一種寡糖分子疫苗的制備方法

專利名稱：一種寡糖分子疫苗的制備方法
技術領域：
本發明涉及一種細菌性抗原的制備方法，具體涉及一種從細菌細胞壁多糖中提取具有免 疫原性寡糖的方法。
背景技術：
早在20多年前，世界上著名的魚病預防專家埃利斯(Ellis， 1998)在他所書寫的《魚 類疫苗》 一書中鄭重指出"由一種稱為革蘭氏陰性，無動力的細菌——產氣單胞菌( Aeromonas)所致的疥瘡病(Furunculosis)是沙門魚最嚴重的疾病之一，在所公開發表的 某些疫苗的效應方面，尤其是那些滅活的全細胞或細胞外產物疫苗越來越引起人們的關注， 但未必令人興奮。"原因是自1942年自魚類疫苗祖先Duff開創疫苗以來，人們曾經歷過組織 懸漿疫苗，滅活疫苗，減毒活菌苗，細菌表面結構蛋白質疫苗與脂多糖疫苗等不同階段的探 索與嘗試，其中大部分則處于模式形式而停留在實驗室研究階段。盡管在歷史上傳統疫苗曾 起到一定的作用，但總體來說，均存在著保護率低，具有毒性或異體反應性，在多數情況下 ，只對某一特定的血清型細菌起反應，而且疫苗用量大，往往需要二次免疫，同時，由于這 些疫苗多為蛋白質，蛋白衍生物或糖蛋白，包括重組疫苗在內，均需要在低溫條件下保存， 極易受各種理化因素的影響而減效或失效，因此，在使用、運輸、保存上帶來許多不便。如 果為減毒活菌苗，還存在著復毒的危險。即從實際意義來說，在我國除草魚出血病毒疫苗( 它是通過將病、死的魚研碎，取之懸漿加熱或福爾馬林處理而成的滅活疫苗)夕卜，尚未有一 種有效的水產動物細菌疫苗在生產中應用。包括常見的，嚴重危害淡水養殖中的產氣單胞菌 ，以及海水魚類病害的罪魁禍首——弧菌屬(Vibrio)病原菌。顯然。傳統上所用的一些產 氣單胞菌疫苗，在種間存在著表面抗原的差異，針對某一種菌的免疫力并非對另一種菌感染 有預防作用，因此，較為理想的疫苗應是在同屬不同種間，不同的血清型間具有共同的抗原 性，起到屬內交叉保護作用——廣譜疫苗。

發明內容
本發明的目的是提供一種寡糖分子疫苗的制備方法，該疫苗可預防多種同類屬細菌引起 的疫病。
本發明的目的通過以下技術方案實現；
3(1) 大規模細菌培養
將單一個純的菌落自固體培養基上轉種于適當量的液體培養基中，再將其逐級轉種至各 種大體積的液體培養基中，在適當的溫度與時間進行培養；
(2) 收集細菌細胞
用低溫高速離心將細菌從懸液中沉淀下來；
(3) 破裂細菌細胞
將細菌沉淀物，用EDTA將細胞破解，使胞漿內容物與胞壁分離；
(4) 提取細菌細胞壁脂多糖 首先用熱水將苯酚結晶配成一定濃度，并將胞壁溶液稀釋，與等量苯酚溶液
混合；隔水加熱，間隔旋轉震蕩；然后置于冷環境中兩小時，使水相與酚相分離，分別 收集水相與酚相脂多糖粗制品；
(5) 回收菌細胞壁脂多糖 兩相脂多糖粗制品分別裝在分子量2000道爾頓的透析袋內，先經流動自來水透析，然后
，再將之置于蒸餾水透析，其間不斷更換蒸餾水，透析后的脂多糖粗制品濃縮回收；
(6) 去蛋白與核酸
剩余的少量蛋白質、核酸、脫氧核糖核酸，經蛋白酶、核酸酶、脫氧核糖核酸酶將之消 化；經反復低溫超速離心，可使脂多糖的蛋白與核酸含減少至最低程度；
(7) 去除類脂A
用強酸、強堿溶液交替加熱處理以及使用電化學方法使類脂A分子去除；
