專利名稱：恩拉霉素新產(chǎn)生菌及其高產(chǎn)突變株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域的肽類抗生素產(chǎn)生菌，特別是恩拉霉素新產(chǎn)生 菌及其高產(chǎn)突變株。
背景技術(shù)：
恩拉霉素，又名恩來霉素、恩霉素、安來霉素、持久霉素，是由土壤放線菌 Streptomyces fungicidious ATCC 21013發(fā)酵產(chǎn)生的一種多肽類抗生素。該藥于1966年 由日本武田藥品工業(yè)株式會(huì)社研發(fā)，1974年在日本正式注冊(cè)，其后在許多國(guó)家被注冊(cè)和廣 泛使用。該技術(shù)后被美國(guó)先靈葆雅動(dòng)物保健品有限公司收購(gòu)，并用于生產(chǎn)飼料預(yù)混劑。恩拉霉素對(duì)梭狀芽孢桿菌、鏈球菌、葡萄球菌、肺炎雙球菌等革蘭氏陽(yáng)性菌具有強(qiáng) 大的抗菌活性和優(yōu)良的促生長(zhǎng)及改善飼料利用率的作用，常作為禽、豬、魚的抗生素促生長(zhǎng) 劑。恩拉霉素具有很高的穩(wěn)定性，在制成顆粒料過程及與飼料混合后在室溫下長(zhǎng)期儲(chǔ)藏效 價(jià)下降甚微。恩拉霉素在腸道內(nèi)不被降解，能夠保持原有的抗菌活性。未吸收抗生素主要隨 糞便排出體外，故口服恩拉霉素藥物殘留很少。恩拉霉素為肽類抗生素，其排放到環(huán)境中， 容易被環(huán)境微生物所降解，從而對(duì)環(huán)境的污染程度小。實(shí)踐證明恩拉霉素是一種優(yōu)良的獸 用抗生素，具有用量低、低殘留、不易產(chǎn)生抗藥性及環(huán)境友好等特點(diǎn)。恩拉霉素為十七個(gè)氨基酸縮合的環(huán)肽，依據(jù)其連接的脂肪酸側(cè)鏈的長(zhǎng)度不同可分 為A、B兩個(gè)不同組分。Streptomyces fungicidious ATCC 21013的研究表明，恩拉霉素 生物合成基因簇包括四個(gè)非核糖體肽合酶(NRPQ基因及其它相關(guān)基因。本發(fā)明根據(jù)非核糖體肽合酶的保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物對(duì)海洋來源的鏈霉菌進(jìn)行篩選， 從中發(fā)現(xiàn)一株暗黑微綠鏈霉菌具有恩拉霉素生物合成相關(guān)的NRPS基因。對(duì)該鏈霉菌的發(fā) 酵產(chǎn)物的HPLC分析表明該菌株可產(chǎn)生恩拉霉素。后對(duì)原始菌株通過抗性誘變選育，獲得了 產(chǎn)量提高的可用于工業(yè)生產(chǎn)的恩拉霉素的新菌株。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一株通過基因篩選方法獲得的恩拉霉素新產(chǎn)生菌，該菌株 為暗黑微綠鏈霉菌(Sti^ptomyces atrovirens)，2009年10月23日保藏于位于北京的中 國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC No. 3365。本發(fā)明的另一目的在于提供一種前述恩拉霉素產(chǎn)生菌的突變菌株，該突變菌株 通過核糖體工程選育，且其產(chǎn)量比原始菌株提高70%。該突變菌株為暗黑微綠鏈霉菌 (Streptomyces atrovirens)，2009年10月23日保藏于位于北京的中國(guó)微生物菌種保藏管 理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC No. 3367。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，本發(fā)明涉及從海洋來源的鏈霉菌中篩選得到 產(chǎn)生肽類抗生素恩拉霉素的菌株，該方法具體為步驟一，提取待選鏈霉菌的基因組DNA ；步驟二，用針對(duì)非核糖體肽類合成酶設(shè)計(jì)的兼并引物對(duì)待選菌株基因組DNA進(jìn)行
3PCR擴(kuò)增；步驟三，將陽(yáng)性擴(kuò)增的片段進(jìn)行測(cè)序，并提交數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，獲得與已知化合物 恩拉霉素產(chǎn)生菌Mi^ptomyces fungicidicus的氨基酸序列相似性為96%的序列，其同源 性比較見圖1.步驟四，對(duì)菌株進(jìn)行發(fā)酵、有機(jī)溶劑萃取、HPLC分析，同時(shí)與恩拉霉素標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn) 行比較，確定菌株產(chǎn)恩拉霉素的能力(見附圖3)；步驟五，測(cè)定菌株16S rDNA序列，確定菌株的分類地位；獲得菌株CGMCC N0.3365 的 16S rDNA 基因片段 1487bp (SEQ ID NO 1)，提交 feTaxon數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較，其與已知鏈霉菌Mi^ptomyces atrovirens NRRL B-16357的相 似性為99.6%。確定菌株為暗黑微綠鏈霉菌(Sti^ptomyces atrovirens)。