新型噬菌體和包含所述噬菌體的抗菌組合物的制作方法

專利名稱：新型噬菌體和包含所述噬菌體的抗菌組合物的制作方法
技術領域：
本發明涉及新型噬菌體，更具體地，本發明涉及對鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)、_夕少 |、1 ft胃(Salmonella gallinarum)夕少 |、lft胃(Salmonella pullorum)具有特異殺菌活性的噬菌體，還涉及包含作為活性成分的所述噬菌體的組合物， 其用于預防或治療包括由鼠傷寒沙門氏菌引起的沙門氏菌病(salmonellosis)或沙門氏 菌食物中毒(Salmonella food poisoning)、由雞沙門氏菌引起的禽傷寒(Fowl Typhoid) 和由雞白痢沙門氏菌引起的雞白痢(Pullorum)在內的傳染病(infectious diseases)，以 及涉及包含作為活性成分的所述噬菌體的動物飼料、飲用水、清潔劑和消毒劑
背景技術：
沙門氏菌是腸桿菌科(Enterobacteriaceae)的一個屬，其特征為革蘭氏陰性、 兼性厭氧、無芽孢形成、桿狀細菌且大多數菌株均通過鞭毛活動。沙門氏菌基因組的平 均GC含量為50-52 %，這與大腸桿菌(Escherichia coll)和志賀氏菌(Shigella)相 似。沙門氏菌屬是在家畜和人中引起傳染的病原微生物。作為沙門氏細菌的一種，腸 道沙門氏菌(Salmonella enterica)具有多個血清型，包括雞血清型(Gallinarum)Jl 白痢血清型(Pullorum)、鼠傷寒血清型(Typhimurium)、腸炎血清型(Enteritidis)、傷 寒血清型(Typhi)、豬霍亂血清型(Choleraesuis)和德爾卑血清型(derby) (Bopp CA, Brenner Fff, Wells JG, Strokebine ΝΑ. Escherichia, Shigella, Salmonella. In Murry PR, Baron EJ, et aleds Manual of clinical Microbiology. 7th ed. Washington DC American Societyfor Microbiology 1999 ；467-74 ；Ryan KJ. Ray CG(editors)(2004). SherrisMedical Microbiology (4th ed). McGraw Hill. ISBN 0-8385-8529-9)。其中， 雞沙門氏菌和雞白痢沙門氏菌是特異于禽的病原體，傷寒沙門氏菌(SalmonellaTyphi) 是特異于人的病原體，豬霍亂沙門氏菌(Salmonella Choleraesuis)和德爾卑沙門氏菌 (Salmonella derby)是特異于豬的病原體，而腸炎沙門氏菌(Salmonella Enteritis)和鼠 傷寒沙門氏菌(Salmonella Typhimurium)是人和動物二者的病原體。所述各種血清型都 會引起疾病，對農民和消費者產生嚴重的不良影響。由沙門氏菌引起的家禽疾病為禽傷寒(FT)，其由雞沙門氏菌(下文稱為SG)病 原體引起。禽傷寒(FT)是家禽(如雞和鴨)的敗血癥，其病程可能為急性或慢性的，并伴 有高死亡率。最近報道禽傷寒常常發生在歐洲、南美洲、非洲和東南亞，并且其破壞性逐漸 增加。韓國自1992年開始有FT爆發的報道，FT在褐色蛋雞中引起的經濟損失非常嚴重 (Kwon Yong-Kook. 2000 annualreport on avian diseases. Information publication by National Veterinary Research& Quarantine Service. March,2001 ；Kim Ae-Ran et al.， The prevalence ofpullorum disease-fowl typhoid in grandparent stock and parent stock in Korea，2003，Korean J Vet Res(2006)46(4) :347 353)。雞白痢也是由一種沙門氏細菌，即雞白痢沙門氏菌(下文稱為SP)引起的。雞 白痢發生在任何年齡或季節，但雛雞特別容易感染此病。上世紀期間，作為由雞蛋傳播的傳染病，雞白痢在世界和韓國嚴重感染了 1-2周齡或更年幼的雛雞。在二十世紀八十 年代，該病的發病率急劇降低。然而，在二十世紀九十年代中期，其發病率又開始增加 (Kwon Yong-Kook. 2000 annual report onavian diseases. Information publication by National Veterinary Research &Quarantine Service. March,2001 ；Kim Ae-Ran et al.， The prevalence of pullorumdisease-fowl typhoid in grandparent stock and parent stock in Korea，2003，Korean J Vet Res (2006)46 (4) :347 353)。在韓國，禽傷寒和 雞白痢的爆發從二十世紀九十年代幵始增加，給農民造成了經濟損失。為此，盡管其功效 尚不確定，但已經從2004年幵始在用于烤焙的雞(broiler)中使用減毒活SG疫苗以預 防禽傷寒(Kim Ae-Ran et al.，The prevalence of pul lorum disease-fowl typhoid in grandparent stock and parent stock in Korea，2003，Korean J VetRes (2006)46 (4) 347 353)，然而由于存在由雞蛋傳播傳染病的風險，不允許活疫苗用于蛋雞。遺憾的是， 與禽傷寒不同，對于雞白痢仍沒有在商業上可行的預防策略。因此，迫切需要預防禽傷寒和 雞白痢的新方法。
