專利名稱：微生物同步發酵正十一烷生產十一碳二羧酸方法
技術領域：
本發明涉及微生物同步發酵正烷烴生產長鏈α，ω-二元酸的方法，尤其是發酵 正十一烷(以下簡稱nCn)高產α，ω-十一碳二羧酸(以下簡稱DC11)的方法。
背景技術：
C10以上的長鏈二元酸是化工上合成高級香料、高級尼龍工程塑料、高檔服裝用尼 龍熱熔膠、高溫電解質、高級涂料、潤滑油和耐寒性增塑劑等的重要原料，尤其是十三碳二 元酸(DC13)和十五碳二元酸(DC15),它們分別是合成日用香料麝香-T和名貴香料麝香酮的 重要原料。C10以上的長鏈二元酸，在自然界中不單獨存在，只有少數幾種二元酸可以從植物 油中裂解制取，例如癸二酸(DCltl)可從蓖麻籽油裂解制取；DC13可從菜籽油中抽提出甘油芥 酸酯再用臭氧氧化方法生產；DC15可從蒜頭果油中的腦神經酸裂解制取。但它們都受農田 和氣候的限制，遠不能滿足需要。除DC12以外，化工上至今也還沒有經濟可行的合成路線和 方法。微生物學家應用生物工程技術，利用微生物發酵石油中的正構烷烴生產相應鏈長的 二元酸，彌補了化工上的不足，開辟了長鏈二元酸的新來源。七十年代以前，各國科學家對微生物發酵生產二元酸的研究，只處于理論研究階 段，所產生和積累的二元酸也都是十個碳以下的短鏈二元酸，七十年代以后，進入應用研究 階段，通過大量的菌種誘變篩選，培育出一批新突變菌株，能從十個碳以上的正烷烴產生和 積累與基質鏈長相同的長鏈二元酸，并通過不斷的培育和代謝調控研究，使每升發酵液中 二元酸的積累從開始時的幾克、十幾克、幾十克，提高到目前的一百多克。八十年代以來，二 元酸的研究進入小規模工業化生產階段，并出現了幾個有實際生產價值的文獻。十一碳二元酸(DC11)是化工上合成尼龍工程塑料、潤滑油和農藥等的重要原料。 至今國內外還沒有經濟可行的化工合成方法。用生物合成法合成生產DC11的報道不多。目 前報道的最好的十一碳二元酸的發酵生產結果為在200m3發酵罐中，發酵時間165小時， 發酵液中DC11含量為120. 4g/L，烷烴轉化率為64. 55%。
發明內容
本發明的目的在于提供一種新的微生物菌種，以及利用該微生物菌種同步發酵正 烷烴生產Cltl-C18長鏈α，ω-二元酸的方法，尤其是同步發酵正十一烷烴，高產α，ω-十一 碳二元酸的方法。本發明所提供的菌種為熱帶假絲酵母(Candida tropicalis) ly_l，是以一株氧化 正烷烴生產混合二羧酸的熱帶假絲酵母參見《微生物學報》20 (1) =88-93,1980為出發菌 株，通過紫外線照射誘變、篩選培育出來的，具體步驟如下接一接種環上述熱帶假絲酵母菌體，裝于25ml麥芽汁液體培養15小時，分別取 3ml種液放入滅過菌并帶有一個玻璃磁轉子的培養皿中，打開培養皿蓋，在24W的紫外線燈 下16cm處照射lmin、2min、3min、4min，不同照射劑量的菌液稀釋10—1，在黑暗處放置2小時，用生理鹽水分別稀釋菌液10_4-10_6，吸取稀釋好的菌液0. Im涂布于10個巴林糖度的麥 芽汁瓊脂培養平板上，每個稀釋度涂布3個平板。將涂好的平皿用黑紙包好，置于28°C的培 養箱中培養2天，統計致死率。菌種篩選以出發菌株為對照，對誘變后的菌株進行發酵產酸試驗及產酸量檢測， 篩選出高產α，ω-十一碳二羧酸的菌株，即為熱帶假絲酵母(CandidatropicalisUy-l， 該菌種能以Cltl-C18的各種單一正烷烴和混合正烷烴，尤其是正十一烷為基質原料，發酵生 產出相應的長鏈二羧酸。本發明熱帶假絲酵母(Candida tropicalis) Iy-I已于2009年10月14日在中國 典型培養物保藏中心進行保藏，地址為中國武漢武漢大學，保藏號為CCTCC NO =M 209223。熱帶假絲酵母(Candida tropicalis) Iy-I的生理特性如下糖類的發酵葡萄糖+，半乳糖+，蔗糖+，麥芽糖+，乳糖_。