專利名稱：大豆GmFTL1蛋白和GmFTL2蛋白及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程領域，特別是涉及兩個大豆開花基因及其在植物光周期和開 花時間調節中的應用。
背景技術：
大豆是重要的農作物之一，是植物蛋白質、食用油、生物柴油以及異黃酮和卵磷脂 等次生代謝產物的重要來源。因為大豆是短日植物，開花受光周期的嚴格控制，因而不同區 域間的優異品種不能相互引種、生育期也受環境光周期的制約ahang et al.，2008)。如果 能降低大豆對光周期的敏感性，突破大豆開花對光周期的限制，就能解決大豆的引種問題， 從而實現各區域間優質品種的相互交換，豐富各地優異種質資源，調節大豆生育期，提高大 豆產量和品質。以往解決大豆光周期敏感性主要是通過雜交的方法獲得新品種，但是，這種 育種方法具有對親本的依賴性強和周期長等缺點，到目前為止尚未獲得大豆光周期廣適應 性品種。對擬南芥等植物的研究表明，植物的光周期是受極其復雜的調節網絡控制的 (Mouradov et al. ,2002 ；Turck et al. ,2008) 但是，其中一個關鍵基因對開花時間的調 節起著至關重要的作用，它就是Flowering Locus T (簡稱FT)，它在葉片中產生，通過維管 組織系統運輸到生長點并誘導生長點形成花(Blazquez and ffeigel,2000 ；Lee et al.， 2000 ；Samach et al.，2000 ；Turck et al. ,2008) 因而,FT 蛋白被稱為成花素(Corbesier et al.，2007 Jaeger and ffigge,2007 ；Mathieu et al. , 2007)。該成花素的表達可以降低 植物對光周期的敏感性，促進植物開花。FT基因的功能在不同的植物中有報道(Bohlenius et al. , 2006 ；Hsu et al. , 2006 ；Yan et al. ,2006 ；Corbesier et al. , 2007 ； Jaeger and ffigge,2007 ；Lin et al. ,2007 ；Mathieu et al. ,2007 ；Tamaki et al. ,2007 ；Liand Dubcovsky, 2008)，但在大豆FT基因的功能及其應用未見報道。通過調節大豆開花基因表 達來改變植物對光周期的敏感性和開花時間也沒有報道。
發明內容
本發明的目的是提供兩個大豆開花基因及其在植物光周期和開花時間調節中的 應用。包括(1)克隆兩個大豆開花基因GmFTLl和GmFTL2 ;(2)提供基因及其編碼蛋白的序 列；C3)提供這兩個基因在育種中的應用，尤其是在調節植物光周期以及開花時間中的應用。為達到上述目的，本發明的技術方案提供一種大豆GmFTLl蛋白，其具有如SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列或該序列經替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功 能的氨基酸序列，以及大豆GmFTL2蛋白，其具有如SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列或該序 列經替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。本發明還提供編碼上述的大豆GmFTLl蛋白和大豆GmFTL2蛋白的基因。大豆 GmFTLl蛋白的基因具有如SEQ ID No. 3所示的核苷酸序列或該序列經替換、缺失或添加一個或幾個核苷酸形成的具有同等功能的核苷酸序列。大豆GmFTL2蛋白的基因具有如SEQ IDNo. 4所示的核苷酸序列或該序列經替換、缺失或添加一個或幾個核苷酸形成的具有同等 功能的核苷酸序列。