專利名稱：：一種檢測陰道分泌物中細菌菌群的試劑盒及其制備方法
技術領域：
：本發明涉及一種檢測微生物的試劑盒及其制備方法，具體地說，涉及一種檢測陰道分泌物中需氧菌/厭氧菌和兼性厭氧菌的試劑盒及其制備方法。
背景技術：
：近來研究發現，女性細菌性陰道感染可分為兩種，一種是由厭氧菌和兼性厭氧菌引起的，臨床上稱細菌性陰道病BV，另一種是由需氧菌引起的，臨床上稱需氧菌陰道炎AV。兩種陰道炎的病原體不同，臨床癥狀和治療方案也不相同，區別這兩種陰道感染，在細菌性陰道感染檢測中具有重要的意義。臨床上主要根據微生物學檢驗和臨床表現來鑒定陰道感染，其中將微生物學檢驗結果作為確診的依據。BV的診斷金標準仍為1983年制定的Amsel方法，我國將唾液酸苷酶也納入了BV的診斷標準。由于Amsel需做四項檢測，特別是濕片鏡檢尋找線索細胞十分費時，不便于臨床常規，特別是醫院門診等的使用。在我國主要采用單項唾液酸苷酶檢測BV，但由于許多細菌和真菌均可以產生唾液酸苷酶，因此，單獨使用唾液酸苷酶診斷BV時，易造成誤診。AV的診斷主要采用Gilbert提出的，經Tempera修改的綜合診斷方法，其診斷標準為①異常陰道黃色分泌物；②陰道ra升高〉5.0;③分泌物有異味，KOH試驗陰性；陰道分泌物高倍鏡檢發現大量白細胞；⑤DonderAV評分〉l分。其中，AV評分為必備指標，但AV評分十分復雜，需綜合陰道分泌物中乳酸桿菌分級、白細胞數量以及中毒白細胞所占比例、背景菌落數等指標，不適于在臨床常規，特別是醫院門診等的使用。
發明內容本發明的目的是提供一種陰道分泌物中需氧菌/厭氧菌和兼性厭氧菌的AV/BV聯合檢測試劑盒。本發明的另一目的是提供所述試劑盒的制備方法。為了實現本發明目的，本發明的一種檢測陰道分泌物中細菌菌群的試劑盒，包括1)反應裝置所述反應裝置具有過氧化氫反應孔、唾液酸苷酶反應孔、白細胞酯酶反應孔、e-葡萄糖醛酸酶反應孔和凝固酶反應孔；2)—種或多種顯色劑。前述的試劑盒，其還包括樣品稀釋液。前述的試劑盒，所述反應裝置的過氧化氫反應孔包被有辣根過氧化物酶和二乙氨基對苯二胺。前述的試劑盒，所述反應裝置的唾液酸苷酶反應孔包被有5-溴-4-氯-3-吲哚-N-乙酰神經氨酸鹽，其對應的顯色劑A為固紫B或固紅TR。前述的試劑盒，所述反應裝置的白細胞酯酶反應孔包被有5-溴-4-氯-3-吲哚-乙酸鹽。前述的試劑盒，所述反應裝置的13-葡萄糖醛酸酶反應孔包被有5-溴-4-氯-3-吲5哚-e-葡萄糖醛酸鹽。前述的試劑盒，所述反應裝置的凝固酶反應孔包被有甘氨酰精氨酸13萘胺，其對應的顯色劑B為固藍B、固紅B、固藍BB或固藍RR，優選固藍B。前述的試劑盒，所述樣品稀釋液中含有TritonX100和樹膠。前述的試劑盒，所述反應裝置按如下方法制備獲得1)反應基板的制備反應基板由ABS工程塑料制成，其上有5個①4mm的圓孔，分別為過氧化氫反應孔、唾液酸苷酶反應孔、白細胞酯酶反應孔、P_葡萄糖醛酸酶反應孔和凝固酶反應孔，在每個反應孔中填入下述相應的反應墊；2)過氧化氫反應墊的制備溶液A:二乙氨基對苯二胺10mga-萘酚20mg無水乙醇10ml溶液B:辣根過氧化物酶10000單位失活純化的牛血清白蛋白lgTris-HCl200,1/LpH7.010ml將溶液A1ill滴加在①4mm層析紙墊上，避光條件下，25"流動空氣干燥1小時后，在紙墊上滴加溶液B1ii1，避光條件下，25t:流動空氣干燥4小時，密封保存在2-8°C;3)唾液酸苷酶反應墊的制備底物溶液5-溴-4-氯-3-吲哚-N-乙酰神經氨酸鹽0.05g乙酸鹽溶液200mmol/LpH5.510ml，其中含NaClO.2mol/L將底物溶液1ii1滴加在①4mm層析紙墊上，避光條件下，25。