專利名稱：斑點野生稻的pcr鑒定引物及鑒定方法
技術領域：
本發明涉及生物檢測技術，具體地說涉及對斑點野生稻生物資源進行檢測用引物及PCR檢測方法。
背景技術：
野生稻由于長期經受各種災害和不良環境的自然選擇，蘊含大量的有利基因如抗病、抗蟲、抗逆及雄性不育等栽培稻不具有或已消失的特異基因，是水稻遺傳改良的重要基因源。伴隨近十幾年來工業的發展，城市化建設的進程，以及環境污染、人口增長等人為因素對野生稻的生存帶來了嚴重的危害，加上物種流失的加劇，主要的野生稻分布面積正在迅速減少，所以保護和鑒定野生稻顯得尤為重要。雖然稻屬多倍體起源和系統發育關系的基本框架已經形成，但是其物種的分類和鑒定仍非常困難，特別是把形態、地域分布或細胞型考慮在內時就更為嚴重，在非洲廣泛分布的斑點野生稻0. punctata鑒定和利用面臨的困難就是很典型的例子。 水稻的分類鑒定和種間親緣關系的研究多集中于形態學和細胞遺傳學的分析研究。近幾年來借助于分子生物學手段，如AFLP、RFLP、SSR、RAPD、FISH、GISH等技術，對稻屬基因組間的親緣關系進行了較廣泛的研究。但是在口岸物種資源的查驗中，這些分子手段都面臨著技術含量高、操作復雜、耗時、成本高、不能通用和難于標準化等問題，很難滿足實際工作的需要。尋找合適的基因、DNA片段進行比較分析，利用分子標記簡單、準確、快捷和不受植物生長周期限制等優勢發展合適的分子鑒定體系是比較科學的策略。W. John Kress等認為色素體psbA-trnH基因能夠很好的區分陸生植物，特別是開花植物。通過比較全部的煙草和龍葵屬植物，以及七個近緣的植物屬和從一個植物區系的五十個植物屬中抽樣的被子植物，提出該基因在區別鑒定植物物種上有巨大的潛力。 目前國內外對于0. punctata的識別僅限于形態上，未見分子檢測方法的研究。
本發明應用PCR方法對斑點野生稻的分子檢測方法進行研究，通過psbA-trnH序列設計特異引物，建立了對斑點野生稻穩定、高效的鑒定方法、成本低，可根據對擴增產物的普通瓊脂糖電泳判定是否有斑點野生稻核酸存在。
發明內容
本發明目的在于提供用于斑點野生稻PCR檢測的引物及方法。 本發明通過分析斑點野生稻0. punctata與稻屬及其近緣種等禾本科植物葉綠體
psbA-trnH基因序列的基礎上，設計特異引物，能夠快速、準確地對0. punctata進行定性檢 本發明提供的檢測引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1和2所示。
以樣品總DNA為模板，上述的引物進行PCR擴增，根據PCR擴增產物判定樣品是否為斑點野生稻。即檢測PCR產物中是否存在118bp的特異性擴增。具體地說，可以利用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，根據是否存在118bp的特異性條帶，來判斷樣品是否為陽性。
PCR25iiL反應體系樣 品DNA 1 ii L (1 0 _5 0 n g) ， 1 0 X P CRbuffer(Mg2+free)2. 5ii L，25mM MgCL2 2 ii L， 10mM d證s 2 ii L， 10 ii MPrimers 1 ii L/l ii L，5U/ ii L Taq DNA polymerase 0. 1 ii L， ddH20 15. 4 ii L。 反應條件預變性94。C 4min，再經94。C變性lmin，62。C退火lmin，72。C延伸1. 5min，30循環，最后72。C延伸7min。 可以將本發明引物以及相關試劑組裝成試劑盒，以方便使用。 本發明建立了適合口岸應用的簡便的檢測方法，即直接從進、出境的禾本科類材料上檢測斑點野生稻，操作快捷、結果準確，避免了用傳統的形態分類學和細胞學方法所產生的耗費時間和易疏漏的缺陷，順應了當今口岸檢測工作的特點。
圖1是PCR法對斑點野生稻特異性檢測實驗； 圖中，M :D應arker DL2000 ;1， 18 :斑點野生稻06-120 ;2 :東鄉野生稻;3 :桂林野
生稻；4 :江永野生稻；5 :藥用野生稻05-28 ;6 :寬葉野生稻06-121 ;7 :高桿野生稻05-61 ;8 :樂東野生稻;9 :普野廣西4084 ;10 :普野臨高YD1-49 ;11 :絲優63 ;12 :湘矮早;13 :普野07-24 ;14 :粗山羊草Y2265 ;15 :野生二粒小麥D510 ;16 :日本晴；17 :稗草；19 :長花藥野生稻05-51 ;20 :普野瓊海YD1-41 ;21 :東方野生稻；22 :緊穗野生稻；23 :普野37 ;24 :恢復系明恢63 ;25 :新香優80 ;26 :密陽46 ;27 :金優207 ;28 :桂99 ;29 :玉米齊319 ;30 :中國春；31 :短柄草BD21 ;32 :水對照。
具體實施例方式
下面實施例用于對本發明的進一步說明，但不用來限制本發明的范圍。
