專利名稱：一種蛋氨酸亞砜還原酶活性的檢測方法及藥物篩選試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物醫藥研究領域。具體包括一種蛋氨酸亞砜還原酶活性的快速檢 測方法及藥物篩選試劑盒，通過測定反應體系的OD值，快速檢測各種藥物處理后細胞及組 織中蛋氨酸亞砜還原酶活性。
背景技術：
蛋氨酸亞砜還原酶(methionine sulfoxide reductase, Msr)是目前發現的唯一 可在生物體內還原逆轉蛋白質蛋氨酸殘基氧化結構變化和功能損傷的抗氧化酶系統。蛋氨 酸亞砜還原酶包括蛋氨酸亞砜還原酶A和蛋氨酸亞砜還原酶B，其存在于很多生物體中，從 進化上非常古老的古細菌大腸桿菌到植物和哺乳動物中均有發現，其抗氧化作用對于生物 體的生存具有特別重要的意義。國外一系列研究表明，在低等生物如大腸桿菌中發現蛋氨 酸亞砜還原酶基因的突變體對氧化損傷的敏感性要高于正常親本菌株，而在酵母中轉入酵 母蛋氨酸亞砜還原酶基因并高效表達和在人T細胞株轉入牛的蛋氨酸亞砜還原酶基因并 高效表達，均可提高宿主細胞對氧化物的抗性，從而提示蛋氨酸亞砜還原酶是一種存在于 生物體中的抗氧化修復因子。過表達蛋氨酸亞砜還原酶基因可以顯著減輕氧化應激引起的 人T細胞、人Lens細胞、PC12細胞和WI-38SV40等細胞的損傷和凋亡。有研究認為，蛋氨 酸亞砜還原酶與衰老及哺乳動物壽命密切相關。因此，調節蛋氨酸亞砜還原酶的基因表達， 為治療多種氧化相關的病理疾病提供了全新的視角和技術手段。申請者所在實驗室經過多年研究，發現蛋氨酸亞砜還原酶的還原功能可能和多種 年齡相關的神經系統疾病密切相關。并首次利用Western Blotting技術，發現一些中草藥 成分可以上調組織細胞中蛋氨酸亞砜還原酶的表達和功能。這表明從中草藥中篩選蛋氨酸 亞砜還原酶調節劑是一種非常可行的尋找治療衰老相關疾病藥物的新思路。目前國際上研究蛋氨酸亞砜還原酶活性的方法主要是兩種一是以放射性標記的 蛋氨酸亞砜作為底物，通過使用液閃計數儀計算一定時間放射性蛋氨酸的生成量來計算酶 活性；二是利用氨基酸衍生化和熒光高效液相相結合，通過衍生化反應，使體系中蛋氨酸亞 砜和蛋氨酸均帶上發光基團，再利用熒光高效液相檢測這兩種物質的含量，并計算單位時 間蛋氨酸的生成量。方法一準確，樣本處理簡單，但是需要特殊的放射性試劑(很難獲取) 和特殊的實驗條件(放射性檢測)。方法二的實驗儀器相對簡單，但衍生化重復性差，生物 樣本處理復雜，操作復雜，尤其不適合篩選多個藥物對于組織細胞中蛋氨酸亞砜還原酶活 性的影響。本發明的目的是獲取一種快速的檢測蛋氨酸亞砜還原酶活性的方法和藥物篩選 技術。
發明內容
本發明的任務是提供一種蛋氨酸亞砜還原酶活性檢測方法，使其具有快速簡便、 可用于大量樣本檢測的特點。同時本發明還提供一種蛋氨酸亞砜還原酶調節劑的篩選試劑盒，并提供
應用該試劑盒篩選蛋氨酸亞砜還原酶調節劑的方法。實現本發明任務的技術方案是本發明提供的這種蛋氨酸亞砜還原酶活性的檢測方法，包括以下步驟步驟一配制含反應試劑MgCl2、KC1、Tris. HCl和二硫蘇糖醇的反應液，其終濃度 分別為:MgCl2IOmM, KCl 30mM, Tris. HCl 25mM，二硫蘇糖醇 l_5mM，用鹽酸調節 PH 到 7. 