_2 基因中的每一種均可以包括蜷曲螺旋(CC)、核苷酸結合結構域(NB)和富亮氨酸的重復單位(LRR)結構域(見圖5和圖6)。本發明的基因包括基因組DNA和編碼Pi5-1和Pi5-2蛋 白的cDNA。更具體地說，Pi5-1的cDNA序列包括5 ‘和3 ‘非翻譯區域(分別包括70bp和 220bp)，并且Pi5-1的cDNA序列編碼1，025個氨基酸。Pi5_2的cDNA序列包括5'和3' 非翻譯區域(分別包括73bp和164bp)，并且Pi5-2的cDNA序列編碼1，063個氨基酸。優選地，本發明的Pi5_l和Pi5_2中的每一種的基因組DNAs均可以能包括如SEQ ID NO :3或SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列。此外，本發明的Pi5_l和Pi5_2中的每一種 的cDNAs均可以包括如SEQ ID NO :5或SEQ IDNO :6所示的核苷酸序列。上述核苷酸序列 的變體也在本發明范圍內。具體地說，所述基因可以包括與如SEQ ID NO :3至SEQ ID NO: 6所示的核苷酸序列具有至少70 %，優選至少80 %，更優選至少90 %，仍然更優選95 %的同 源的核苷酸序列。對于某一多核苷酸，術語“序列同源性”由對最佳排列的具有待比對區域 的兩個核苷酸序列的比對來確定的。在這方面，待比對的區域中的部分核苷酸序列可以包 括相對于與最佳排列的兩個序列有關的參比序列(無任何插入或缺失)而言的插入或缺失 (即，間隙)。此外，本發明提供了一個重組體載體，其中，該重組體載體包括本發明的Pi5_l和 Pi5-2。術語“重組體”是指能夠復制異源核苷酸或表達該異源核苷酸的細胞、肽、異源肽 或由所述異源核苷酸編碼的蛋白質。重組體細胞能夠表達自然狀態下的細胞中未發現的正 義或反義形式的基因或基因片段。此外，當通過人工方法將所述基因修飾并再次引入到所 述細胞中時，所述重組體細胞能夠表達在自然狀態中發現的基因。此處所用術語“載體”是指被遞送至細胞的DNA片段和核苷酸分子。載體能復制 DNA，并在宿主細胞中獨立地復制。術語“遞送系統”和“載體”通常可以互換地使用。術語 “表達載體”是指包括期望的編碼序列和對于在特定的宿主有機體中表達可操作連接的編 碼序列所必需的其他適當的核苷酸序列的重組體DNA分子。優選地，本發明的重組體載體是一個重組的植物表達載體。所述植物表達載體的優選例子是Ti-質粒載體，當所述載體位于合適的宿主(諸 如根癌土壤桿菌)中時，所述Ti-質粒載體能轉移它本身的一部分(即所謂的T區域)到 植物細胞中。目前，其他類型的Ti-質粒載體(見EPO 116 718 Bi)用于將雜和基因轉移 到原生質體中，該原生質體通過將所述雜合DNA適當地插入到植物基因組中而產生新的植 物。特別地，Ti質粒載體的優選形式是在EP 0 120 516 Bl和USP No. 4，940，838中描述 的所謂二元載體。其他可以用于將本發明的DNA轉移到植物宿主中的載體，可以選自雙鏈 植物病毒(如，CaMV)、單鏈植物病毒、以及來源于復染色體病毒等的病毒載體(例如，不完 整的植物病毒載體)。所述載體的使用是有益的，特別是當植物宿主不適宜被轉化的時候。
所述表達載體可以包括至少一個選擇性標記。所述選擇性標記是具有允許基于通 常的化學方法進行選擇的特性的核苷酸序列。能被用來從非轉化細胞中區分出轉化的細胞 的任何種類基因均可以作為選擇性標記。例子包括對除草劑(如草甘膦和磷酸麥黃酮) 有抗性的基因；以及對抗生素(如卡那霉素、G418、博來霉素、潮霉素和氯霉素)有抗性的基 因，但不局限于此。 對于根據本發明的一個具體實施方式