此外，與SG或SP不同，鼠傷寒沙門氏菌(下文稱為ST)是沒有宿主特異性的人畜 共患病病原體(Zoobises Report ；United Kingdom 2003)。ST是家禽、豬和牛等沙門氏菌病的起因。沙門氏菌病是由沙門氏細菌在家畜中引 起的急性或慢性消化道傳染病，并表現為發燒、腸炎和敗血癥等主要癥狀，偶爾伴有肺炎、 關節炎、流產和乳腺炎。沙門氏菌病全世界范圍內都有發生，且多發于夏季(T.R. Callaway et al. Gastrointestinal microbial ecologyand the safety of our food supply as related to Salmonella. J Anim Sci2008. 86 :E163_E172)。在牛中的典型癥狀包括食欲下 降、發燒、黑褐色腹瀉物或粘液狀血便。在小牛中的急性感染可導致其迅速死亡，在妊娠期 的感染可因敗血癥而導致的胎牛死亡，引起早產(www, livestock, co. kr)。在豬中的沙門氏 菌病在臨床上表征為三個主要癥狀急性敗血癥、急性腸炎和慢性腸炎。急性敗血癥發生在 2-4月齡仔豬中，且常在癥狀出現后2-4天內死亡。急性腸炎發生在肥育期，并且伴隨有腹 瀉、高燒、肺炎和神經癥狀。在某些嚴重的病例中可能發生皮膚變色。慢性腸炎伴有持續性 腹灣(www, livestock, co. kr) 0沙門氏菌病一旦在家禽、豬和牛中爆發，將難以用治療劑控制。原因是沙門氏細菌 對各種藥物具有很強的抗性，并且在細胞內存活而抗生素不能滲入其中。目前為止，包括抗 生素在內，還沒有有效治療由ST引起沙門氏菌病的方法(www, lhca. or. kr)。除家畜外，ST還通過家畜產品引起人的感染，導致沙門氏菌食物中毒。食用被感 染且烹飪不當的家畜產品(例如肉制品、家禽產品、蛋和副產品)是人感染的原因。沙門氏 菌食物的人中毒癥狀常包含頭痛、發燒、腹痛、腹瀉、惡心和嘔吐的立即發作。通常在攝入該 生物體后6-72小時內出現癥狀，并可能持續4-7天或者更長(NSW+HEALTH. 2008. 01. 14.)。根據⑶C(美國疾病控制和預防中心)的報道，在2005年至2008年間發生的人 食物中毒中，有16%是由沙門氏細菌引起的，其中有18%是ST(鼠傷寒沙門氏菌)。對于 1973年至1984年間的人沙門氏菌食物中毒，據報道所涉及的食物傳播載體有雞肉(5% )、 牛肉(19%)、豬肉(7%)、乳制品(6%)和火雞肉(9%)。在1974-984年，在屠宰過程中 對用于烤焙的雞的細菌污染檢測顯示35%或更多的沙門氏菌發生率。1983年，在50. 6% 的雞肉、68. 8 %的火雞肉、60 %的鵝肉、11. 6 %的豬肉和1. 5 %的牛肉中分離到沙門氏菌。此外，2007年進行的調查顯示，在5. 5%的生禽肉和1. 的生豬肉中都發現了沙門氏 菌。具體而言，這表明ST常來源于受污染的豬肉、禽肉和牛肉(www, cdc. gov(疾病控制 和預防中心(⑶C))。FAO和WHO在2002年進行的風險評估表明，通過蛋和禽肉傳播的沙 門氏菌病在人中的發病率似乎與在家禽中觀察到的沙門氏菌的流行度呈線性關系。這意 味著，通過降低沙門氏菌在家禽中的流行度，可以相應的降低沙門氏菌病在人中的發病率 (Salmonella control at thesource ；World Health Organization. International Food Safety AuthoritiesNetwork(INF0SAN) Information Note No. 03/2007)。由于近期在花生、 菠菜、馬鈴薯、開心果、胡椒和甜酥餅干面團等產品中發現沙門氏菌而引起人們對食品安全 的擔憂(Jane Black and Ed 0' Keefe. Overhaul of Food Safety Rules inthe Works. Washington Post Staff Writers Wednesday, July 8，2009)。
由于這些原因，在德國，沙門氏菌感染必須上報(§6 and §7 of the Germanlaw on infectious disease prevention, Infektionsschutzgesetz)。在 1990 年至 2005 年間， 官方記載的病例數量由約200，000例下降至約50，000例。據估計，在德國每5人中就有1 人是沙門氏菌攜帶者。在美國，每年報道的沙門氏菌感染約有40，000例(en.wikipedia. orR/wiki/Salmonella#cite note~2)。因此，迫切需要控制在家畜和人中引起沙門氏菌病的ST。通過USDA和FDA的共同 努力，在美國已經開發出多種有效預防引起百萬例以上食源性疾病的沙門氏菌病的策略。 在丹麥，對在生產環節控制沙門氏菌的花費和沙門氏菌病公共健康總花費進行比較的成本 效益分析的保守估計表明，在2001年沙門氏菌控制方案為丹麥社會挽回1.41千萬美元 (Salmonella control at thesource. World Health Organization. International Food Safety AuthoritiesNetwork(INF0SAN)Information Note No. 03/2007)。噬菌體是僅感染并破壞細菌，并且僅能在宿主細菌內進行自我復制的一種特殊 類型的病毒。噬菌體由被蛋白質外殼包圍的遺傳物質(單鏈或雙鏈DNA或RNA)構成。 噬菌體有三種基本的結構類型有尾部的二十面體頭部、無尾部的二十面體頭部和絲狀 體。