專利名稱：一株軟腐果膠桿菌及其在生物制漿中的應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于造紙領域，涉及一種軟腐果膠桿菌及其在生物制漿中的應用。
背景技術：
植物韌皮纖維是優質的長纖維的主要來源，尤其是應用于特種紙的紙漿纖維來 源。其中構樹、桑樹樹皮纖維是重要的原料。生物制漿的研究在國外有了很大的發展，尤其是韌皮纖維原料生物法制漿研究更 受到人們的重視，許多科學家試圖用果膠酶來浸漬韌皮纖維使之成漿造紙，即選擇一種適 當的微生物，利用它分泌出的分解酶，把可作為微生物生活營養物質的果膠質分解成半乳 糖醛酸，最后達到纖維解析。張秀芝等(中國造紙1992(3) :64_65)報告采用歐氏桿菌所產堿性果膠酶分離后 應用于韌皮纖維制漿。但這種方法需要先進行酶的提取分離，工藝較為繁瑣，生產成本較
尚ο采用發酵浸漬法制漿的菌株一般為嗜堿性芽孢桿菌(Bacillussp)、歐文氏胡蘿卜 WiMf^M (Ecarotovora) ,Mi^M (Actinomycessp)(Spirillosporasp) ,/L禾中。 此項研究近些年已有不少專利和文獻的報道，其中以日本的研究更為引人注目。如工業技 術院四國工業技術試驗所的小林良生在探討生物制漿方面進行了不少研究，如他利用歐氏 菌G1R-277液體發酵山椏皮三天可成漿，得率為70% ；用G1R-726液體發酵構樹皮兩天可 成漿，得率達85% ；用酶法處理山椏皮，24h可成漿，得率為79%。
發明內容
本發明的目的是針對現有技術的上述不足，提供一株新的軟腐果膠桿菌。本發明 的另一目的是提供生物制漿中的應用。本發明的技術方案如下一種軟腐果膠桿菌軟腐亞種 C519 (Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorumstrain C519)，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏 號為CGMCCN0 3350，保藏日為期為2009年10月23日。該菌株能夠在高堿性(pH彡11)條 件下生長，適合植物韌皮纖維的脫膠工藝。軟腐果膠桿菌C519(CGMCC No 3350)是從市售大白菜的典型軟腐病癥狀組織中分 離得到，采用16S rDNA序列經RDP對比方法對該菌鑒定結果顯示該菌為軟腐果膠桿菌屬軟 腐亞禾中(Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum),與同屬的菌株最高相似性為 99%，系統進化樹顯示菌株C519 (CGMCCNo 3350)為該屬的一個新種。軟腐果膠桿菌C519(CGMCC No 3350)的形態及生理特征如下
注“ + ”陽性反應；“一“陰性反應軟腐果膠桿菌CGMCC No 3350可在果膠桿菌屬的常規培養基上培養，特別適合金 氏培養基B上培養。金氏培養基B (King，s medium B)的配制蛋白胨20. Og
甘油10. Og
磷酸氫二鉀(K2HPO4)1.5g
硫酸鎂(MgSOJH2O)1.5g
瓊脂15. Og
蒸餾水1000ml
軟腐果膠桿菌CGMCC No3350可在生物制漿中的應用。
一種利用軟腐果膠桿菌CGMCC No 3350處理植物韌皮組織分離纖維的方法為將植
物韌皮組織浸泡在水中，向其中按一定比例接種經液體培養擴增的軟腐果膠桿菌CGMCCN0 3350，經過發酵將植物韌皮組織中的果膠分解導致植物纖維分離，按常規制漿法，用碎漿機 處理浸漬發酵的韌皮組織，使其纖維分離；再經過除渣器去除黑色表皮等等固體殘渣。所述 的浸泡韌皮組織的水用堿(NaOH、Na2CO3^ NH4OH等)調整pH，使其初始pH值為9 11。所 述的發酵分兩階段，第一階段為通氣發酵，時間為24小時，加堿保持發酵體系的pH維持在 9-10;第二階段為厭氧發酵，室溫發酵2 6日。兩階段通常情況下為室溫自然發酵。本發明的有益效果①C519(CGMCC No 3350)菌株可以在粗放的培養基上快速的增殖，世代時間為 25min。②C519(CGMCC No 3350)可以在堿性條件下(pH9 11)生長，同時分泌高活性嗜 堿性果膠酶(適宜的PH值為8-10)。