(8) 提取具有免疫原的寡糖分子 用現代分子生物學和免疫化學的方法，從多糖中分離出具有特異性高、抗原性強的寡糖
分子，再將其回收、濃縮、真空冷凍干燥。
寡糖分子疫苗的研制是基于革蘭氏陰性細菌細胞壁核心多糖的寡糖部分，在同一屬菌的 不同種中具有共同抗原成分，它既有種的特異性又有屬的特異性的原理，這一點在以該寡糖 分子作為免疫原制備的單克隆抗體與分子生物學的免疫轉印技術加以證實。本技術發明涉及 到幾乎所有的致病性革蘭氏陰性細菌，包括弧菌(Vibrio)、氣單胞菌(Aeromonas)、沙 門氏菌(Salmonella)、埃希氏菌(Ecsherichia)、志賀氏桿菌(Shigella)、假氣單胞 菌(Pseudomonas)、愛德華氏菌(Edwarseilla)、耶爾森氏菌(Yersinia)、空腸彎曲菌
(Campylobacter)、 屈撓桿菌(Flexibacter)、 軍團菌(Legionella)、 奈瑟氏球菌( Neisseria)、巴斯德氏菌(Pastuerella)、博代氏桿菌(Bordetella)、變形桿菌(Prodeus)等。
其理論依據與實驗發現在于用革蘭氏陰性細菌的脂多糖(由"0"菌體多糖、核心多糖 與類脂A三個部分組成)作為免疫原致敏的小白鼠B淋巴細胞與同系小鼠的骨髓瘤細胞進行雜 交所產生的單克隆抗體，具有該屬菌所屬的種于屬的特異性。其意義在于取自某一特定種細 菌的寡糖作為免疫原而產生的抗體，可與同屬的其他任何種間細菌起反應，在實際應用起到 廣泛交叉保護作用。體外中和試驗與細胞吸附抑制試驗均證明了該抗體能有效地中和細菌對 細胞的治病作用與細菌對易感細胞的吸附作用，這種免疫保護作用最后經動物試驗得到進一 步的證實。
寡糖分子疫苗與其它任何傳統上的疫苗不同表現在以下幾個方面
1、 來自核心多糖，具有種與屬特異性，在免疫保護上不受地方流行菌株或不同血清型 的影響。
2、 非致病性菌與致病性菌的核心多糖的寡糖具有的抗原特異性相同，因此，用非致病 性菌制備的疫苗可用于預防致病菌的感染，因而使之更加安全可靠。
3、 抗原性極為穩定不受外界與內在因素的影響而使之減效或失效，這與那些本質為 蛋白質或多肽的疫苗因運輸或保存的關系而致使蛋白變性進而失去免疫原性成鮮明的對比。
4、 不像其它減毒、滅活或懸漿疫苗那樣，有復毒、減毒不完全或過敏反應的危險。
5、 實用性廣從劑型上說，可以制成注射劑、浸泡型、口服型、膠囊劑等劑型，還可 以于飼料摻在一起，或直接溶解到水中，讓魚浸泡其中。應用范圍方面，包括海水魚類的石 斑魚、鯛魚、艫魚、沙門魚、虹鱒魚；淡水魚類的甲魚、桂花魚、鰻魚；甲殼類的螃蟹及觀 賞魚類的錦鯉、金魚等。
6、 在其它動物的應用寡糖來自革蘭氏陰性細菌，由該組細菌引起的疾病，寡糖疫苗 均能起到保護作用，如大腸桿菌、沙門氏菌所致的幼豬腹瀉、雞瘟等。
本發明寡糖疫苗的突出特點表現在以下幾個方面
(一) 用量少、生效快、效果佳、維持時間長傳統上疫苗的用量各有不同， 一般為毫 克水平，而本寡糖分子疫苗用量均在微克水平以下，免疫后7天可測出血清抗體水平，14天 后出現明顯的保護作用，4周達到高峰； 一次免疫可維持一年以上。
(二) 無副作用，無毒性由于本身為寡糖成份，無蛋白質、核酸或脂類等有毒物質污 染，首先對動物無不良反應，也無殘留物質對人類或其他動物產生影響。
