專利名稱：穩定堿性磷酸酶或其標記物的試劑和方法
技術領域：
本發明涉及酶穩定劑。具體地講，本發明涉及堿性磷酸酶或其標記物的穩定劑，采 用所述穩定劑穩定堿性磷酸酶或其標記物的方法，包含所述穩定劑和堿性磷酸酶或其標記 物的試劑。
背景技術：
堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,AP)是一種廣泛存在于動物、植物、微生物等 中的酶。經常使用的堿性磷酸酶從小牛腸粘膜和大腸桿菌中提煉，由多個同功酶組成。在 適宜的緩沖液中，堿性磷酸酶可以催化水解硝基苯磷酸鹽(PNP)、β-甘油磷酸鈉、磷酸萘 酯、3-(2-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1，2-二氧環乙烷(AMPPD)等含 磷酸根基團的顯色底物和化學發光底物。鑒于此，堿性磷酸酶作為一種標記酶，廣泛應用于 臨床免疫的定量診斷中。堿性磷酸酶的標記物溶液是體外診斷試劑盒的組分之一，堿性磷酸酶的酶活穩定 性成為試劑盒質量性能的重要影響因素。同其他生物酶一樣，堿性磷酸酶半衰期短、易失 活。酸、堿、鹽離子、溫度條件的變化都會改變甚至使酶完全失去活性。堿性磷酸酶在溶液 中的長期穩定保存技術是體外診斷試劑盒產品的關鍵技術。提高酶穩定性技術包括化學修飾技術和添加劑技術。交聯酶結晶技術(Curr Opin Biotechnol, 10 :331-335,1999)和酶的多聚體共價 結合技術(Bioconjugate Chem,9 =390-398,1998)是現有兩種通過化學修飾提高酶活的技 術。Bieniarz等(Bioconjugate Chem,9 :399-402,1998)將蛋白質、多聚體和堿性磷酸酶 化合，將堿性磷酸酶分別在37°C和45°C保存后測定剩余酶活，發現修飾后的堿性磷酸酶活 性有所增加。然而，化學修飾法改性堿性磷酸酶過程繁雜不易控制，對于診斷試劑產品來說 并不是一個好的選擇。中國專利CN100353166C公開了一種可用于酶標記物作為示蹤劑的免疫檢測產品 中，以延長酶標記物溶液保存期的酶標記物穩定劑。所述穩定劑由蛋白、血紅蛋白、抗自由 基物質以及緩沖液組成。該專利主要運用于易受氧化物質影響的過氧化物酶的保存，未涉 及堿性磷酸酶的穩定保存。中國專利CN1522^8A公開了一種向堿性磷酸酶溶液中加入選自半乳糖、乳糖和 果糖的糖和白蛋白或葡聚糖，并對混合物進行冷凍干燥處理提高人源堿性磷酸酶穩定性的 方法。該專利也未涉及溶液中堿性磷酸酶的穩定保存。中國專利CN1986785A公開了一種由牛血清白蛋白、EGTA、1，2_ 二硫代蘇糖醇、葡 萄糖酸鉀、氯化鈉、Pr0Clin3(K)、醋酸鎂等組成的酶復合穩定劑。該穩定劑對乳酸脫氫酶、肌 氨酸氧化酶、脲酶、肌酐酶、肌酸水解酶、過氧化氫酶、膽固醇氧化酶、膽固醇酯酶、過氧化物 酶具有穩定效果。同樣，該專利也未涉及溶液中堿性磷酸酶的穩定保存。由此可見，本領域仍需要尋求一種能夠穩定堿性磷酸酶或其標記物的試劑。
發明內容
