專利名稱：一種動物干擾素的制備方法
技術領域：
本發明屬于動物醫藥領域，特別涉及一種制備動物干擾素的方法。
背景技術：
雞病毒性疾病仍是當前嚴重制約養雞業健康發展的主要傳染病。而傳統的傳染病治療方案臨床上有時難以湊效，尤其針對病毒病辦法不多。雞病毒性疾病至今尚無有效的治療藥物和治療方法。近年來曾經有人進行過用中草藥制劑預防和治療雞病毒性疾病的試驗，但治愈率較低。抗生素及磺胺類藥物基本無效。目前，雞干擾素是治療雞病毒性疾病的有效藥物。存在的問題是在雞干擾素的生產中使用常規用雞新城疫病毒(NDV)誘導雞脾白細胞產生干擾素含量較低，但沒有人用仙臺病毒作為干擾素誘導劑。另外采集無菌雞脾比較困難。黃芪多糖是一種具有新型免疫調節作用物質，能刺激人體免疫系統的功能，誘生和促生干擾素產生，也是一種的雞脾淋巴細胞調節素。黃芪多糖具有增強免疫力、 抗腫瘤、抗病毒、抗放射、保肝、催眠等廣泛的藥理活性，能誘生與促誘生人血細胞產生干擾素-a(IFN-a)，干擾素_r(IFN_r)，雞脾淋巴細胞介素-2(IL4)，雞脾淋巴細胞介素-6(IL-6)，腫瘤壞死因子-a(TNF-a)，與粒一巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)等多種細胞活性因子。黃芪多糖是一種新型的生物反應調節劑，具有間接抗病毒、抗腫瘤作用。但有關利用仙臺病毒和黃芪多糖作復合干擾素誘導劑高效制備干擾素的方法目前還未見報道。因此，提供一種簡單工藝方法生產含量高、制備成本低的高效生產動物干擾素的方法，是該技術領域科研人員急需開發的新課題之一。
發明內容
本發明的目的在于克服上述技術中的不足之處，提供一種動物干擾素的制備方法。為實現上述目的本發明所采用的技術方案如下一種動物干擾素的制備方法，具體實施步驟如下(1)無菌采取實驗雞脾臟，用脾臟制備淋巴細胞懸液，加入10μ g/ml卡那霉素，用配置好的培養液稀釋淋巴細胞懸液，使雞脾淋巴細胞濃度稀釋為每ml含IXIO5-IXIO7 ；；(2)對淋巴細胞單層進行傳代培養；(3)雞脾淋巴細胞中加入少量干擾素，使其最終濃度為100-1000IU/ml，于37°C水浴培養0. 5-2小時；(4)再加入黃芪多糖，使其最終濃度為25-100μ g/ml，于37°C水浴培養1_2小時；(5)然后在上述雞脾淋巴細胞懸液中再加入適量干擾素誘生劑仙臺病毒，使其最終濃度為128-1280血凝單位/ml，37°C搖床培養18- 小時；
(6)待干擾素達到高峰值時，離心收集上清，加入鹽酸調至pH2. 0,4. 0°C，放置1_4 天，滅活病毒，再加NaOH調至pH 7. 0，即得粗制動物干擾素。本發明的有益效果是雞基因工程干擾素具有制備成本高，在臨床推廣中受到很到限制。本發明利用雞脾制備動物干擾素的方法其具有很多優點生產工藝簡單、制備成本低，療效好。常規用NDV-F誘導雞脾淋巴細胞產生干擾素含量低。本發明在仙臺病毒誘導干擾素過程中加入黃芪多糖，顯著提高利用雞脾制備動物干擾素的含量，顯著降低了藥物的成本。本產品注入雞機體后，具有療效好、安全可靠、用量低、無毒副作用和成本低等優點。
具體實施例方式以下結合實施例，對依據本發明提供的具體實施方式
詳述如下實施例1一種動物干擾素的制備方法的具體步驟如下(1)雞脾淋巴細胞制備無菌采取實驗雞脾臟，用脾臟制備淋巴細胞懸液，加入10 μ g/ml卡那霉素，用配置好的培養液稀釋淋巴細胞懸液，使雞脾淋巴細胞濃度稀釋為每ml含1X106。雞脾淋巴細胞的分離應在采集后48小時內進行。活細胞數應達到90%以上。并對淋巴細胞單層進行傳代培養；使雞脾淋巴細胞濃度稀釋為每ml含1X106。雞脾淋巴細胞的分離應在制備后 48小時內進行。活細胞數應達到90%以上。(2)誘生病毒采用仙臺病毒，血凝效價達到適宜滴度方可投產。(3)培養液采用細胞培養基RPMI-1640，內含5_10%牛血清和10 μ g/ml卡那霉素或慶大霉素，也可用其它適宜培養液。(4)生產用原水應符合飲用水標準，直接用于制品的水應符合注射用水標準。(5)粗制干擾素的制備工藝(5. 