本發明GmFTLl和GmFTL2(全稱為Glycine max Flowering Locus T Like丄和幻是從大豆墾農18 (Glycine max L. Kennong 18)中克隆到的兩個基因，該基 因編碼蛋白的氨基酸序列相互間的同源性為94.3%，與擬南芥FT蛋白質的同源性分別為 67%和73%。并且GmFTLl和GmFTL2蛋白與擬南芥FT具有相同的保守域。因此，GmFTLl 和GmFTL2與擬南芥FT基因具有類似促進開花的功能。但是，GmFTL 1和GmFTL2的蛋白質序 列與擬南芥FT蛋白有重要不同。在重要功能域中，大豆GmFTLl和GmFTL2的蛋白質第1 位氨基酸殘基為谷氨酰胺⑴)，第1 位是苯丙氨酸(F)，第132位是精氨酸(R)，第150位 氨基酸殘基是亮氨酸(L)，而擬南芥相應部位是亮氨酸(L)、甘氨酸(G)、蘇氨酸(T)和異亮 氨酸(I)。這些差異導致GmFTLl和GmFTL2的活性比擬南芥FT高。大豆GmFTLl和GmFTL2 基因主要在開花前期和開花期的葉中表達。本發明包括通過各種方法獲得的、如SEQ ID No. 1-2所示氨基酸序列或該序列經 替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的衍生蛋白質以及編碼這些衍生 蛋白質的基因。本發明將GmFTLl和GmFTL2基因構建到表達載體p35S-GW，并在大腸桿菌DH5a中 擴繁。通過農桿菌介導轉化方法，將P35S-GW攜帶的GmFTLl和GmFTL2基因轉入擬南芥，獲 得擬南芥轉化植株。實驗結果表明，GmFTLl和GmFTL2具有降低植物對光周期的敏感性并 促進擬南芥開花的作用。本發明還包括含有GmFTLl和GmFTL2核苷酸序列或其片段的克隆載體或各類表達 載體、含有所述載體的宿主細胞、含有所述核苷酸序列或其片段的轉化植物細胞和轉基因 植物。上述技術方案具有如下優點1、提供了大豆GmFTLl和GmFTL2基因及其編碼的蛋白本身；2、過表達GmFTLl和GmFTL2基因改變植物生育期、促進植物開花。過表達大豆開 花基因GmFTLl和GmFTL2明顯促進植物(擬南芥)開花，使開花時間縮短，生育期縮短。因 而，GmFTLl和GmFTL2具有調節花期，可用于解決雜交育種中的花期不遇問題、各種作物、 蔬菜、水果、花卉的生育期控制問題、光周期敏感性問題和引種問題。而且，大豆GmFTLl和 GmFTL2的效應明顯比擬南芥FT基因的效應強。
圖1是本發明大豆開花基因GmFTLl和GmFTL2編碼蛋白的結構分析；圖2為本發明實施例3的植物表達載體p35S-GW ；圖3為本發明實施例4的克隆中間載體pGWGC ；圖4為本發明實施例5的大豆開花基因GmFTLl促進擬南芥開花圖；圖5為本發明實施例6的大豆開花基因GmFTLl促進擬南芥開花圖；圖6為本發明實施例7的大豆開花基因GmFTLl促進擬南芥開花圖；圖7為本發明實施例8的大豆開花基因GmFTLl促進擬南芥開花圖；圖8為本發明實施例9的大豆開花基因GmFTL2促進擬南芥開花4
圖9為本發明實施例10的大豆開花基因GmFTL2促進擬南芥開花圖；圖10為本發明實施例11的大豆開花基因GmFTL2促進擬南芥開花圖；圖11為本發明實施例12的大豆開花基因GmFTLl和GmFTL2的表達水平；圖12為本發明實施例13的大豆開花基因GmFTLl和GmFTL2在細胞核中的定位。
具體實施例方式下面結合附圖和實施例，對本發明的具體實施方式