的所述植物表達載體，啟動子可以是CaMV 35S、肌動蛋白、泛素、pEMU、MAS或組蛋白啟動子中的任意一種，但不局限于此。術語“啟動子”是指為了起始DNA的轉錄，RNA聚合酶所結合的DNA分子，并且啟動子對應于結構基因 的上游DNA區域。術語“植物啟動子”表示能在植物細胞中啟動轉錄的啟動子。術語“結構 啟動子”表示在大多數環境情況和發育狀態或細胞分化狀態下有活性的啟動子。由于轉化 株可以在不同階段通過不同的機制篩選出，因此，結構啟動子對本發明就是優選的。因而， 本發明中并不限制篩選結構啟動子的可能性。對于所述終止子，任何常規的終止子均可用于本發明。所述終止子的例子包括 胭脂堿合酶(NOS)、水稻α-淀粉酶RAmylA終止子、菜豆堿終止子和用于根癌土壤桿菌的 optopine基因的終止子等，但是不局限此。關于終止子的必要性，已知該區域能增加植物細 胞轉錄的可靠性和有效性。因而，由本發明的上下文看來，優選使用終止子。此外，本發明提供了一種植物，其中，該植物由根據本發明的重組體載體轉化。根據本發明，所述植物是單子葉植物，包括水稻、大麥、玉蜀黍、小麥、黑麥、燕麥、 草坪草(turfgrass)、干草、粟、甘蔗、黑麥草、果樹草(turfgrass)等等。最優選的是水稻。此外，本發明提供了所述植物的種子。優選地，所述種子是水稻種子。此外，本發明提供了增強對植物病原體的抗性的方法，其中，該方法包括用包括 Pi5-1和Pi5-2基因的本發明的重組體載體轉化植物，并在該植物中表達Pi5-1和Pi5-2基 因的步驟。優選地，該病原體為稻瘟病曲霉菌。更優選地，所述植物是單子葉植物，包括水稻、 大麥、玉蜀黍、小麥、黑麥、燕麥、草坪草、干草、粟、甘蔗、黑麥草、果樹草等等。最優選水稻。植物轉化是指能夠將DNA轉入到植物的任何方法。這樣的轉化方法不必須具有再 生和/或組織培養的時期。目前植物物種的轉化不只對于雙子葉植物，對單子葉植物也非 常普遍。原則上，任何轉化辦法均可以用于將本發明的雜合DNA引入到適當的祖細胞。所 述轉化方法可以選自以下方法用于原生質體的鈣/聚乙烯甘醇方法(Krens，F. Α.等人， 1982, Nature 296,72-74 ；Negrutiu I.等人，June 1987，Plant Mol. Biol. 8,363-373)；用 于原生質體的電穿孔方法(Shillito R.D.等人，1985 Bio/Technol. 3，1099-1102)；用于 植物成分的纖維注射方法(Crossway A.等人，1986，Mol. Gen. Genet. 202，179-185)；用于 多種植物成分的粒子轟擊方法(DNA或RNA包被的)(Klein Τ. Μ.等人，1987，Nature 327， 70)；或通過植物入侵或完整成熟花粉或小孢子轉化(EP 0 301 316)而由根癌土壤桿菌介 導的基因轉移中的(非完整)病毒感染方法。本發明中優選的方法包括土壤桿菌屬介導的 DNA轉移。尤其，在EP A 120 516和USP No. 4，940，838中描述的雙載體技術優選用于本發 明。用于根據本發明的植物轉化的術語“植物細胞”可以是任何植物細胞。植物細胞可 以是培養細胞、培養組織、培養器官或整體植物；優選地是培養細胞、培養組織或培養器官； 更優選的是培養細胞的任何形式。優選地，該植物是水稻。術語“植物組織”包括具有用于培養的各種形態的分化或未分化的植物組織(包 括根、莖、葉、花粉、種子)，例如單細胞、原生質體、蓓蕾和愈合組織，但不局限于此。植物組 織可以是整株的，或為器官培養、組織培養或細胞培養的狀態。此外，本發明還提供了抗本發明的Pi5_l和Pi5_2蛋白的抗體。根據本發明，術 語“抗體”包括單克隆抗體、多特異性抗體、人抗體、人源化抗體、駱駝源抗體(camelised antibody)、嵌合體抗體、單鏈Fvs (scFv)、單鏈抗體、單結構域抗體、Fab片段、F(ab)片段、
7結合有二硫化物的Fvs (SdFv)、抗個體遺傳型(抗-Id)抗體或能夠結合上述任何表位的片 段。尤其是免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性片段(例如包括抗原結合區域的 分子)，也包括在本發明的抗體內。免疫球蛋白分子可以是IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY 中的任意一類，或IgGp IgG2, IgG3、IgG4, IgA1和IgA2或它們的亞類中的任何一類。