1 AGAGTTTGAT CCTGGCTCAG GACGMCGCT GGCGGCGTGC TTAACACATG CAAGTCGAAC61 GATGMCCAC TTCGGTGGGG ATTAGTGGCG MCGGGTGAG TMCACGTGG GCMTCTGCC121 CTGCACTCTG GGACAAGCCC TGGAMCGGG GTCTMTACC GGATACTGAC CCGCCTGGGC181 ATCCAGGCGG TTCGAMGCT CCGGCGGTGC AGGATGAGCC CGCGGCCTAT CAGCTTGTTG241 GTGAGGTAAC GGCTCACCAA GGCGACGACG GGTAGCCGGC CTGAGAGGGC GACCGGCCAC301ACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACM
361TGGGCGMAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACC
421TCTTTCAGCAGGGAAGMGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTAC
481GTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCGAGCGTTGTCCGGMTTATTGGGCGTAM
541GAGCTCGTAGGCGGCTTGTCGCGTCGGTTGTGAAAGCCCGGGGCTTAACCCCGGGTCTGC
601AGTCGATACGGGCAGGCTAGAGTTCGGTAGGGGAGATCGGMTTCCTGGTGTAGCGGTGA
661AATGCGCAGATATCAGGAGGMCACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCCGATACTGAC
721GCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTA
781AACGGTGGGCACTAGGTGTGGGCGACATTCCACGTCGTCCGTGCCGCAGCTAACGCATTA
841AGTGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAMACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCC
901GCACAAGCGGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTT
961GACATACACCGGAAACGTCTGGAGACAGGCGCCCCCTTGTGGTCGGTGTACAGGTGGTGC
1021ATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCC
1081TTGTCCCGTGTTGCCAGCAGGCCCTTGTGGTGCTGGGGACTCACGGGAGACCGCCGGGGT
1141CMCTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTGCA
1201CACGTGCTACMTGGCCGGTACAATGAGCTGCGATACCGCGAGGTGGAGCGMTCTCAAA
1261AAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGMGTCGGAGTCGCTAG
1321TMTCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGT
1381CACGTCACGAMGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCCAACCCCTTGTGGGAGGGAGCT
1441GTCGAAGGTGGGACTGGCGATTGGGACGAAGTCGTAACAAGGTAACC步驟六，對(duì)原始菌株進(jìn)行核糖體工程誘變和篩選，獲得產(chǎn)量提高的菌株；步驟七，比較原始菌株和突變菌株的合成核糖體S12蛋白的rpsL基因，確定突變 株的基因突變位點(diǎn)；第88位氨基酸由K變?yōu)镽。步驟八，將原始菌株和突變菌株進(jìn)行發(fā)酵，對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行高效液相色譜分析，確定突變菌株的產(chǎn)量提高了 70%。本發(fā)明獲得以下有益的效果本發(fā)明通過特定的抗生素生物合成基因篩選方 法，獲得一株恩拉霉素產(chǎn)生菌。通過16S rDNA基因序列比對(duì)，確定為暗黑微綠鏈霉菌 (Str印tomycesatrovirens)，其為一株恩拉霉素的新產(chǎn)生菌。本發(fā)明通過核糖體工程誘變 的方法，獲得鏈霉素抗性的突變株，其產(chǎn)量比原始菌株提高了 70%。通過基因篩選的方法，預(yù)測(cè)菌株產(chǎn)生化合物的種類，減少了分離提取及鑒定化合 物的重復(fù)工作；篩選得到已知化合物的新產(chǎn)生菌，在生理性狀上進(jìn)行改良，可能獲得比已知 的產(chǎn)生菌更利于工業(yè)生產(chǎn)的菌株；通過核糖體工程改造，獲得比出發(fā)菌株提高70%的突變 株，具有明顯的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。