作進一步詳細描述。以下實施 例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。實施例1 大豆開花基因GmFTLl和GmFTL2的克隆利用正向引物ATGCCTAGTGGTAGTAGGAAC (如SEQ ID No. 5所示)和反向引物 TCAAAATGTTCTACCACCAGA (如 SEQ ID No. 6 所示)從大豆墾農 18 (Glycine max L. Kennong 18)中克隆并測序獲得GmFTLl和GmFTL2，其基因序列如SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4所示; 由其編碼的蛋白質的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1和SEQ IDN0. 2所示。實施例2 大豆開花基因GmFTLl和GmFTL2編碼蛋白的結構分析(見圖1)大豆開花基因的GmFTLl和GmFTL2蛋白序列之間的同源性大于94. 3%，C端的功 能域與擬南芥高度同源，但存在重要區別。如大豆GmFTLl和GmFTL2的蛋白質第1 位氨 基酸殘基為谷氨酰胺⑴)，第1 位是苯丙氨酸(F)，第132位是精氨酸(R)，第150位氨基 酸殘基是亮氨酸(L)，而擬南芥相應部位是亮氨酸(L)、甘氨酸(G)、蘇氨酸(T)和異亮氨酸 (I)。這些差異導致GmFTLl和GmFTL2的活性比擬南芥FT高。實施例3 大豆開花基因GmFTLl和GmFTL2植物表達載體大豆開花基因GmFTLl和GmFTL2構建在圖2所示的植物表達載體p35S_GW中，用 于在植物中過表達大豆開花基因GmFTLl和GmFTL2，研究其功能。植物的轉化方法采用農桿 菌介導法進行。植物中的篩選標記為Bar。實施例4 大豆開花基因GmFTLl和GmFTL2所用克隆的中間載體為pGWGC (見圖3)。從實施例1中擴增獲得的PCR產物直接按照TA克隆方法克隆到pGWGC上。克隆 前，pGWGC事先用Ahd I內切酶水解已獲得T載體。連接產物轉化大腸桿菌DH5 α，并在其 中擴繁，陽性克隆經過測序篩選獲得實施例1所示的序列。應用實施例實施例5 大豆開花基因GmFTLl促進擬南芥開花一轉化系I從實施例3獲得的擬南芥轉化植株與其親本(野生型C0L)在長日植株生長室中 的條件(16小時光照/8小時黑暗的光周期，光強80 μ m0l*m_2· s—1)下同時一起培育，直至 轉化植株開花(約20天)。圖4顯示大豆開花基因GmFTLl轉化擬南芥，導致擬南芥早開 花，對光周期不敏感。如圖4所示，其中右圖為轉基因植株，左圖為對照。說明大豆GmFTLl 具有開花活性，可以促進植物開花。實施例6 大豆開花基因GmFTLl促進擬南芥開花一轉化系II從實施例3獲得的擬南芥轉化植株與其親本(野生型C0L)在長日植株生長室中 的條件(16小時光照/8小時黑暗的光周期，光強80 μ m0l*m_2· s—1)下同時一起培育，直至 轉化植株開花(約20天)。圖5顯示大豆開花基因GmFTLl轉化擬南芥，導致擬南芥極早開 花，對光周期不敏感。如圖5所示，其中右圖為轉基因植株，左圖為對照。說明大GmFTLl具有開花活性，可以促進植物開花。實施例7 大豆開花基因GmFTLl促進擬南芥開花一轉化系III從實施例3獲得的擬南芥轉化植株與其親本(野生型C-0L)在長日植株生長室中 的條件(16小時光照/8小時黑暗的光周期，光強80 μ m0l*m_2· s—1)下同時一起培育，直至 轉化植株開花(約20天)。圖6顯示大豆開花基因GmFTLl轉化擬南芥，導致擬南芥極早開 花，對光周期不敏感。如圖6所示，其中右圖為轉基因植株，左圖為對照。說明大豆GmFTLl 具有開花活性，可以促進植物開花。實施例8 大豆開花基因GmFTLl促進擬南芥開花一轉化系IV從實施例3獲得的擬南芥轉化植株與其親本(野生型C0L)在長日植株生長室中 的條件(16小時光照/8小時黑暗的光周期，光強80 μ m0l*m_2· s—1)下同時一起培育，直至 轉化植株開花(約20天)。圖7顯示大豆開花基因GmFTLl轉化擬南芥，導致擬南芥早開 花，對光周期不敏感。如圖7所示，其中右圖為轉基因植株，左圖為對照。說明大豆GmFTLl 具有開花活性，可以促進植物開花。