(三) 保存、運輸、使用方便在不需要任何特殊設備條件下，該產品可在室溫中保存 五年或更長。加上該疫苗為高濃度、高純度、重量輕、體積小的凍干品，并且包裝精致，不
5因冷熱或強烈撞擊而破壞其化學結構或生物活性。在推廣應用上易為用戶所接受。
具體實施例方式
(一) 大規模細菌培養
所有細菌菌種為標準菌株，均來自美國模式菌種收藏所(American Type Culture Collection ATCC)。
由于寡糖來自于細菌細胞壁多糖，作為批量生產，每批至少需要50g濕重的細菌才足夠 提取用。首先將單一個純的菌落自固體培養基上轉種于適當量的液體培養基中(以感染海水 魚類的弧菌為例，需要海水營養培養基)，再將其逐級轉種至各種大體積的液體培養基中， 經在適當的溫度與時間(因不同細菌所要求的生長溫度與時間不同)進行培養。
(二) 收集菌細胞
用低溫高速離心(BECKMAN J2-HS低溫高速離心機)的方法將細菌從懸液中沉淀下來。
(三) 破裂菌細胞
經用低溫高速離心沉淀下來的細菌沉淀物，再用乙二胺四乙酸(EDTA)化學方法將細胞 破解，使到胞漿內容物與胞壁分離。
(四) 提取細菌細胞壁脂多糖
1、 苯酚-熱水法
首先用熱水將苯酚結晶配成一定濃度，并將細菌沉淀物稀釋，然后與等量苯酚溶液混合
2、 加熱處理法
隔水加熱，間隔旋轉震蕩，可間歇采用超聲粉碎法，以加速細菌細胞壁的裂解；
3、 冷處理法
經熱處理與震蕩后的混合物置于冷環境中兩小時，使水相與酚相分離，分別收集水相與 酚相脂多糖粗制品。光滑型菌落與粗糙型菌落的細菌脂多糖分別存在于水相與酚相中。對那 些典型的粗糙型菌落細菌，可用氯仿提取脂多糖。
(五) 回收菌細胞壁脂多糖
1、 加強透析去酚法
兩相脂多糖粗制品分別裝在分子量2000道爾頓的透析袋內，先經流動自來水透析，然后 ，再將之置于蒸餾水透析，其間不斷更換蒸餾水
2、 濃縮脂多糖粗制品
透析后的脂多糖粗制品體積相當大，從50g濕重的細菌所提取的500mg脂多糖粗制品的體積達1000-1500ml。該溶液可經熱處理、冷凝聚、蒸發、真空等技術將大體積的水相脂多糖 粗制品濃縮回收，以便進一步的加工處理。
(六) 去蛋白與核酸
1、 蛋白酶、核酸酶處理法
苯酚、熱處理后的脂多糖粗制品，大部分蛋白質、核酸已失去活性或被去除，剩余的少 量蛋白質、核酸、脫氧核糖核酸，可經蛋白酶、核酸酶、脫氧核糖核酸酶將之消化；
2、 低溫超速離心法
在經反復低溫超速離心(BECKMAN 0PTIMALE-80低溫超速離心機)的條件下，可使脂多 糖的蛋白與核酸含量減少至最低程度。
(七) 去除類脂A
類脂A除它特有的內毒素的毒性基因外，本身不具有種或屬的特異性，應將之加以清除 。用強酸、強堿溶液交替加熱處理以及使用電化學方法可使類脂A分子去除。此時的脂多糖 已不再是一個完整的大分子組分，而是不含類脂A的多醣體。
(八) 提取具有免疫原的寡糖分子 用現代分子生物學和免疫化學的方法，如聚丙烯酰胺凝膠電泳、免疫吸附技術從多糖(
已去類脂A)中分離出具有特異性高、抗原性強的"核心多糖"中的寡糖分子，再將其回收 、濃縮、真空冷凍干燥，以便于保存、運輸與使用。
(九) 寡糖分子疫苗的純度、濃度及化學組分的測定與分析 該部分操作與分子生物學的十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，光學的紫外分光光度