本發明公開一方面涉及一種堿性磷酸酶或其標記物的穩定劑，所述穩定劑包括(1)蛋白；(2)選自鎂離子和含鈣離子的一種或兩種激活劑；(3)鋅離子；以及(4)鈉離子。本發明另一方面涉及一種制備所述堿性磷酸酶或其標記物的穩定劑的方法，所述 方法包括將本發明所公開的穩定劑中各組分溶解在水中，并任選在溶解后干燥成粉末而制 得相應的穩定劑。本發明還一方面涉及一種穩定堿性磷酸酶或其標記物的方法，所述方法包括將本 發明所公開的穩定劑與堿性磷酸酶或其標記物混合溶解成溶液。本發明再一方面涉及一種堿性磷酸酶或其標記物試劑，所述試劑含有本發明所公 開的穩定劑和堿性磷酸酶或其標記物。本發明再一方面涉及一種堿性磷酸酶或其標記物試劑的制備方法，所述方法包括 將本發明所公開的穩定劑和堿性磷酸酶或其標記物溶解混合在水中，并任選在溶解后干燥 成粉末。本發明還再一方面涉及一種試劑盒，所述試劑盒含有本發明所公開的穩定劑和堿 性磷酸酶或其標記物。本發明所公開的穩定劑可以長期穩定保存堿性磷酸酶或其標記物，延長堿性磷酸 酶或其標記物溶液的保存期。對比普通堿性磷酸酶保護劑，使用本發明介紹的堿性磷酸酶 穩定劑，37°C加速破壞進行兩周，堿性磷酸酶酶活基本無損失。本發明可廣泛應用于以堿性 磷酸酶標記物為示蹤劑的免疫檢測產品中，提高該類產品的穩定性和產品質量，如酶保護 劑產品、酶聯免疫診斷試劑盒產品和化學發光免疫診斷試劑盒產品等；可廣泛應用于臨床 診斷、科學研究、環境衛生檢測、法醫鑒定等領域。
具體實施例方式除另有說明外，否則本文中使用的術語“可溶性鹽”是指在水中可溶解的鹽，包括 但不限于鹵化物、硫酸鹽、碳酸鹽、磷酸鹽等。堿性磷酸酶的標記物溶液是體外診斷試劑盒的組分之一。但是，眾所周知，同其他 生物酶一樣，堿性磷酸酶半衰期短、易失活。酸、堿、鹽離子、溫度條件的變化都會改變甚至 使酶完全失去活性。堿性磷酸酶的酶活穩定性成為試劑盒質量性能的重要影響因素。堿性 磷酸酶在溶液中的長期穩定保存技術是體外診斷試劑盒產品的關鍵技術。因此，本發明公開一方面提供了一種堿性磷酸酶或其標記物的穩定劑，所述穩定 劑包括(1)蛋白；(2)選自鎂離子和含鈣離子的一種或兩種激活劑；⑶鋅離子；以及(4)鈉離子。酶試劑中通常含有一定量的蛋白作為保護劑，工業上最常用的就是白蛋白，其主CN 102115737 A
說明書
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用作用是優先吸附，從而防止溶液中堿性磷酸酶因吸附而變性，也可以防止堿性磷酸酶分 子之間因相互作用而導致的聚合變性。本領域技術人員能夠理解，其他的蛋白只要能起到 優先吸附的作用，都對堿性磷酸酶有保護效果。除白蛋白之外，可用于本發明公開的保護劑 中的蛋白還可以包括酪蛋白、明膠、黃原膠等。堿性磷酸酶為一種二聚體蛋白，是一種含鋅的金屬酶。每分子酶至少含2個Si原 子。酶上包含3種類型的金屬結合位點，即所謂的催化結合位點(A)、結構結合位點(B)和 調節結合位點(C)。其中兩個A結合位點的結合則只會導致一個亞單位的磷酸化，即負協作 亞單位之間發生相互作用。雖然不希望受理論的約束，但是認為加入例如Mg2+或Ca2+等金屬離子結合B和C 位點時，可消除上述負協作亞單位之間的相互作用，使得2個亞單位都被磷酸化。每個亞單 位Si2+結合于3個不同的組氨酸殘基，其中至少1個位于A位點。本發明公開的穩定劑中所含的作為激活劑的鎂離子可來源于含鎂離子的可溶性 鹽，所述含鎂離子的可溶性鹽選自硫酸鎂、乙酸鎂、氯化鎂以及其他各種在溶液狀態可以解 離出鎂離子的鹽。