1)誘生病毒的制備采用9-10日齡健康雞胚，于每胚的尿囊腔內接種適量仙臺病毒，37°C培養48-72 小時，雞胚發育良好，病毒達到適宜滴度后，收集尿囊液，并做無菌試驗，檢驗合格后合并， 抽樣做效價測定，放-20°C待用；(5. 雞脾淋巴細胞懸液用離心法分離血漿，吸取雞脾淋巴細胞層，然后用步驟(3)中配置的培養液稀釋， 以每ml含5X106為宜；(5. 3)起動與誘生雞脾淋巴細胞懸液中加入少許干擾素，使其最終濃度為600IU/ml，于37°C水浴培養0. 5小時，再加入黃芪多糖，使其最終濃度為100 μ g/ml，于37°C水浴培養1. 5小時；(5. 4)再加入IOM血凝單位/ml仙臺病毒進行誘生，待干擾素達到高峰值時，收集上清，將上清經酸化和中性化后滅活病毒，即為粗制動物干擾素；(5. 5)待干擾素達到高峰值時，離心收集上清，加入鹽酸調至pH2. 0，4. 0°C，放置2天，滅活病毒，再加NaOH調至pH7. 0,即得粗制動物干擾素；(5. 6)離心收集上清即得粗制干擾素，放-20°C保存；(5.7)留樣分別作無菌試驗、余毒試驗及安全檢驗，并以微量法滴定干擾素效價。通過此法制備的雞粗制干擾素共1次，2個批號，獲得了高產量干擾素，平均效價為 21600IU/ml。不加入黃芪多糖的常規誘生組干擾素平均效價低于8450IU/ml。干擾素效價測定采用CPE (細胞致病效應)抑制為基礎的抑制微量測定法，以每 ml干擾素檢品的最高稀釋度仍能保護半數細胞人羊膜細胞Wish細胞(50)免受水泡性口腔炎病毒攻擊的稀釋度的倒數定為干擾素單位。以國際單位(IU)表示，并用國家標準品校正結果。半成品和成品的檢驗半成品檢定半成品進行細菌內毒素、無菌檢查、PH值等項檢測。成品檢定成品分別作干擾素的鑒別試驗、外觀檢測、PH值、特異活性試驗、蛋白質反應、無菌檢查、細菌內毒素、異常毒性等項檢驗。實施例2一種動物干擾素的制備方法的具體步驟如下(1)無菌采取實驗雞脾臟，用脾臟制備淋巴細胞懸液，10 μ g/ml青霉素、鏈霉素， 用配置好的1640培養基稀釋細胞沉淀物，使雞脾淋巴細胞濃度稀釋為每ml含IX 107。(2)在雞脾淋巴細胞懸液中加入8%雞血漿，混勻。(3)在上述雞脾淋巴細胞懸液中加入少許干擾素，使其最終濃度為200-300IU/ ml，于37°C水浴培養1小時。(4)再加入黃芪多糖，使其最終濃度為25 μ g/ml ；于37°C水浴培養2小時。(5)在啟動的雞脾淋巴細胞懸液中再加入512血凝單位/ml仙臺病毒進行誘生， 37°C搖床培養12- 小時。(6)待干擾素達到高峰值時，以3000rpm離心，離心收集上清，加入鹽酸調至 PH2. 0，4. 0°C，放置4天，滅活病毒，再加NaOH調至pH7. 0，即得粗制雞細胞干擾素。留樣測定干擾素效價，通過此法制備的雞粗制干擾素共2次，4個批號，獲得了高產量干擾素，平均效價為19700IU/ml。不加入黃芪多糖的常規誘生組干擾素平均效價為11750IU/ml。半成品和成品的檢驗半成品檢定半成品進行細菌內毒素、無菌檢查、PH值等項檢測。成品檢定成品分別作干擾素的鑒別試驗、外觀檢測、PH值、特異活性試驗、蛋白質反應、無菌檢查、細菌內毒素、異常毒性等項檢驗。實施例3一種動物干擾素的制備方法，具體步驟如下(1)無菌采取實驗雞脾臟，用脾臟制備淋巴細胞懸液，加入10 μ g/ml卡那霉素， 4. 0°C冰箱放置。用配置好的培養液稀釋細胞沉淀物，使雞脾淋巴細胞濃度稀釋為每ml含 IXlO50(2)雞脾淋巴細胞懸液中加入少許干擾素，使其最終濃度為800IU/ml，于37°C水浴培養2小時。(3)再加入黃芪多糖，使其最終濃度為50 μ g/ml，于37°C水浴培養2小時。
(4)在啟動的雞脾淋巴細胞懸液中再加入256-1280血凝單位/ml仙臺病毒進行誘生，同時在雞脾淋巴細胞懸液中加入含5%牛血清的DMEM培養基，37°C搖床培養12-24小時。(5)待干擾素達到高峰值時，以3000rpm離心，收集上清即得粗制動物干擾素。留樣測定干擾素效加，通過此法制備的雞粗制干擾素共2次，3個批號，平均效價為18900IU/ ml。不加入黃芪多糖的常規誘生組干擾素平均效價為13400IU/ml。半成品和成品的檢驗半成品檢定半成品進行細菌內毒素、無菌檢查、PH值等項檢測。