本發明的抗體可以根據常規的方法制備，該方法包括通過下述典型的操作將本 發明的基因克隆在表達型載體中，以獲得蛋白并從這種蛋白中制備抗體。因此，也包括能夠 從所述蛋白中生成的部分肽。關于本發明的部分肽，它含有至少7個氨基酸，優選至少9個 氨基酸，更優選至少12個氨基酸。本發明的抗體的類型是沒有明確的限制的。單克隆抗體、 多克隆抗體和具有抗原結合特性的部分抗體都包括在本發明的抗體中。各種免疫球蛋白抗 體也包括在內。而且，如人源化抗體的特殊抗體等也包括在本發明的抗體內。此外，本發明還提供了含有能夠增強對植物病原體抗性的Pi5_l和Pi5_2基因的 組合物。由于本發明的Pi5_l和Pi5-2蛋白基于它們之間的協同作用能夠增強對植物病原 體的抗性，因此，含有Pi5-1和Pi5-2基因的組合物可以被用來增強對植物病原體的抗性。 優選地，該植物病原體是稻瘟病曲霉菌。參照下述實施例對本發明進行更詳細的說明。然而，這只是具體地舉例說明本發 明，本發明絕不局限于這些例子。實施例植物材料攜帶Pi5等位基因的RIL260水稻品種和稻瘟病易感品種(IR50)被用作本研究中 的親本品系。RIL260和IR50品種雜交生成用于基因連鎖分析的圖譜種群。RII^eO/IRSOFi 個體的自花授粉種子(F2)被收集，以獲得足夠大的圖譜種群。一種山茶水稻品種(Dongjin) 被用作稻瘟病曲霉菌接種和水稻轉化實驗的易感對照。RIL260和攜帶Pi5的單基因水稻品 系IRBL5-M被用來作為在稻瘟病曲霉菌實驗有抗性的對照品種。另外的8個單基因水稻品 系，IRBLi-F5、IRBL9-W、IRBLb-B、IRBLta-Kl、IRBLz-Fu、IRBLks-F5、IRBLkm-Ts 和 IRBLsh-S 以及這些單基因品系易感背景品種Lijiangxintuanheigu(LTH)也被用于確定稻瘟病曲霉 菌分離株的毒力模式的接種實驗。水稻幼苗生在白天室溫30°C和夜里20°C的14/10小時 周期的光/暗循環的溫室。病原體接種和疾病評估與Pi5抗性基因座不相容的一種菲律賓分離株稻瘟病曲霉菌P06-6已被通常地用 于檢測這個基因座。為了在Pi5轉基因水稻株中分析稻瘟病的抗性，使用了另外5個不同 的韓國稻瘟病曲霉菌分離株KJ105a、KJ107、KJ401、KI215和R01-1。所有接種和疾病評估 在 Kyung Hee 大學溫室設施內，使用從 Liu 等(2002，Mol. Genet. Genomics 267:472-480) 輕微改良的方法進行。每種確定的重組體品系和轉基因植物的F3子代的3周齡植物被用 于接種實驗。稻瘟病曲霉菌在燕麥片瓊脂培養基上于24°C黑暗中生長2周。分生孢子在收 集前4天通過用消毒的環刮盤表面而被誘導。接種的植物被放置于密封的容器內在黑暗中 24°C保持濕度24小時，然后轉到在14/10小時(光/暗)光周期下24°C和80%濕度的生 長室。接種后7天，完成疾病評估。來自RIL260/IR50圖譜種群子代的基因型分析C1454和JJ817的酶切擴增多態序列(CAPS)標記和一個序列特征擴增區域
8(SCAR)標記JJ803(符合先前報道的占主導地位的標記JJ803)被用于RIL260/IR50分離子 代的分析(表1)。按需使用占主導地位的標記JJ113-T3和S04G03。表1.本研究中使用的PCR引物 通過簡單的小量方法從水稻株幼葉中分離基因組DNA (Chen和Ronal d (1999) Plant Mol. Biol. Rep. 17 :53_57)。用50ng基因組DNA做為模板，在最終的30 μ 1體系 (每種引物 ΙΟΟρΜ、每種 dNTP 200 μ MUOmM ρΗ 9. O 的 Tris-鹽酸、2mM MgCl2、50mM KCl, 0. 聚乙二醇辛基苯基醚X-IOO和0. 5UTaq聚合酶)進行PCR分析。針對CAPS標 記，C1454和JJ817PCR產物隨后分別被MluI和AseI消化，然后在瓊脂糖凝膠上分級 (size-fractionated)。DNA測序和基因預測跨越Pi5基因座的RIL260雙BAC(BIBAC)克隆被選作DNA序列分析。