本發明公開的穩定劑中所含的作為激活劑的鈣離子可來源于含鈣離子的 可溶性鹽，所述含鈣離子的可溶性鹽選自乙酸鈣、氯化鈣以及其他各種在溶液狀態可以解 離出鈣離子的鹽。可用于本發明公開的穩定劑的鎂離子和鈣離子激活劑用于激活堿性磷酸酶，以提 高堿性磷酸酶催化水解反應的效率。此外，在溶液中存在的鎂、鈣離子還可能與蛋白形成多 點接觸，從而使蛋白的剛性增加，提高了蛋白對溫度等的穩定性。通常來說，在使用中，在溶液中存在的鎂、鈣離子的合適使用濃度為0.001 0. 01mol/Lo當兩者共同使用時，鎂、鈣離子兩者濃度之和在此范圍內。本發明公開的穩定劑所含的鋅離子可來源于含鋅離子的可溶性鹽。所述含鋅離子 的可溶性鹽選自硫酸鋅、氯化鋅以及其他各種在溶液狀態可以解離出鋅離子的鹽。堿性磷酸酶本身是一種含鋅離子的金屬酶，在本發明公開的穩定劑中包含鋅離 子，是為了防止堿性磷酸酶受到螯合劑作用而失去鋅。通常來說，所述含鋅離子的可溶性鹽在溶液中解離出的鋅離子的合適使用濃度為 0.01 0. 2mmol/Lo在本發明公開的穩定劑中還包含鈉離子。雖然不希望受理論約束，但認為在本發明公開的穩定劑中包含的鈉離子可能與堿 性磷酸酶的鋅結合中心結合，使堿性磷酸酶處于較低能級，從而使堿性磷酸酶更加穩定，更 易保持活性。通常認為，高鹽環境不利于酶活性的穩定。因此，發明人發現，鈉離子的使用濃度 為0. 1 3. Omol/L時，對穩定磷酸酶的活性有很大幫助。本發明公開的穩定劑所含的鈉離子可來源于含鈉離子的可溶性鹽。優選用于本發 明公開的穩定劑的含鈉離子的可溶性鹽為氯化鈉。優選氯化鈉的使用濃度為8g/L 175g/ L0如本領域所知，溶液中蛋白質失活或者變性的原因可能有例如吸附，蛋白凝聚，熱 條件導致二硫健交換，蛋白酶水解，門冬氨酸及谷氨酸脫氨，氨基酸殘基消旋，胱氨酸硫基 氧化，色氨酸吲哚氧化等。
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本發明公開的穩定劑還可以任選包含保護劑以消除或減弱上述破壞堿性磷酸酶 活性的因素。可用作本發明穩定劑的保護劑中的多元醇包括但不僅限于甘油、甘露醇、山梨醇、 肌醇、木糖醇等。這些多羥基化合物能與蛋白質分子形成很多氫鍵，有助于形成溶劑層，還 可以增加溶劑水表面張力而導致堿性磷酸酶優先水化，從而增加堿性磷酸酶分子的穩定 性。另外，在穩定劑中包含甘油可在堿性磷酸酶溶液中形成均勻懸液，使懸浮于其中 的堿性磷酸酶保持活性狀態，從而使得堿性磷酸酶構象的平衡轉換朝著天然狀態移動。可用作本發明公開的保護劑中的多糖包括但不僅限于半乳糖、乳糖、果糖、蔗糖、 海藻糖等。多糖的存在能夠干擾堿性磷酸酶的重折疊過程，從而保護堿性磷酸酶。同時，這 些糖類物質的多元醇結構，既可通過氫鍵與堿性磷酸酶表面分子相聯結，也能通過氫鍵有 效地與外部水分子相聯結，使堿性磷酸酶分子穩定。可用作本發明公開的保護劑中的表面活性劑可選自非離子型表面活性劑。非離 子表面活性劑包括但不僅限于失水山梨醇聚氧乙烯醚脂肪酸酯和烷基酚聚氧乙烯醚，例如 失水山梨醇聚氧乙烯醚月桂酸酯類表面活性劑、失水山梨醇聚氧乙烯醚油酸酯類表面活性 劑、辛基酚聚氧乙烯醚類表面活性劑。本發明公開的穩定劑所包含的保護劑中還可包含聚乙二醇(PEG)。該類物質可以 增加溶劑水表面張力而導致堿性磷酸酶優先水化，從而增加堿性磷酸酶分子的穩定性。