一方面，堿性條件下纖維素有潤脹的趨向，果膠酶在韌 皮纖維中擴散較快，所以制漿速率快；另一方面，在堿性范圍內一般其他微生物的生長繁殖 困難，因而可防止其他雜菌的污染。③堿性條件下，能損傷纖維素的酶無活性，可以極大程度上保持韌皮纖維的原始 性能，并提高得漿率。涉及的生物材料樣品的保藏本發明所要求保護的軟腐果膠桿菌軟腐亞種(Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum) C519保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為 北京市朝陽區大屯路中國科學院微生物研究所，保藏號為CGMCC N0. 3350，保藏日期為2009 年10月23日。
附圖1軟腐果膠桿菌C519(CGMCC No 3350)系統進化樹圖
具體實施例方式實施例1菌種分離取市售大白菜中典型軟腐病癥狀的組織，邊緣用鋒利刀片切下，在70%的酒精中 浸2-3s后，用滅菌去離子水沖洗3次，轉移到無菌的0. 85%生理鹽水中，用滅菌的玻璃棒將 病組織搗碎，無菌條件下于室溫靜置10-15min，然后用滅菌的移植環蘸取菌懸液在LB平板 上劃線，28°C培養16-24hr。從中挑取單菌落進一步劃線培養，轉接6_7次。根據軟腐歐文 氏菌能在結晶紫果膠培養基(CVP)上產生很深凹陷的特征，從凹陷中心挑取典型菌落在LB 培養基上劃線培養，挑取單菌落。
5
結晶紫果膠培養基(CVP)的配制在500ml煮沸的蒸餾水中，依次加入下列成分結晶紫的10%水溶液IOmlImol/L 氫氧化鈉(NaOH)4.5mlCaCl2H2O 1% (新鮮配置)4.0ml瓊脂2. Og硝酸鈉(NaNO3)1. Og隨后將聚果膠酸鈉加入，高速攪拌15s，分裝于三角瓶中滅菌(12rC，15min)后， 制成平板備用。實施例2菌種鑒定16SrDNA是編碼原核生物核糖體RNA小亞基16S rRNA的基因，長度為1540bp，是細 菌分類學研究中最常用、最有用的“分子鐘”，其序列包含10個可變區(variable region) 和與之相間的11個恒定區(constant region)。根據保守性可以設計出細菌的通用引物， 并且擴增出所有細菌的16S rDNA片段。可變區因細菌而異，能夠揭示生物物種特征核酸序 列，是種屬鑒定的分子基礎。提取軟腐果膠桿菌C519 (CGMCC No 3350) 16SrRNA,測得該菌16SrRNA基因的大部 分序列1445bp 的 SEQ ID No. 1。使用16S rDNA序列經RDP對比法對該菌分類顯示該菌為軟腐果膠桿菌屬軟腐亞 禾中(Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum)。將序列經 GenBank 數據庫同源性
比較結果表明該菌株與同屬的菌株最高相似性為99%，下表為相似度最高的部分菌株
6 采用16S rDNA序列近似菌株，采用鄰接法(NJ法)對軟腐果膠桿菌C519 (CGMCCNo 3350)進行系統進化分析，結果如圖1。綜上所述，將C519鑒定為果膠桿菌屬的一個新種。并因其能夠導致大白菜 軟腐病，所以命名為軟腐果膠桿菌軟腐亞種(Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum)C519。實施例3(1)培養基①斜面培養基(％——g/100ml，未注明的成分為水，下同)果膠2%，酵母浸出汁0.2%，氯化銨0.2%，磷酸氫二鉀0. 1%、碳酸鈉1%、瓊脂 2%②液體培養基200g馬鈴薯去皮切成片，加入到1000ml自來水中，煮沸30min。紗布過濾；濾液加 入蔗糖20g，定容至1000ml ； 120°C滅菌15分鐘。(2)C519(CGMCC No 3350)的培養將純化的軟腐果膠桿菌C519接種在斜面培養基上，30°C培養24小時，然后接種一 環此菌于液體培養基中，30°C 18小時，搖瓶轉速180rpm。(3)C519(CGMCC No 3350)用于分離纖維構樹皮切成IOcm的小段，浸沒在自來水中，液-皮質量比為1 5，用Na2CO3調整 PH值為11，按2% (ν/ν)的比例加入液體培養的軟腐果膠桿菌C519。通入空氣。前24小 時保持ΡΗ9 10。后24小時厭氧發酵，自然ρΗ值，25 29°C浸漬發酵48小時。用水力碎 漿機處理浸漬發酵的構樹皮，使其纖維分離；再經過除渣器去除黑色表皮等等固體殘渣，獲 得長纖維紙漿，得漿率大于70%。實施例4(1)培養基①斜面培養基果膠2%，酵母浸出汁0.2%，氯化銨0.2%，磷酸氫二鉀0. 1%、碳酸鈉1%、瓊脂