實施例1引物的設計根據斑點野生稻psbA-trnH序列，利用軟件和Primer 3設計引物，經過多輪篩選，意外發現以下引物的特異性顯著優于其它引物，該引物序列為
正向5' -CGGCATTTCACGAGTTATGA-3'
反向5' -TTGCTTCAGCGAGATATTGG-3，。
實施例2總DNA的提取 (1)取0. 2 0. 3g植物組織，用硅膠保存，剪碎后置研缽中加液氮研成粉末狀，移至已滅菌的1. 5mL離心管，一般加到離心管的1/3體積。 (2)在離心管中加入已在65t:預熱500 y LCTAB提取液(20g/LCTAB， 1. 4M NaCl，
0. 1M Tris-HCl，20mM EDTA， pH 8.0)混勻，置于65。C水浴鍋保溫30分鐘。 (3)將樣品從水浴鍋中取出，加入與提取液等體積的氯仿/異戊醇(24 : l)，上下
顛倒離心管充分混勻，12000轉/分鐘離心15分鐘。 (4)吸取上清液置于另一已滅菌的1. 5mL離心管。 (5)再加入等體積的氯仿/異戊醇(24 : l)，重復步驟(3)， (4)。 (6)加入等體積或兩倍體積的無水乙醇(已在_201:預冷)，輕輕顛倒離心管混勻，
置于_201:冰箱，放置30分鐘。 (7) 10000轉/分鐘離心10分鐘，倒去上清液，保留沉淀.此時的沉淀物主要為DNA。 (8)加入400iiL70X乙醇，10000轉/分鐘離心5分鐘，收集沉淀。置于37。C或5(TC烘箱烘干。(9)加入100 ii L TE (或者滅菌水)溶解DNA，再加2 y LRNA酶(10mg/ml)，37。C保溫30分鐘。 (10) 1. 0%瓊脂糖電泳檢測DNA濃度及質量。
實施例3PCR擴增方法的建立
1、PCR反應體系 以總DNA為模板，進行PCR反應，25 ii L反應體系中有樣品樣品DNA1 ii L(10-50ng) ， 10XPCR buffer (Mg2+free) 2. 5 ii L， 25mMMgCL2 2iiL，10mM dNTPs 2 ii L，10 ii M Primers 1 u L/1 u L， 5U/ u L TaqDNA polymerase 0. 1 u L， ddH20 15. 4 u L。
2、PCR反應條件 將樣品管放入ABI 7900PCR儀后，設置如下條件進行反應預變性94t: 4min，再經94"變性lmin，62t:退火lmin，72t:延伸1. 5min， 30循環，最后72"C延伸7min。反應結
束后擴增產物經過瓊脂糖凝膠電泳判定結果。 實施例4斑點野生稻PCR方法的特異性確定 以斑點野生稻與稻屬及其近緣種等22個禾本科植物總DNA為模板，以水為陰性對照，通過PCR反應結束后瓊脂糖凝膠電泳118bp的特異性擴增條帶判定陽性結果。
試驗結果 只有斑點野生稻的PCR擴增產物出現陽性擴增，而其它近緣和本科材料和陰性對照均沒有擴增信號，結果見圖1。序列表〈110〉中國檢驗檢疫科學研究院〈120〉斑點野生稻的PCR鑒定引物及鑒定方法〈130〉〈160>2〈170>PatentIn version〈210>1〈211>20〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>1cggcatttca cgagttatga〈210>2〈211>20〈212>DNA
〈213〉人工序列〈400>2ttgcttcagc gagatattgg
權利要求
一種斑點野生稻鑒定用引物，其核苷酸序列為正向5’-CGGCATTTCACGAGTTATGA-3’反向5’-TTGCTTCAGCGAGATATTGG-3’。
2. —種鑒定斑點野生稻的方法，該方法以樣品總DNA為模板，利用權利要求l所述的引物進行PCR擴增，根據PCR擴增產物判定樣品是否為斑點野生稻。
3. 如權利要求2所述的方法，其特征在于，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，產生118bp的特異性擴增條帶則判定陽性結果。
4. 如權利要求2或3所述的方法，其特征在于，PCR的反應程序為預變性94°C 4min，再經94t:變性lmin，62。C退火lmin，72。C延伸1. 5min， 30循環，最后72。C延伸7min。
5. 含有權利要求1所述引物的試劑盒。
全文摘要
本發明提供了一種斑點野生稻PCR鑒定用引物及方法，所述引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1&2所示。本發明還進一步提供了斑點野生稻鑒定的PCR檢測方法，該方法以樣品總DNA為模板，利用上述引物進行PCR擴增，反應結束后根據瓊脂糖電泳判定結果。本發明引物特異性好，檢測方法快速簡單，準確性高，靈敏度好，為斑點野生稻物種資源的鑒定提供了有效檢測方法。
文檔編號C12N15/11GK101701257SQ200910238019
公開日2010年5月5日 申請日期2009年11月13日 優先權日2009年11月13日
發明者徐濤, 許瑾 申請人:中國檢驗檢疫科學研究院