也 可通過氫鍵與堿性磷酸酶表面分子相聯結，使堿性磷酸酶分子穩定。通常來說，分子量大于 1000的PEG由于具有良好的保濕性，因此優選用于本發明。更優選聚乙二醇6000-20000。可用于本發明穩定劑的各種保護劑可以單獨使用，也可以兩種以上配合使用。所 述保護劑用量通常為0. 10%重量。本發明公開的穩定劑中還任選含有防腐劑，以有助于試劑的防腐和長期保存。對 于防腐劑的種類沒有特殊的要求，市場上常見的防腐劑如PrOclin300、疊氮鈉、凱松、慶大 霉素均可用于本發明公開的穩定劑中。這些添加劑的濃度以不影響堿性磷酸酶活性為宜。本發明公開的穩定劑中還可任選包含有緩沖劑，以將試劑的pH維持在7到9左 右。對于緩沖劑的選擇沒有特殊的要求，常見的緩沖劑包括三羥甲基氨基甲烷(Tris)、三乙 醇胺(TRA)、二乙醇胺(DEA)、2-甲基-2-氨基-1丙醇(AMP)，N-雙(2-羥乙基)_2_氨基 乙磺酸(BESN)、(環己胺)-1-丙磺酸(CAPS3)、(環己胺)_1_乙磺酸(CHES2)、2-羥乙基哌 嗪-N-2-乙磺酸(HEPESN)、(N-嗎啡啉)乙磺酸(MES2)、3_(N_嗎啡代)丙烷磺酸(MOPS)、 哌嗪-N，N-雙乙磺酸)(PIPES)、哌嗪-N，N-雙(2-羥基乙烷磺酸)(POPSO)、三(羥甲 基)甲基-3-氨基丙烷磺酸(TAPSN)、三(羥甲基)甲基-2-氨基磺酸(TESN)、N-2-羥乙 基哌嗪-N-3丙磺酸(HEPPS)。優選緩沖液pH值維持范圍為7. 0 8. 0，緩沖劑的使用量通 常在 10-500mM。本發明公開的穩定劑中還可任選包含有蛋白酶抑制劑，用于防止堿性磷酸酶被蛋 白酶水解破壞。常用抑制劑包括PMSF、P印statin、Leup印tin、Aprotinin等。所述抑制劑 可以常用工作濃度使用。本發明公開的穩定劑可以溶液狀態保存，也可以干粉形式保存。本發明另一方面涉及一種制備所述堿性磷酸酶或其標記物穩定劑的方法。可以將本發明所公開的穩定劑中各組分溶解在水中而制得相應的穩定劑，也可以在制成溶液后， 使用例如凍干的方法干燥成粉末而制得相應的穩定劑本發明還一方面公開了一種穩定堿性磷酸酶或其標記物的方法，所述方法包括將 上述本發明公開的穩定劑和堿性磷酸酶溶解在水中配制成溶液的步驟。具體來說，本發明所公開的穩定堿性磷酸酶或其標記物的方法包括將本發明公開 的穩定劑溶解在水中配成溶液，然后加入堿性磷酸酶。本發明所公開的穩定堿性磷酸酶或 其標記物的方法也可以包括將堿性磷酸酶和本發明公開的穩定劑一起溶解在水中配成溶 液。或者，本發明所公開的穩定堿性磷酸酶或其標記物的方法還可以包括先配好堿性磷酸 酶溶液，再加入本發明公開的穩定劑，混合配成溶液。本發明還一方面涉及一種堿性磷酸酶試劑，所述試劑含有本發明公開的穩定劑和 堿性磷酸酶或其標記物。穩定劑和堿性磷酸酶或其標記物可以溶液狀態保存，也可以干粉 形式保存。穩定劑與堿性磷酸酶或其標記物可以混合保存，也可以分開保存，臨用前混合或 溶解在一起。本發明還再一方面涉及一種制備堿性磷酸酶試劑的方法，所述方法包括將本發明 公開的穩定劑和堿性磷酸酶或其標記物溶解在水中配成溶液，任選再使用例如凍干的方法 干燥成粉末，或者將穩定劑粉末和堿性磷酸酶或其標記物干粉混合，制備堿性磷酸酶試劑。