測量(波長與透光率、光密度)以及氣相液相色譜分析有關。 (十)免疫效應與無毒性試驗
按經典的疫苗測試方法，經動物接種該疫苗一定時間后，通過人工攻毒的方式加以證實 ，并通過方陣滴定測出最佳的有效疫苗劑量。而毒性試驗包括體外的細胞病變與體內試驗， 經反復多次試驗無毒性反應，無副作用后方可推廣與臨床應用。
實施例一 實驗室效果
1、小白鼠試驗
純系Balb/c，雌性，6-8周齡，體重15-20g，共80只，分五組，其中四個組分各分別接 受弧菌屬四個不同種疫苗，如鰻弧菌、溶藻弧菌、霍亂弧菌、冷水弧菌寡糖分子疫苗腹腔內 注射0.2ml/只其中含寡糖0.25yg。另一組注射同量生理鹽水作對照，在免疫28后，每只小 白鼠口服0.5ml含6.8Xl(/霍亂弧菌活菌液、6小時后，對照組動物出現豎毛、動作遲鈍、大
7便稀爛，有81%在48小時內死亡，而接受免疫各組總共64只動物有遲鈍，大便稀爛外，其余 均外觀正常，全部存活。 2、魚類實驗
(1) 寵物金魚取遺傳均一，體重8-10g/尾，身長5-6cm的金魚90尾，分為
五組，其中四個組分別接受嗜水氣單胞菌、殺蛙氣單胞菌、溫和氣單胞菌和鰻弧菌寡糖 分子疫苗尾腹腔內注射O. lml/尾其中含寡糖0. 125y g。其余的一組注射等量生理鹽水做對照 。28天后，各自接受0.2ml含6.6X107嗜水氣單胞菌腹腔內攻毒，對照組在注射活菌后首先 出現眼球，肌肉出血，繼而脫鱗，75%在48小時內死亡，而試驗組只有4尾有出血現象，但 100%能存活至二周。
(2) 彩虹鱒魚自淡水孚化場，取遺傳均一，體重25-30g/尾，身長10-12cm， 共60尾，分三組，二個試驗組分別接收鰻弧菌、溶藻弧菌寡糖分子疫苗腹腔內注射
0. lml/尾其中含寡糖0.25yg。對照組注射等量生理鹽水。28天后，每尾魚接受O. 5ml含9X 107鰻弧菌活菌液腹腔內注射。鰻弧菌疫苗與溶藻弧菌疫苗組的存活率分別為90%和85%，而 未接受免疫組在攻毒后24小時出現明顯的弧菌病(vibriosis) ， 80%在兩周內死亡。
(3) 甲魚將同來源、同批號、體重100-150g/只的甲魚90只分成五個組，每 組18只。其中四個組分別接受嗜水氣單胞菌、殺蛙氣單胞菌、溫和氣單胞菌和鰻弧菌寡
糖分子疫苗腹腔內注射O. 2ml/只其中含寡糖0. 25 y g。其余的一組注射等量生理鹽水做對照 。28天后，各自接受0.2ml含6.6Xl()7嗜水氣單胞菌腹腔內攻毒。發現鰻弧菌寡糖疫苗免疫 和生理鹽水對照組在24小時后全部出現不同程度的病征，48小時后該兩組各有6只死亡，另 有6只處于瀕死狀態，72小時后總死亡數達31只。然而，接受嗜水氣單胞菌、殺蛙氣單胞菌 與溫和氣單胞菌三種寡糖疫苗免疫組，在72小時內，僅有4只有明顯病征，其中兩只在96小 時后死亡，其余的甲魚均存活到兩周。
(4) 石斑魚類自然捕撈經觀察一周的石斑魚，體重20-30g/尾，身長10cm左