根據其形態結構和遺傳物質對噬菌體進行分類。根據其尾部結構，具有二十面體頭 部并以線狀雙鏈DNA為遺傳物質的噬菌體被分成三個科肌尾噬菌體科(Myoviridae)、 長尾噬菌體科(Siphoviridae)和短尾噬菌體科(Podoviridae)，其特征分別在于收縮性 尾部、無收縮性的長尾和無收縮性的短尾。可以根據其頭部形狀和成分以及外殼的存在 對具有無尾部的二十面體頭部并以RNA或DNA為遺傳物質的噬菌體進行分組。根據其 大小、形狀、外殼和纖絲(filament)成分對以DNA為其遺傳物質的絲狀噬菌體進行分組 (H. W. Ackermann. Frequency of morphological phagedescriptions in the year 2000 ； Arch Virol(2001) 146 843-857 ；Elizabeth Kutter etal. Bacteriophages biology and application ；CRC press)0在感染過程中，噬菌體附著在細菌上，并將其遺傳物質注入到所述細胞中。之后， 噬菌體進入兩個生命周期之一裂解性或溶源性周期。裂解性噬菌體接管所述細胞的運轉 以制備噬菌體成分，隨后使細胞破裂或裂解，以釋放新的噬菌體顆粒。溶源性噬菌體將其核 酸并入到宿主細胞的染色體中，將其作為一個單元進行復制，而不破壞所述細胞。在某種情 況下，溶源性噬菌體可以被誘導進入裂解周期(Elizabeth Kutter et al. Bacteriophages biology andapplication. CRC press)。
在發現噬菌體后，人們最初對于其在傳染病治療中的應用給予了極大地信心。然 而，在廣譜抗生素得到普遍使用后，噬菌體因具有特異靶標譜而被認為是不必要的。但是， 抗生素的誤用和濫用使得人們對抗生素的耐藥性和食品中殘留抗生素的不良影響的擔 憂增力口(Cislo，M et al. Bacteriophagetreatment of suppurative skin infections. Arch Immunol. Ther. Exp. 1987. 2 :175—183 ；Kim sung-hun et al.，Bacteriophage ；New Alternative Antibiotics, biological research information center，BRIC)。特別地，力口 入到動物飼料以促進生長的抗生素類生長促進劑(AGP)可誘導抗生素耐藥性，因此最近提 出禁止使用AGP的禁令。在歐盟，從2006年開始禁止使用所有抗生素類生長促進劑(AGP)。 韓國從2009年開始禁止使用一些AGP，并且考慮至2013- 2015年限制使用所有的AGP。這些逐漸增加的對抗生素使用的擔憂已經引起人們再度提起對作為抗生素替代 物的噬菌體的興趣。在美國專利第6，485，902號公開了控制大腸桿菌0157:H的7種噬菌體 (2002 年申請-Use of bacteriophages for control ofEscherichia coli 0157)。在美 國專利第6，942，858號公開了用于控制多種微生物的兩種噬菌體(2005年由Nymox申請)。 許多公司已經積極嘗試利用噬菌體開發各種產品。EBI food system(歐洲)開發了用于預 防由單核細胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)引起的食物中毒的食品添加劑， 命名為Listex-PlOO，這是得到美國FDA批準的首個噬菌體產品。研發的產品LMP-102也 是基于噬菌體的抗單核細胞增生李斯特氏菌食品添加劑，并被批準為GRAS (公認安全)級。 在2007年，OmniLytics生產的基于噬菌體的洗劑被開發用于預防屠宰過程中牛肉的大腸 桿菌0157污染，并得到美國農業部(USDA)的食品安全監督服務局(FSIS)的批準。在歐洲， 產胞梭菌(Clostridium sporogenes)噬菌體NCIMB 30008 和 Clostridium tyrobutiricum 噬菌體NCIMB 30008分別在2003年和2005年被注冊為抗梭菌的飼料防腐劑。這些研究表 明，目前正在對將噬菌體作為抗人畜共患病病原體的抗生素用于家畜產品中進行深入的研 允。然而，多數噬菌體生物控制研究都集中于對大腸桿菌、李斯特氏桿菌和梭菌的控 制。沙門氏菌也是一種人畜共患病病原體，并且由該病原體造成的損失也非常顯著。如上 所述，由于ST具有多藥耐性，韓國已經根據預防傳染病的強制條例(執行號16961)、預防傳 染病的強制條令(衛生和福利部法令第179號)和國家衛生研究所組織法(執行號17164) 進行了全國范圍內的抗菌耐性監察。因此，需要開發出控制沙門氏菌的噬菌體。

發明內容
技術問題為了解決包括由于誤用和濫用抗生素引起的抗生素耐性、食品中殘留的抗生素的 有害作用在內的問題以及由使用廣譜抗生素產生的問題，本發明人從自然源中分離了對在 家畜中引起主要疾病的沙門氏菌具有特異殺菌活性的新型沙門氏菌噬菌體，并鑒定了其形 態、生化特性和遺傳特性。本發明人發現，所述噬菌體對鼠傷寒沙門氏菌(ST)、雞沙門氏菌 (SG)和雞白痢沙門氏菌(SP)具有特異殺菌活性且不影響有益細菌，并且具有良好的耐酸 性、耐熱性和耐干燥性，并因此可應用于能夠用于預防或治療由鼠傷寒沙門氏菌引起的家 畜沙門氏菌病、由污染家畜產品引起的沙門氏菌食物中毒和由雞沙門氏菌或雞白痢沙門氏 菌引起的傳染病(特別是禽傷寒或雞白痢)的組合物中，并且可應用于各種控制沙門氏菌的產品中，例如動物飼料添加劑和家畜飲用水、畜棚消毒劑和肉制品清潔劑，從而完成本發 明。技術方案本發明的一個目的是提供對鼠傷寒沙門氏菌、雞沙門氏菌或雞白痢沙門氏菌具有 抗菌活性的新型噬菌體。