本發明還一方面涉及一種試劑盒，所述試劑盒包含本發明公開的穩定劑和堿性磷 酸酶或其標記物，還任選包含相應的底物和/或包被液等。在本發明公開的穩定劑溶液中添加一定量的堿性磷酸酶或其標記物，隨后置于 37°C恒溫恒濕箱中加速破壞。通過檢測穩定劑中堿性磷酸酶的酶活損失率(100% -活性剩 余比率)判斷穩定劑對堿性磷酸酶的穩定效果。結果發現，未添加穩定劑的堿性磷酸酶酶 活損失率是穩定劑中的堿性磷酸酶酶活損失率的7 70倍(見以下實施例數據)。實施例以下所提供的實施例僅用于對本發明作出進一步的舉例說明，而無意于對說明書 作出任何限定。除非特別聲明，否則本發明實施例中使用的試劑均購自Sigma公司。另外，各實施例中所用的術語“BSA”是指“牛血清白蛋白”。實施例1將堿性磷酸酶加入到以下描述的穩定劑溶液中，配制成終濃度為5ug/mL的酶溶 液，置于37°C恒溫恒濕箱中進行加速試驗。以酶溶液為樣本，利用邁瑞全自動生化分析儀 BS300及配套堿性磷酸酶測定試劑盒，測定溶液中堿性磷酸酶的活性剩余比率(加速試驗 后的活性與制備后活性的比率)。按以下配方配制溶液
BSA1% (g/100ml)
MgCl2
Proclin 300 Tris
用鹽酸調節PH值
ImM
0. 05% (g/100ml) 50mM
pH 為 7· 5
由表1結果可知，在本例穩定劑中，堿性磷酸酶經過加速，一周后酶活剩余沈％，
損失了近70%,
表1堿性磷酸酶活性剩余比率
力口速天數第1天第2天第7天第8天活性剩余比率75%65%33%26%實施例2
將堿性磷酸酶加入到以下描述的穩定劑溶液中，配制成終濃度為5ug/mL的酶溶 液，置于37°C恒溫恒濕箱中進行加速試驗。以酶溶液為樣本，利用邁瑞全自動生化分析儀 BS300及配套堿性磷酸酶測定試劑盒，測定溶液中堿性磷酸酶的活性剩余比率(加速試驗 后的活性與制備后活性的比率)。
按以下配方配制溶液
BSA1% (g/100ml)
ZnCl2,0. ImM
NaCl8g/L
MgCl2ImM
Proclin 300 0. 05% (g/100ml)
Tris50mM
用鹽酸調節PH值
由表2結果可知，在本例穩定劑中，堿性磷酸酶經過加速，二周后酶活損失為 表2堿性磷酸酶活性剩余比率
15%。實施例3將堿性磷酸酶加入到以下描述的穩定劑溶液中，配制成終濃度為5ug/mL的酶溶 液，置于37°C恒溫恒濕箱中進行加速試驗。以酶溶液為樣本，利用邁瑞全自動生化分析儀 BS300及配套堿性磷酸酶測定試劑盒，測定溶液中堿性磷酸酶的活性剩余比率(加速試驗 后的活性與制備后活性的比率)。
加速天數第8天第9天第11天第14天活性剩余比率86%86%83%85%按以下配方配制箱 液
BSA1% (g/100ml)
ZnCl2,0. ImM
NaCl100g/L
酪蛋白1% (g/100ml)
明膠1% (g/100ml)
MgCl2ImM
Proclin 3000. 05% (g/lOOml)
Tris50mM
用鹽酸調節PH值pH 為 7. 5
8由表3結果可知，在本例穩定劑中，堿性磷酸酶經過加速，二周后酶活損失為 10%。表3堿性磷酸酶活性剩余比率
權利要求
1.一種堿性磷酸酶或其標記物的穩定劑，所述穩定劑包括(1)蛋白；(2)選自鎂離子和含鈣離子的一種或兩種激活劑；(3)鋅離子；以及(4)鈉離子。
