一種控制植物生長的蛋白及其編碼基因與應用的制作方法

專利名稱：一種控制植物生長的蛋白及其編碼基因與應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術領域，特別涉及一種植物發(fā)育相關蛋白及其編碼基因與應用。

背景技術：
植物的發(fā)育及形態(tài)由細胞的伸長，延展及分裂決定。其中植物細胞的伸長受外部環(huán)境因素及包括油菜素甾醇類激素在內的多種植物內源激素共同影響。而油菜素甾醇類激素對于植物最為明顯的生理效應就是促進植物細胞的伸長，如BRs促進幼苗的莖、豌豆和綠豆的上胚軸、黃瓜下胚軸、單子葉植物的胚芽鞘、中胚軸等的伸長，而且幼嫩的營養(yǎng)器官對BRs的反應尤為明顯。近年來隨著一系列BR相關突變體的鑒定及分子遺傳學及生物化學手段的研究，在擬南芥中BR信號轉導途徑已經比較清楚了。BRs可結合在BRI1的胞外域，激活BRI1的激酶域，使得BRI1與BAK1結合并相互磷酸化，同時與抑制因子BKI1解聚，活化的BRI1磷酸化BSKs，BSKs將BRs信號由受體復合物BRI1/BAK1傳出，激活BSU1，BSU1通過去磷酸化使BIN2失活，去磷酸化的BZR1和BZR2積累，激活BR信號途徑下游基因的表達，從而調控植物的生長發(fā)育。然而BR如何通過BZR1調控下游基因的表達從而調控細胞伸長，還有待進一步研究。因此克隆BR信號途徑下游調控植物細胞伸長的基因，將成為調控植物細胞伸長從而控制植物發(fā)育及株型的重要分子工具。


發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種植物發(fā)育相關蛋白。
本發(fā)明提供的蛋白(AtIBH1)，來自擬南芥col生態(tài)型，是如下(a)或(b)的蛋白質 (a)由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質； (b)將序列3的蛋白質經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物發(fā)育相關的由其衍生的蛋白質；所述植物發(fā)育體現在成株株高和/或葉柄長度和/或下胚軸長度和/或特定器官的大小等性狀上。
為了使(a)中的AtIBH1便于純化，可在由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標簽。
表1標簽的序列 上述(b)中的AtIBH1可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得到。上述(b)中的AtIBH1的編碼基因可通過將序列表中序列4所示的DNA序列中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在其5′端和/或3′端連上表1所示的標簽的編碼序列得到。
所述蛋白的編碼基因也屬于本發(fā)明的保護范圍。
所述蛋白的編碼基因(AtIBH1)可為如下1)或2)或3)或4)或5)的DNA分子 1)其編碼序列是序列表中序列4所示的DNA分子； 2)序列表中序列5的自’端第54-600位所示的DNA分子； 3)序列表中序列5所示的DNA分子； 4)在嚴格條件下與1)或2)或3)限定的DNA序列雜交且編碼相同功能蛋白質的DNA分子； 5)與1)或2)或3)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質的DNA分子。
上述嚴格條件可為在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下雜交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。
含有所述基因的重組表達載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌均屬于本發(fā)明的保護范圍。
可用現有的植物表達載體構建含有AtIBH1基因的重組表達載體。
所述植物表達載體包括雙元農桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。所述植物表達載體還可包含外源基因的3’端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號和任何其它參與mRNA加工或基因表達的DNA片段。所述聚腺苷酸信號可引導聚腺苷酸加入到mRNA前體的3’端，如農桿菌冠癭瘤誘導(Ti)質?；?如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆貯存蛋白基因)3’端轉錄的非翻譯區(qū)均具有類似功能。
使用AtIBH1構建重組植物表達載體時，在其轉錄起始核苷酸前可加上任何一種增強型啟動子或組成型啟動子，如花椰菜花葉病毒(CAMV)35S啟動子、玉米的泛素啟動子(Ubiquitin)，它們可單獨使用或與其它植物啟動子結合使用；此外，使用本發(fā)明的基因構建植物表達載體時，還可使用增強子，包括翻譯增強子或轉錄增強子，這些增強子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉錄起始區(qū)域或結構基因。
為了便于對轉基因植物細胞或植物進行鑒定及篩選，可對所用植物表達載體進行加工，如加入可在植物中表達的編碼可產生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(GUS基因、螢光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標記物(慶大霉素標記物、卡那霉素標記物等)或是抗化學試劑標記基因(如抗除莠劑基因)等。從轉基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標記基因，直接以逆境篩選轉化植株。
所述重組表達載體具體可為將所述AtIBH1基因插入pSN1301的多克隆位點得到的重組表達載體。