C流動空氣干燥4小時，密封保存在2-8°C;4)白細胞酯酶反應墊的制備底物溶液5-溴-4-氯-3-吲哚-乙酸鹽0.05g磷酸鹽緩沖液200mmol/LpH7.010ml，其中含硫酸鈉2wt%將底物溶液1ii1滴加在①4mm層析紙墊上，避光條件下，25。C流動空氣干燥4小時，密封保存在2-8°C;5)13-葡萄糖醛酸酶反應墊的制備底物溶液5-溴-4-氯-3-吲哚-13-葡萄糖醛酸鹽0.05g磷酸鹽緩沖液200mmol/LpH7.010ml，其中含乙二醇50mmol/L將底物溶液1ii1滴加在①4mm層析紙墊上，避光條件下，25。C流動空氣干燥4小時，密封保存在2-8°C;6)凝固酶反應墊的制備底物溶液甘氨酰精氨酸13萘胺0.05gTris-HCl200,1/LpH8.510ml將底物溶液1ii1滴加在①4mm層析紙墊上，避光條件下，25。C流動空氣干燥4小時，密封保存在2-8°C;將2)6)制備的反應墊填入相應的反應孔中，用沖壓機壓實，在孔上粘貼鋁箔保6護膜，裝入鋁箔袋中，即得反應裝置。前述試劑盒的制備方法，包括如下步驟1)反應基板的制備反應基板由ABS工程塑料制成，其上有5個①4mm的圓孔，分別為過氧化氫反應孔、唾液酸苷酶反應孔、白細胞酯酶反應孔、P_葡萄糖醛酸酶反應孔和凝固酶反應孔，在每個反應孔中填入下述相應的反應墊；2)過氧化氫反應墊的制備溶液A:二乙氨基對苯二胺10mga-萘酚20mg無水乙醇10ml溶液B:辣根過氧化物酶10000單位失活純化的牛血清白蛋白lgTris-HCl200mmol/LpH7.010ml將溶液A1ill滴加在①4mm層析紙墊上，避光條件下，25"流動空氣干燥1小時后，在紙墊上滴加溶液Blyl，避光條件下，25t:流動空氣干燥4小時，密封保存在2-8t:;3)唾液酸苷酶反應墊的制備底物溶液5-溴-4-氯-3-吲哚-N-乙酰神經氨酸鹽0.05g乙酸鹽溶液200mmol/LpH5.510ml，其中含NaClO.2mol/L將底物溶液1ii1滴加在①4mm層析紙墊上，避光條件下，25。C流動空氣干燥4小時，密封保存在2-8°C;4)白細胞酯酶反應墊的制備底物溶液5-溴-4-氯-3-吲哚-乙酸鹽0.05g磷酸鹽緩沖液200mmol/LpH7.010ml，其中含硫酸鈉2wt%將底物溶液1ii1滴加在①4mm層析紙墊上，避光條件下，25。C流動空氣干燥4小時，密封保存在2-8°C;5)13-葡萄糖醛酸酶反應墊的制備底物溶液5-溴-4-氯-3-吲哚-13-葡萄糖醛酸鹽0.05g磷酸鹽緩沖液200mmol/LpH7.010ml，其中含乙二醇50mmol/L將底物溶液1ii1滴加在①4mm層析紙墊上，避光條件下，25。C流動空氣干燥4小時，密封保存在2-8°C;6)凝固酶反應墊的制備底物溶液甘氨酰精氨酸13萘胺0.05gTris-HCl200,1/LpH8.510ml將底物溶液1ii1滴加在①4mm層析紙墊上，避光條件下，25。C流動空氣干燥4小時，密封保存在2-8°C;7)將2)6)制備的反應墊填入相應的反應孔中，用沖壓機壓實，在孔上粘貼鋁箔保護膜，裝入鋁箔袋中，即得反應裝置；8)樣品稀釋液的制備TritonX10020g阿拉伯樹膠10g防腐劑Proclin3000.2g蒸餾水1000ml;9)顯色劑A的制備固紫B1.5gTritonXlOO2gPVPK304g蒸餾水1000ml充分混勻，分裝在深色瓶中；10)顯色劑B的制備固藍B1.5gTritonXlOO2gPVPK304g蒸餾水1000ml充分混勻，分裝在深色瓶中。