由小量制 備純化的質粒被Sau3AI部分消化，并進行瓊脂糖凝膠電泳分離。用商業試劑盒(凝膠提 取試劑盒，Qiagen)分離該0. 5-3. Okb的基因組DNA片段，亞克隆到pBluescriptll SK(-) (Clontech)的BamHI部位，然后用電穿孔轉化到Ε. coli DH10B。為了對每種帶有25_kb平 均大小的插入的BIBAC克隆進行DNA測序，篩選約60個克隆并用T3和T7引物在一個或兩 個方向上進行測序。用BLAST(基本的局部對比檢索工具)執行對NCBI資料庫(http://www.ncbi. nlm. nih. gov/)的相似性檢索。為了預測蛋白質編碼基因區域，使用水稻基因組自動注釋系 統(水稻 GAAS) (http://RiceGAAS. dna. affrc. go. jp/)。用于遺傳互補實驗的載體構建通過來自于BIBAC克隆的亞克隆重建Pi5_l和Pi5_2的基因組DNA區域(Jeon 等人.(2003)Mol. Genet. Genomics 269:280-289)。為了 構建攜帶整個 Pi5_l 編碼區的
c1454
JJ8I7
jj803
PiS-/
Ρ 5-2
Actinl
PB7J
gtattacctgaaatcctagtggtg (seq id no: 7)
gatatggttgaaaagctaatctca (seq id no: 9)
aa<3tgagcatcx:agtgcctaatga
(seq id no: u)
tacaagttggcagctttatctgag (shq id no: 13}
agtgaactccaaacatgtgaacac (seq id no; 15) ggaactggataggtcaaggc (seq id no: 17)
accatctacaccatgaagcttaac (seq id no: 19)
9克隆，將包括0. 5-kb預測啟動子的JJ80載體的6. 6-kbBamHI-SacI片段亞克隆到雙載體 pC1300intC(基因庫登記號· AF294978)中。合成的質粒JJ104用BamHI和BstEII進行消 化，并融合到JJ106的7. 3-kbHindIII-BstEII插入片段，構建具有5. 2_kb啟動子區域的 JJ105。0. 5-kbSacI-XhoI 片段用引物5' -GTCCAAAGAGAAATGCGACAACAC-3‘ (SEQ IDNO 21) 和 5' -CGCTCGAGGTGGCATTTCATCCAATAGGCAAC-3' (SEQ IDNO 22)通過 PCR 進行擴增。將 合成的產物插入到JJ105延伸終止子區域，產生攜帶11，516-bp Ρ 5-1基因組區域的JJ204 構建體。Pi5-2基因由以下4個片段的多重配位構建4. 2-kbJJ113的EcoRI-BglIIDNA片 段；用引物 5' -GGATGATGTGATCTGCAGAGAAAC-3 ‘ (SEQ ID NO: 23)和 5' -CAGCCTCACTGA AATTGCGAAGCA-3‘ (SEQ ID NO :24)擴增的 200-bp BglII-ClaI PCR 產物；4. 2_kb JJ120 的ClaI-XbaI DNA片段；以及EcoRI-XbaI消化的pC1300intC載體片段。在合成的構建體 11117中，通過克隆11120的3.7-吐NsiI-Ec0RI片段，啟動子區域被延伸。最后，通過插入 0. 9kb-延伸的終止序列到JJ142質粒的Eco065I部位，構成JJ212中Ρ 5-2的13，250-bp 的整個基因組序列。在JJ204和JJ212的克隆的基因組序列通過DNA測序被確定。轉基因水稻株的產生通過電穿孔將Pi5_l和Pi5_2的基因組克隆轉化到根癌土壤桿菌EHA105或 LBA4404，并根據已經確定的程序由土壤桿菌屬轉入到易感的水稻品種(Jeon等人.(2000) Plant J. 22 :561-570)。轉基因植物(Ttl)是自花授粉的，T1種子被收集。