圖1為本發(fā)明與已知化合物恩拉霉素產(chǎn)生菌Mi^ptomyces fungicidicus的氨基 酸序列同源性比較；圖2為突變位點(diǎn)示意圖，示突變株rpsL基因第88位氨基酸由K變?yōu)镽 ；圖3為突變菌株與野生型菌株發(fā)酵產(chǎn)物的高效液相色譜分析圖；其中A代表恩拉霉素組分A ；B代表恩拉霉素組分B。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)例將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前 提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。 下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的 條件。步驟一，待選鏈霉菌總DNA的提取用500 μ 1溶菌酶溶液懸浮5mg菌絲體，在37°C溫育直至細(xì)胞成為半透明狀。加入 50%體積的2% SDS，混合振蕩約Imin直到溶液的粘度顯著下降，然后加入1倍體積的中性 苯酚/氯仿，混合振蕩均勻后，12000rpm離心5min，移取上清液，棄去白色中間層。用中性 苯酚/氯仿重復(fù)抽提直至看不見(或非常少)中間層為止，最后，加入0. 1倍體積的3mol/ L醋酸鈉(自然pH)和1倍體積的異丙醇，上下顛倒混合直至出現(xiàn)白色絮狀DNA沉淀團(tuán)，用 玻棒挑出DNA沉淀團(tuán)，用70%乙醇洗滌DNA沉淀團(tuán)兩次，最后棄去所有上清液，待乙醇揮發(fā) 后，用一定量TE緩沖液溶解DNA沉淀待用。步驟二，肽類抗生素產(chǎn)生菌的篩選以備選菌株總DNA為PCR模板，利用引物NRPSA/NRPSB篩選具有非核糖體多肽合 成酶基因的菌株，其中引物序列為NRPSA :5’-GCS TAC SYS ATS TAC ACS TCS GG_3’;NRPSB: 5’ -SAS GTC VCC SGT SCG GTA S_3’。該對(duì)引物擴(kuò)增的標(biāo)靶為非核糖體多肽合成酶所含模 塊中的腺苷?；Y(jié)構(gòu)域。20 μ L擴(kuò)增反應(yīng)體系為包含9 μ LddH20、2 μ LlO XPCR Buffer、1 μ L DMSO,引物 NRPSA/NRPSB (20 μ Μ)各 1 μ L、4 μ L dNTP (each 2. 5mM)、1 μ L Taq 酶(lunit/ μ L)、1 μ L總DNA0 PCR擴(kuò)增條件為95°C預(yù)變性3min，然后94°C變性lmin，55°C退火lmin， 72°C延伸lmin共30個(gè)循環(huán)，再72°C后延伸IOmin。PCR產(chǎn)物經(jīng)0. 8%的瓊脂糖凝膠電泳分 離后，切出擴(kuò)增目的條帶，用Gel Extraction Kit試劑盒回收純化。將回收后的片段送測(cè)序公司進(jìn)行分析。將測(cè)序所得核酸序列翻譯為氨基酸序列，氨基酸序列在ExPASy中利用 Blast進(jìn)行同源性比對(duì)，根據(jù)同源性比對(duì)結(jié)果判斷是否為預(yù)期擴(kuò)增基因的片段。用翻譯所 得的氨基酸序列，使用DNAMAN進(jìn)行蛋白序列之間相似性的比對(duì)。菌株CGMCC NO. 1擴(kuò)增所 得NRPS氨基酸序列與已知的恩拉霉素產(chǎn)生菌Mi^ptomycesfungicidious ATCC 21013的 相似性為90%，證明菌株可能產(chǎn)生恩拉霉素。步驟三，原始菌株發(fā)酵產(chǎn)物的分析取菌株CGMCC孢子懸液接種5ml TSB培養(yǎng)基，28°C，200rpm振蕩培養(yǎng)兩天后接種發(fā) 酵培養(yǎng)基，28 0C，200rpm發(fā)酵。第八天取發(fā)酵液，SOOOrpm離心10分鐘收集菌體。將菌絲體沉淀按照如下步驟處 理，用于HPLC分析。12g菌體沉淀一30ml去離子水洗一30ml甲醇重懸一15W超聲處理 2min — 18°C 230rpm 振搖 3h — 2000g 離心 20min — 35°C減壓蒸干—10ml90% 甲醇重懸 —IM HCl調(diào)pH 4.3 - 2000g離心20分鐘一上清用0. 45mm纖維素膜過濾后使用高效液 相色譜分析。色譜分析工作條件為色譜柱Aglilent zorbax_C18，5 μ m，4. 6拉50讓，流速 1. Oml/min ；流動(dòng)相含30%乙腈和70%的50mM磷酸二氫鈉(pH 4. 5)，檢測(cè)波長(zhǎng):267nm ；柱 溫25°C。利用購(gòu)自美國(guó)MP公司的恩拉霉素標(biāo)準(zhǔn)樣品做為對(duì)照，通過保留時(shí)間及特定的紫外 吸收特征證明菌株CGMCC可以產(chǎn)生恩拉霉素。發(fā)酵培養(yǎng)基配方可溶性淀粉3g，大豆餅粉 2g，玉米漿 lg, NaCl 3g, CaC03 0. 5g, K2HP04 0. 2g, FeS04 0. Olg，水 100ml。步驟四，產(chǎn)恩拉霉素菌株的分類地位的確定以菌株CGMCC的NO. 1總DNA為PCR模板，禾丨』用弓丨物27F/1492R擴(kuò)增 菌株的 16S rDNA。