本發明AV/BV聯合檢測試劑盒的使用方法為用棉簽從陰道后穹隆取陰道分泌物，放入軟塑料試管中，加入O.5ml樣S5稀釋液，用手擠壓試管，使分泌物與樣品稀釋液混勻，取出棉簽，用吸管取稀釋后的樣品，滴加在反應裝置的反應孔中，每孔1滴(約30iU)，在唾液酸苷酶孔中加入1滴(約30iU)顯色劑A，將反應裝置放在5(TC干浴器上反應lOmin，在凝固酶反應孔中加1滴(約30y1)顯色劑B，結果如表l所示表l檢測項目陽性陰性過氧化氫淡紫色,監唾液酸苷酶紫色無色白細胞酯酶,監無色e-葡萄糖醛酸酶,監無色凝固酶紫色淺黃色結果表明唾液酸苷酶陽性+過氧化氫陽性的為8￥，過氧化氫陽性+白細胞酯酶陽性伴有13-葡萄糖醛酸酶、凝固酶陽性或其中之一陽性的為AV。在本發明中，AV的主要致病菌金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、埃希氏大腸桿菌產生凝固酶GADP，B族鏈球菌和埃希氏大腸桿菌可產生13-葡萄糖醛酸酶；BV的主要致病菌消化鏈球菌、普雷沃菌和加德納菌可產生唾液酸苷酶；白細胞酯酶是一種炎性反應指標，患AV8時，陰道分泌物出現大量中毒白細胞，白細胞酯酶上升；兩種陰道感染的致病菌均出現產過氧化氫的乳酸桿菌減少甚至消失的現象。基于這些研究結果，本發明建立了一種簡便、快速的AV/BV聯合測定試劑盒，包括過氧化氫的檢測、唾液酸苷酶、白細胞酯酶、13_葡萄糖醛酸酶和凝固酶活性的檢測。本發明的優點在于，AV/BV聯合檢測試劑盒通過對過氧化氫的測定以及對唾液酸苷酶、白細胞酯酶、P_葡萄糖醛酸酶和凝固酶的活性的測定，從而直接鑒定出陰道分泌物中的需氧菌/厭氧菌和兼性厭氧菌等菌群，該方法操作簡便快速，準確性高，適于臨床常規特別是醫院門診的使用。圖1為本發明AV/BV聯合檢測試劑盒的反應裝置示意圖，其中1代表反應基板，2為過氧化氫反應孔，3為唾液酸苷酶反應孔，4為白細胞酯酶反應孔，5為13-葡萄糖醛酸酶反應孔，6為凝固酶反應孔。具體實施例方式以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。實施例1AV/BV聯合測定試劑盒制備1、過氧化氫反應墊的制備溶液A:二乙氨基對苯二胺10mga-萘酚20mg無水乙醇10ml溶液B:辣根過氧化物酶10000單位失活純化的牛血清白蛋白lgTris-HCl200mmol/LpH7.010ml將溶液A1ii1滴加在①4mm層析紙墊上，避光條件下，25t:流動空氣干燥1小時后，在紙墊上滴加溶液B1ii1，避光條件下，25t:流動空氣干燥4小時，密封保存在4°C;2、唾液酸苷酶反應墊的制備底物溶液5-溴-4-氯-3-吲哚-N-乙酰神經氨酸鈉鹽0.05g乙酸鹽溶液200mmol/LpH5.510ml，其中含NaClO.2mol/L將底物溶液lyl滴加在①4mm層析紙墊上，避光條件下，25t:流動空氣干燥4小時，密封保存在4t:;3、白細胞酯酶反應墊的制備底物溶液5-溴-4-氯-3-吲哚-乙酸鈉鹽0.05g磷酸鹽緩沖液200mmol/LpH7.010ml，其中含硫酸鈉2wt%將底物溶液lyl滴加在①4mm層析紙墊上，避光條件下，25t:流動空氣干燥4小時，密封保存在4t:;4、13-葡萄糖醛酸酶反應墊的制備底物溶液5-溴-4-氯-3吲哚-13_葡萄糖醛酸鈉鹽0.05g磷酸鹽緩沖液200mmol/LpH7.010ml，其中含乙二醇50mmol/L將底物溶液lyl滴加在①4mm層析紙墊上，避光條件下，25t:流動空氣干燥4小時，密封保存在4t:;5、凝固酶反應墊的制備底物溶液甘氨酰精氨酸P萘胺0.05gTris-HCl200mmol/LpH8.510ml將底物溶液滴加在①4mm層析紙墊上，避光條件下，25t:流動空氣干燥4小時，密封保存在4t:;6、反應裝置的制備反應裝置由ABS工程塑料制成，其上有5個①4mm的圓孔，從上至下分別在孔中填入上述過氧化氫反應墊、唾液酸苷酶反應墊、白細胞酯酶反應墊、P_葡萄糖醛酸酶反應墊和凝固酶反應墊，用沖壓機壓實，在孔上粘貼鋁箔保護膜，裝入鋁箔袋中；7、樣品稀釋液的制備TritonXlOO20g阿拉伯樹膠10g防腐劑Proclin3000.2g蒸餾水1000ml;充分混勻，裝入瓶中。