本發明的另一個目的是 提供用于預防或治療由鼠傷寒沙門氏菌、雞沙門氏菌或雞 白痢沙門氏菌引起的傳染病的組合物，該組合物包含作為活性成分的所述噬菌體，特別是 作為抗生素使用以預防或治療傳染病的組合物。本發明的另一個目的是提供包含作為活性成分的所述噬菌體的動物飼料和飲用 水。本發明的另一個目的是提供包含作為活性成分的所述噬菌體的消毒劑和清潔劑。本發明的另一個目的是提供利用包含作為活性成分的所述噬菌體的組合物來預 防或治療由鼠傷寒沙門氏菌引起的家畜沙門氏菌病或由污染家畜產品引起的沙門氏菌食 物中毒的方法。本發明的另一個目的是提供用于預防或治療傳染病(由雞沙門氏菌和雞白痢沙 門氏菌引起的禽傷寒或雞白痢)的方法。有益效果本發明的新型噬菌體對鼠傷寒沙門氏菌、雞沙門氏菌和雞白痢沙門氏菌具有特異 抗菌活性，該噬菌體還具有優異的耐酸性、耐熱性和耐干燥性。因此，其可用于預防或治療 由鼠傷寒沙門氏菌、雞沙門氏菌或雞白痢沙門氏菌引起的傳染病(包括沙門氏菌病、沙門 氏菌食物中毒、禽傷寒或雞白痢)，還可用于控制鼠傷寒沙門氏菌、雞沙門氏菌和雞白痢沙 門氏菌。


圖1為C5CJ2的電子顯微鏡照片，其中OCJ2符合長尾噬菌體科的形態，特征為等 軸衣殼(isometric caps id)和非收縮性長尾；圖2為所分離的噬菌體OCJ2的SDS-PAGE結果，其中顯示了所述噬菌體的蛋白圖 譜，包括約40kDa的主要蛋白和約65kDa、17kDa和15kDa的其它蛋白(參見作為標記的藍 色 plus 2 預染標準物(Invitrogen))；圖3為所分離的噬菌體OCJ2的PFGE結果，其顯示全基因組大小約為43kbp (使 用5kbp DNA大小標準物(Bio-rad)作為大小標記)；圖4為利用OCJ2基因組DNA的各對引物對進行PCR的結果，其中，A、B和C泳道 (A 利用引物對SEQ ID Nos. 4和5進行PCR擴增，B 利用引物對SEQ ID Nos. 6和7進行 PCR擴增，C 利用引物對SEQ ID Nos. 8和9進行PCR擴增)分別表示約Ikbp的PCR產物；圖5為噬菌體ΦCJ2的耐酸性試驗結果，顯示噬菌體在pH 2. 1、2. 5、3. O、3. 5、4. O、 5. 5、6. 4、6. 9、7. 4、8. O和9. O時存活噬菌體的數量，其中，與對照相比，噬菌體OCJ2在pH 2. 5時保留其傳染性，但在pH 2. 1時完全喪失其傳染性；圖6為噬菌體OCJ2的耐熱性試驗結果，表明在37°C、45°C、53°C、60°C、70°C和 80°C和0、10、30、60、120分鐘的時間點時存活噬菌體的數量，其中，即便在60°C溫育2小時后噬菌體OCJ2依然保持其傳染性，但在70°C溫育10分鐘后則完全喪失其傳染性圖7為利用加速真空干燥器(SVD)在60°C持續120分鐘進行的噬菌體OCJ2耐干 燥性試驗的結果，其中，比較干燥前后病毒滴度的變化從而確定其相對穩定性，且顯示噬菌 體的傳染性沒有下降；圖8為對大鼠單劑量口服給藥進行的OCJ2毒性研究結果，其顯示了體重的變化 (〇用20mM Tris-HCl和2mM MgCl2的混合溶液處理的雄性對照組，·用lxl012pfu的 OCJ2處理的雄性試驗組，■用20mM Tris-HCl和2mM MgCl2的混合溶液處理的雌性對照 組，口 用IxlO12Pfu的OCJ2處理的雌性對照組)，其中，即便在14天后也沒有觀察到體重 的顯著變化；和圖9為對大鼠單劑量靜脈給藥進行的OCJ2毒性研究的結果，其顯示了體重的變 化(〇用20mM Tris-HCl和2mM MgCl2的混合溶液處理的雄性對照組，·用lxl012pfu的 OCJ2處理的雄性試驗組，■用20mM Tris-HCl和2mM MgCl2的混合溶液處理的雌性對照 組，口 用IxlO12Pfu的OCJ2處理的雌性試驗組)，其中，即便在14天后也沒有觀察到體重 的顯著變化。最佳實施方式一方面，本發明涉及對鼠傷寒沙門氏菌、雞沙門氏菌或雞白痢沙門氏菌具有特異 殺菌活性的噬菌體。本發明的噬菌體符合長尾噬菌體科的形態，其特征在于等軸衣殼和非收縮性長 尾，其全基因組大小為43kbp，主要結構蛋白的大小為40kDa。特別地，本發明的噬菌體具有可選擇感染鼠傷寒沙門氏菌、雞沙門氏菌和雞白痢 沙門氏菌的能力，即具有這些細菌的種特異性。本發明噬菌體在遺傳上具有大小為43kbp的全基因組，并且所述全基因組可包含 選自由SEQ ID Nos. 1、2和3組成的組中的一種或多種核酸分子，優選所述全基因組包含 SEQ ID Nos. 1-3所示的核酸分子。當利用選自由 SEQ ID Nos. 4 和 5、SEQ ID Nos. 6 和 7 以及 SEQ ID Nos. 8 禾口 9 組成 的組中的一對或多對引物對對本發明的噬菌體進行PCR時，每種PCR產物的大小約為lkbp。 優選地，當利用上述所有引物對進行PCR時，每種PCR產物的大小約為lkbp。本文所使用的術語“核酸分子，，包括DNA (gDNA和cDNA)和RNA分子，作為核酸的 基本結構單元，術語“核苷酸”包括天然核苷酸及其糖或堿基被修飾的類似物。本發明噬菌體的基因組編碼大小為40kDa的主要結構蛋白。此外，本發明的噬菌體具有耐酸性和耐熱性的生化特性，其中，所述噬菌體可以在 PH 2. 5-pH 9. O的寬范圍pH環境中和37°C -60°C的高溫環境中穩定保持其傳染性。此外， 本發明的噬菌體還具有耐干燥性，從而即使在高溫干燥后仍能穩定保持其傳染性。這種耐 酸性、耐熱性和耐干燥性的特性允許本發明的噬菌體應用于在各種溫度和PH環境下生產 用于由ST、SG和SP引起的家畜疾病或由受污染家畜引起的人類疾病的預防性或治療性組 合物中。