專利名稱：mRNA二級結構優化提高(R)-羰基還原酶的生物轉化效率的方法
技術領域：
mRNA 二級結構優化提高(R) _羰基還原酶的生物轉化效率的方法，通過優化mRNA 翻譯起始區的二級結構，克服蛋白翻譯啟動的空間位阻，促進目標蛋白的高效表達及其空 間結構的正確折疊，有效提高酶蛋白活力及生物催化功能的方法與應用，屬于生物催化不 對稱轉化技術領域。
背景技術：
手性醇具有特殊的光電磁性能和生理活性，是非常理想的手性藥物中間體和液晶 材料摻加劑。特別是光學純苯基乙二醇，更是醫藥、農藥和化工材料中一種重要的手性模塊 化合物。利用重組氧化還原酶不對稱還原潛手性酮制備光學手性醇，已成為當今工業上生 產手性醇的主要發展趨勢。 mRNA翻譯起始區二級結構的穩定性與靶蛋白翻譯的起始進程密切相關。據統計， mRNA翻譯起始區二級結構內吉布斯自由能(AG)絕對值每增加1. 4kcal/mo1，翻譯起始效 率將降低10倍。 近平滑假絲酵母細胞催化混旋的苯基乙二醇，可獲得光學活性的(S)-苯基乙二 醇，參與反應的關鍵酶有兩種，即(R)-羰基還原酶和(S)-羰基還原酶。前者催化(R)-苯 基乙二醇與2-羥基苯乙酮之間的可逆反應；后者以中間體2-羥基苯乙酮為底物，產生 (S)-苯基乙二醇；由于(R)-羰基還原酶的表達水平和催化效率遠遠低于(S)-羰基還原 酶，導致近平滑假絲酵母只能合成(S)-苯基乙二醇。在此研究基礎上，本實驗室以mRNA翻 譯起始區中的+1 +78區作為優化對象，對多個核苷酸實施定點突變，構建相應的優化突 變體，實現了 (R)-羰基還原酶的高效表達，提高了酶活力和生物轉化效率，為高效制備光 學活性的(R)-苯基乙二醇提供了嶄新途徑。
發明內容
1、要解決的技術問題。本發明的目的是提供一種mRNA翻譯起始區二級結構優化 技術改善酶的表達水平和催化功能，利用重組菌株(菌種保藏號CCTCCN0 :M 209289)高效 不對稱轉化制備(R)-苯基乙二醇的方法。本發明目的在于通過對(R)-羰基還原酶mRNA翻 譯起始區的二級結構中的14個核苷酸位點實施同義突變，使酶蛋白表達水平提高了 4 5 倍，酶活力提高61. 9%，對高濃度(5. 0g/L)底物2-羥基苯乙酮進行催化反應，產物(R)-苯 基乙二醇的光學純度和產率分別達到95. 2% e. e.和83. 3%，比優化前提高了 30. 4%和 43.1%。為高效制備具有光學活性的(R)-苯基乙二醇提供了新型研究思路和借鑒意義。
2、技術方案 (1)、一株不對稱轉化制備(R)-苯基乙二醇的重組菌，其分類命名為大腸桿菌 (Escherichia coli)BL21/pET32a-mrcr，已保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號 CCTCC NO :M209289。
(2)、所述重組菌CCTCC NO :M209289的構建方法，將突變基因mrcr插入載 體pET32a構建重組質粒pET32a-mrcr，重組質粒pET32a_mrcr轉化大腸桿菌E. coli BL21(DE3)感受態細胞，通過含100ii g/mL氨節青霉素的LB平板篩選，獲得重組菌株E. coli BL21/pET32a-mrcr，即CCTCC NO :M209289 ;步驟為 ①基因的優化根據MFOLD軟件算法，對(R) _羰基還原酶編碼基因rcr的mRNA翻 譯起始區中部分核苷酸(+lnt +78nt)進行分析，以降低二級結構的穩定性或自由能AG 為依據，對13個核苷酸進行了定點突變；由A :(+l)atgtca att cca tea age cag tac gga ttc gta ttc aat aag caa tea gga ctt aag ttg