8、顯色劑A的制備固紫B1.5gTritonXlOO2gPVPK304g蒸餾水1000ml充分混勻，分裝在黑色瓶中；9、顯色劑B的制備固藍B1.5gTritonXlOO2gPVPK304g蒸餾水1000ml充分混勻，分裝在黑色瓶中。實施例2使用AV/BV聯合測定試劑盒檢測陰道分泌物中需氧菌/厭氧菌和兼性厭氧菌的準確性1、分別采用臨床和微生物學檢驗方法和本發明AV/BV聯合測定試劑盒檢測陰道分泌物中細菌菌群的結果如表2所示，準確性按下式計算敏感性=D+(C+D)X100%;特異性=A+(A+B)X100%表2<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>對五組人群進行檢測，分別為正常育齡婦女67例(第1組)、BV患者51例(第2組)、AV患者44例(第3組)，白色假絲酵母菌陰道炎VVC患者52例(第4組)和滴蟲性陰道炎TV患者31例(第5組)，取陰道分泌物，用本發明試劑盒進行檢測，結果如表3所不表3<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>2、分別采用臨床和微生物學檢驗方法和唾液酸苷酶單項陽性檢測BV的方法檢測上述人群陰道分泌物中細菌菌群的結果如表4所示表4<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>敏感性=49+51X100%=96%;特異性=153+194X100%=78.8%可見采用唾液酸苷酶單項陽性檢測BV的特異度較差，且有28%的VVC患者(52例VVC患者中有15例唾液酸苷酶陽性)和35%的TV患者(31例TV患者中有11例唾液酸苷酶陽性)被誤診為BV。3、依據本發明，唾液酸苷酶陽性、過氧化氫陽性者為BV;過氧化氫陽性、白細胞酯酶陽性并伴有凝固酶陽性、P-葡萄糖醛酸酶陽性或其中之一陽性者為AV，進行分析的結果如表5所示表5<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>(1)采用本發明AV/BV聯合測定試劑盒檢測陰道分泌物中BV的結果如表6所示，BV的準確度按下式計算表6<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>敏感性=47+51X100%=92%;特異性=188+194X100%=97%(2)采用本發明AV/BV聯合測定試劑盒檢測陰道分泌物中AV的結果如表7所示，AV的準確度按下式計算表7<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>敏感性=41+44X100%=93%;特異性=195+201X100%=97%由此可見，采用本發明的試劑盒可以有效提高AV、BV的檢測準確度。雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳盡的描述，但在本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發明要求保護的范圍。