4，分 別加入到96孔板的空白孔和反應孔；步驟二 向反應孔加入蛋氨酸亞砜，至終濃度達到10-50mM，向空白孔和反應孔分 別加入待測樣本至反應液中，待測樣本的體積不能超過總反應液的十分之一，于37°C反應 60分鐘后，加入顯色液Ellman試劑(5，5，- 二硫代-雙-2-硝基苯甲酸)0. OlM和NaOH 0. 1M，使反應液PH到8. 0-8. 5，37°C反應5-10分鐘，用酶標儀檢測412nm處OD值，將不加反 應物的背景液OD值和反應結束后的OD值，帶入下述公式(I)，計算得到酶活性公式(I)酶活(U/ml) = (0D _背景-OD販應)*V體系*樣品稀釋倍數/反應時間ε TNB*V樣品式中ODllfi應為反應結束后反應孔的OD值，；ODgrp^為反應結束后背景孔的OD值；乂體胃為反應總體積；V樣品為樣品總體積；1為光程厚度(儀器常數)；ε TNB 為硫代-2-硝基苯甲酸的消光系數。*為乘法運算符號。1和ε ΤΝΒ的數值可以分別通過查找儀器說明書和查找化學手冊方法得到。1和 ε ΤΝΒ的乘積值也可通過標準曲線計算得到。標準曲線的制作方法用緩沖液(MgC1210mM，
KCl 30mM，Tris. HCl 25mM，PH=7. 4)配置不同濃度二硫蘇糖醇(100 μ M-2000 μ M)，和DTNB 甲醇溶液(0. 01Μ)等體積在37°C反應10分鐘，加入NaOH溶液(0. 1M)調節PH到8. 0-8. 5， 在412nm處讀取OD值，將OD值和二硫蘇糖醇濃度進行線性回歸分析，可以算出1和ε TNB的 乘積值。在上述本發明提供的蛋氨酸亞砜還原酶活性的檢測方法中，反應液中二硫蘇糖醇 和蛋氨酸亞砜的終濃度濃度比為1 10，并需要將反應液在37°C預熱lOmin。顯色液為甲 醇配制的Ellman試劑(5，5’- 二硫代-雙-2-硝基苯甲酸，0. OlM)。顯色劑加入反應液，必 須同時加入相當于反應液10%體積的0. IM的NaOH溶液，使反應液PH達到8. 0-8. 5。本發明提供的蛋氨酸亞砜還原酶調節劑的篩選試劑盒，包括以下試劑試劑A 二硫蘇糖醇(l-5mM，用試劑C配制)；試劑B蛋氨酸亞砜(10-50mM，用試劑C配制)；試劑C 緩沖液(MgCl2 IOmM, KCl 30mM, Tris. HCl 25mM, PH = 7. 4)；試劑D顯色液Ellman試劑(0. OlM)；禾口試劑E顯色液NaOH溶液(0. 1M)。該試劑盒還可以包括96孔板。應用本發明蛋氨酸亞砜還原酶調節劑的篩選試劑盒篩選蛋氨酸亞砜還原酶調節劑的方法如下(1)使用不含蛋白酶抑制劑的細胞裂解液或者超聲破碎儀從細胞或組織中提取總 蛋白樣本，按考馬斯亮藍法測定蛋白濃度；(2)向96孔板加入試劑A和試劑B各50 μ 1作為反應孔；試劑A和試劑C各50 μ 1 作為背景孔，37°C預熱10分鐘；(3)向反應孔及對應的背景孔分別加入等蛋白量(30_60yg)的蛋白提取液，37°C 振搖反應60分鐘；(4)向反應孔及對應的背景孔分別加入20 μ 1試劑E，37°C振搖5分鐘；(5)向反應孔及對應的背景孔分別加入100 μ 1試劑D，37°C振搖5分鐘；(6)用酶標儀在412nm處讀取數值，按前述公式(I)計算酶活性酶活(U/ml) = (0D販應-OD _背景)*V體系*樣品稀釋倍數/反應時間ε TNB*V樣品式中ODllfi應為反應結束后反應孔的OD值，；ODgrp^為反應結束后背景孔的OD值；Vfts為反應總體積；Vtis為樣品總體積；1為光程厚度(儀器常數)；ε TNB 為硫代-2-硝基苯甲酸的消光系數；*為乘法運算符號。