所述質粒pSN1301是將質粒pCAMBIA1301的EcoRI和HindIII酶切位點間插入35S-Noster序列得到的；所述35S-Noster序列是用限制性內切酶EcoRI部分酶切和HindIII完全酶切質粒pUC19-35S-Noster得到的；所述質粒pUC19-35S-Noster是將質粒pUC19-Noster的HindIII和BamHI酶切位點間插入35S啟動子片段得到的；所述35S啟動子片段是用限制性內切酶HindIII和BamHI雙酶切質粒pBI221得到的；所述質粒pUC19-Noster是將質粒pUC19的SacI和EcoRI酶切位點間插入Noster poly A終止序列得到的；所述Noster poly A終止序列是用限制性內切酶Sac I和EcoR I雙酶切質粒pBI221得到的。
本發(fā)明還保護一種培育轉基因植物的方法。
該方法是如下1)或2)的方法 1)將上述基因導入目的植物中，得到轉基因植物，所述轉基因植物為與所述目的植物相比株高變矮和/或葉柄縮短和/或下胚軸縮短和/或葉片變小的轉基因植物； 2)在目的植物中將上述基因進行抑制表達，得到轉基因植物，所述轉基因植物的株型大小大于所述目的植物。該目的植物為含有上述AtIEH1基因的植物。
利用任何一種可以引導外源基因在植物中表達的載體，將本發(fā)明所提供的AtIBH1基因導入植物細胞，可獲得株高變矮和/或葉柄縮短和/或下胚軸縮短和/或葉片變小。攜帶有AtIBH1基因的表達載體可通過使用Ti質粒、Ri質粒、植物病毒載體、直接DNA轉化、顯微注射、電導、農桿菌介導等常規(guī)生物學方法轉化植物細胞或組織，并將轉化的植物組織培育成植株。被轉化的植物宿主可為雙子葉植物，如擬南芥(Columbia擬南芥)。
上述方法1)中，上述基因可具體通過上述重組表達載體導入所述目的植物中。
上述方法2)中，抑制表達是將AtIBH1-RNAi導入目的植物中實現的； 所述AtIBH1-RNAi是將序列表中序列5的自5’端第66-359位所示的片段正向插入pTCK309的Spe I和Sac I酶切位點間構成pTCK309-1，將序列表中序列5的白5’端第66-359位所示的片段反向插入pTCK309-1的BamH I和Kpn I酶切位點，構成AtIBH1-RNAi； 所述pTCK309的構建方法如下將序列表中序列6所示的片段插入pBluescriptII SK+的KpnI和SacI酶切位點之間，構成pTCK302；用5’-GGTAAGTTACTACAAACCTTTTTG-3’和5’-TGAAAATCTCGAAACAGCCGTGTC-3’引物從水稻(中花10號)基因組DNA中擴增出478bp的水稻內含子，連入pGEM-T(Promega)載體，構成重組T載體；以所述重組T載體為模板，用引物5’-GCGTCGACAGATCTGCTAGCGGTAAGTTAC-3’和5’-CCATCGATCTGAAAATCTCGAAACAGCCGTG-3’PCR擴增，擴增產物用Sal I和Cla I酶切并克隆到所述pTCK302載體中，構成的載體命名為pTCK302-1；用KpnI和Sacl酶切pTCK302-1得到小片段插入所述pSN1301的KpnI和Sacl酶切位點間，構成pTCK309。
上述目的植物為雙子葉植物，該雙子葉植物可為擬南芥，該擬南芥具體可為Columbia擬南芥。
本發(fā)明發(fā)現了一個新蛋白AtIBH1及其編碼基因AtIBH1。AtIBH1可以與PRE1相互作用并功能拮抗，因此兩個基因可以同時使用達到控制對生長的促進或抑制。用組織特異性啟動子可以特異性的控制特定器官(包括營養(yǎng)和有性生殖器官)的生長和大小。本發(fā)明還獲得了含有該編碼基因AtIBH1的重組表達載體，用重組載體轉化目的植物，可以得到成株株高變矮和/或葉柄變短和/或下胚軸變短和/或特定器官變小的轉基因植物。將AtIBH1抑制表達后發(fā)現擬南芥的整個植株變大。因此AtIBH1可以作為一種潛在的分子育種工具，改變植物細胞伸長，從而改良植物株型，提高植物生物量。



圖1為實施例1中i1i1-D突變體植株和日本晴(WT)幼苗期的照片。
圖2為實施例1中i1i1-D突變體植株和日本晴(WT)分蘗期的照片。
圖3為實施例1中種植于大田的揚花期的i1i1-D和日本晴(WT)的旗葉、旗下第一葉和旗下第二葉葉夾角測量數據統(tǒng)計結果。
圖4為實施例1中i1i1-D突變體植株和日本晴(WT)幼苗葉枕部位近軸面細胞掃描電鏡的照片。
圖5為實施例1中i1i1-D突變體、日本晴(WT)、轉基因陽性植株R2和R5的表型和OsILI1的表達量；A陽性轉基因植株的表型；B實時定量PCR檢測OsILI1在轉基因植株中的相對表達量。
圖6為實施例2中PRE1和AtIBH1在酵母中及植物體內相互作用的實驗結果，其中A是酵母雙雜交檢測PRE1和AtIBH1在體外的相互作用；B煙草體內AtIBH1-myc和PRE1-YFP免疫共沉淀的結果。
圖7為為實時定量PCR的方法檢測用24-epiBL終濃度為100nM的水溶液處理擬南芥野生型col及det2突變體幼苗2小時后，AtIBH1的相對表達量。
圖8為為實時定量PCR檢測野生型擬南芥col的根，幼苗，蓮座葉，莖生葉，花序及角果部位中AtIBH1的相對表達量，R、S、RL、CL、F、Si分別代表根，幼苗，蓮座葉，莖生葉，花序及角果。
圖9為染色質免疫共沉淀檢測轉錄因子BZR1與AtIBH1啟動子體內的結合，其中A，BZR1 ChIP-chip Genome Browser software在AtIBH1啟動子區(qū)的分析示意圖，空心矩形框代表啟動子區(qū)，實心矩形框代表編碼區(qū)，黑線代表非編碼區(qū)，空心圓圈代表E-box，實心圓圈代表BRRE結合域，a和b代表ChIP-qPCR分析區(qū)段；B，BZR1染色質免疫共沉淀分析結果。Y軸指qPCR分析所選區(qū)段與BZR1共沉淀后的富積程度，CNX5為對照基因，Bar為三次生物重復后取平均值的標準誤差。
圖10為實施例3中AtIBH1過表達擬南芥植株的表型。