aga aat gat ttgcct gtc (+78);突變 為B :(+l)atg tea atA cca tea TCA caA tac gga ttc gtattc aat aagcaa tea gga TTA aaA CtA CgT aaC gat ttg cct gtc (+78);即第9， 16， 17， 18， 21， 52， 54， 57， 58， 60， 61， 63和 66位的t， a， g， c， c， c， t， g， t， g， a， a， t突變為A， T， C， A， A， T， A， A， C， A， C， T， C ;
②mrcr的獲得以重組質粒pETRCR作為PCR反應模板，利用含有Ncol限制性酶 切位點的引物mRCR_F，含有Xhol限制性酶切位點的引物mRCILR，通過PCR擴增反應，獲得 mrcr基因，其全長為1008bp ;
mRCR—F:5'
GTAACGATTTG-3，，mRCR_R : 5' -TGACTCTCGAGTGGATTAAAAACAACTCTACCTTCATAAGCATTGTT-3'，
PCR反應體系ddH20 37. 5 ii L， 10 X Reaction Buffer 5 ii L， 25mmol/L的 d證4 ii L， 50pmo1/ ii L的弓|物mRCR_F禾口 mRCR_R各1 ii L，重組質粒pETRCR 1 ii L， 5U/ ii L的 T叫DNA polymerase 0. 5 li L PCR反應條件95。C預變性5min ;94。C lmin，57。C lmin，72。C lmin，30個循環； 72°C 10min ;獲得mrcr基因； ③重組質粒pET32a-mrcr的構建先利用限制性內切酶Ncol和Xhol對基因mrcr 和載體pET32a分別進行雙酶切處理，處理后DNA片斷通過粘性末端連接，獲得帶有基因 mrcr的重組質粒pET32a-mrcr ; ④重組質粒轉化大腸桿菌取重組質粒pET32a-mrcr 2 y L，轉化大腸桿菌E. coli BL21(DE3)感受態細胞，轉化液涂布到含有100iig/mL氨芐青霉素的LB平板上，37t:倒置培 養過夜，獲得陽性克隆E. coli BL21/pET32a-mrcr。 (3)、利用定點突變后構建的重組菌CCTCC NO :M209289不對稱轉化制備(R)-苯基
乙二醇 (a)重組菌株CCTCC NO :M209289的培養 采用LB液體培養基以g/L計胰蛋白胨IO，酵母提取物5，NaCl 10，pH 7. 0 ;固體
培養基再添加液體培養基重量1. 5%的瓊脂粉； 培養條件挑取重組菌株CCTCC NO :M209289的單菌落接種于3mL含100 y g/mL氨 芐青霉素的LB液體培養基中，于37°C 200rpm振蕩培養過夜；取lmL培養液轉接于50mL含 100 ii g/mL氨芐青霉素的LB液體培養基中，于37°C 200rpm振蕩培養至0D6。。為0. 6 0. 8 ; 加入誘導物異丙基-P -D-硫代半乳糖苷lmmol/L， 30。C下誘導培養過夜，10， OOOrpm離心 10min，收集菌體，用生理鹽水洗滌兩次，收集得到重組菌全細胞；