本發明的發明人收集了雞屠宰場的污水樣品，并從其中分離出對ST、SG和SP具 有特異殺菌活性和上述性質的本發明噬菌體，將其命名為噬菌體OCJ2，并于2008年12 月17日保藏在韓國微生物培養中心(361-221，Honje 1，Sudaemun, Seoul)，保藏號為KCCM10976P。根據本發明的具體實施例，本發明人收集了雞屠宰場的污水樣品以分離裂解宿主 細胞ST的噬菌體，并且證實所述噬菌體能夠特異性地裂解SG和SP (表1)。本發明人還進 一步在電子顯微鏡下觀察了所述噬菌體(ΦCJ2)，發現其符合長尾噬菌體科的形態(圖1)。本發明人還進一步分析了所述噬菌體OCJ2的蛋白圖譜，發現了大小約為40kDa 的主要結構蛋白(圖2)。此外，還分析了所述噬菌體OCJ2的全基因組大小，發現其全基因組大小約為 43kbp (圖3)。對其遺傳特性的分析結果表明，所述噬菌體的全基因組包含SEQ ID NOs. 1- 3 所示的核酸序列(實施例6)。在這些結果的基礎上，比較與其它種的遺傳相似性。結果發現 所述噬菌體與已知噬菌體的遺傳相似性非常低，這表明所述噬菌體是新型噬菌體(表2)。 更具體地，使用OCJ2特異性引物對(具體而言為SEQ ID Nos. 4和5，SEQ ID NOs. 6和7， SEQ ID NOs. 8和9)進行PCR,發現每種PCR產物的大小均約為Ikbp (圖4)。此外，當用CDCJ2感染SG和SP時，顯示噬菌斑(由一個噬菌體裂解宿主細胞在軟 瓊脂上產生的清澈區域)具有相同的大小和濁度。此外，測定了 OCJ2在各種溫度和pH條件下的穩定性，發現OCJ2在pH 2. 5-pH 9. O的寬范圍pH環境下(圖5)和37°C-60°C的高溫環境下(圖6)都能保持其傳染性，即 便在60°C的高溫下干燥120分鐘后仍能保持其傳染性(圖7)。這些結果表明，可以容易地 將本發明的噬菌體。CJ2應用于各種用于控制沙門氏菌的產品中。另一方面，本發明涉及用于預防或治療由選自鼠傷寒沙門氏菌、雞沙門氏菌和雞 白痢沙門氏菌組成的組中的一種或多種細菌引起的傳染病的組合物，所述組合物包含作為 活性成分的所述噬菌體。在一個優選的實施方案中，所述治療性組合物可以包含抗生素。本發明的噬菌體對鼠傷寒沙門氏菌、雞沙門氏菌和雞白痢沙門氏菌具有特異殺菌 活性，并因此可以用于預防或治療由這些細菌引起的疾病。優選地，由鼠傷寒沙門氏菌引起 的疾病的實例可以包括沙門氏菌病或沙門氏菌食物中毒，由雞沙門氏菌引起的疾病的實例 可以包括禽傷寒，由雞白痢沙門氏菌引起的疾病的實例可以包括雞白痢，但均不限于此。本文所使用的術語“沙門氏菌病”表示由沙門氏菌感染引起的癥狀，包括發燒、頭 痛、腹瀉和嘔吐，即，由沙門氏菌屬細菌引起的疾病被定義為兩種臨床類型急性敗血癥型 (與傷寒熱類似)和急性腸胃炎，包括腸炎、食物中毒和急性敗血癥。本文所使用的術語“預防”是指包括通過施用所述組合物來抑制或延遲所述疾病 的所有行為。本文所使用的術語“治療”是指包括通過施用所述組合物而使所述疾病好轉 或有所改善的所有行為。本發明的組合物包含5x 102-5xl012pfu/ml 的 OCJ2，優選為 lxl06-lxl01Qpfu/ml。本發明的組合物還可以進一步包含藥學上可接受的載體，并可以與所述載體一起 配制，從而提供食品、藥物和飼料添加劑。本文所使用的術語“藥學上可接受的載體”指不對生物體造成顯著刺激且不消除 所施用化合物的生物活性和特性的載體或稀釋劑。為了將所述組合物配制成液體制劑，可 以使用無菌且具有生物相容性的藥學上可接受的載體，例如鹽水、無菌水、Ringer' s溶液、 緩沖生理鹽水、白蛋白輸注液、葡萄糖溶液、麥芽糖糊精溶液、甘油和乙醇。這些物質可以單獨使用或以其任意組合使用。如果需要，可以加入其它常規添加劑，例如抗氧化劑、緩沖劑 和抑菌劑等。此外，還可以向所述組合物中添加稀釋劑、分散劑、表面活性劑、粘合劑和潤滑 齊 ，從而制備可注射制劑(例如水溶液、懸浮液和乳液)，或者口服制劑(例如丸劑、膠囊、粒 劑或片劑)。本發明的預防性或治療性組合物可以涂覆或噴施到受影響的區域或者通過口腔 或腸胃外途徑施用。所述腸胃外施用可以包括靜脈內、腹膜內、肌內、皮下或外用施用。適合涂覆、噴施或施用本發明組合物的劑量依賴于多種因素，包括配制方法、施用 方式，接收治療的患者或動物的年齡、體重、性別、病情，和施用時間、施用途徑、排泄速率和 反應敏感度。掌握本領域常規技術的醫師或獸醫可以容易地確定所需組合物的有效量并開 具處方。適合本發明組合物的口服劑型的實例包括片劑、錠劑(troches)、糖錠 (lozenges)、水懸液或乳懸液、散劑或粒劑、乳劑、硬膠囊或軟膠囊、糖漿或酏劑。對于諸如 片劑和膠囊的制劑，可使用粘合劑，例如乳糖、蔗糖、山梨醇、甘露 醇、淀粉、支鏈淀粉、纖維 素或明膠；賦形劑，例如磷酸二鈣；崩解劑，例如玉米淀粉或甘薯淀粉；潤滑劑，例如硬脂酸 鎂、硬脂酸鈣、硬脂酰延胡索酸鈉或聚乙二醇蠟。對于膠囊，除了上述化合物外，還可以進一 步使用諸如脂質的液體載體。對于非口服施用，可以將本發明的組合物配制成用于經皮下、靜脈內或肌內途徑 施用的注射劑，配制成栓劑、或經呼吸道施用的噴霧吸入劑，例如氣霧劑。可以通過將本發 明的組合物與穩定劑或緩沖劑一起溶解或懸浮在水中，并將所述溶液或懸浮液分裝在安瓿 或單位小瓶中而獲得注射制劑。對于噴劑，例如氣霧劑，可以將用于噴射水分散濃縮物或濕 粉末的推進劑與添加劑組合使用。本文所使用的術語“抗生素”是指可應用于動物以殺滅病原體的任何藥物，用在本 文中作為防腐劑、殺菌劑和抗菌劑的通用術語。所述動物為包括人在內的哺乳動物。與傳 統抗生素不同，本發明的噬菌體對于沙門氏菌具有高特異性，從而可以殺滅特定病原體而 不影響有益細菌，并且不誘導耐性，因此其生命周期相當長。根據本發明的一個具體實施方案，我們進行了單劑量口服毒性和靜脈內毒性研 究，以及對正常腸細菌的毒性研究，從而評估其在大鼠中的安全性。當以lxl012pfuc5CJ2的 劑量水平進行單劑量口服毒性研究時，沒有明顯的臨床體征或動物死亡(表4和5)。