1和ε ΤΝΒ的數值可以分別通過查找儀器說明書和查找化學手冊方法得到。1和 ε ΤΝΒ的乘積值也可通過標準曲線計算得到。標準曲線的制作方法用緩沖液(MgC12 IOmM, KCl 30mM,Tris. HCl 25mM，PH=7. 4)配置不同濃度二硫蘇糖醇(100 μ M-2000 μ M)，和DTNB 甲醇溶液(0. 01Μ)等體積在37°C反應10分鐘，加入NaOH溶液(0. 1M)調節PH到8. 0-8. 5， 在412nm處讀取OD值，將OD值和二硫蘇糖醇濃度進行線性回歸分析，可以算出1和ε TNB的 乘積值。本發明的檢測方法可用于蛋氨酸亞砜還原酶活性的批量檢測和蛋氨酸亞砜還原 酶活性調節劑的篩選，在酶工程、生物醫藥和藥物開發領域有著較高的實際意義。酶活定 義每分鐘由蛋氨酸亞砜還原成ι μ M蛋氨酸所需的酶量稱為ιυ。本發明的優點1.樣本用量極低，步驟簡單。2.與放射性同位素方法相比，對環境友好，且無需復雜設備和特殊試劑。3.與熒光衍生化-高效液相方法相比，大大節省了時間，降低了工作量。4.與前兩種方法相比，成本很低，在實驗室和生物醫藥工業中具有很高的應用價值。
圖1為本發明檢測方法的基本檢測原理。
具體實施例方式以下結合實施例詳細解釋本發明的實施方式，這些實例不能用來限制本發明的范圍。
實施例1利用本發明的檢測方法和試劑盒測定重組大鼠蛋氨酸亞砜還原酶A活性(1)向96孔板加入試劑A和試劑B各50 μ 1作為反應孔；試劑A和試劑C各50 μ 1 作為背景孔，37°C預熱10分鐘；(2)向反應孔及對應的背景孔分別加入等蛋白量0.5yg，Iyg和2yg的酶液， 37 °C振搖反應60分鐘；(3)向反應孔及對應的背景孔分別加入20 μ 1試劑E，37°C振搖5分鐘；(4)向反應孔及對應的背景孔分別加入100 μ 1試劑D，37°C振搖5分鐘；(5)用酶標儀在412nm處讀取數值，按以下公式計算酶活性酶活(U/ml) = (0D販應-OD _背景)*V體系*樣品稀釋倍數/反應時間ε TNB*V樣品表一反應體系OD值與酶活性
權利要求
1.一種蛋氨酸亞砜還原酶活性的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟步驟一配制含反應試劑MgCl2、KCUTris. HCl和二硫蘇糖醇的反應液，其終濃度分別 % =MgCl2 IOmM, KCl 30mM, Tris. HCl 25mM，二硫蘇糖醇 l_5mM，用鹽酸調節 PH 到 7. 4，分別 加入到96孔板的空白孔和反應孔；步驟二 向反應孔加入蛋氨酸亞砜，至終濃度達到10-50mM，向空白孔和反應孔分別加 入待測樣本至反應液中，待測樣本的體積不能超過總反應液的十分之一，于37°C反應60分 鐘后，加入顯色液Ellman試劑(5，5，-二硫代-雙_2_硝基苯甲酸)0. OlM和NaOH 0. 1M， 使反應液PH到8. 0-8. 5，37°C反應5_10分鐘，用酶標儀檢測412nm處OD值，將不加反應物 的背景液OD值和反應結束后的OD值，帶入以下公式，計算得到酶活性酶活(U/ml) = (0D酶背景-OD酶反應)*V體系*樣品稀釋倍數/反應時間*1*εΤΝΒ*ν樣品式中OD I8as為反應結束后反應孔的OD值，； ODgrp^為反應結束后背景孔的OD值； 為反應總體積； 為樣品總體積； 1為光程厚度(儀器常數)； ε 為硫代-2-硝基苯甲酸的消光系數。