(b)以重組菌全細胞為催化劑，以2-羥基苯乙酮為底物，進行不對稱轉化反應 5mL 0. lmol/L pH 5. 0 6. 0的醋酸緩沖液，或5mL 0. lmol/L pH 7. 0的磷酸緩沖液，或5mL 0. lmol/L pH 8. 0 9. 0的Tris-HCl緩沖液中，重組菌全細胞濃度為0. 1 0. 2g/mL，底物 濃度為5g/L，反應溫度30°C，反應時間為48h。 反應結束后，將反應混合物離心除去菌體，上清液加入2倍體積乙酸乙酯萃取，有 機相用于分析；產物通過手性固定相高效液相色譜(Agillent HP1100)進行分析，條件為 Chiralcel 0B-H柱(4. 6mmX 25cm ;Daicel Chemical Ind. ， Ltd. ， Japan)，流動相為正己烷 /異丙醇(9/1，V/V)，流速0. 5mL/min，檢測波長為215nm。產物的光學純度通過對映過量值 來衡量。 產物(R)-苯基乙二醇對映過量值的計算 對映過量值(e. e. % ) = [ (CK_CS) / (CK+CS) ] X 100 % 產物(R)-苯基乙二醇產率的計算產率(％ ) = CK/C。X 100% 式中CK為反應后(R)-苯基乙二醇的濃度，Cs為反應后(S)-對映體的濃度，C。為
反應前底物(R)-苯基乙二醇的濃度。 重組菌全細胞為催化劑，不對稱生物轉化反應后，產物均為(R)-苯基乙二醇。
3、有益效果通過對(R)-羰基還原酶(編碼基因的GenBank登記號DQ675534)的 mRNA翻譯起始區二級結構進行優化，利用成功構建的重組菌E. coli BL21/pET32a-mrcr進 行生物轉化2-羥基苯乙酮，獲得產物(R)-苯基乙二醇。通過優化反應條件，在pH8.5的 Tris-HCl緩沖液中，利用0. 2g/mL重組全細胞對5g/L底物2-羥基苯乙酮催化轉化48h，最 終產物(R)-苯基乙二醇的光學純度為95. 2%e. e.，產率為83. 3%。這些工作為(R)-苯基 乙二醇的高效轉化提供了有效途徑，通過mRNA翻譯起始區二級結構的優化提高生物酶的 催化功能提供了研究思路與借鑒意義。
生物材料樣品保藏 大腸桿菌(Escherichia coli)BL21/pET32a-mrcr，保藏單位中國典型培養物保 藏中心，簡稱CCTCC，保藏編號:CCTCC NO :M 209289，保藏日期2009年11月29日。
圖1優化前后核苷酸序列及翻譯起始區二級結構的對比。 (A):用MF0LD方法預測的(R) _羰基還原酶的mRNA翻譯起始區(從+1到+78位) 優化前的二級結構；(B):用MF0LD方法預測的(R) _羰基還原酶的mRNA翻譯起始區(從+1 到+78位)優化后的二級結構。
具體實施例方式
實施例l基因的優化 以降低二級結構的穩定性或自由能(AG)為依據，對(R)-羰基還原酶編碼基因 rcr的mRNA翻譯起始區中13個核苷酸，即第9， 16， 17， 18， 21， 52， 54， 57， 58， 60， 61， 63和66 位的t， a， g， c， c， c， t， g， t， g， a， a， t突變為A， T， C， A， A， T， A， A， C， A， C， T， C。 [OO36] 實施例2mrcr基因的獲得 以重組質粒pETRCR作為PCR反應模板，利用含有Ncol限制性酶切位點的mRCR_F和含有XhoI限制性酶切位點的mRCILR作引物 TAAAACTACGTAACGATTTG-3，，mRCR_R : 5' -TGACTCTCGAGTGGATTAAAAACAACTCTACCTTCATAAGCATTGTT-3'，PCR反應體系ddH20 37. 5 ii L， 10 X Reaction Buffer 5 ii L， 25mmol/L dNTP4iiL，
50pmo1/ y L的弓I物mRCR_F禾口 mRCR_R各1 ii L，重組質粒pETRCR 1 ii L， 5U/ ii L Taq DNA
polymerase 0. 5 ii L ;PCR反應條件95。C 5min ;94。C lmin，57。C lmin，72。C lmin，30個循環；