當以 lxl012pfuOCJ2的劑量水平進行單劑量靜脈內毒性研究時，沒有明顯的臨床體征或動物死 亡(表6和7和圖9)。當利用lxlOnpfu/mlOCE的系列稀釋液進行對正常腸細菌的毒性 研究時，發現即使最大劑量的OCJ2也沒有抑制正常腸細菌的生長(表8)，這表明了 Φ 2 具有安全性。此外，當用添加OCJ2的飼料飼養SG感染的雞時，OCJ2-處理組的受保護率顯著 高于非處理組(表9)，這表明Φ 2對SG感染具有預防和治療功效。根據另一方面，本發明涉及包含作為活性成分的所述噬菌體的動物飼料或家畜飲 用水。在漁業和家畜業中使用飼料抗生素添加劑的目的是為了抑制感染，但卻導致細菌 耐性株的增多，并且家畜產品中殘留的抗生素可能被人攝入，從而使人體內病原體產生抗 生素耐性并導致疾病的傳播。此外，由于存在多種飼料抗生素添加劑，多藥耐性株在全球出現的增加是一個嚴重的問題。因此，可以將本發明的噬菌體作為飼料抗生素添加劑使用，其 對生態更為友好且能解決上述問題。可以將本發明的噬菌體單獨制備成飼料添加劑，隨后添加到動物飼料中，或直接 添加到動物飼料中。本發明的噬菌體可以以液體或干燥形式包含在動物飼料中，其中優選 干燥粉末的形式。所述干燥過程可以通過風干、自然干燥、噴霧干燥或凍干而進行，但并不 限于此。基于動物飼料的重量，可以以粉末的形式添加0.05-10重量％，優選0. 1-2重量％ 的本發明噬菌體。除了本發明的噬菌體外，所述動物飼料中還可以包含用于長期保存的其 它常用添加劑。本發明的飼料添加劑還可以包含其它非病原微生物。所述其他微生物可以選自 以下組成的組可以產生蛋白酶、脂肪酶和轉化酶的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)； 具有分解有機化合物的能力并在厭氧條件下具有生理活性的乳桿菌(Lactobacillus sp.)；能夠增加家養動物體重、提高產奶量并有助于飼料消化和吸收的絲狀真菌， 如米 曲霉(Aspergillus oryzae) (J AnimalSci 43:910-926,1976)；和酵母，如釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)(J Anim Sci56 :735_739，1983)。本發明的包含OCJ2的飼料可以包括基于植物的飼料，例如谷物、堅果、食品副產 物、海草、纖維、藥物副產物、油、淀粉、粗粉和谷物副產物；基于動物的飼料，例如蛋白質、礦 物質、脂肪、單細胞蛋白質、浮游動物和食品廢料，但并不限于此。本發明的包含OCJ2的飼料添加劑可以包含粘合劑、乳化劑和防腐劑(用于防止 質量退化)、氨基酸、維生素、酶、益生菌、調味劑、非蛋白氮、硅酸鹽/酯、緩沖劑、著色劑、提 取物和用于提高工藝效率的寡糖以及其它飼料預混料，但并不限于此。此外，提供混合有本發明噬菌體的飲用水可以降低家畜腸內沙門氏菌的數量，由 此獲得不含沙門氏菌的家畜。根據另一方面，本發明涉及包含作為活性成分的所述噬菌體的消毒劑或清潔劑。包含作為活性成分的所述噬菌體的消毒劑可以用作食品消毒劑，從而用于預防食 物中毒。特別地，在食品工業中，其可以用作預防沙門氏菌感染的食品消毒劑或食品添加 齊U，在家畜業中，其還可以用于生產不含沙門氏菌的家畜。為了除去沙門氏菌，所述消毒劑 可以用在污水處理廠，也可以用在家禽舍、屠宰場、污染區域和其它生產設施上，但并不限 于此。此外，包含作為活性成分的所述噬菌體的清潔劑可以涂覆在動物活體的受污染皮 膚、羽毛和其它受污染的身體部分，從而除去沙門氏菌。另一方面，本發明涉及對鼠傷寒沙門氏菌、雞沙門氏菌或雞白痢沙門氏菌具有特 異殺菌活性的噬菌體治療由鼠傷寒沙門氏菌、雞沙門氏菌或雞白痢沙門氏菌引起的傳染病 的方法。另一方面，本發明涉及用于預防或治療由鼠傷寒沙門氏菌、雞沙門氏菌或雞白痢 沙門氏菌引起的傳染病的組合物治療由鼠傷寒沙門氏菌、雞沙門氏菌或雞白痢沙門氏菌引 起的傳染病的方法。可以將本發明的組合物含在藥物制劑中或將其作為動物飼料的成分或含在飲用 水中施用于動物，優選通過將其作為飼料添加劑混入動物飼料中來施用。可以以通常方式通過各種途徑施用本發明的組合物，例如口服或腸胃外途徑，特別是口服、經直腸、外用、靜脈內、腹膜內、肌內、動脈內、透皮、鼻內和吸入途徑。
本發明的治療疾病的方法包括施用藥學有效量的本發明組合物。對于本領域技術 人員顯而易見的是，醫師通過適當的醫學判斷應當可以確定單日總劑量。對于患者來說，治 療有效量可能根據醫學領域熟知的各種因素而變化，包括要獲得的應答的種類和程度；患 者的狀況，例如年齡、體重、健康狀況、性別和飲食；施用時間和途徑、組合物的分泌率、治療 時間周期、根據是否使用其它試劑的具體組合物等。下文將參考以下實施例對本發明進行更詳細的闡述。然而，這些實施例僅出于說 明的目的，本發明并不限于這些實施例。
具體實施方式

實施例1 沙門氏菌噬菌體的分離1-1.噬菌體的篩選和單噬菌體的分離將來自雞屠宰場和排水溝污水的50ml樣品轉移到離心管中，并以4000rpm離心 10分鐘。隨后，利用0.45 μ m濾器過濾上清。將18ml所述樣品濾液與150 μ 1 ST振蕩培 養基(OD6tltl = 2)和2ml的IOXLuria-Bertani培養基(下文稱為LB培養基，蛋白胨10g、 酵母提取物5g、NaCl 10g，終體積為1L)混合。將混合物在37°C培養18小時，并將培養基 以4000rpm離心10分鐘。利用0. 2 μ m濾器過濾上清。將3ml 0. 7%瓊脂(w/v)和150 μ 1 ST振蕩培養基(0D· = 2)混合，并鋪在LB平板上，使其轉變成固體培養基。在其上涂布 10 μ 1培養濾液，并在37°C培養18小時(將0. 7%的瓊脂用作“上層瓊脂”，并在所述上層 瓊脂上進行噬菌體裂解物的滴定，稱為軟瓊脂覆層法)。