圖11為實施例3中AtIBH1過表達擬南芥植株在光下的下胚軸和根的情況，其中A是下胚軸和根的表型，B是下胚軸和根的相對長度。
圖12為實施例3中AtIBH1過表達擬南芥植株在暗中的下胚軸和根的情況，其中A是下胚軸和根的表型，B是下胚軸和根的相對長度。
圖13為實施例3中AtIBHI-RNAi的轉基因擬南芥Col的情況分析，其中A是表型分析；B是AtIBH1的表達量檢測。

具體實施例方式 下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明，但本發(fā)明并不限于以下實施例。
下述實施例中，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。
本發(fā)明依賴的遺傳資源如下日本晴水稻和突變體植株i1i1-D于2004年5月從中國農業(yè)科學院獲得，其原始來源不清楚；擬南芥Columbia的直接來源是2004年6月從華盛頓卡內基研究院獲得，原始來源不清楚。
日本晴水稻中國科學院植物研究所；毛建軍，楊秀芬，曾洪梅，袁京京，邱德文.水稻品種日本晴粳稻組培培養(yǎng)基的篩選及轉稻瘟菌蛋白激發(fā)子基因植株的獲得.《農業(yè)生物技術學報》，2008年16卷5期，824-830。
中花10號中國科學院植物研究所；李國甫，倪丕沖，李梅芳.高頻水稻原生質體植株再生.《植物學報》，1993年，35(3)234-237. 擬南芥Columbia中國科學院植物研究所；劉俊，蔡平鐘，馬林，張志雄，向躍武，王閔霞，張志勇.冷相關轉錄因子CBF2基因的克隆及其植物表達載體的構建.《西南農業(yè)學報》，2009年22卷2期，428-432。
擬南芥bri1-5中國科學院植物研究所；Xuelu Wang，Xiaoqing LI，JillMwisenhelder，Tony Hunter，Shigeo Yoshida，Tadao Asami，and Joanne Chory.Autoregulation and Homodimerization Are Involved in the Activation of thePlant Steroid Receptor BRI1.《Development Cell》，2005年第8期855-865. 農桿菌GV3101中國科學院植物研究所；鄭銀英，崔百明，常明進，彭明.轉擬南芥ICE1基因增強煙草抗寒性的研究.《西北植物學報》.2009年29卷1期.75-79。
以下實施例中的基因表達量檢測結果，均是以野生型植株的目的基因表達量為1，其它植株的目的基因表達量與野生型植株的目的基因表達量進行比較。
實施例1、OsILI1的發(fā)現 一、突變體植株i1i1-D的獲得和形態(tài)觀察 1、突變體植株i1i1-D的獲得 構建日本晴水稻T-DNA插入突變體庫，從中發(fā)現了一個葉夾角明顯增大的突變體植株i1i1-D。
2、突變體植株i1i1-D的形態(tài)觀察 對突變體植株i1i1-D進行如下形態(tài)觀察。
(1)葉夾角 i1i1-D最重要的表型是在其各個生長時期，均表現為葉夾角明顯增大。在幼苗期，突變體萌發(fā)后生長5天左右，在第二葉發(fā)育完全后就可觀察到第二葉葉夾角彎曲已超過90度(見圖1)。在分蘗期，突變體的每個新生分蘗都表現為葉夾角明顯增大(見圖2)。
對種植于大田的揚花期的日本晴及i1i1-D的旗葉、旗下第一葉和旗下第二葉葉夾角進行測量，統(tǒng)計結果表明野生型旗葉、旗下第一葉和旗下第二葉葉夾角大小主要集中在0-30°之間，而突變體的葉夾角則主要分布于90-150°之間(見圖3)。
(2)種子長度 分別檢測100粒日本晴種子和100粒i1i1-D種子的長度。i1i1-D種子的平均長度為5.3±0.1，日本晴種子的平均長度為4.8±0.2，差異顯著，有統(tǒng)計學意義。這表明，與日本晴相比，i1i1-D種子變長。
(3)葉枕部位細胞的伸長 用掃描電鏡的方法對幼苗期的日本晴及i1i1-D突變體葉枕部位近軸面的細胞形態(tài)進行觀察，見圖4。結果表明，i1i1-D突變體葉枕部位近軸面的細胞比野生型日本晴相同部位細胞的伸長更為明顯。
3、突變體植株i1i1-D的子代的形態(tài)觀察 將i1i1-D種子繁殖后，后代持續(xù)出現葉夾角增大的表型。這些結果表明i1i1-D葉夾角增大的表型在各個生長時期中都是穩(wěn)定的，并且表型是可穩(wěn)定遺傳的。
二、OsILI1的發(fā)現 根據插入的T-DNA載體序列設計引物，進行Tail-PCR擴增，然后將PCR產物回收，送至公司測序，再將測序結果在NCBI數據庫中進行BLASTn比對。結果表明T-DNA插入于水稻4號染色體BAC克隆OsJNBa0063C所對應的序列上。
用Real-time PCR的方法對T-DNA插入兩側各10kb的DNA片段在日本晴及iii1-D中的表達進行分析，結果表明其中一段DNA(序列2所示的DNA)在i1i1-D突變體中上調了近20倍，因此推測可能是由于T-DNA上的35S啟動子插入在序列2所示的DNA附近，造成了序列2所示的DNA的過量表達，從而造成了OsILI1突變體的表型。
三、OsILI1的功能鑒定 將序列2自5′端第116位至第297位核苷酸構建入RNAi載體中，轉化i1i1-D，以期用RNA干涉的方法降低突變體中序列2所示的DNA的表達量。共獲得了11個株系，大部分轉基因陽性植株都恢復了野生型表型。隨機選擇轉基因陽性植株中的幾個株系進行進一步的鑒定，兩個株系R2和R5明顯恢復到了野生型的表型，經檢測，序列2所示的DNA的在植株中表達量相對于i1i1-D突變體明顯降低(見圖5)。結果表明，序列2所示的DNA與轉基因植株恢復野生型的程度密切相關。
以上結果表明i1i1-D突變體的表型是由于T-DNA插入在序列2所示的DNA附近，T-DNA上的35S啟動子驅動序列2所示的DNA過量表達造成的。序列表的序列2所示的DNA編碼序列表的序列1所示的蛋白質，根據表型將序列1所示的蛋白質命名為OsILI1(Oraza sativa increased leaf inclination-1)，將OsILI1的編碼基因命名為OsILI1。