72°C 10min ;PCR反應獲得mrcr基因。 實施例3重組質粒pET32a-mrcr的獲得 利用限制性內切酶Ncol和Xhol對基因mrcr和pET32a (pET32a質粒來源于 Novagen公司)分別進行雙酶切處理，處理后DNA片斷通過粘性末端連接，獲得帶有基 因mrcr的重組質粒pET32a-mrcr。利用質粒提取試劑盒Mini-PlasmidR即id Isolation Kit(購買于北京博大泰克生物基因技術有限公司)提取質粒pET32a-mrcr。
實施例4重組菌株E. coli BL21/pET32a-mrcr的獲得 重組質粒轉化大腸桿菌在每管的100 ii L E. coli BL21 (DE3)感受態細胞懸液中 加入10 ii L連接產物，輕輕混勻后冰浴30min。轉入42。C水浴，熱擊90s。快速轉移至冰浴 中，冷卻2min。每管中加入700iiL LB液體培養基，37t: 100rpm搖床溫育培養lh。培養后 菌液3， OOOrpm離心2min，棄上清600 y L，剩余菌液混勻后涂布含100 y g/mL氨芐青霉素的 LB平板上，37t:倒置培養過夜。 LB培養基胰蛋白胨1%，酵母提取物0. 5%，NaCl l%，pH 7.0。使用前加入氨芐 青霉素(100 ii g/mL)，固體培養基添加1. 5%瓊脂粉。 挑取4個克隆，轉接入裝有3mL的含有100 y g/mL氨芐青霉素的LB液體培養基 中，37。C培養12h，利用質粒提取試劑盒Mini-Plasmid Rapid Isolation Kit(北京博大泰 克生物基因技術有限公司)從培養的菌液中提取質粒。經下列酶切體系驗證10XBuffer H 2 ii L，質粒DNA 5 ii L， Nco I 0. 5 ii L， Xhol 0. 5 ii L， ddH20將體系補足20 ii L。酶切結果 為陽性的菌體即為重組菌E. coli BL21/pET32a-mrcr (菌藏編號CCTCC NO :M209289)。
實施例5重組菌的培養 LB液體培養基如說明書所述。挑取實施例3中重組菌E. coliBL21/pET32a-mrcr 的單菌落接種于3mL含100 g/mL氨芐青霉素的LB液體培養基中，于37°C ， 200rpm振蕩培 養過夜，取lmL培養液轉接于50mL含100 y g/mL氨芐青霉素的LB液體培養基中，于37°C， 200rpm振蕩培養至0D6。。為0. 6 0. 8后，加入lmmol/L異丙基-P _D_硫代半乳糖苷，于 3(TC誘導培養過夜；10， OOOrpm離心10min收集菌體，用生理鹽水洗滌菌體兩次，收集重組 菌全細胞。 實施例6目標蛋白的表達 用實施例5中的菌液，進行SDS-PAGE檢測，凝膠定量軟件(Quantity One)分析蛋 白表達；將收集的重組菌溶解于20mmol/L， pH8. 0的Tris-HCl緩沖液中，超聲破碎20min， 工作時間2s，間歇時間6s。將破碎后的菌體于16， OOOrpm離心40min，分別取上清和沉淀， SDS-PAGE檢測結果顯示(R)-羰基還原酶蛋白表達量是優化前的4 5倍。
實施例7
7
用實施例5中所獲得的菌體進行生物轉化試驗。在5mL 0. lmol/L醋酸緩沖液(pH 5.0)中，分別加入5g/L底物2-羥基苯乙酮，0. lg/mL重組大腸桿菌濕菌體，混勻后于3(TC 恒溫搖床上振蕩反應48h。反應后混合物離心，取上清液萃取，產物為(R)-苯基乙二醇的光 學純度為28.5% e. e.，產率為16.9%。
實施例8 用實施例5中所獲得的菌體進行生物轉化試驗。在5mL 0. lmol/L醋酸緩沖液(pH 6.0)中，分別加入5g/L底物2-羥基苯乙酮，0. lg/mL重組大腸桿菌濕菌體，混勻后于3(TC 恒溫搖床上振蕩反應48h。反應后混合物離心，取上清液萃取，產物為(R)-苯基乙二醇的光 學純度為43. 7 % e. e.，產率為32.6%。