同化葡萄糖+，半乳糖+，山梨糖-，蔗糖+，麥芽糖+，纖維二糖+，海藻糖+，乳糖-，密二糖-，棉子糖-，松三糖+，菊芋糖-，可溶性淀粉+，木糖+， L-阿戊糖+，D-阿戊糖_，核糖_，鼠李糖_，α -甲基葡萄糖苷+，甘油+，乙醇+，赤蘚醇-， 甘露醇+，肌醇_，核糠醇+，半乳糖醇_，葡萄糖醇+，檸檬酸鈉_，丁二酸鈉+，乳酸鈣_。生長素的需要生物素++，維生素B1++,維生素B2+,維生素B6+,維生素B12+,葉酸 +，煙酸+，泛酸+，肌醇+，對氨基苯甲酸+。其他硝酸鹽-，凍化牛奶_，熊果酸分解-，凝固牛奶-，油脂酶-。熱帶假絲酵母(Candida tropicalis) Iy-I形態特征奶油白色，皺褶型，菌落為 蛋糕狀和桃酥狀。培養特征在麥芽汁液體培養基中培養時，假菌絲多而長；在烷烴種子培養基中培養時，有一 定數量的短假菌絲；而在發酵培養基中發酵時，大部分是單個橢圓細胞。本發明所述同步發酵生產長鏈二羧酸，特別是十一碳二羧酸的方法是以熱帶假絲 酵母(Candida tropicalis) Iy-I為發酵菌種，在以正十一烷為基質的培養基中同步發酵， 生產α，ω-^碳二元酸。同步發酵生產二元酸過程中所使用的熱帶假絲酵母(Candida tropicalis) Iy-I 的種子培養方法如下種子培養基和發酵培養基(1). 10個巴林糖度的麥芽汁加2%瓊脂制成的固體斜面；(2). 10個巴林的麥芽汁液體培養基；(3).混合液體種子培養基包含=KH2PO4 6-12g/L，玉米漿3_8g/L，酵母膏3_8g/L， 蔗糖13-38g/L，尿素3-6g/L，自來水配制，自然PH。培養種子的過程為取一接種環熱帶假絲酵母Iy-I菌體，涂布在麥芽汁固體斜面 上(15\180試管，每支裝6-711^培養基，放成斜面)，于28-301培養40小時。取一支上述 培養好的熱帶假絲酵母Iy-I菌種刮入裝有25mL麥芽汁液體培養基的250mL三角瓶中，于 28-300C 220轉/分的旋轉搖床上培養40-48小時，作為搖瓶發酵種子或者取兩支上述培養 好的熱帶假絲酵母Iy-I菌種全部刮入裝有500mL混合液體種子培養基的5000mL三角瓶 中，于180轉/分旋轉搖床上28-30°C培養44-48小時，菌株生長光密度OD達到0. 6，作為一級種子罐的種子。同步發酵生產二元酸的方法如下發酵培養基的組成為堿金屬磷酸鹽6_14g/L (最好為7-10g/L)、氯化鈉
0.5-2. Og/L、酵母膏 l_6g/L(最好為 3-5g/L)、玉米漿 3_5g/L、尿素 0. 5-2. 5g/L(最好為
1.0-2. Og/L)、硝酸鹽 5-10g/L(最好為 6-8g/L)、蔗糖 10_30g/L(最好為 10_20g/L)、消泡劑 400-1200ppm以及一些其他公知的營養源。上述堿金屬磷酸鹽可從KH2PO4、NaH2P04、K2HPO4和Na2HPO4中選一種，硝酸鹽可從鉀 或鈉鹽中選一種。發酵基質正十一烷烴和發酵培養基在混合發酵液中的用量比例為10_45% (V/ V) WEi^ —烷烴(ncn)和55-90% (V/V)發酵培養基；，最好為10-20%的正i^一烷烴 (IiC11)和80-90%的發酵培養基。具體發酵過程如下將前述制備的發酵種子，按發酵培養基量的15-25% (V/V)的用量，接入PH 5. 5-9. 0，最好為 6. 5-8. 0 的含有 15-45% (V/V)正—^一烷烴(nCn)，最好為 10-20% 正i^一 烷烴(nCn)的發酵培養基混合液中，將上述混合物在25-32°C，最好在28-30°C，通氣發酵 48-160小時。28小時內，PH控制在6. 8以下，以菌體生長為主，產酸為副，此時菌株生長光 密度OD達到0. 4以上，產酸達到18-25g/L，在28-60小時，PH控制在7. 3以下，產酸為主， 菌體生長為副，此時OD達至0. 