實施例2、AtIBH1的發(fā)現 一、AtIBH1的發(fā)現 通過對OsILI1蛋白序列進行分析可知，OsILI1屬于basic helix-loop-helix(bHLH)類轉錄因子家族，但它并沒有典型的basic結構域。此類bHLH蛋白被歸類為D類bHLH蛋白，它們不能直接結合DNA，主要通過與典型的bHLH轉錄因子形成異源二聚體以調節(jié)它們的功能。以OsILI1全長蛋白作為誘餌，利用酵母雙雜交技術篩選與OsILI1相互作用的蛋白。將OsILI1的編碼序列從cDNA文庫中擴增后，連入pBD-GAL4載體，然后將構建好的載體轉入酵母AH109，制作成感受態(tài)細胞后，共轉化水稻三葉期酵母雙雜交文庫。篩庫的效率為3×105克隆/g DNA，總的篩庫量為3×106克隆，能在-His/-Trp/-Leu SD培養(yǎng)基上生長的克隆數為22個，最后能在-His/-Trp/-Leu/-Ade SD培養(yǎng)基上生長的克隆數為10個。對這10個克隆進行測序分析，發(fā)現其中有5個屬于bHLH轉錄因子，其中的克隆16在篩選中出現了3次，對這個克隆所對應的蛋白序列進行保守域分析，發(fā)現它是一個典型的含有basicdomain的bHLH轉錄因子，因此我們選取這一蛋白進行下一步的研究，在此將它命名為AtIBH1(OsILI1-binding bHLH protein 1)。
用OsIBH1的蛋白序列在NCBI數據庫中進行蛋白序列的blastP比對，發(fā)現在擬南芥中與OsIBH1相似度最高的蛋白對應的編碼基因為At2g43060。因此將At2g43060命名為AtIBH1。AtIBH1的氨基酸序列如序列表中序列3所示，AtIBH1的編碼基因AtIBH1的編碼序列如序列表中序列4所示，其全序列如序列表中序列5所示，將AtIBH1的全長編碼序列(序列表中序列4)從cDNA文庫中擴增出來后構建到pAD-GAL4載體中構建成pAD-AtIBH1，與pBD-PRE1共轉化酵母感受態(tài)細胞，涂布-Trp/-Leu SD平板，然后將長出的菌落轉入-His/-Trp/-Leu/-Ade SD培養(yǎng)基上培養(yǎng)，結果表明含pBD-PRE1和pAD-AtIBH1的酵母菌落可以在-His/-Trp/-Leu/-Ade SD平板上很好地生長，而對照則不能生長，這說明PRE1和AtIBH1在酵母中確實存在著相互作用(圖6A)。
將AtIBH1的全長編碼序列cDNA文庫中擴增出來后構建到35S啟動子驅動的帶有myc標簽的載體中，得到AtIBH1-myc載體。然后將AtIBH1-myc和PRE1-YFP以等量的比例在煙草中瞬時表達。在注射菌液后的煙草培養(yǎng)48小時后，選取生長狀態(tài)良好的煙草葉片在熒光顯微鏡下觀察YFP熒光信號，并取少量組織分別用anti-GFP和anti-myc抗體做western雜交檢測組織內融合蛋白的含量，anti-GFP和anti-myc雜交信號均一的用于下一步的免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation，Co-IP)，單打了AtIBH1-myc的葉片作為負對照。結果表明在共沉淀之后，只有共轉化了AtIBH1-myc和PRE1-YFP的洗脫樣品用anti-myc雜交才有信號，而單轉了AtIBH1-myc的樣品在洗脫后則雜不出信號，這說明AtIBH1-myc和PRE1-YFP在體內也有著相互作用(圖6B)。
二、AtIBH1的功能鑒定 1、BR對AtIBH1基因表達的調節(jié) 用24-epiBL終濃度為100nM的水溶液處理擬南芥野生型col及det2突變體幼苗2小時，未處理的擬南芥野生型col及det2突變體幼苗作為對照，提取RNA反轉錄，利用實時定量PCR的方法分析AtIBH1的表達情況，結果表明在BR合成缺陷突變體det2中，AtIBH1的表達量相對于在野生型中是上升的，而外源施加BR后，AtIBH1的表達量相比于對照下調，這說明AtIBH1的表達是受BR抑制的(附圖7)。
2、AtIBH1基因表達模式的分析 分別取野生型擬南芥col的根，幼苗，蓮座葉，莖生葉，花序及角果部位提取RNA反轉錄，利用實時定量PCR的方法分析AtIBH1的表達情況，結果表明AtIBH1主要在根，蓮座葉，莖生葉等成熟組織表達，而在未開放的花蕾等幼嫩部位表達量較低；PRE1則主要在幼嫩的部位表達，這表明AtIBH1與PRE1在擬南芥的這些器官共表達，既順序又重疊地調節(jié)著植物細胞的伸長(附圖8)。
3、轉錄因子BZR1對AtIBH1的調節(jié) BZR1是BR信號途徑中的重要轉錄因子，它通過DNA結合結構域直接結合到BRs合成基因啟動子上的CGTG(T/C)G保守序列，即BR反應元件(BR responseelement，BRRE)，調節(jié)這些基因的表達。通過對AtIBH1啟動子序列進行分析，找到了若干BZR1可能的作用位點CGTG(T/C)G。為了確認BZR1蛋白和PRE1、AtIBH1的啟動子區(qū)域有著直接的相互作用，用pBZR1:BZR1-CFP的轉基因擬南芥來做染色質免疫共沉淀的實驗(chromatin immunoprecipitation)。將pBZR1:BZR1-CFP的轉基因擬南芥在活細胞狀態(tài)下固定蛋白質-DNA復合物，并將其隨機切斷為一定長度范圍內的染色質小片段，然后通過免疫學方法用anti-GFP抗體沉淀此復合體，特異性地富集目的蛋白結合的DNA片段，ChIP DNA雜交到Affymetrix基因芯片上，結果用BZR1 ChIP-chip Genome Browser software進行分析，結果表明AtIBH1在如圖9A所示的a區(qū)段有富集。再用根據AtIBH1啟動子上BRs響應元件富集區(qū)設計的引物進行PCR擴增。結果表明在免疫共沉淀后的pBZR1:BZR1-CFP樣品中，AtIBH1的啟動子選定區(qū)域相對于在對照中有明顯的富集。這表明BZR1與AtIBH1啟動子在體內有直接相互作用(圖9B)。