因基于轉基 因的分離模式的1\品系的自花授粉，繼而從T2子代中選取純合子Pi5-l(Pi5-l-63)和 Ρ 5-2 (Ρ 5-2-74)轉基因品系。攜帶 Pi5_l 和 Pi5_2 的 F1 株從 Pi5_l_63 和 Pi5_2_74 品系 間的交叉產生，并自花授粉產生F2株。Ρ 5-1 和 Pi5_2cDNAs 的分離從與稻瘟病曲霉菌P06-6接種后24和48小時收集的水稻葉，并用Trizol試劑制 備兩種總RNA制品。用PolyATtract mRNA隔離系統(Promega)從每批總RNA中獲得純化 的mRNA，并以1 1比例混合以合成cDNA。經由凝膠過濾按大小進行分級分離，以篩選超 過0. 5kb的cDNA，用單ZAP XR載體構建(Stratagene) cDNA文庫。然后，經由集落印記雜 交(colony blothydridization)分別用Pi5_l和Pi5_2編碼區域的相應的探針(570-bp JJ204的HindIII-KpnI片段和589-bp JJ212的EcoRV-SpeI片段部分)，篩選文庫。通過 DNA測序分析對分離出的cDNA克隆進行分析。RT-PCR 分析為了檢測響應病原體治療在轉錄本積累上的變化，收集不同時期的來自于 10RIL260、IRBL5-M和與稻瘟病曲霉菌P06-6接種的轉基因水稻株中的每一種的葉子，以進 行RT-PCR分析。總RNA用Trizol試劑和一種寡_dT的逆轉錄引物以及第一鏈cDNA合成 試劑盒(Roche)制備。在PCR反應中使用第一鏈cDNA和基因特異性引物。水稻Actinl基 因和發病機制相關的可誘導的烯丙苯噻唑(PBZl)基因的引物用于內部對照(表1)。PCR 條件如下94°C 5min，隨后 28-35 個以下循環94°C，lmin ；56°C, Imin ；72°C,lmin,以及最 后在72°C 5min的延伸。對每個引物設定三個獨立的擴增。實施例1 攜帶Pi5的130-kb的染色體區域的基因特征先前，Pi5抗病基因被劃分到在水稻染色體9的兩個側翼標記S04G03和C1454之間的170-kb的區間。這個發現是我們先前分析產生于攜帶Pi5的RIL260和易感品種C039 之間的雜交，以及RIL260和另一個易感品種M202之間的雜交的兩個種群的結果(Jeon等 人· (2003)Mol. Genet. Genomics269 :280-289)。為 了進一步描繪 Pi5 基因，在本研究中，我 們產生了來源于RIL260和另一個易感品種IR50之間雜交的第三個圖譜種群。通過PCR篩 選，我們發現在檢測過的易感品種中，只有IR50包括占主導地位的標記JJ817，這也在抗性 品種RIL260被發現(未顯示數據)。相反，我們不能在包括C039和M202的其他易感品種 中擴增JJ817的PCR產物。我們選定IR50作為基于RIL260和IR50基因組區域之間的相 似性的一個標測親本，我們推測其能促進在這個區間的重組。 為了確定在170-kbPi5基因座內的罕見重組，運用CAPS標記JJ817和C1454以及 SCAR標記JJ803的預先篩選策略，在我們目前的RIL260/IR50F2種群分析中使用。在被分 析的2，014個F2個體中，我們確定了 JJ817和JJ803之間的8個重組體，但沒有位于JJ803 和C1454之間的重組體(圖1)。用占主導地位的標記JJ113-T3和S04G03,我們隨后確定 了我們在它們的子代(F3)株分離的這8個重組體的斷裂點，這使我們能從雜合子基因型區 分出純合子。總的來說，發現所有8個品系中含有JJ113-T3和JJ817之間的重組體。