實施例9 用實施例5中所獲得的菌體進行生物轉化試驗。在5mL 0. lmol/L磷酸緩沖液(pH 7.0)中，分別加入5g/L底物2-羥基苯乙酮，0. lg/mL重組大腸桿菌濕菌體，混勻后于3(TC 恒溫搖床上振蕩反應48h。反應后混合物離心，取上清液萃取，產物(R)-苯基乙二醇的光學 純度為74. 5% e. e.，產率為58. 2% 。
實施例10用實施例5中所獲得的菌體進行生物轉化試驗。在5mL 0. lmol/L Tris-HCl緩沖 液(pH 8. 0)中，分別加入5g/L底物2-羥基苯乙酮，0. lg/mL重組大腸桿菌濕菌體，混勻后 于3(TC恒溫搖床上振蕩反應48h。反應后混合物離心，取上清液萃取，產物(R)-苯基乙二 醇的光學純度90.7% e. e.，產率80. 4%。
實施例11用實施例5中所獲得的菌體進行生物轉化試驗。在5mL 0. lmol/L Tris-HCl緩沖 液(pH8. 5)中，分別加入5g/L底物2-羥基苯乙酮，0. lg/mL重組大腸桿菌濕菌體，混勻后 于3(TC恒溫搖床上振蕩反應48h。反應后混合物離心，取上清液萃取，產物(R)-苯基乙二 醇的光學純度為93. 1% e. e.，產率為81.8%。
實施例12 用實施例5中所獲得的菌體進行生物轉化試驗。在5mL 0. lmol/L Tris-HCl緩沖 液(pH9. 0)中，分別加入5g/L底物2-羥基苯乙酮，0. lg/mL重組大腸桿菌濕菌體，混勻后 于3(TC恒溫搖床上振蕩反應48h。反應后混合物離心，取上清液萃取，產物(R)-苯基乙二 醇的光學純度為89. 6% e. e.，產率為78.9%。
實施例13 用實施例5中所獲得的菌體進行生物轉化試驗。在5mL 0. lmol/L Tris-HCl緩沖 液(pH8. 5)中，分別加入5g/L底物2-羥基苯乙酮，0. 2g/mL重組大腸桿菌濕菌體，混勻后 于3(TC恒溫搖床上振蕩反應48h。反應后混合物離心，取上清液萃取，產物(R)-苯基乙二 醇的光學純度為95. 2% e. e.，產率為83. 3% 。
8
權利要求
一株不對稱轉化制備(R)-苯基乙二醇的重組菌，其分類命名為大腸桿菌(Escherichia coli)BL21/pET32a-mrcr，已保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號CCTCC NOM209289。
2. 根據權利要求1所述重組菌CCTCC NO :M209289的構建方法，其特征是將突變基因 mrcr插入載體pET32a構建重組質粒pET32a-mrcr，重組質粒pET32a-mrcr轉化大腸桿菌 E.coli BL21(DE3)感受態細胞，通過含100 y g/mL氨節青霉素的LB平板篩選，獲得重組菌 株E. coli BL21/pET32a-mrcr，即CCTCCNO :M209289 ;步驟為:① 基因的優化根據MFOLD軟件算法，對(R)-羰基還原酶編碼基因rCr的mRNA翻譯 起始區中+lnt +78nt部分核苷酸進行分析，以降低二級結構的穩定性或自由能A G為依 據，對13個核苷酸進行了定點突變；即第9，16，17，18，21，52，54，57，58，60，61，63和66位 的t， a， g， c， c， c， t， g， t， g， a， a， t突變為A， T， C， A， A， T， A， A， C， A， C， T， C ;② mrcr的獲得以重組質粒pETRCR作為PCR反應模板，利用含有Ncol限制性酶切位 點的引物mRCR_F，含有Xhol限制性酶切位點的引物mRCR_R，通過PCR擴增反應，獲得mrcr 基因，其全長為1008bp ;CTACGTAACGATTTG-3，，mRCR_R :5' -TGACTCTCGAGTGGATTAAAAACAACTCTACCTTCATAAGCATTGTT-3，，PCR反應體系ddH20 37. 