將含有噬菌體裂解物的樣品培養液稀釋，并與150 μ 1 ST振蕩培養基(0D_ = 2) 混合，隨后進行軟瓊脂覆層法，從而獲得單個噬菌斑。由于單個噬菌斑代表一個噬菌體，為 了分離單噬菌體，將一個噬菌斑加入到400 μ 1 SM溶液(NaCl，5. 8g ；MgSO4 · 7H20，2g ；IM Tris-Cl (pH7. 5), 50ml ;H20，終體積為1L)中，在室溫下靜置4小時，以分離單噬菌體。為了 大量純化噬菌體，從所述單噬菌體溶液中取出100 μ 1上清，并與12ml 0. 7%瓊脂和500 μ 1 ST振蕩培養基混合，隨后在LB平板(直徑為1 50mm)上進行軟瓊脂覆層法。當裂解完成 后，向平板中加入15ml SM溶液。將平板在室溫下溫和振蕩4小時，以從上層瓊脂中洗脫噬 菌體。回收含有洗脫的噬菌體的SM溶液，并加入終體積的氯仿，充分混合10分鐘。將 溶液在4000r pm下離心10分鐘。利用0. 2um濾器過濾所獲得的上清，并貯存在冰箱中。1-2.大批量的噬菌體利用ST大量培養所選擇的噬菌體。振蕩培養STJf 1.5X IOltlCfu(集落形成單 位)的等分試樣在4000rpm離心10分鐘，隨后將沉淀重懸在4ml SM溶液中。在其中接種 7. 5X IO7Pfu (噬菌斑形成單位)的噬菌體(Μ0Ι 感染倍數=0. 005)，在37°C靜置20分鐘。 將所述溶液接種到150ml LB培養基中，并在37°C培養5小時。加入終體積的氯仿，并 將培養溶液振蕩20分鐘。分別加入終濃度為1 μ g/ml的Dnase I和Rnase A。將溶液在 37°C靜置30分鐘。分別加入終濃度為IM和10% (w/v)的NaCl和PEG(聚乙二醇)，并再 在4°C靜置3小時。將所述溶液在4°C以12000rpm離心20分鐘，以舍棄上清。將沉淀重懸 在5ml SM溶液中，并在室溫下靜置20分鐘。向其中加入4ml氯仿，并混合均勻，隨后在4°C 以4000rpm離心20分鐘。利用0. 2 μ m濾器過濾上清，并通過甘油密度梯度超離心(密度40%，5%甘油在4°C以35，OOOrpm離心1小時)純化噬菌體。將純化的噬菌體命名為噬菌 體Φ CJ2，并重懸在300 μ ISM溶液中，隨后進行滴定。噬菌體Φ CJ2于2008年12月17日保 藏到韓國微生物培養中心(361-221，Honje 1，Seodaemun, Seoul)，保藏號為KCCM10976P。實施例2 檢測Φ CJ2對沙門氏菌的感染為了檢測所選噬菌體對其它沙門氏菌種以及ST的裂解活性，利用其它沙門 氏菌種進行了交叉感染的試驗。結果，。CJ2沒有感染SE(腸道沙門氏菌腸炎血清型， Salmonella enterica Serotype Enteritis)、SC (腸道沙門氏菌豬霍舌Lili青型，Salmonella enterica Serotype Choleraesuis)、SD(腸道沙門氏菌德爾卑血清型，Salmonella enterica Serotype Derby)禾口 SA(腸道沙門氏菌亞利桑那亞種，Salmonella enterica subsp. Arizonae)、SB (腸道沙門氏菌邦戈亞禾中，Salmonella entericl subsp Bongori))。 與SG和SP不同，當利用除ST ATCC 14028株以外的其它沙門氏菌種進行交叉傳染的試驗 時，裂解活性為40%或更小。該結果表明OCJ2是特異于SG和SP的噬菌體(參見實施例 11)。所述結果示于下表1中。利用SG作為宿主細胞產生的噬菌體Φ 2具有與利用ST 作為宿主細胞所產生的噬菌體相同 的噬菌斑大小和噬菌斑濁度，以及相同的蛋白譜和基因 組大小。表 1Φ CJ2對沙門氏菌的感染
噬菌斑的形
噬菌斑的形
血清型 菌株名稱血清型 菌株名稱
成成
SGSGSC22930SCATCC 13312X
SPSGSC22950SDSCSG 2467X
STATCC140280SAATCC 13314 X
SESGSC2282XSBATCC 43975X*ATCC 全球生物資源中心(The Global Bioresource Center)*SGSC 沙門氏菌遺傳庫中心(salmonella genetic stock center)實施例3 噬菌體OCJ2的形態檢測利用0.01%明膠溶液稀釋經純化的OCJ2，隨后固定在2. 5%的戊二醛溶液中。將 樣品滴在碳包被的云母板(ca. 2. 5X2. 5mm)上并使其適應10分鐘后，用無菌的蒸餾水洗 滌。將碳膜封裝在銅柵(copper grid)上，并用4%的乙酸鈾酰染色30-60秒，干燥，并在 JEM-1011透射式電子顯微鏡(80kV，放大倍率為X 120，000-X200，000)下觀察。結果如圖 1所示，發現純化的OCJ2具有包括等軸衣殼和非收縮性長尾在內的形態特征，這表明其屬 于長尾噬菌體科的形態型。實施例4 噬菌體OCJ2的蛋白譜分析
利用3 μ 1 5 X SDS樣品溶液處理15 μ 1純化的OCJ2溶液(IollPfuAil滴定度)， 并加熱5分鐘。將OCJ2的總蛋白在4-12% NuPAGE Bis-Tris凝膠(Invitrogen)中進行 電泳，隨后用考馬斯亮藍將凝膠在室溫下染色1小時。如圖2所示，所述蛋白譜顯示觀察到 作為主要蛋白的約40kDa的條帶，同時還觀察到約65kDa、17kDa和15kDa的條帶實施例5 噬菌體Φ CJ2的全基因組DNA大小的分析通過超速離心法從純化的OCJ2分離基因組DNA。具體而言，向純化的OCJ2的培 養液中分別加入終濃度為20mM、50 μ g/ml和0. 5% (w/v)的EDTA(乙二胺四乙酸，pH8. 0)、 蛋白酶K和SDS(十二烷基硫酸鈉)，并在50°C下靜置1小時。加入等量的苯酚(pH8.0)并 混合均勻，隨后在室溫下以12000rpm離心10分鐘。