右，共350尾，分五個組。分別接受鰻弧菌、冷水弧菌、霍亂弧菌和溶藻弧菌寡糖分子 疫苗腹腔內注射0.2ml/尾，其中含寡糖疫苗0.25yg。對照組注射等量生理鹽水。28天后用 0. 5ml含7. 6 X 107鰻弧菌活菌液腹腔內注射。24小時后對照組多數出現嚴重的弧菌病病征， 在兩周后，只有30%存活。而盡管免疫各組也有不同程度的弧菌病發生，但其二周后的存活 率分別為鰻弧菌疫苗免疫組85%，冷水弧菌疫苗免疫組88%，霍亂弧菌疫苗免疫組81%和溶藻 弧菌疫苗免疫組78%。在病征上，非免疫組體表、翅、腮出血、潰爛，嚴重者可見椎骨外露 ，解剖可見內臟器官液化。對比之下，接受疫苗免疫組盡管也有少數魚出現病變，但起病時間較晚，病狀較輕微，有逐漸康復的傾向。
(5)甲殼類(鋸緣青蟹)受疫苗免疫保護組與非免疫保護組接受鰻弧菌、溶
藻弧菌攻毒后72小時的存活率分別為83. 6%與25%， 一周后分別為66. 6%與0
經大量的實驗室反復在多種動物、魚類、甲殼類上進行研試證明，寡糖分子疫苗具有良 好的保護作用，無不良反應，且在同屬不同種間具有廣泛交叉保護反應。
實施例二田間使用效果
1、在預防甲魚細菌性疾病的應用
在廣東省海洋與水產廳的大力支持與汕尾市陸河縣水產局的協助下，首先于1997年5月 至1998年6月在陸河縣進行大量的大田試用。該縣為廣東省較早開展大規模人工溫泉養殖甲 魚的幾個縣之一。由于長年恒溫，養殖年限長、土質、水質下降，日趨高密度集養，加之種 苗來源的多樣性，導致細菌性傳染病越來越重，其嚴重程度可在短暫的二、三周內毀掉上百 畝大小規模的養殖場。特別是在96-97年度，多數養殖場的甲魚存活率普遍低于60%，相當部 分在40%左右，甚者"全軍覆沒"。可見，甲魚產量低，質量差，加之市場價格不穩定，給 養殖業帶來嚴重的經濟損失。基于上述緣故，選擇陸河縣作為試驗基地，進行反復多次大規 模的田間試驗，過程如下
選擇同一來源的種苗，體重介于50-150g之間試驗前，連續嚴密觀察一周以上(其甲 魚苗自外地購入時5g左右，已在當地小池養2-3個月)，確認體健無病，再將之隨機分組。 根據水池面積大小。決定放養甲魚數量，原則上，6-8只/m2，水深度80cm，透明度約為20cm ，水溫控制在28-3(TC之間。本試驗設有一次和二次免疫組以及試驗對照與天然對照組。免 疫方法為每只甲魚腹腔內注射O. lml含O. 25y g寡糖分子疫苗。而二次免疫注射組在第一次免 疫注射一個月后，再重復一次。試驗對照組用無菌生理鹽水代替寡糖分子疫苗腹腔內注射同 量溶液。
在最初免疫的四個月內，除對照組有零星甲魚發病以及少數死亡外，接受免疫注射的各 組均未發現病或死魚。這可能與發病季節尚未來到有關。然而，四個月后，對照組的發病數 逐日增加，隨之死亡數也增高，下表為各組不同時間存活率比較。
表l寡糖分子疫苗免疫后不同時間存活率比較(％)組別 免疫后月數
四 五 六 七至八
一次免疫 93 91 90 87
......:次免疫 96 94 93 91
試驗對照 77 52 47 42
上述結果表明，在免疫注射八個月后，免疫保護率分別為87%與91%，而且可維持達一年 之久(見陸河縣水產局匯報)。 一次免疫與二次免疫在保護率上沒有明顯差別；但免疫組與 對照組有顯著差異。此后，該場曾一次性大面積應用該疫苗免疫注射12，000只來源不同，體 積偏小的甲魚(30-50只)，自1997年5月使用，到1998年底收獲上市，各池的存活率均在 80%以上，高者達85%;遠遠高于其他非免疫組平均50%的存活率水平。順德一農戶一次性 給24，000只甲魚免疫注射該疫苗，盡管他并沒有具體記錄、分析，但從放養同等甲魚數量魚 池的絕對死亡數量來看，未接種疫苗組的死亡數為注射疫苗組的二倍或以上。