弓丨物序列為 27F :5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，；1492R 5，-GGTTACCTTGTTACGACTT-3，。20 μ L 擴(kuò)增反應(yīng)體系為包含 9 μ LddH20、2 μ L 10XPCR BufferU μ L DMS0、引物 27F/1492R(20 μ Μ)各 1 μ L、4 μ L dNTP (each 2. 5mM) UuL Taq 酶 (lunit/μ L)、1 μ L 總 DNA0 PCR 擴(kuò)增條件為95°C預(yù)變性 3min，然后 94°C變性 50sec，55°C 退火50sec，72°C延伸Imin共30個(gè)循環(huán)，72°C后延伸IOmin。PCR產(chǎn)物經(jīng)0. 8%的瓊脂糖凝 膠電泳分離后，切出擴(kuò)增目的條帶，用Gel Extraction Kit試劑盒回收純化。將回收后的 片段送測(cè)序公司進(jìn)行分析。將獲得的基因序列信息提交NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，確定菌株為 暗黑微綠鏈霉菌(Streptomyces atrovirens)。步驟五，核糖體工程選育恩拉霉素高產(chǎn)突變株接種該菌株于高氏平板培養(yǎng)7-10天，收集成熟的孢子，制備孢子懸液。配置 GYM培養(yǎng)基，設(shè)置合適的鏈霉素濃度梯度，制備抗性平板。每個(gè)平板取100 μ 1孢子懸液涂 布，測(cè)定野生型菌株CGMCC對(duì)鏈霉素的最小抑制濃度(MIC)。將野生菌株孢子分別涂布5 X， 10X，50XMIC的鏈霉素抗性平板。培養(yǎng)15-20天后，挑取鏈霉素抗性菌株，并劃線純化。以 枯草芽孢桿菌作制備指示平板，比較突變菌株和野生型菌株的抗菌能力，篩選獲得抗菌能 力提高的突變菌株。步驟六，分析高產(chǎn)突變菌株的rpsL基因突變位點(diǎn)提取野生型菌株與突變菌株的總DNA，用引物rpslF/rpslR擴(kuò)增菌株的rpsL基 因。20μ L 擴(kuò)增反應(yīng)體系為包含 9μ LddH20、2y L10XPCR BufferU μ L DMS0、引物 rpslF/ rpslR(20yM)各 lyL、4yL dNTP (each 2. 5mM) UuL Taq 酶(lunit/μ L)、1 μ L 總 DNA。 PCR擴(kuò)增條件為95°C預(yù)變性:3min，然后94°C變性lmin，55°C退火lmin，72°C延伸Imin共30個(gè)循環(huán)，72°C后延伸lOmin。PCR產(chǎn)物經(jīng)0. 8%的瓊脂糖凝膠電泳分離后，切出擴(kuò)增目的 條帶，用Gel Extraction Kit試劑盒回收純化。將回收后的片段送測(cè)序公司進(jìn)行分析。將 獲得的堿基序列通過DNAMAN分析軟件進(jìn)行比較，分析rpsL基因的突變位點(diǎn)。
步驟七，利用高效液相色譜對(duì)野生型菌株和突變菌株產(chǎn)生的恩拉霉素含量的檢測(cè) 將菌株CGMCC和CGMCC相同條件接種發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行搖瓶發(fā)酵。第八天取發(fā)酵液，按照步 驟四所述的方法對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行收集和樣品的提取。利用高效液相色譜分析野生型菌株和突 變菌株產(chǎn)恩拉霉素的含量。用美國(guó)MP公司的恩拉霉素標(biāo)準(zhǔn)樣品做為對(duì)照。
圖2為突變株CGMCC與野生型菌株CGMCC發(fā)酵產(chǎn)物的高效液相色譜分析結(jié)果，檢 測(cè)結(jié)果表明，突變株CGMCC產(chǎn)恩拉霉素的量比野生型菌株高15%。
上述僅為本發(fā)明的具體實(shí)施例，但本發(fā)明的設(shè)計(jì)構(gòu)思并不局限于此，凡利用此構(gòu) 思對(duì)本發(fā)明進(jìn)行非實(shí)質(zhì)性的改動(dòng)，均應(yīng)屬于侵犯本發(fā)明保護(hù)范圍的行為。 序列表
<110>國(guó)家海洋局第三海洋研究所 <120>恩拉霉素新產(chǎn)生菌及其高產(chǎn)突變株 <160>1 <210>1 <211>1487 <212>DNA
<213> 暗黑微綠鏈霉菌(Sti^ptomyces atrovirens) <400>1
60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960
GACATACACC GGAMCGTCT GGAGACAGGC GCCCCCTTGT GGTCGGTGTA CAGGTGGTGC 1020 ATGGCTGTCG TCAGCTCGTG TCGTGAGATG TTGGGTTMG TCCCGCMCG AGCGCMCCC 1080 TTGTCCCGTG TTGCCAGCAG GCCCTTGTGG TGCTGGGGAC TCACGGGAGA CCGCCGGGGT 1140AGAGTTTGATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAAC
GATGAACCACTTCGGTGGGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCC
CTGCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTMTACCGGATACTGACCCGCCTGGGC
ATCCAGGCGGTTCGAMGCTCCGGCGGTGCAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTG
GTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCAC
ACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACM
TGGGCGMAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACC
TCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGMAGTGACGGTACCTGCAGMGAAGCGCC GGCTMCTAC
GTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCGAGCGTTGTCCGGMTTATTGGGCGTAM
GAGCTCGTAGGCGGCTTGTCGCGTCGGTTGTGAAAGCCCGGGGCTTAACCCCGGGTCTGC
AGTCGATACGGGCAGGCTAGAGTTCGGTAGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGA
AATGCGCAGATATCAGGAGGMCACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCCGATACTGAC
GCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTA
AACGGTGGGCACTAGGTGTGGGCGACATTCCACGTCGTCCGTGCCGCAGCTAACGCATTA
AGTGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAMACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCC
GCACAAGCGGCGGAGCATGTGGCTTMTTCGACGCAACGCGAAGMCCTTACCMGGCTT
CMCTCGGAGGMGGTGGGGACGACGTCMGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTGCA1200
CACGTGCTACMTGGCCGGTACMTGAGCTGCGATACCGCGAGGTGGAGCGMTCTCAM1260
MGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCMCTCGACCCCATGMGTCGGAGTCGCTAG1320
TMTCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGMTACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGT1380
CACGTCACGAMGTCGGTMCACCCGMGCCGGTGGCCCAACCCCTTGTGGGAGGGAGCT1440
GTCGMGGTGGGACTGGCGATTGGGACGMGTCGTMCMGGTMCC148權(quán)利要求
1.一種恩拉霉素的產(chǎn)生菌，其特征在于該菌種暗黑微綠鏈霉菌(Sti^ptomyces atrovirens)的保藏號(hào)為 CGMCC No. 3365。
2.—種恩拉霉素產(chǎn)生菌的突變株，其特征在于該突變株為權(quán)利要求1所述的暗黑微 綠鏈霉菌CGMCC No. 3365的鏈霉素抗性突變株，其突變特征是rpsL基因第176位堿基發(fā)生 點(diǎn)突變，由T轉(zhuǎn)變?yōu)镃。
3.如權(quán)利要求2所述的一種恩拉霉素產(chǎn)生菌的突變株，其特征在于該突變株的微生物 菌種保藏號(hào)為CGMCC No. 3367。
4.一種生產(chǎn)恩拉霉素的方法，其特征在于采用權(quán)利要求1或2或3所述的菌株。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種恩拉霉素新產(chǎn)生菌及其高產(chǎn)突變株。本發(fā)明利用針對(duì)肽類抗生素合成基因保守區(qū)域設(shè)計(jì)的引物篩選海洋環(huán)境分離得到的鏈霉菌，通過同源性比對(duì)獲得肽類抗生素恩拉霉素的新產(chǎn)生菌。本發(fā)明還利用核糖體工程技術(shù)選育出恩拉霉素產(chǎn)量提高的突變株。本發(fā)明為發(fā)酵生產(chǎn)恩拉霉素提供了新的菌種來源，且其突變菌株可用于工業(yè)生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12P21/04GK102080056SQ200910253869
公開日2011年6月1日 申請(qǐng)日期2009年12月1日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月1日
發(fā)明者徐俊, 肖靜, 馬光輝 申請(qǐng)人:國(guó)家海洋局第三海洋研究所