2.權利要求1的穩定劑，其中所述蛋白選自白蛋白、酪蛋白、明膠和黃原膠中的至少一種。
3.權利要求1至2中任一項的穩定劑，所述穩定劑還含有選自多元醇、多糖、表面活性 劑和聚乙二醇中的一種或多種的保護劑。
4.權利要求3的穩定劑，其中所述多元醇選自甘油、甘露醇、山梨醇、肌醇和木糖醇中 的至少一種。
5.權利要求3-4中任一項的穩定劑，其中所述多糖選自半乳糖、乳糖、果糖、蔗糖、海藻 糖中的至少一種。
6.權利要求3-5中任一項的穩定劑，其中所述表面活性劑選自非離子表面活性劑，優 選失水山梨醇聚氧乙烯醚脂肪酸酯和烷基酚聚氧乙烯醚中的至少一種。
7.權利要求6的穩定劑，其中所述失水山梨醇聚氧乙烯醚脂肪酸酯選自失水山梨醇聚 氧乙烯醚月桂酸酯或失水山梨醇聚氧乙烯醚油酸酯。
8.權利要求6的穩定劑，其中所述的烷基酚聚氧乙烯醚選自辛基酚聚氧乙烯醚。
9.權利要求1-8中任一項的穩定劑，其中作為所述激活劑的鎂和/或鈣離子的使用濃 度為 0. 001 0. 01mol/L。
10.權利要求1-9中任一項的穩定劑，其中所述鋅離子的使用濃度為0.01 0. 2mmol/ L0
11.權利要求1-10中任一項的穩定劑，其中所述鈉離子的使用濃度為0.1 3. 0mol/Lo
12.權利要求1-11中任一項的穩定劑，其中所述鈉離子來源于氯化鈉。
13.權利要求12的穩定劑，其中所述氯化鈉的使用濃度為8g/L 175g/L。
14.權利要求1-13中任一項的穩定劑，其中所述穩定劑任選還含有選自PrOclin300、 疊氮鈉、凱松和慶大霉素的防腐劑，任選還含有緩沖劑，以及任選還含有蛋白酶抑制劑。
15.一種堿性磷酸酶或其標記物的穩定劑的制備方法，所述方法包括將權利要求1-14 的穩定劑中各組分溶解在水中，并任選在溶解后干燥成粉末而制得相應的堿性磷酸酶或其 標記物的穩定劑。
16.一種穩定堿性磷酸酶或其標記物的方法，所述方法包括將權利要求1-14中任一項 的穩定劑與堿性磷酸酶或其標記物混合溶解成溶液。
17.一種堿性磷酸酶或其標記物試劑，所述試劑含有權利要求1-14中任一項的穩定劑 和堿性磷酸酶或其標記物。
18.一種堿性磷酸酶或其標記物試劑的制備方法，所述方法包括將權利要求1-14中任 一項的穩定劑和堿性磷酸酶或其標記物溶解混合在水中，并任選在溶解后干燥成粉末，或 將權利要求1-14中任一項的穩定劑和堿性磷酸酶或其標記物分別干燥成粉末后混合。
19.一種試劑盒，所述試劑盒含有權利要求1-14中任一項的穩定劑和堿性磷酸酶或其 標記物。
全文摘要
本發明公開涉及一種堿性磷酸酶或其標記物的穩定劑及其制備方法，以及采用所述穩定劑穩定堿性磷酸酶或其標記物的方法。本發明還涉及一種堿性磷酸酶或其標記物試劑，及其制備方法。本發明還一方面涉及一種試劑盒，所述試劑盒含有本發明所公開的穩定劑和堿性磷酸酶或其標記物。本發明所公開的穩定劑可以長期穩定保存堿性磷酸酶或其標記物，延長堿性磷酸酶或其標記物溶液的保存期。
文檔編號C12N9/96GK102115737SQ20091023951
公開日2011年7月6日 申請日期2009年12月31日 優先權日2009年12月31日
發明者張裕平, 錢純亙 申請人:深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司