在病變觀察與病理解剖上，當甲魚受產氣單胞菌感染時，各自魚池捕捉一定數量的魚作 觀察比較，自然對照組的400只甲魚中，有明顯病變的為212 (53%)，試驗對照組的421只中 有191只(45%)有明顯病變，單一次免疫組的476只有90只(19%)有輕微病變，和二次免疫 組的514只有103 (20%)有可見病變。盡管一次或二次免疫組的甲魚也有可見病變，但在病 變的嚴重程度上，對照組要比免疫組嚴重得多。前者在明顯潰爛或穿孔(多發性)的情況下 ，5-7天內死亡，而免疫組，即使有病變，但多較輕微，大部分能生存下來。從外表觀察所 見的病魚，有脖子紅腫、腐皮、潰瘍、穿孔、出血、底板紅腫、肝、腎腫大，可見斑點狀， 腮腺出血，嚴重潰爛，進一步細菌學分離、培養和鑒定，確認為嗜水氣單胞菌。取新鮮分離 的純培養物，經無菌生理鹽水稀釋后，分別給小白鼠與金魚腹腔內注射，24小時后，可見金 魚注射部位周圍首先出現典型的產氣單胞菌所致的癤病、脫鱗、出血、漬爛等，在48小時內 死亡，而小白鼠出現豎毛、行動和反應遲鈍等內毒素所致的一系列癥狀。
2、在預防鋸緣青蟹弧菌病中的應用
試驗基地位于珠海市南水鎮，鋸緣青蟹苗由珠海市南水鎮種養殖珠海三角增殖護養海區 提供。平均體重50g，平均甲寬2.5cm，裝于尼龍網箱浸泡海水中運輸，健康狀況基本良好。 放養前水體經生石灰75kg/畝消毒、投喂飼料為幼蛤，隨著幼蟹的生長可改喂小雜魚。 一般 每5-7天換一次水，以新舊各半對換。鰻弧菌、溶藻弧菌與創傷弧菌寡糖分子疫苗(簡稱弧菌混合疫苗)均為該發明技術的產品，并由發明人給予技術操作指導。
免疫方法大田試驗的鋸緣青蟹苗1000只，分批放在盛有10mg/L的弧菌混合疫苗尼龍袋 中(稀釋疫苗用的溶液為海淡比l: 1)，沖氧浸泡作用30min，放置海田養殖。另設有六個 組，每組20-30只，分別由六個籠子組成，即不同疫苗濃度A、 B組；不同免疫浸泡時間C、 D 組；加疫苗但不加壓充氧E組和加壓充氧但不加疫苗F (非免疫)組對照。另外，同期購進而 未加任何處理的蟹苗為天然對照。
加壓充氧浸泡免疫法(充氧壓力1.5磅/m3):
A、 不同疫苗濃度組，A和B組分別為含弧菌混合疫苗10mg和20mg/L，將各組蟹苗與相應 濃度疫苗混合，盛于充氧尼龍袋中，加壓作用30min，然后放到相應的籠子里。
B、 不同免疫浸泡時間C和D組分別為含弧菌混合疫苗濃度為10mg/L浸泡作用20和30min不 等。經加壓充氧浸泡免疫后的各組蟹苗放養于各自的籠子里。
C、 由專人負責該項工作，包括喂養、管理、標本收集、病情、死亡記錄及試驗報告。 試驗結果表明，寡糖分子疫苗通過浸泡免疫對幼蟹提供相當明顯的保護作用(見表2)
。在接受免疫的1130只平均體重50g的幼蟹中，經過8周的養殖觀察比較，直至上市，免疫組 的生存率為99%，而對照組與天然對照組，包括同一養殖區其他養殖戶的比較，其養殖成活 率普遍低于30%，與文獻報導相符。在擴大試驗中， 一共浸泡免疫平均體重5-50g不等的幼蟹 S800只，放養在二個面積分別為3-4畝的海田里。收獲時總存活率65%。本應用以探討的方式 介紹寡糖分子疫苗浸泡免疫操作方法，免疫保護效果，體液免疫水平檢測，對攻毒的反應， 病變的發生、發展與結局，病原菌的分離、培養和鑒定以及病理分析等研究結果。