實施例3、AtIBH1過表達擬南芥轉基因植株的獲得 一、重組表達載體的構建 1、35S啟動子片段的獲得 用限制性內切酶HindIII和BamHI對質粒載體pBI221(Clontech)進行雙酶切，經瓊脂糖凝膠電泳檢測后回收長度約為0.8kb的35S啟動子片段。
2、用限制性內切酶Sac I和EcoR I將Noster poly A終止序列從質粒載體pBI221(Clontech)上切下，連接到載體pUC19(TaKaRa公司)的相應位點中，得到重組載體，命名為pUC19-Noster。再用限制性內切酶HindIII和BamHI雙酶切pUC19-Noster，瓊脂糖凝膠電泳檢測后，回收線性化的載體大片段，并將該回收片段與步驟1獲得的35S啟動子片段相連，得到重組載體pUC19-35S-Noster。
3、用限制性內切酶EcoR I部分酶切和HindIII完全酶切從步驟2構建的重組載體切下包含35S和Noster的片段，將該片段克隆入質粒載體pCAMBIA1301(Center for the Application of Molecular Biology to International Agriclture，www.cambia.org)多克隆位點的EcoR I和HindIII位點處，得到重組載體，命名為pSN1301。
4、提取擬南芥野生型col的總RNA，將RNA用逆轉錄酶合成cDNA。以反轉錄得到的cDNA為模板，進行PCR擴增制備AtIBH1的編碼序列，PCR擴增的引物如下 FCCGGGATCC

BamHI RGCGGGTACC

KpnI 將PCR擴增產物測序，結果表明擴增產物具有序列表中序列5的自’端第54-600位所示的核苷酸，該擴增產物包括了序列4所示的AtIBH1的編碼序列。將擴增產物連入pSN1301的BamHI和KpnI酶切位點，得到含有AtIBH1的重組表達載體，命名為AtIBH1-OX。重組表達載體經過測序檢驗正確。
二、AtIBH1過表達轉基因植物的獲得 1、將步驟一構建的重組表達載體轉入農桿菌GV3101，用于轉化擬南芥Col和BR信號轉導突變體擬南芥bri1-5，獲得轉基因植物(AtIBH1-OX/Col和AtIBH1-OX/bri1-5)，具體步驟如下 1)在YEB平板上挑取含有表達載體的農桿菌單克隆，接種于10ml含抗生素(50mg/L卡納霉素)的YEB液體培養(yǎng)基中，28℃，200rpm，振蕩培養(yǎng)至對數生長晚期。
2)按1∶50的比例轉接到50ml YEB培養(yǎng)基中，28℃，200rpm，振蕩培養(yǎng)至OD600為0.6左右。
3)5,000rpm，離心15分鐘，收集菌體，重懸于滲透緩沖液(5％蔗糖，0.02％silwetL-77)，調OD600至0.6左右。
4)取正在開花的擬南芥，剪去轉化前形成的果莢，然后將整個花序浸泡在步驟3)的菌懸液中15秒，使得農桿菌很好的粘附在花序中進行轉化。
5)農桿菌侵染后的擬南芥放于陰暗處保濕培養(yǎng)24小時，然后將擬南芥移到培養(yǎng)室中繼續(xù)正常培養(yǎng)，7-10天后再浸泡轉化一次。
6)收獲成熟的擬南芥種子，充分晾干后用10％次氯酸鈉消毒后，鋪在含有相應抗生素的1/2MS培養(yǎng)基上，篩選得到的抗性苗(T1代)移入土中繼續(xù)培養(yǎng)。
用pSN1301代替重組表達載體，制備轉空載體T1代植株，方法同上。
2、對轉AtIBH1-OX的轉基因擬南芥Col的1號，2號，3號株系的T1代植株進行進一步的分析(用轉空載體T1代植株和非轉基因擬南芥Col作為對照)。
將轉空載體T1代植株、非轉基因擬南芥Col、以及1號株系、2號株系和3號株系植株在25℃條件下、培養(yǎng)三周時間，拍照的結果如圖10A所示，由于轉空載體T1代植株與擬南芥Col表型相同，圖10A中的對照僅顯示擬南芥Col。由圖10A可見，轉基因植株變小，緊湊，葉柄縮短，葉片變小變圓，葉色深綠，其中以3號的表型為最明顯。在成熟期，3號開花明顯比其他株系及野生型要晚，它的主苔也非常矮小。對這些轉基因植株中AtIBH1的表達量進行檢測(引物FGGAGCAGAGCCCTCTTGCG；RGCTCTCTGGTTACTCCTCCTCCG)，發(fā)現轉基因植株的表型是與AtIBH1的表達量相對應的，在表型最強的2號中，AtIBH1的表達量為最多。
3、對轉AtIBH1-OX的轉基因擬南芥bri1-5的1號株系的T1代植株進行進一步的分析(用轉空載體T1代植株和非轉基因擬南芥bri1-5作為對照)。
將將轉空載體T1代植株、非轉基因擬南芥bri1-5以及1號株系在25℃條件下、培養(yǎng)三周時間，拍照的結果如圖10B所示，因轉空載體T1代植株與擬南芥bri1-5表型相同，圖10B中的對照僅顯示擬南芥bri1-5。由圖10B可見，轉基因植株相對于對照更小，緊湊，葉柄明顯縮短，葉片變小變圓，葉色深綠。對這些轉基因植株中AtIBH1的表達量進行檢測(引物FGGAGCAGAGCCCTCTTGCG；RGCTCTCTGGTTACTCCTCCTCCG)，發(fā)現轉基因植株的表型是與AtIBH1的表達量相對應的。
4、ATIBH1過表達植株幼苗在光下下胚軸和根縮短 將AtIBH1-OX的轉基因擬南芥Col的3號株系、轉空載體T1代植株和非轉基因擬南芥Col在1/2MS上4℃冰箱春化兩天，在相同的光照強度下(45umol m-2s-1)20小時光照，4小時黑暗22℃同時生長六天后觀察表型和統(tǒng)計下胚軸和根的相對長度。相對長度測定方法是Col和AtIBH1-OX/Col分別測量45棵幼苗，取平均長度后，以Col的平均長度為1，ATIBH1-OX/Col與Col的長度的比值為縱坐標，結果如圖11所示，非轉基因擬南芥Col與轉空載體T1代植株的表型一致，圖11中的對照只顯示非轉基因擬南芥Col。由圖11可見，ATIBH1過表達植株幼苗與非轉基因擬南芥Col相比，在光下培養(yǎng)后的下胚軸和根縮短。