權利要求一種檢測陰道分泌物中細菌菌群的試劑盒，其包括1)反應裝置所述反應裝置具有過氧化氫反應孔、唾液酸苷酶反應孔、白細胞酯酶反應孔、β-葡萄糖醛酸酶反應孔和凝固酶反應孔；2)一種或多種顯色劑。2.如權利要求1所述的試劑盒，其還包括樣品稀釋液。3.如權利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于，所述反應裝置的過氧化氫反應孔包被有辣根過氧化物酶和二乙氨基對苯二胺。4.如權利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于，所述反應裝置的唾液酸苷酶反應孔包被有5-溴-4-氯-3-吲哚-N-乙酰神經氨酸鹽，其對應的顯色劑A為固紫B或固紅TR。5.如權利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于，所述反應裝置的白細胞酯酶反應孔包被有5-溴-4-氯-3-吲哚-乙酸鹽。6.如權利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于，所述反應裝置的P-葡萄糖醛酸酶反應孔包被有5-溴-4-氯-3-吲哚-13-葡萄糖醛酸鹽。7.如權利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于，所述反應裝置的凝固酶反應孔包被有甘氨酰精氨酸P萘胺，其對應的顯色劑B為固藍B、固紅B、固藍BB或固藍RR。8.如權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述樣品稀釋液中含有TritonX100和樹膠。9.如權利要求18任一項所述的試劑盒，其特征在于，所述反應裝置按如下方法制備獲得1)反應基板的制備反應基板由ABS工程塑料制成，其上有5個①4mm的圓孔，分別為過氧化氫反應孔、唾液酸苷酶反應孔、白細胞酯酶反應孔、P-葡萄糖醛酸酶反應孔和凝固酶反應孔，在每個反應孔中填入下述相應的反應墊；2)過氧化氫反應墊的制備溶液A:二乙氨基對苯二胺10mga_萘酚20mg無水乙醇10ml溶液B:辣根過氧化物酶10000單位失活純化的牛血清白蛋白lgTris-HCl200mmol/LpH7.010ml將溶液A1ii1滴加在①4mm層析紙墊上，避光條件下，25t:流動空氣干燥1小時后，在紙墊上滴加溶液B1ii1，避光條件下，25t:流動空氣干燥4小時，密封保存在2-8°C;3)唾液酸苷酶反應墊的制備底物溶液5-溴-4-氯-3-吲哚-N-乙酰神經氨酸鹽0.05g乙酸鹽溶液200mmol/LpH5.510ml，其中含NaC10.2mol/L將底物溶液1P1滴加在①4mm層析紙墊上，避光條件下，25t:流動空氣干燥4小時，密封保存在2-8°C;4)白細胞酯酶反應墊的制備底物溶液5-溴-4-氯-3-吲哚-乙酸鹽0.05g磷酸鹽緩沖液200mmol/LpH7.010ml，其中含硫酸鈉2wt%將底物溶液1P1滴加在①4mm層析紙墊上，避光條件下，25t:流動空氣干燥4小時，密封保存在2-8°C;5)13_葡萄糖醛酸酶反應墊的制備底物溶液5-溴-4-氯-3-吲哚-13-葡萄糖醛酸鹽0.05g磷酸鹽緩沖液200mmol/LpH7.OlOml，其中含乙二醇50mmol/L將底物溶液liil滴加在①4mm層析紙墊上，避光條件下，25t:流動空氣干燥4小時，密封保存在2-8°C;6)凝固酶反應墊的制備底物溶液甘氨酰精氨酸P萘胺0.05gTris-HCl200mmol/LpH8.510ml將底物溶液liil滴加在①4mm層析紙墊上，避光條件下，25t:流動空氣干燥4小時，密封保存在2-8°C;將2)6)制備的反應墊填入相應的反應孔中，用沖壓機壓實，在孔上粘貼鋁箔保護膜，裝入鋁箔袋中，即得反應裝置。