在每例的F3子代中確定了源自這8個確定品系的稻瘟病曲霉菌P06-6感染的疾病 表型。這些實驗進一步將Pi5基因定位在標記JJ817和C1454間一個130_kb的區間(圖 1)。我們先前的和目前的結果顯示標記JJ803和JJ113-T3都與Pi5介導的抗性共分離(圖 1)。我們不能進一步在Pi5基因座上細致標測R基因。實施例2 包括Pi5基因座的130-kb染色體區域的基因序列分析為了確定候選在Pi5基因座的R基因，涵蓋130_kbPi5區域的7個BIBAC克隆—— JJ80、JJ98、JJ106、JJ110、JJ113、JJ120和JJ123被篩選和測序。用這些序列對照公共數據 庫的BLAST搜索和并且用水稻GAAS程序基因注釋分析在RIL260品種的Pi5基因座預測整 體18個可讀框(ORFs) :7個假定軛蛋白、2個NB-LRR蛋白、2個推測的轉座子蛋白、1個推 測的真核生物的翻譯起始因子、1個推測的GTP-結合蛋白、1個推測的四氫葉酸酯合成酶、1 個推測的醛糖1-表異構酶、1個推測的組蛋白H5、l個推測的冷休克-DEAD-盒-蛋白A和 1個錨定蛋白(圖2)。從這基因組序列分析，2個顯示與NB-LRR抗病基因同源性的Pi5候 選基因在RIL260和指定的Pi5-1和Pi5_2被確定。130-kb RIL260 Ρ 5區間的從JJ803到JJ817的接近90kb的區域，與由已測 序的品系Nipponbare表示的山茶基因組的相應區域進行比較(國際水稻基因組測序計 劃2005;圖2)。作為結果的序列分析顯示，Nipponbare Pi5區間包括2個NB-LRR基因、 0s09gl5840(—個Pi5-1等位基因)和在RIL260、0s09gl5850、被指示的Pi5_3中沒有確 定的基因。相反，Nipponbare缺乏相應的Pi5-2。值得注意的是，RIL260和Nipponbare的 Ρ 5-1等位基因的5個上游序列非常不同，顯示在這些等位基因調節序列內的極端序列趨 勢。另外，我們沒有在RIL260和Nipponbare的90_kbPi5區間的任何其他部分發現顯著的 序列相似性(圖2)。這些結果提示Pi5抗病基因座在這些抗病和易感水稻品種有顯著的差
已 升。由于該基因座的大間隙，我們沒有比較Pi5抗病基因座與公開序列的秈稻品種 93-11的基因座。在一個接種實驗，我們發現Nipponbare和93-11都對稻瘟病曲霉菌P06-6 易感(未顯示數據)，說明它們都沒有攜帶Pi5抗病基因。
實施例3 表達Pi5候選基因的轉基因水稻株的特征要確定Pi5_l和Pi5_2兩個候選基因哪個為Pi5對M.曲霉菌介導的抗病性負責， 我們分別用攜帶Pi5_l和Pi5-2的基因組克隆JJ204和JJ212，在天然啟動子的對照下，轉 化用土壤桿菌介導轉化的易感粳稻品種Dongjin。生成的轉基因品系的RT-PCR分析顯示 獨立轉化的品系的15個Pi5-1中的13個以及13個Pi5-2中的12個，表達它們的在稻瘟 病曲霉菌P06-6接種的轉基因(圖3A)。主要的攜帶Pi5-1或Pi5-2的轉基因品系(Ttl)被 與稻瘟病曲霉菌P06-6接種。令人驚訝的是，無論如何，13個Pi5-1或12個Pi5-2轉基因 株中沒有顯示對稻瘟病曲霉菌分離株P06-6顯示出抗性(圖3B)。為了確定這些結果，我們 接種來自于這些Ttl品系的T1子代，并發現所有子代對對稻瘟病曲霉菌分離株的易感性與野 生型對照Dongjin品系相同。這顯示無論Pi5-1或Pi5-2都不能單獨賦予對稻瘟病曲霉菌 P06-6的抗性。實施例4 表達Pi5_l和Pi5_2的轉基因水稻株的特征因為最近的報道(Sinapidou等人.(2004) Plant J. 38 :898_909)已經證實對于病 原體感染的抗性2個R基因是必需的，我們決定檢測表達抗稻瘟病的2個候選基因株。我 們因而通過一個高度易感純合子Pi5-1品系#63(Pi5-l-63)與高度易感純合子Pi5_2品系 #74(Pi5-2-74)雜交生成攜帶Pi5-1和Pi5-2的轉基因株。基因表達分析顯示來源于在稻 瘟病曲霉菌P06-6接種上Pi5-1和Pi5-2基因均表達的雜交的F1株。引人注目的是，23個 PiS-l-eS/PiSHAF:株檢測均顯示完全抗稻瘟病曲霉菌P06-6。攜帶Pi5_l或Pi5_2轉 基因品系像先前確定的那樣易感(圖3B)。為了確定這個發現，我們把來自于Pi5-l-63/Pi5-2_74 F1品系的F2子代株與瘟病 曲霉菌分離株P06-6接種。72個被檢測的F2子代中37個攜帶2個轉基因，并賦予抗稻瘟 病曲霉菌P06-6。