蟹的生長情況免疫試驗8周過程中，免疫組的螃蟹攝食、活動活躍、體表色澤光滑， 體重增長快，相反，非免疫組體表粗糙，體表色素沉著，攝食能力差，生長緩慢。
表2各試驗對照存活率比較
分組A10mg/L B20mg/LC20' D30'EF Omg/L
處理30'10mg/L不充氧壓力充氧壓力
存活20Z20 20/2020/20 20Z2019Z2023/30
活率％100 100100 1009577
存活率比較大田試驗、不同浸泡時間、不同濃度的免疫組螃蟹一共1130只，除8只于 免疫后一周死外，其余1122只存活至試驗結束，存活率達99%。而其他所有對照組的總死亡 率高達70%。
11病蟹的基本表現首先為攝食反應遲鈍、活動障礙，繼而出現關節紅腫，趾、足脫落而 死亡，漂浮于水面。
病理解剖體液為黃膿色，肉質、結構破壞、鰲足骨髓空洞形成、液化，嚴重者可累及甲冗。
體液免疫檢測分別抽取免疫與非免疫組螃蟹鰲足髓液體與鰻弧菌、溶藻弧菌懸液進行 玻片凝集反應，兩者的凝集效價分別為l: 16和1: 4。
攻毒試驗浸泡免疫組與非免疫組螃蟹各12只，每組再分為兩個小組，即每小組6只。 各自接受新鮮傳代的2XLD50鰻弧菌、溶藻弧菌(5. 5X106/ml與2. 7X106/ml)浸泡10min作 為攻毒試驗，并另設空白對照。每天早晚觀察結果，連續7天。非免疫組浸泡攻毒后24、 48 、72、 96小時的存活率分別為83. 6%， 50%， 25%，和0%。而免疫組攻毒后24、 48、 72、 96、 120、 144小時的存活率分別為100%、 91.6%、 83.6%、 83.6%、 66.6%、 66.6%。
病變的發展結局螃蟹受弧菌感染后，其表現與魚類不同，沒有脫鱗、糜爛、出血、肌 肉壞死等癥狀，而是關節紅腫，趾、足脫落，接著死亡。此時，如打開甲殼可見體內實質部 分液化、惡臭。
病原菌的分離和鑒定自瀕死的螃蟹體內或鰲足髓液中取樣，接種于海水瓊脂平板或弧 菌鑒別培養基TCBS上，經25。C培養18小時，可見直徑2mm，表面光滑、邊緣整齊、凸起的菌 落。在TCBS上為橙黃色。初步說明分離菌屬于弧菌，進一步的FITC-免疫熒光單克隆抗體檢 測被鑒定為鰻弧菌。
病理分析根據病理解剖所見，病死蟹體內有大量黃色膿液，肉質、結構破壞，可認為 弧菌短期內過度生長、繁殖，產生大量內、外毒素，如類脂多糖、溶血素等。這些毒素可使 蟹基底組織結構破壞、液化、空洞形成，最后導致死亡。
3、在石斑魚中的應用
在魚苗接受免疫注射后的二周內，各組魚均有紅鰭、紅尾、紅嘴、脫鱗現象，每天可發 現l-2尾死魚，而且符合弧菌病的表現。此后，兩組受免疫的魚絕對死亡數開始下降，趨向 穩定，而兩個對照組的發病數量不斷增加，病情逐日加重，死亡數依然不斷增長。其結果詳 細記錄如下
(1)免疫試驗組甲(IOOO尾)
經免疫注射后一個月，存活率95% (950/1000)，兩個月為94. 7% (947/1000)，三個月 為94. 5% (945/1000)，四個月為94. 1% (941/1000)，五個月為93. 7% (937/1000)和六個 月后為93. 5% (935/1000)。(2) 免疫試驗乙(500尾)