5、ATIBH1過表達植株幼苗在暗中比野生型下胚軸和根縮短 將AtIBH1-OX的轉基因擬南芥Col的3號株系、轉空載體T1代植株和非轉基因擬南芥Col在1/2MS培養(yǎng)基上、4℃冰箱春化處理兩天，光下22℃放置2小時，在完全黑暗中生長6天后觀察表型、并且按照上述方法統(tǒng)計下胚軸和根的相對長度。
結果如圖12所示，ATIBH1過表達植株幼苗與非轉基因擬南芥Col相比，在暗中培養(yǎng)后下胚軸和根縮短。由于非轉基因擬南芥Col與轉空載體T1代植株的表型一致，圖12中的對照僅顯示非轉基因擬南芥Col。
實施例4、AtIBH1-RNAi擬南芥轉基因植株的獲得 一、重組表達載體的構建 1、目標片段的獲得 提取擬南芥野生型col的總RNA，將RNA用逆轉錄酶合成cDNA。以反轉錄得到的cDNA為模板，進行PCR擴增，PCR擴增的引物如下 FCGCGGTACC

KpnI Spe I RGCGGGATCC

BamH I Sac I 2、構建重組表達載體 將PCR擴增產物(序列5的自5’端第66-359位所示的片段)酶切兩步法連入TCK309(先用Spe I和Sac I酶切PCR擴增產物與pTCK309連接，在此基礎上再用BamHI和KpnI酶切PCR擴增產物連入反向片段)，得到含有AtIBH1的重組表達載體，命名為AtIBH1-RNAi。重組表達載體經過測序檢驗正確。
其中，pTCK309的構建方法如下 含有KpnI，XhoI，SalI，ClaI，SpeI，XbaI，SacI酶切位點的片段(序列表中序列6)插入pBluescript II SK+(Stratagene)載體的KpnI和SacI酶切位點之間，構成pTCK302； 然后用5’-GGTAAGTTACTACAAACCTTTTTG-3’和5’-TGAAAATCTCGAAACAGCCGTGTC-3’引物從水稻(中花10號)基因組DNA中擴增出478bp的水稻內含子，連入pGEM-T(Promega)載體，構成重組T載體； 用引物5’-GCGTCGACAGATCTGCTAGCGGTAAGTTAC-3’和5’-CCATCGATCTGAAAATCTCGAAACAGCCGTG-3’從作為模板的重組T載體中PCR擴增，PCR產物用Sal I和Cla I酶切并克隆到上述pTCK302載體中，構成的載體命名為pTCK302-1。然后用KpnI和Sacl分別酶切pTCK302-1和實施例3中的pSN1301，回收pSN1301的大片段和pTCK302-1的小片段，將大片段和小片段連接，構成pTCK309。
二、AtIBH1-RNAi擬南芥轉基因植株 1、將步驟一構建的重組表達載體按照實施例3步驟二提供的方法導入擬南芥col，得到轉基因擬南芥(AtIBH1-RNAi/Col)。
用pTCK309代替重組表達載體，制備轉空載體T1代植株，方法同上。
2、對轉AtIBH1-RNAi的轉基因擬南芥Col的8，1，5，9，4號株系的T1代植株進行進一步的分析 將轉空載體T1代植株、非轉基因擬南芥Col、以及8，1，5，9，4號株系植株在22℃條件下、培養(yǎng)30天時間，拍照的結果如圖13所示，因轉空載體T0代植株與擬南芥Col表型相同，圖中的對照僅為擬南芥Col。由圖13A可見，轉基因植株整個植株變大，其中以1號的表型為最明顯。對這些轉基因植株中AtIBH1的表達量進行檢測(引物FGGAGCAGAGCCCTCTTGCG；RGCTCTCTGGTTACTCCTCCTCCG)，發(fā)現轉基因植株的表型是與AtIBH1的表達量相對應的(圖13B)，在表型最強的1號中，AtIBH1的表達量為最少。
序列表
<110>中國科學院植物研究所
中國農業(yè)科學院生物技術研究所
華盛頓卡內基研究院
<120>一種控制植物生長的蛋白及其編碼基因與應用
<160>6
<210>1
<211>104
<212>PRT
<213>粳稻日本晴(Oryza sativa)
<400>1
Met Ser Ser Ser Arg Arg Ser Arg Ser Arg Arg Ala Gly Ser Ser Val
1 5 10 15
Pro Ser Ser Ser Ser Ser Ser Arg Thr Ser Ile Ser Glu Asp Gln Ile
20 25 30
Ala Glu Leu Leu Ser Lys Leu Gln Ala Leu Leu Pro Glu Ser Gln Ala
35 40 45
Arg Asn Gly Ala His Arg Gly Ser Ala Ala Arg Val Leu Gln Glu Thr
50 55 60
Cys Ser Tyr Ile Arg Ser Leu His Gln Glu Val Asp Ash Leu Ser Glu
65 70 75 80
Thr Leu Ala Gln Leu Leu Ala Ser Pro Asp Val Thr Ser Asp Gln Ala
85 90 95
Ala Val Ile Arg Ser Leu Leu Met
100
<210>2
<211>315
<212>DNA
<213>粳稻日本晴(Oryza sativa)
<400>2
atgtcgagca gccggaggtc gcgctcacgg cgagccggga gctcggtgcc gtcgtcgtcg 60
tcgtcgtcga ggacgtcgat ctcggaggac cagatcgccg agcttctctc caagcttcag120
gccctgctcc cggagtctca ggctcgcaat ggcgcccata ggggctcggc ggcgagggtt180
ttgcaggaga cgtgcagcta catcaggagc ctgcaccagg aggtggacaa cctcagcgag240
acgctcgctc agctgctcgc ctcccccgac gtcaccagcg accaggcggc cgtcatcagg300
agcctcctca tgtga 315
<210>3
<211>156