1和ε ΤΝΒ的數值可以分別通過查找儀器說明書和查找化學手冊方法得到。1和εΤΝΒ 的乘積值也可通過標準曲線計算得到。標準曲線的制作方法用緩沖液(MgC12 IOmM, KCl 30mM, Tris. HCl 25mM, PH = 7. 4)配置不同濃度二硫蘇糖醇(100 μ Μ-2000 μ Μ)，和 DTNB 甲 醇溶液(0. 01Μ)等體積在37°C反應10分鐘，加入NaOH溶液(0. 1M)調節PH到8. 0-8. 5，在 412nm處讀取OD值，將OD值和二硫蘇糖醇濃度進行線性回歸分析，可以算出1和ε TNB的乘 積值。
2.根據權利要求1所述的蛋氨酸亞砜還原酶活性的檢測方法，其特征在于，反應體系 中二硫蘇糖醇和蛋氨酸亞砜的終濃度濃度比為1 10，并需要將反應液在37°C預熱lOmin。
3.根據權利要求1所述的蛋氨酸亞砜還原酶活性的檢測方法，其特征在于，顯色液 Ellman試劑為甲醇配制的Ellman試劑。
4.根據權利要求1所述的蛋氨酸亞砜還原酶活性的檢測方法，其特征在于，顯色劑加 入反應液，必須同時加入相當于反應液10%體積的0. IM的NaOH溶液，使反應液PH達到 8. 0-8. 5。
5.一種蛋氨酸亞砜還原酶調節劑的篩選試劑盒，包括 試劑A 二硫蘇糖醇(l_5mM，用試劑C配制)；試劑B蛋氨酸亞砜(10-50mM，用試劑C配制)； 試劑 C 緩沖液(MgCl2 IOmM, KCl 30mM, Tris. HCl 25mM, PH = 7. 4)； 試劑D顯色液Ellman試劑(0. 01M)；和 試劑E顯色液NaOH溶液(0. 1M)。
6.根據權利要求4所述的蛋氨酸亞砜還原酶調節劑的篩選試劑盒，其特征在于包括96 孔板。
7.應用權利要求5或6所述的蛋氨酸亞砜還原酶調節劑的篩選試劑盒篩選蛋氨酸亞砜還原酶調節劑的方法，包括(1)使用不含蛋白酶抑制劑的細胞裂解液或者超聲破碎儀從細胞或組織中提取總蛋白 樣本，按考馬斯亮藍法測定蛋白濃度；(2)向96孔板加入試劑A和試劑B各50μ 1作為反應孔；試劑A和試劑C各50 μ 1作 為背景孔，37°C預熱10分鐘;(3)向反應孔及對應的背景孔分別加入等蛋白量(30-60yg)的蛋白提取液，37°C振搖 反應60分鐘；(4)向反應孔及對應的背景孔分別加入20μ 1試劑E，37°C振搖5分鐘；(5)向反應孔及對應的背景孔分別加入100μ 1試劑D，37°C振搖5分鐘；(6)用酶標儀在412nm處讀取數值，按以下公式計算酶活性酶活(U/ml) = (0D販應-OD酶背景)*V體系*樣品稀釋倍數/反應時間*1*ε·*ν樣品
全文摘要
本發明公開了一種蛋氨酸亞砜還原酶活性的檢測方法及按照該方法研制的藥物篩選試劑盒，通過測定反應體系的OD值，快速檢測各種藥物處理后細胞及組織中蛋氨酸亞砜還原酶活性。可用于蛋氨酸亞砜還原酶活性的批量檢測和蛋氨酸亞砜還原酶活性調節劑的篩選，在酶工程、生物醫藥和藥物開發領域有著較高的實際意義。樣本用量極低，步驟簡單，對環境友好，且無需復雜設備和特殊試劑，成本很低，在實驗室和生物醫藥工業中具有很高的應用價值。
文檔編號C12Q1/26GK102094068SQ20091027317
公開日2011年6月15日 申請日期2009年12月10日 優先權日2009年12月10日
發明者吳鵬飛, 張醉, 曾建華, 王悅, 王芳, 陳建國 申請人:華中科技大學