經免疫注射后一個月，存活率94. 4% (472/500)，兩個月為92. 6% (463/500)，三個月 為91.8% (459/500)，四個月為90. 2% (451/500)，五個月為88% (440/500)和六個月后為 86.4% (432/500)。
(3) 對照組(試驗對照組及天然對照組，共500尾) 兩個對照組的存活率很相近，但明顯低于試驗組。六個月后，其存活率不足25.2% (
126/500)，而一至五個月的存活率分別為63. 6% (318/500) ， 54.2% (271/500) ， 41.6% ( 208/500) ， 31.2% (156/500)和28. 2% (141/500)。
病變與病理觀察在檢査各組病魚中發現，對照組一旦發病，病情往往比較嚴重，從脫 鱗、漬瘍、肌肉腐爛以及骨質破壞，多在數天內死亡。而注射疫苗組即使發病，其發病過程 比較慢，病情相對較輕，大多在急性發病后逐漸得到恢復，而極少有爛身、爛骨頭的情況。 取不同發病階段病魚行病理解剖，可見內臟充血、出血，血性腹水。組織壞死，肝、腎等重 要器官嚴重損害。
1權利要求
1.一種寡糖分子疫苗的制備方法，包括以下步驟(1)大規模細菌培養將單一個純的菌落自固體培養基上轉種于適當量的液體培養基中，再將其逐級轉種至各種大體積的液體培養基中，在適當的溫度與時間進行培養；(2)收集細菌細胞用低溫高速離心將細菌從懸液中沉淀下來；(3)破裂細菌細胞將細菌沉淀物，用EDTA將細胞破解，使胞漿內容物與胞壁分離；(4)提取細菌細胞壁脂多糖首先用熱水將苯酚結晶配成一定濃度，并將胞壁溶液稀釋，與等量苯酚溶液混合；隔水加熱，間隔旋轉震蕩；然后置于冷環境中兩小時，使水相與酚相分離，分別收集水相與酚相脂多糖粗制品；(5)回收菌細胞壁脂多糖兩相脂多糖粗制品分別裝在分子量2000道爾頓的透析袋內，先經流動自來水透析，然后，再將之置于蒸餾水透析，其間不斷更換蒸餾水，透析后的脂多糖粗制品濃縮回收；(6)去蛋白與核酸剩余的少量蛋白質、核酸、脫氧核糖核酸，經蛋白酶、核酸酶、脫氧核糖核酸酶將之消化；經反復低溫超速離心，可使脂多糖的蛋白與核酸含減少至最低程度；(7)去除類脂A用強酸、強堿溶液交替加熱處理以及使用電化學方法使類脂A分子去除；(8)提取具有免疫原的寡糖分子用現代分子生物學和免疫化學的方法，從多糖中分離出具有特異性高、抗原性強的寡糖分子，再將其回收、濃縮、真空冷凍干燥。
全文摘要
本發明涉及一種從細菌細胞壁多糖中提取具有免疫原性寡糖的方法，具體包括以下步驟大規模細菌培養，收集細菌細胞，破裂細菌細胞，提取細菌細胞壁脂多糖，回收菌細胞壁脂多糖，去蛋白與核酸，去除類脂A，提取具有免疫原的寡糖分子。該寡糖疫苗具有種與屬特異性，在免疫保護上不受地方流行菌株或不同血清型的影響，安全可靠，抗原性極為穩定，用量少、生效快、效果佳、維持時間長、實用性廣等優點。
文檔編號C12R1/185GK101596313SQ200910304328
公開日2009年12月9日 申請日期2009年7月14日 優先權日2009年7月14日
發明者陳德勝 申請人:李子定