5 ii L， 10XReaction Buffer 5 ii L， 25mmol/L的dNTP4 ii L，50pmo1/ ii L的弓l物mRCR_F禾口 mRCR_R各1 ii L，重組質粒pETRCR 1 ii L， 5U/ ii L的Taq DNApolymerase 0. 5 li L ;PCR反應條件95。C預變性5min ;94。C lmin， 57 °C lmin， 72 °C lmin， 30個循環；72。C 10min ;獲得mrcr基因；③ 重組質粒pET32a-mrcr的構建先利用限制性內切酶NcoI和Xhol對基因mrcr和載 體pET32a分別進行雙酶切處理，處理后DNA片斷通過粘性末端連接，獲得帶有基因mrcr的 重組質粒pET32a-mrcr ;④ 重組質粒轉化大腸桿菌取重組質粒pET32a-mrcr 2 y L，轉化大腸桿菌E. coli BL21(DE3)感受態細胞，轉化液涂布到含有100i！ g/mL氨芐青霉素的LB平板上，37t:倒置培 養過夜，獲得陽性克隆E. coli BL21/pET32a-mrcr。
3. 利用定點突變后構建的重組菌CCTCC N0 :M209289不對稱轉化制備(R)-苯基乙二 醇，其特征是(1) 重組菌株CCTCC NO :M209289的培養采用LB液體培養基以g/L計胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10， pH 7. 0 ;固體培養 基再添加液體培養基重量1. 5%的瓊脂粉；培養條件挑取重組菌株CCTCC NO :M209289的單菌落接種于3mL含100 y g/mL氨芐 青霉素的LB液體培養基中，于37°C 200rpm振蕩培養過夜；取lmL培養液轉接于50mL含 100 ii g/mL氨芐青霉素的LB液體培養基中，于37°C 200rpm振蕩培養至0D6。。為0. 6 0. 8 ; 加入誘導物異丙基-P -D-硫代半乳糖苷lmmol/L， 30。C下誘導培養過夜，10， OOOrpm離心 10min，收集菌體，用生理鹽水洗滌兩次，收集得到重組菌全細胞；(2) 以重組菌全細胞為催化劑，以2-羥基苯乙酮為底物，進行不對稱轉化反應5mL`0. lmol/L pH 5. 0 6. 0的醋酸緩沖液，或5mL 0. lmol/L pH 7. 0的磷酸緩沖液，或5mL 0. lmol/L pH 8. 0 9. 0的Tris-HCl緩沖液中，重組菌全細胞濃度為0. 1 0. 2g/mL，底物 濃度為5g/L，反應溫度30°C ，反應時間為48h。
全文摘要
mRNA二級結構優化提高(R)-羰基還原酶的生物轉化效率的方法，屬于生物催化不對稱轉化技術領域。本發明通過優化(R)-羰基還原酶的mRNA翻譯起始區二級結構，并構建了相應的突變重組菌，其分類命名為大腸桿菌(Escherichia coli)BL21/pET32a-mrcr，保藏編號CCTCC NoM209289。該突變菌株不僅實現了(R)-羰基還原酶的高效表達，而且有效提高了該酶蛋白活力及其生物轉化效率，為高底物濃度下高效制備(R)-苯基乙二醇提供了新型研究思路與途徑。
文檔編號C12N15/53GK101724597SQ20091026314
公開日2010年6月9日 申請日期2009年12月16日 優先權日2009年12月16日
發明者張榮珍, 徐巖, 王珊珊 申請人:江南大學