相反，缺乏Pi5-1和Pi5-2的F2子代是易感的(圖3C)。RT-PCR分析證 實Pi5-l-63/Pi5-2-74品系在稻瘟病曲霉菌P06-6接種之前和之后在相似于RIL260的水 平表達它們的轉基因。為了檢測如果Pi5_l和Pi5-2對抗其他稻瘟病曲霉菌分離株是必需 的，我們接種與Pi5不相容的帶有4個另外的分離株的轉基因株。這些分離株顯示在攜帶不 同單R基因水稻品系的不同的毒力模式，確認這些是真正不同的稻瘟病分離株。我們發現 共表達Pi5-1和Pi5-2的轉基因株抗所有被檢測的稻瘟病曲霉菌分離株。抗病供者RIL260 和攜帶Pi5的單基因品系IRBL5-M也抗這4個分離株。相反，Dongjin和只攜帶Pi5_l或 Pi5-2的植株對檢測的稻瘟病曲霉菌分離株易感(表2)。這些結果證實2個NB-LRR基因 Ρ 5-1和Pi5-2對Pi5-介導的抗稻瘟病曲霉菌分離株是必需的。表2.轉基因株對稻瘟病曲霉菌分離株的疾病反應
a轉基因植株bR，抗性；S，易感性。Ρ 5單基因品系IRBL5-M對稻瘟病曲霉菌KI215易感。基因組序列分析顯示攜帶 Ρ 5的IRBL5-M基因組區域與RIL260的相同(未顯示數據)。另外，RT-PCR分析進一步證 實IRBL5-M在稻瘟病曲霉菌P06-6接種之前和之后，表達Pi5_l和Pi5_2的水平與RIL260 相似。基于這些結果，我們假定Pi5-1和Pi5-2均表達的轉基因株將也對稻瘟病曲霉菌 KI215易感。實際上，我們的接種結果顯示Pi5-1和Pi5-2均表達的轉基因株對稻瘟病曲霉 菌KI215易感。相反，RIL260被發現抗稻瘟病曲霉菌KI215，這顯示可能包含另一個對這個 分離株賦予抗性的R基因(表2)。實施例5 由Pi5_l和Pi5_2編碼的蛋白的特性和系統進化分析為了分離研究中相對于2個Pi5基因的cDNA克隆，用從稻瘟病曲霉菌P06-6接 種24和48小時后收集的水稻葉分離的mRNA的Uni-ZAP XR載體，建立RIL260的cDNA文 庫。該文庫用集落雜交法篩選，用Pi5_l和Pi5-2的基因特異區域作為探針。我們分別確定 Ρ 5-1和Pi5-2的7個和5個cDNA克隆。序列分析進一步顯示包含整個開放閱讀框(ORF) 的Pi5-1 cDNA的3個克隆，而其他缺失包繞ATG翻譯起始密碼子的N-末端。在全部ORF 克隆中，最長的克隆(#1-7)被全部測序。這些實驗顯示T Pi5-1編碼1，025個氨基酸的蛋 白，ORF分別側臨70bp和220bp的5'-和3'-非翻譯區(基因庫登記號· EU869185 ；圖 4和5)。克隆的序列分析顯示了包括整個ORF的5個克隆中的3個。在它們中間，最長的 克隆(#2-4)被進一步通過測序特征化。該分析顯示Pi5-2編碼1，063個氨基酸的ORF，并 且這個ORF分別側臨73bp和164bp的5'-和3'-非翻譯區(基因庫登記號.EU869186 ； 圖4和6)。其推導的氨基酸序列比較顯示，Pi5_l和Pi5_2編碼N-末端CC，中心定位的NB和 LRR,并且也編碼C-末端區域(圖5和6)。用Pfam和SMART數據庫的保守的區域掃描預測 Ρ 5-1的109-576位和Pi5_2的109-567位殘基包括NB區域，這是被植物R基因產物共享 的信號基序。以NB-包含R基因產物為特征的保守的內部結構域也在Pi5-1和Pi5-2中確 定，包括P-環、激酶_2、RNBS-B、GLPL、RNBS-D和MHDV結構域。另外用Paircoil2程序分析 (http://groups, csail.mit. edu/cb/paircoil2/)用閾值 0· 1 預測一個在 Pi5_l 的 31-67 位和Pi5-2的26-87位氨基酸之間潛在的CC結構域，顯示這些蛋白屬于NB-LRR抗蛋白CC亞群。Ρ 5-1和Pi5_2的LRR區域分別由24. 3%和22. 6%的亮氨酸殘基組成，并包含一 系列不同長度的不完整的重復單位(10-12)(圖5和6)。值得注意的是，Ρ 5-1和Pi5-2 蛋白的一些重復單位與在其他細胞漿R蛋白發現的共有序列LxxLxxLxxLxLxxC/N/SxOO LxxLPxx匹配。