8左右，產酸達到45-65g/L，從60小時以后，每隔4_6小時用 NaOH溶液調一次PH至7. 5-8. 0，菌體量不再增加，而產酸量繼續迅速增加，發酵完成后將產 生的二羧酸從發酵液中分離出來。在發酵開始時，混合液中正烷烴含量最好為10-20% (V/ V)，以后在適當時間補加正烷烴，使發酵液中正烷烴濃度始終(V/V)為準。發酵結束后，加堿至PH10-12，加熱至85-90°C，進行破乳分層，上層為殘油，回收 再用，放出中間清液，下層菌體層再處理一次或壓濾或離心，合并清液，加入適量活性炭，在 85-900C，脫色30分鐘，除去活性炭后，脫色液加熱至60-70°C，加HCL或H2SO4至PH3-4進 行酸化結晶，冷卻至30°C后，壓濾，用空氣吹干，60°C烘干，得白色十一碳二羧酸結晶。其中在210m3發酵罐中，發酵IiC11生產DC11時，發酵150小時，產酸量達到156g/L， nCn轉化率86.7%，后處理總收率達到92%，DC11純度為98. 2%。與現有技術所報道的結 果相比較，發酵時間少15小時，DC11的產酸水平卻高30%，IiC11的轉化率高34. 3% 0應用本發明所述的熱帶假絲酵母Iy-I菌種和發酵方法，在以Cltl-C18的單一或混合 正烷烴為基質的培養基中同步發酵，可生產相應的Cltl-C18Ci，ω-二元酸。
具體實施例方式實施例1.(1).取一接種環熱帶假絲酵母Iy-I菌體，涂布在15 X 180大試管麥芽汁固體斜面 上，30°C培養兩天。(2).取(1)中培養好的菌種一支，接入裝有25mL混合液體種子培養基的250mL三 角瓶中，于30°C、220rpm的旋轉搖床上培養48小時。混合液體種子培養基中，KH2PO4 8g/L， 酵母膏5g/L，玉米漿3g/L，蔗糖25g/L，尿素3g/L，自來水配制，PH 5. 0。(3)在裝有15mL發酵培養基的500mL三角瓶中，接入3.5mL(2)中培養好的種子液，在220rpm的旋轉搖床上，30°C發酵4天，每24小時用NaOH調一次PH至7. 8。發酵培 養基含 KH2PO4 8g/L，NaCL lg/L，酵母膏 3g/L，玉米漿 3. 5g/L，尿素 1. 5g/L，KNO3 7g/L，泡敵 400ppm，及正i^一烷(IiC11) 200mL/L，自來水配制，PH 7. 1，110°C滅菌30分鐘。發酵結束后， 用HCL調PH至3，用120mL乙醚提取，除去乙醚，得白色DC11結晶，加入20mL中性乙醇溶解 DC11,用標準NaOH溶液滴定，計算二元酸量。結果DC11產量為78. 5g/L，DCn純度為97. 5%。實施例2.按照實施例1的方法，只是其中發酵基質IiC11用IiC13替代，所得的DC13產量為 53. 6g/L，純度 96.8%。實施例3.按照實施例1的方法，只是其中發酵基質IiC11用IiC15替代，所得的DC15產量為 58. 5g/L，純度 97. 2%0實施例4.按照實施例1的方法，只是其中發酵基質IiC11用IiC17替代，所得的DC17產量為 66. 2g/L，純度 96. 3%0實施例5.(1).取一接種環的熱帶假絲酵母Iy-I突變株的菌體，涂布在15 X 180大試管麥芽 汁固體斜面上，30°C培養2天，總共16支。(2).取2支(1)中培養好的Iy-I斜面菌種，接入裝有250mL 10個波林糖度的麥 芽汁液體的IOOOmL三角瓶中，共8瓶，放于220rpm的旋轉搖床上，28°C培養40小時，鏡檢 無雜菌，合并后共2000mL，作為一級種子罐種子。(3).把(2)中培養好的2000mL麥芽汁種液，接入裝有1400L混合液體種子培養基 的2000L種子罐中，于29 士 1°C，培養罐轉速為250rpm，罐壓為lkg，通氣量1 1，培養40 小時。鏡檢無雜菌后作為二級種子罐的種子。混合液體種子培養基中含有=KH2PO4 8g/L，酵 母膏5g/L，玉米漿3. 