<212PRT
<213>擬南芥Columbia(Arabidopsis thaliana)
<400>3
Met Ala Ser Ala Asp Lys Leu Ile Asn Thr Asp Val Pro Glu Lys Asp
1 5 10 15
Val Phe Ala Phe His Phe Leu Gln Ser Leu Ser Asn Leu Arg Lys Gln
20 25 30
Asn Pro Phe Asp Thr Pro Asp Gln Lys Asn Tyr Arg Val Arg Lys Ile
35 40 45
Lys Lys Ala Ala Tyr Val Ser Met Ala Arg Ala Ala Gly Gly Ser Ser
50 55 60
Arg Leu Trp Ser Arg Ala Leu Leu Arg Arg Ala Asp Lys Asp Asp Asn
65 70 75 80
Lys Ile Val Arg Phe Ser Arg Arg Lys Trp Lys Ile Ser Ser Lys Arg
85 90 95
Arg Arg Ser Asn Gln Arg Ala Pro Val Val Glu Glu Ala Ala Glu Arg
100 105 110
Leu Arg Asn Leu Val Pro Gly Gly Gly Gly Met Glu Thr Ser Lys Leu
115 120 125
Met Glu Glu Thr Ala His Tyr Ile Lys Cys Leu Ser Met Gln Val Lys
130 135 140
Val Met Gln Cys Leu Val Asp Gly Leu Ser Pro Lys
145 150 155
<210>4
<211>471
<212>DNA
<213>擬南芥Columbia(Arabidopsis thaliana)
<400>4
atggcctctg cagacaaact cataaacaca gatgtccctg aaaaggacgt ttttgccttc 60
cacttcctcc aatccctctc aaatctcaga aaacaaaacc cttttgatac tccggaccaa120
aaaaactacc gcgtgaggaa gatcaagaag gctgcgtacg tttccatggc cagagcagcc180
ggagggagta gccggctatg gagcagagcc ctcttgcgta gagcagacaa agatgacaac240
aagatcgtaa gattttcaag gaggaagtgg aagatatcat caaaacggag gaggagtaac300
cagagagctc cggtggtgga ggaggcggcg gagaggctga ggaatcttgt tccgggaggc360
ggaggaatgg agacgtcaaa gctgatggaa gagacggctc attacatcaa gtgccttagt420
atgcaggtca aggtcatgca gtgtctcgtt gatggcttat ctcccaaatg a 471
<210>5
<211>898
<212>DNA
<213>擬南芥Columbia(Arabidopsis thaliana)
<400>5
aaaaaaaaaa aagttttata aaggttctca actcaagttc tcttctctaa aaaacccaaa 60
caatggcctc tgcagacaaa ctcataaaca cagatgtccc tgaaaaggac gtttttgcct120
tccacttcct ccaatccctc tcaaatctca gaaaacaaaa cccttttgat actccggacc180
aaaaaaacta ccgcgtgagg aagatcaaga aggctgcgta cgtttccatg gccagagcag240
ccggagggag tagccggcta tggagcagag ccctcttgcg tagagcagac aaagatgaca300
acaagatcgt aagattttca aggaggaagt ggaagatatc atcaaaacgg aggaggagta360
accagagagc tccggtggtg gaggaggcgg cggagaggct gaggaatctt gttccgggag420
gcggaggaat ggagacgtca aagctgatgg aagagacggc tcattacatc aagtgcctta480
gtatgcaggt caaggtcatg cagtgtctcg ttgatggctt atctcccaaa tgatcatcaa540
ttaatcatca acatcatcat caatgatcga tgtatataga gatacgacac atacatagtc600
tattggattg gggtaatcat aacgaatata tatgtgtata tatatatata tatatatata660
tatattctta tatatataca tacgtgtaag ataggataca tatatgaaat gtgtggatat720
gtattagtct cgaagtaacg aaagattttt ttctttttct tttcttgaat tttgataaaa780
ggggatttat tatttatcat atgctatggc cggtttaaac attagggctt ggtaacttgc840
ccttgtcata tgataaaagg ggatttatta cttatcatat gctaagagaa ttttcttt 898
<210>6
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>6
ggtaccctcg aggtcgacat cgatactagt tctagagagc tc4權利要求