2 % ο②液體培養基(％—g/100ml，未注明的成分為水，下同)酵母提取物0.3%谷氨酸鈉0.4%KH2PO40. 3%NaH2PO40. 24%MgSO40. 02%CaCl20. 01%ρΗ7· 1250ml體積三角瓶中裝液體培養基50ml，120°C滅菌15分鐘(2)C519(CGMCC No 3350)的培養將純化的軟腐果膠桿菌C519接種在斜面培養基上，30°C培養24小時，然后接種一
8環此菌于三角搖瓶培養基中，30°C 18小時，搖瓶轉速180rpm。(3)C519(CGMCC No 3350)用于分離纖維①將構樹皮切成Icm左右的小段，浸入自來水中，液-皮質量比例為20 1，調整 pH為9. 2，120°C滅菌15分鐘。②按照5%液體培養的菌液量接種量，接種軟腐果膠桿菌C519至構樹皮浸泡液 中，調整pH為9. 2 ；30°C,180rpm浸漬發酵72小時。③用水力碎漿處理浸漬發酵的構樹皮，使其纖維分離；再經過除渣器去除黑色表 皮等等固體殘渣，獲得單纖維紙漿，得漿率為91. 1%。本發明未涉及部分均與現有技術相同或可采用現有技術加以實現。序列表<110>南京農業大學、南京天乾生物技術有限責任公司<120> 一種軟腐果膠桿菌及其在生物制漿中的應用<160>1
<210>1<211>1445<212>DNA<213> 軟腐果膠桿菌軟腐亞種(Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum)<220><223> 軟腐果膠桿菌 CGMCC No 3350 的 16S rDNA
<400>1
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一種軟腐果膠桿菌軟腐亞種(Pectobacterium carotovorum subsp.carotovorum)C519菌株，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No 3350。
2.權利要求1所述的軟腐果膠桿菌CGMCCNo 3350在生物制漿中的應用。
3.一種利用軟腐果膠桿菌CGMCC No 3350處理植物韌皮組織分離纖維的方法，其特 征在于將植物韌皮組織浸泡在水中，向其中接種經液體培養擴增的軟腐果膠桿菌CGMCCNo 3350，經過發酵將植物韌皮組織中的果膠分解導致植物纖維分離。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于所述的韌皮組織浸漬發酵溶液的初始pH值 為9 11。
5.根據權利要求3所述的方法，其特征在于所述的發酵分兩階段，第一階段為通氣發 酵，時間為24小時，加堿保持發酵體系的pH維持在9-10 ；第二階段為厭氧發酵，自然發酵2 6日。
全文摘要
本發明屬于造紙領域，公開了一種軟腐果膠桿菌及其在生物制漿中的應用。軟腐果膠桿菌軟腐亞種(Pectobacterium carotovorum subsp.carotovorum)C519，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No.3350。該菌株能夠在高堿性(pH11)條件下生長，適合植物韌皮纖維的脫膠工藝，可應用于生物紙漿。C519(CGMCC No.3350)可以在堿性條件下(pH9～11)生長，同時分泌高活性嗜堿性果膠酶(適宜的pH值為8-10)。在堿性范圍內一般其他微生物的生長繁殖困難，因而可防止其他雜菌的污染，并且堿性條件下，纖維素酶無活性，可以極大程度上保持韌皮纖維的原始性能，并提高得率。
文檔編號C12R1/01GK101899403SQ20091026313
公開日2010年12月1日 申請日期2009年12月16日 優先權日2009年12月16日
發明者于漢壽, 盧萬里, 張益民, 張艷紅, 謝維 申請人:南京農業大學;南京天乾生物技術有限責任公司