成品檢定成品分別作干擾素的鑒別試驗、外觀檢測、PH值、特異活性試驗、蛋白質反應、無菌檢查、細菌內毒素、異常毒性等項檢驗。使用該制備方法生產的干擾素含量高，顯著降低了生產成本。具體方法如下首先取雞脾臟，用脾臟制備淋巴細胞懸液，使用仙臺病毒和黃芪多糖作為復合干擾素誘生劑誘導健康動物干擾素，其包括有雞脾淋巴細胞懸液、啟動干擾素、病毒液和培養液，經原料制備一混和一水浴攪拌、誘導培養一離心收獲一滅活病毒一解凍除菌一分裝一成品包裝工序制成，制成的動物干擾素。留樣分別作無菌試驗、余毒試驗及安全檢驗。通過此法制備的雞粗制干擾素共3次，4個批號，獲得了高產量干擾素，平均效價大于30720IU/ml，無菌試驗、 余毒試驗均陰性，動物體內注射后均健康存活，無不良反應。本發明制備的動物干擾素具有治療雞病毒性疾病等病毒病作用，同時對細菌性疾病也有治療作用。用于防治雞疾病。如雞法氏囊病、雞新城疫病、雞傳染性支氣管炎等疾病。注射用法與用量小雞0. 002萬-0. 02萬IU/只/天，育成雞0. 004萬-0. 04萬IU/頭 /天。每日注射1次，一個療程3次，病重用量略加。通過本發明獲得了高產量干擾素，通過此法制備的雞粗制干擾素共7次，6個批號，其中4個批號效價在31200IU/ml以上(最高達40960IU/ml)；其余效價在10120IU/ml 以上。平均效價約*M230IU/ml，使用該制備方法生產的干擾素含量高，顯著降低了生產成本。留樣干擾素無菌試驗、余毒試驗均陰性，動物體內注射后均健康存活，無不良反應。副作用，對雞病毒性傳染性疾病有良好治療效果。本發明是一種廣譜抗病毒制劑，主要治療雞病毒性疾病，例如雞法氏囊病、雞瘟、雞傳染性支氣管炎和雞新城疫病等。通過注射或口服該制劑，使其與機體細胞發生反應，誘導細胞產生抗病毒蛋白，從而抑制病毒的繁殖，起到抗病毒作用。臨床實驗證明利用本發明研制的動物干擾素治療雞法氏囊病、雞傳染性支氣管炎和雞新城疫病等雞疾病共觀19頭，治愈2545頭，治愈率達90. 1 % ；其中特別是治療雞法氏囊病有效率達 96.2%,治愈率高達91.6%，效果非常顯著。上述參照實施例對該高效生產動物干擾素的方法進行的詳細描述，是說明性的而不是限定性的，可按照所限定范圍列舉出若干個實施例，因此在不脫離本發明總體構思下的變化和修改，應屬本發明的保護范圍之內。
權利要求
1.一種動物干擾素的制備方法，其特征在于具體實施步驟如下(1)無菌采取實驗雞脾臟，用脾臟制備淋巴細胞懸液，加入10μg/ml卡那霉素，用配置好的培養液稀釋淋巴細胞懸液，使雞脾淋巴細胞濃度稀釋為每ml含105-1X107 ；(2)對淋巴細胞單層進行傳代培養；(3)雞脾淋巴細胞中加入少量干擾素，使其最終濃度為100-1000IU/ml，于37°C水浴培養0. 5-2小時；(4)再加入黃芪多糖，于37°C水浴培養1-2小時；(5)然后在上述雞脾淋巴細胞懸液中再加入適量干擾素誘生劑仙臺病毒，使其最終濃度為128-1280血凝單位/ml，37°C條件下旋轉培養18-24小時；(6)待干擾素達到高峰值時，離心收集上清，加入鹽酸調至pH2.0，40°C，放置1-4天， 滅活病毒，再加NaOH調至pH 7. 0，即得粗制動物干擾素；
2.根據權利要求書1所述的一種動物干擾素的制備方法，其特征是誘導雞脾淋巴細胞產生干擾素的黃芪多糖質量濃度為25-100 μ g/ml。
全文摘要
本發明涉及一種制備動物干擾素的方法。本發明方法的實施步驟如下(1)無菌采取實驗雞脾臟，用脾臟制備淋巴細胞懸液，加入10μg/ml卡那霉素，用配置好的培養液稀釋淋巴細胞懸液；(2)雞脾淋巴細胞中加入為每ml含105少量干擾素，于37℃水浴培養0.5-2小時；(3)再加入黃芪多糖，使其最終濃度為25-100μg/ml，于37℃水浴培養1-2小時；(4)然后在上述雞脾淋巴細胞懸液中再加入適量干擾素誘生劑仙臺病毒；(5)待干擾素達到高峰值時，離心收集上清，即得粗制動物干擾素。該方法生產的干擾素含量高，生產成本明顯降低。
文檔編號C12P21/02GK102154418SQ200910303630
公開日2011年8月17日 申請日期2009年6月25日 優先權日2009年6月25日
發明者王麗莉, 王文彪 申請人:天津艾森生物工程有限公司