1.一種蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白質
(a)由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質；
(b)將序列表中序列3的蛋白質經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物發(fā)育相關的由其衍生的蛋白質；所述植物發(fā)育體現在成株株高和/或葉柄長度和/或下胚軸長度和/或特定器官的大小等性狀上。
2.權利要求1所述蛋白的編碼基因。
3.如權利要求2所述的基因，其特征在于所述蛋白的編碼基因為如下1)或2)或3)或4)或5)的DNA分子
1)其編碼序列是序列表中序列4所示的DNA分子；
2)序列表中序列5的自’端第54-600位所示的DNA分子；
3)序列表中序列5所示的DNA分子；
4)在嚴格條件下與1)或2)或3)限定的DNA序列雜交且編碼相同功能蛋白質的DNA分子；
5)與1)或2)或3)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質的DNA分子。
4.含有權利要求2或3所述基因的重組表達載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌。
5.根據權利要求4所述的重組表達載體，其特征在于所述重組表達載體為將權利要求2或3所述基因插入質粒pSN1301的多克隆位點得到的重組表達載體；
所述質粒pSN1301是將質粒pCAMBIA1301的EcoRI和HindIII酶切位點間插入35S-Noster序列得到的；
所述35S-Noster序列是用限制性內切酶EcoR I部分酶切和HindIII完全酶切質粒pUC19-35S-Noster得到的；
所述質粒pUC19-35S-Noster是將質粒pUC19-Noster的HindIII和BamHI酶切位點間插入35S啟動子片段得到的；
所述35S啟動子片段是用限制性內切酶HindIII和BamHI雙酶切質粒pBI221得到的；
所述質粒pUC19-Noster是將質粒pUC19的Sac I和EcoR I酶切位點間插入Nosterpoly A終止序列得到的；所述Noster poly A終止序列是用限制性內切酶Sac I和EcoRI雙酶切質粒pBI221得到的。
6.一種培育轉基因植物的方法，是如下1)或2)的方法
1)將權利要求2或3所述基因導入目的植物中，得到轉基因植物，所述轉基因植物為與所述目的植物相比株高變矮和/或葉柄縮短和/或下胚軸縮短和/或葉片變小的轉基因植物；
2)在目的植物中將權利要求2或3所述基因進行抑制表達，得到轉基因植物，所述轉基因植物的株型大小大于所述目的植物。
7.如權利要求6所述的方法，其特征在于所述方法1)中，權利要求2或3所述基因通過權利要求4或5所述重組表達載體導入所述目的植物中。
8.如權利要求6所述的方法，其特征在于所述方法2)中，抑制表達是將AtIBH1-RNAi導入目的植物中實現的；
所述AtIBH1-RNAi是將序列表中序列5的自5’端第66-359位所示的片段正向插入pTCK309的Spe I和Sac I酶切位點間構成pTCK309-1，將序列表中序列5的自5’端第66-359位所示的片段反向插入pTCK309-1的BamH I和Kpn I酶切位點，構成AtIBH1-RNAi；
所述pTCK309的構建方法如下將序列表中序列6所示的片段插入pBluescriptII SK+的KpnI和SacI酶切位點之間，構成pTCK302；用5’-GGTAAGTTACTACAAACCTTTTTG-3’和5’-TGAAAATCTCGAAACAGCCGTGTC-3’引物從水稻(中花10號)基因組DNA中擴增出478bp的水稻內含子，連入pGEM-T載體，構成重組T載體；以所述重組T載體為模板，用引物5’-GCGTCGACAGATCTGCTAGCGGTAAGTTAC-3’和5’-CCATCGATCTGAAAATCTCGAAACAGCCGTG-3’PCR擴增，擴增產物用Sal I和Cla I酶切并克隆到所述pTCK302載體中，構成的載體命名為pTCK302-1；用KpnI和Sacl酶切pTCK302-1得到小片段插入所述pSN1301的KpnI和Sacl酶切位點間，構成pTCK309。
9.如權利要求6至8中任一所述的方法，其特征在于所述目的植物為雙子葉植物。
10.如權利要求9所述的方法，其特征在于所述雙子葉植物為擬南芥；所述擬南芥為Columbia擬南芥。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種調控植物生長發(fā)育與植物株型相關的蛋白及其編碼基因和應用。本發(fā)明提供的蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白質(a)由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(b)將序列表中序列3的蛋白質經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物發(fā)育相關的由其衍生的蛋白質；所述植物發(fā)育體現在成株株高和/或葉柄長度和/或下胚軸長度和/或特定器官的大小性狀上。將上述蛋白的編碼基因過表達，可以得到株高變矮和/或葉柄縮短和/或下胚軸縮短和/或葉片變小的轉基因植物；將上述蛋白的編碼基因進行抑制表達，可是植株變大。因此AtIBH1可以作為一種潛在的分子育種工具，改良植物株型，提高植物產量。
文檔編號C12N1/21GK101824078SQ20091024186
公開日2010年9月8日 申請日期2009年12月11日 優(yōu)先權日2009年12月11日
發(fā)明者王志勇, 種康, 路鐵剛, 白明義, 張麗穎, 朱佳瑛, 王昊 申請人:中國科學院植物研究所, 中國農業(yè)科學院生物技術研究所, 華盛頓卡內基研究院