5g/L，蔗糖40g/L，尿素3. 5g/L，自來水配制，PH5. 0左右。(4).把(3)中培養好的1. 4m3的種子液，接入裝有22m3混合液體種子培養基同 (3)的30m3 二級種子罐中，于29 士 1°C，轉速170rpm，罐壓lkg，通氣量1 0.8，培養40小 時，鏡檢無雜菌，作為發酵種子。(5).把(4)中培養好的22m3種子液，接入裝有120m3發酵培養基的210m3發酵罐 中。發酵培養基含有KH2PO4 8g/L，酵母膏3g/L，玉米漿3.5g/L，氯化鈉lg/L，KNO3 7g/L， 尿素1. 5g/L，泡敵400ppm，NaAC 5g/L，加水至100m3，在121°C滅菌，降溫至30°C，加入30% 濃度工業燒堿，調PH至6. 9，加入滅過菌的IiC11 18m3，開始發酵，溫度控制29 士 1°C，攪拌速 度135rpm，罐壓lkg，通氣量1 0. 7。發酵過程中，40小時以內，PH控制在7. 3以下，40-70 小時，PH控制在7. 7以下，70-120小時，PH控制在8. 0以下，120小時后到發酵結束，PH控 制在8. 5以下，并于發酵60、90和120小時分別補加nCn6m3和定量的營養液。發酵150小 時。發酵清液含DC11為156g/L，IiC11轉化率為86. 7%。發酵結束后，加熱加堿破乳分層，通過膜分離方法，除去菌體，回收IiC11O. 2m3，清液 用活性炭脫色，壓濾去除活性炭，濾清液加熱至70°C，加濃H2SO4連續酸化，冷卻結晶，板框 壓濾、洗滌、吹干、烘干、精制，成為白色結晶固體粉末。收獲DC11總量21. 54T，后處理總收 率為92%, DC11純度為98. 2%0
權利要求
1.一種微生物同步發酵正十一烷生產十一碳二羧酸方法，其特征在于所用的微生物為 熱帶假絲酵母(Candida tropicalis) ly_l，該菌種已在中國典型培養物保藏中心保藏，保 藏號為CCTCC NO :M209223。
2.如權利要求1所述微生物同步發酵正十一烷生產十一碳二羧酸方法，其特征在于以 熱帶假絲酵母(Candida tropicalis) Iy-I為發酵種子，在以正十一烷為基質的培養基中同 步發酵，生產α，ω-十一碳二元酸。
3.如權利要求2所述微生物同步發酵正十一烷生產十一碳二羧酸方法，其特征在于所 說的發酵種子是由熱帶假絲酵母(Candida tropicalis) Iy-I菌株經斜面培養、液體種子培 養基培養，獲得一級種子罐的種子；所使用的固體斜面培養基為10個巴林糖度的麥芽汁加 2%瓊脂制成；液體培養基為10個巴林的麥芽汁；混合液體種子培養基包含KH2P046-12g/ L，玉米漿3-8g/L，酵母膏3-8g/L，蔗糖13_38g/L，尿素3_6g/L，自來水配制，自然PH。
4.如權利要求2所述微生物同步發酵正十一烷生產十一碳二羧酸方法，其特征在于所 說的同步發酵過程如下發酵培養基的主要組成為堿金屬磷酸鹽6-14g/L、氯化鈉0. 5-2. Og/L、酵母膏l_6g/ L、玉米漿 3-5g/L、尿素 0. 5-2. 5g/L、硝酸鹽 5-lOg/L、蔗糖 10_30g/L、消泡劑 400-1200ppm， 其中堿金屬磷酸鹽可從KH2PO4、NaH2PCVK2HPO4和Na2HPO4中選一種，硝酸鹽可從鉀或鈉鹽中 選一種；發酵基質正十一烷烴和發酵培養基在混合發酵液中的用量比例為10-45% (V/V)的 正十一烷烴和55-90% (V/V)發酵培養基；具體發酵操作方法為將發酵種子按發酵培養基量的15-25% (V/V)的用量，接入PH 5.5-9.0的含有 10-45% (V/V) Ei烷烴的發酵培養基的混合液中，在PH 5. 8-7. 5之間，將上述混合物在 25-32°C，通氣發酵48-160小時；28小時內，PH控制在6. 8以下，以菌體生長為主，產酸為 副，此時菌株生長光密度OD達到0.4以上，產酸達至IJ 18-258/1，在觀-60小時，PH控制在 7. 3以下，產酸為主，菌體生長為副，此時OD達至0. 8左右，產酸達到45-65g/L，從60小時 以后，每隔4-6小時用NaOH溶液調一次PH至7. 5-8. 0，菌體量不再增加，而產酸量繼續迅速 增加，發酵完成后，將產生的二羧酸從發酵液中分離出來；在發酵過程中，補加正烷烴，使發 酵液中正烷烴濃度始終≥5% (V/V)。