Pi5_l的第一和第三個重復區域以及Pi5_2的第三和第六個重復區域包括 xLDL基序，該基序在許多NB-LRR蛋白的第三個LRR是保守的(圖5和6)。仍然值得注意 的是，Ρ 5-1和Pi5-2蛋白包含一個與其他NB-LRR蛋白不同的獨特的C末端，不與任何已 知蛋白基序匹配。cDNA和這些R基因的基因組序列之間的序列比較顯示，Pi5_l和Pi5_2分別攜帶 5個和6個外顯子(圖4)。Pi5基因比較其他對M.曲霉菌賦予抗性的克隆的水稻R基因， 在它們的編碼區域內有更大數量的內含子。而且，Pi5-1和Pi5-2基因在它們的RNBS-D和 MHDV結構域均包含內含子。實施例6 :Pi5-l和Pi5_2基因的表達分析為了檢測是否這兩個確定的R基因的表達在病原體治療時有變化，我們在稻瘟病 曲霉菌P06-6感染的RIL260、IRBL5-M和Pi5_l-63/Pi5-2_74轉基因植物進行這兩個基因 的RT-PCR分析(圖7)。為了這個目的，使用從在稻瘟病曲霉菌P06-6接種后不同時間點 收集的3周齡植株的葉子分離總RNA。該結果顯示Pi5-1在病原體攻擊12小時后表達增 加，而Pi5-2基因在感染前后的RIL260均持續低水平表達(圖7)。IRBL5-M和Pi5_l_63/ Ρ 5-2-74品系也展示與Pi5基因相似的表達模式。這些發現顯示Pi5-1和Pi5_2均在病 原體感染期間表達，提示被編碼的蛋白也共表達。PBZl轉錄本——病原體誘導基因——在 M.曲霉菌處理的葉子累積到高水平(圖7)。
1權利要求
增強對稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)的抗性的Pi5 1蛋白和Pi5 2蛋白，其中，該Pi5 1蛋白和Pi5 2蛋白分別由SEQ ID NO1和SEQ ID NO2組成。
2.編碼權利要求1所述的Pi5-1蛋白和Pi5-2蛋白的基因。
3.根據權利要求1所述的基因，其特征在于，所述Pi5-1蛋白和Pi5-2蛋白的基因組 DNA分別由SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4的核苷酸序列組成，并且所述Pi5_l蛋白和Pi5_2 的cDNA分別由SEQ ID NO 5和SEQ ID NO 6的核苷酸序列組成。
4.一種重組體載體，其中，該重組體載體包括權利要求2所述的基因。
5.一種植物，其中，該植物由權利要求4所述的重組體載體轉化。
6.根據權利要求5所述的植物，其特征在于，該植物為單子葉植物。
7.權利要求5所述的植物的種子。
8.一種增加對植物病原體的抗性的方法，其中，該方法包括如下步驟用權利要求4所 述的重組體載體轉化植物，并繼而在該植物中使Pi5-1蛋白和Pi5-2蛋白的基因表達。
9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于，所述植物病原體為稻瘟病菌 (Magnaporthe oryzae)0
10.根據權利要求8所述的方法，其特征在于，所述植物為單子葉植物。
11.權利要求1所述的Pi5_l蛋白和Pi5-2蛋白的抗體。
12.一種用于增強對植物病原體的抗性的組合物，其中，該組合物含有權利要求2所述 的基因。
全文摘要
本發明涉及能夠增強對稻溫病菌(Magnaporthe oryzae)的抗性的Pi5-1蛋白和Pi5-2蛋白、編碼這些蛋白的基因、包括這些基因的重組體載體、用重組體載體轉化的植物、植物的種子、通過在植物中表達所述基因以增強對植物病原菌的抗性的方法、抗所述蛋白的抗體、以及包括能夠增強對植物病原菌的抗性的基因的組合物。
文檔編號C12N1/11GK101932710SQ200980100692
公開日2010年12月29日 申請日期2009年7月15日 優先權日2008年7月18日
發明者P·羅納德, 盧在煥, 安鎮興, 宋玟英, 徐廷弼, 徐榮秀, 曹培健, 李祥圭, 李起煥, 田鐘聲, 金惠景, 韓胎龍, 高世虎 申請人:慶熙大學校產學協力團;加州大學校務委員會