10.制備權利要求19任一項所述試劑盒的方法，其包括如下步驟1)反應基板的制備反應基板由ABS工程塑料制成，其上有5個①4mm的圓孔，分別為過氧化氫反應孔、唾液酸苷酶反應孔、白細胞酯酶反應孔、P-葡萄糖醛酸酶反應孔和凝固酶反應孔，在每個反應孔中填入下述相應的反應墊；2)過氧化氫反應墊的制備溶液A:二乙氨基對苯二胺10mga_萘酚20mg無水乙醇10ml溶液B:辣根過氧化物酶10000單位失活純化的牛血清白蛋白lgTris-HCl200mmol/LpH7.010ml將溶液A1ii1滴加在①4mm層析紙墊上，避光條件下，25t:流動空氣干燥1小時后，在紙墊上滴加溶液B1ii1，避光條件下，25t:流動空氣干燥4小時，密封保存在2-8°C;3)唾液酸苷酶反應墊的制備底物溶液5-溴-4-氯-3-吲哚-N-乙酰神經氨酸鹽0.05g乙酸鹽溶液200mmol/LpH5.510ml，其中含NaClO.2mol/L將底物溶液1P1滴加在①4mm層析紙墊上，避光條件下，25t:流動空氣干燥4小時，密封保存在2-8°C;4)白細胞酯酶反應墊的制備底物溶液5-溴-4-氯-3-吲哚-乙酸鹽0.05g磷酸鹽緩沖液200mmol/LpH7.010ml，其中含硫酸鈉2wt%將底物溶液liil滴加在①4mm層析紙墊上，避光條件下，25t:流動空氣干燥4小時，密封保存在2-8°C;5)13-葡萄糖醛酸酶反應墊的制備底物溶液5-溴-4-氯-3-吲哚-13-葡萄糖醛酸鹽0.05g磷酸鹽緩沖液200mmol/LpH7.OlOml，其中含乙二醇50mmol/L將底物溶液1P1滴加在①4mm層析紙墊上，避光條件下，25t:流動空氣干燥4小時，密封保存在2-8°C;6)凝固酶反應墊的制備底物溶液甘氨酰精氨酸P萘胺0.05gTris-HCl200mmol/LpH8.510ml將底物溶液liil滴加在①4mm層析紙墊上，避光條件下，25t:流動空氣干燥4小時，密封保存在2-8°C;7)將2)6)制備的反應墊填入相應的反應孔中，用沖壓機壓實，在孔上粘貼鋁箔保護膜，裝入鋁箔袋中，即得反應裝置；8)樣品稀釋液的制備TritonXlOO20g阿拉伯樹膠10g防腐劑Proclin3000.2g蒸餾水1000ml;9)顯色劑A的制備固紫B1.5gTritonXlOO2gPVPK304g蒸餾水1000ml充分混勻，分裝在深色瓶中；10)顯色劑B的制備固藍B1.5gTritonXlOO2gPVPK304g蒸餾水1000ml充分混勻，分裝在深色瓶中。11.權利要求19任一項所述試劑盒在檢測陰道分泌物中需氧菌/厭氧菌和兼性厭氧菌中的應用。全文摘要本發明提供了一種AV/BV聯合檢測試劑盒，由反應裝置、樣品稀釋液、顯色劑A和顯色劑B組成，其中反應裝置上設置有過氧化氫反應孔、唾液酸苷酶反應孔、白細胞酯酶反應孔、β-葡萄糖醛酸酶反應孔和凝固酶反應孔，反應孔中有相應的反應墊。本發明還提供了該檢測試劑盒的制備方法。本發明的檢測試劑盒通過對過氧化氫的測定以及對唾液酸苷酶、白細胞酯酶、β葡萄糖醛酸酶和凝固酶的活性的測定，從而直接鑒定出陰道分泌物中的需氧菌/厭氧菌和兼性厭氧菌等菌群，該方法操作簡便快速，準確性高，適于臨床常規特別是醫院門診的使用。文檔編號C12R1/46GK101792791SQ20091024426公開日2010年8月4日申請日期2009年12月30日優先權日2009年12月30日發明者宋金才,張麗梅,王加義,郭智芳申請人:北京中生金域診斷技術有限公司