5.如權利要求2所述微生物同步發酵正十一烷生產十一碳二羧酸方法，其特征在于所 說的同步發酵過程如下發酵培養基的組成主要為堿金屬磷酸鹽7-10g/L、氯化鈉0. 5-2. Og/L、酵母膏3_5g/ L、玉米漿 3-5g/L、尿素 1. 0-2. 0g/L、硝酸鹽 6-8g/L、蔗糖 10_20g/L、消泡劑 400-1200ppm。 其中堿金屬磷酸鹽可從KH2PO4、NaH2PCVK2HPO4和Na2HPO4中選一種，硝酸鹽可從鉀或鈉鹽中 選一種。發酵基質正十一烷烴和發酵培養基在混合發酵液中的用量比例為10-20% (V/V)的 正十一烷烴和80-90% (V/V)的發酵培養基。具體發酵操作方法為將前述制備的發酵種子，按發酵培養基量的15-25% (V/V)的用量，接入PH為6. 5-8.0 的含有10-20%的正十一烷烴的發酵培養基的混合液中，將上述混合物在25-32°C，最好在28-30°C，通氣發酵48-160小時；28小時內，PH控制在6. 8以下，以菌體生長為主，產酸為 副，此時菌株生長光密度OD達到0.4以上，產酸達到18-258/1，在觀-60小時，PH控制在 7. 3以下，產酸為主，菌體生長為副，此時OD達至0. 8左右，產酸達到45-65g/L，從60小時 以后，每隔4-6小時用NaOH溶液調一次PH至7. 5-8. 0，菌體量不再增加，而產酸量繼續迅速 增加，發酵完成后將產生的二羧酸從發酵液中分離出來；在發酵過程中補加正烷烴，使發酵 液中正烷烴濃度始終彡5% (V/V)。
6.如權利要求2所述微生物同步發酵正十一烷生產十一碳二羧酸方法，其特征在于所 說的同步發酵結束后，加堿至PH 10-12，加熱至85-90°C，進行破乳分層，上層為殘油，回收 再用，放出中間清液，下層菌體層壓濾或離心分離出清液，與中層清液合并，加入適量活性 炭，在85-90°C，脫色30分鐘，除去活性炭后，脫色液加熱至60-70°C，加酸至PH 3-4進行酸 化結晶，冷卻至30°C后，壓濾，用空氣吹干，60°C烘干，得白色十一碳二羧酸結晶。
7.應用權利要求2 6所述微生物同步發酵正十一烷生產十一碳二羧酸方法，其特征 在于在以Cltl-C18的單一或混合正烷烴為基質的培養基中同步發酵，生產相應的Cltl-C18Ci， ω- 二元酸。
全文摘要
本發明公開了一種利用微生物同步發酵正十一烷(nC11)高產十一碳二羧酸(DC11)的方法。所用微生物為一株熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)ly-1保藏號為CCTCC NOM 209223。其特點是在微生物菌種接入正烷烴為基質的培養基后，28小時內，pH控制在6.8以下，以菌體生長為主，也產生一定量的二元酸；28-60小時，pH控制在7.3以下，以產酸為主，也增長一定量的菌體；60小時以后，pH控制在8.0以下，迅速產生各種二元酸。當本方法用于發酵正十一烷(nC11)生產十一碳二羧酸(DC11)時，在210m3發酵罐內，發酵150小時，DC11產量高達156g/L，轉化率達到86.7％，DC11純度達到98.2％。
文檔編號C12P7/44GK102115767SQ200910256588
公開日2011年7月6日 申請日期2009年12月30日 優先權日2009年12月30日
發明者曹務波, 曹荀梅子, 陳遠童 申請人:曹務波