將上清與等量PC(苯酚氯仿=1 1) 混合均勻，隨后在室溫下以12000rpm離心10分鐘。將上清與等量氯仿混合均勻，隨后在室 溫下以12000rpm離心10分鐘。再次向上清中加入1/10體積的3M乙酸鈉和2體積95% 的冷乙醇，并在_20°C靜置1小時。在0°C以12000rpm離心10分鐘后，徹底除去上清，并將 DNA沉淀溶解在50 μ 1 TE (Tris-EDTA, ρΗ 8. 0)中。將所提取的DNA稀釋10倍，并測量其 在OD26tl的吸光度。將Iyg全基因組DNA上樣到1%PFGF(脈沖場凝膠電泳)瓊脂糖凝膠 中后，利用BIORAD PFGE系統程序7 (大小范圍為25_100kbp ；轉換時間梯度(switch time ramp)為0. 4-2. 0秒，線形；正向電壓為180V ；反向電壓為120V)在室溫下進行電泳20小 時。如圖3所示，OCJ2的基因組大小約為43kbp。實施例6 噬菌體Φ CJ2的遺傳分析為了分析純化的OCJ2的遺傳特征，利用限制性酶EcoR V對5μ gOCJ2基因組 DNA進行處理。利用Sma I酶切載體PCL(Promega)，并用CIP (小牛腸堿性磷酸酶)處理。 經酶切的基因組DNA和載體以3 1的比例混合，并在16°C連接5小時。將連接產物轉 化到大腸桿菌DH5 α中。將轉化的細胞涂布在含壯觀霉素和X-gal (5_溴_4_氯_3_吲哚 基- β -D-吡喃半乳糖苷)的LB平板上，以進行藍/白斑篩選，由此選出3個克隆。將所選 克隆在含壯觀霉素的培養基中振蕩培養16小時。隨后，利用質粒提取試劑盒(Promega)提 取質粒。利用Μ13正向和Μ13反向引物對通過PCR確定質粒克隆，并選擇Ikbp或更長的插 入片段，利用Μ13正向和Μ13反向引物對對其序列進行分析。如SEQ IDNOs. 1、2和3所示， 其大小分別為約3. IkbpU. 7kbp和800bp。利用NCBI blastx程序進行序列相似性分析，結 果示于下表2中。如下表2所示，OCJ2的SEQ ID NO. 1的前部分序列顯示與沙門氏菌噬菌體KS7 的BPKS7gp07以及SETP3的包被蛋白具有90%的序列相似性。SEQID NO. 1的后部分序列 也顯示分別與沙門氏菌噬菌體KS7和噬菌體SET3的BPKS7gp04和SPSV3_gp41具有75% 和66%的序列相似性。在SEQ ID NO. 2中，前部分序列顯示與沙門氏菌噬菌體SETP3的假 定蛋白SPSV3_gp02具有91%的序列相似性，后部分序列顯示與沙門氏菌噬菌體SETP3的尾 部組成蛋白具有94%的序列相似性。序列SEQ ID NO. 3也顯示與沙門氏菌噬菌體KS7的 BPKS7gp41和噬菌體SETP3的DNA聚合酶具有69%的序列相似性。通過NCBI blastn程序 對SEQ ID NOs. 1、2和3的堿基序列進行分析，結果顯示與沙門氏菌噬菌體KS7和SETP3具 有60-70%的序列相似性。然而，它們彼此并不完全相同，這表明OCJ2是感染沙門氏菌的 新型噬菌體。表2 與其它噬菌體的序列相似性比較
權利要求
對鼠傷寒沙門氏菌、雞沙門氏菌或雞白痢沙門氏菌具有特異殺菌活性的噬菌體，其屬于長尾噬菌體科的B1形態組，特征為等軸衣殼和非收縮性長尾，其全基因組大小為43kbp，主要結構蛋白大小為40kDa。
2.如權利要求1所述的噬菌體，其中所述噬菌體具有圖1所示的形態。
3.如權利要求1所述的噬菌體，其中所述噬菌體的全基因組包含選自由SEQID NO. 1、 2和3組成的組中的一種或多種核酸分子。
4.如權利要求1所述的噬菌體，其中利用選自由SEQID NOs. 4和5、SEQ ID NOs. 6和 7、SEQ ID NOs. 8和9組成的組中的一對或多對引物對進行PCR后，各PCR產物的大小均為 Ikbp0
5.如權利要求1所述的噬菌體，其中所述噬菌體在pH2. 5-pH 9.0的pH范圍內具有耐 酸性，在37°C -60°C的溫度范圍內具有耐熱性，并具有在60°C持續120分鐘的耐干燥性。
6.如權利要求1所述的噬菌體，其保藏號為KCCM10976P。
7.用于抑制或預防由選自鼠傷寒沙門氏菌、雞沙門氏菌和雞白痢沙門氏菌組成的組中 的一種或多種細菌引起的傳染病的組合物，其包含作為活性成分的權利要求1-6中任一項 所述的噬菌體。
8.如權利要求7所述的組合物，其中由鼠傷寒沙門氏菌引起的傳染病為沙門氏菌病或 沙門氏菌食物中毒，由雞沙門氏菌引起的傳染病為禽傷寒，由雞白痢沙門氏菌引起的傳染 病為雞白痢。
9.如權利要求7所述的組合物，其中所述組合物被用作抗生素。
10.動物飼料或飲用水，其包含作為活性成分的權利要求1-6中任一項所述的噬菌體。
11.消毒劑或清潔劑，其包含作為活性成分的權利要求1-6中任一項所述的噬菌體。
12.權利要求1-6中任一項所述的噬菌體用于治療由選自鼠傷寒沙門氏菌、雞沙門氏 菌和雞白痢沙門氏菌組成的組中的一種或多種細菌引起的傳染病的方法。
13.權利要求7的組合物用于治療由選自鼠傷寒沙門氏菌、雞沙門氏菌和雞白痢沙門 氏菌組成的組中的一種或多種細菌引起的傳染病的方法。
全文摘要
本發明涉及新型的噬菌體，更具體地，本發明涉及對鼠傷寒沙門氏菌、雞沙門氏菌或雞白痢沙門氏菌具有特異殺菌活性的噬菌體，還涉及包含作為活性成分的所述噬菌體的組合物，其用于預防或治療包括由鼠傷寒沙門氏菌引起的沙門氏菌病或沙門氏菌食物中毒、由雞沙門氏菌引起的禽傷寒和由雞白痢沙門氏菌引起的雞白痢在內的傳染病，并涉及包含作為活性成分的所述噬菌體的動物飼料、飲用水、清潔劑和消毒劑。
文檔編號C12N7/01GK101970644SQ200980000318
公開日2011年2月9日 申請日期2009年9月7日 優先權日2008年12月24日
發明者姜寅惠, 崔香, 樸敏兌, 申秀安, 趙英郁 申請人:Cj第一制糖株式會社