實施例9 大豆開花基因GmFTL2促進擬南芥開花一轉化系I從實施例3獲得的擬南芥轉化植株與其親本(野生型C0L)在長日植株生長室中 的條件(16小時光照/8小時黑暗的光周期，光強80 μ m0l*m_2· s—1)下同時一起培育，直至 轉化植株開花(約20天)。圖8顯示大豆開花基因GmFTL2轉化擬南芥，導致擬南芥極早開 花，對光周期不敏感。如圖8所示，其中右圖為轉基因植株，左圖為對照。說明大豆GmFTL2 具有開花活性，可以促進植物開花。實施例10 大豆開花基因GmFTL2促進擬南芥開花一轉化系II從實施例3獲得的擬南芥轉化植株與其親本(野生型C0L)在長日植株生長室中 的條件(16小時光照/8小時黑暗的光周期，光強80 μ m0l*m_2· s—1)下同時一起培育，直至 轉化植株開花(約20天)。圖9顯示大豆開花基因GmFTL2轉化擬南芥，導致擬南芥極早開 花，對光周期不敏感。如圖9所示，其中左圖為轉基因植株，右圖為對照。說明大豆GmFTL2 具有開花活性，可以促進植物開花。實施例11 大豆開花基因GmFTL2促進擬南芥開花一轉化系III從實施例3獲得的擬南芥轉化植株與其親本(野生型C0L)在長日植株生長室中 的條件(16小時光照/8小時黑暗的光周期，光強80 μ m0l*m_2· s—1)下同時一起培育，直至 轉化植株開花(約20天)。圖10顯示大豆開花基因GmFTL2轉化擬南芥，導致擬南芥早開 花，對光周期不敏感。如圖10所示，其中右圖為轉基因植株，左圖為對照。說明大豆GmFTL2 具有開花活性，可以促進植物開花。實施例12 大豆開花基因GmFTLl和GmFTL2主要在開花前期和開花期的葉片中表 達，在葉柄和莖中高水平表達。如圖11所示。通過利用實時定量熒光PCR(quantitative real time RT-PCR)測定大豆開花基 因GmFTLl和GmFTL2表達。圖中，短線前面字母表示植株的發育時期，后面字母表示器官。 U，單葉；T為復葉(T后面的數字為復葉的順序)；F，花；Pd，莢；Pt，葉柄(其后數字表示不 同時期的莢)；R，根；HH，上胚軸；EH，下胚軸；SAM，生長點；St，莖；L，側生葉；C，子葉實施例13 大豆開花基因GmFTLl和GmFTL2編碼蛋白定位于細胞核中大豆開花基因GmFTLl和GmFTL2與GFP的融合基因，通過基因槍法轉化擬南芥原生質體和大豆葉片。轉化細胞中GFP熒光信號表示大豆開花基因GmFTLl和GmFTL2編碼蛋 白的定位。圖12顯示大豆開花基因GmFTLl(A和C)和GmFTL2 (B和D)編碼蛋白在擬南芥 原生質體(A和B)和大豆葉片(C和D)中定位于核。 以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人 員來說，在不脫離本發明技術原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾 也應視為本發明的保護范圍。序列表
<110>中國農業科學院作物科學研究所
<120>大豆GmFTLl蛋白和GmFTL2蛋白及其應用
<130>KHP09113517. 7
<160>6
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>175
<212>PRT
<213>GmFTLl
<400>1
Met Pro SerGlySerArgAsnProLeuValValGlyArgVallieGly
151015
Glu Val lieAspProPheGluSerSerlieProPheArgValThrTyr
202530
Gly Asn LysGluValGlyAsnGlyCysGluLeuLysProSerGlnVal
354045
Pro Asn GlnProArgValSerlieGlyGly Asp Asp Leu Arg Lys Phe
505560
Tyr Thr MetValMetValAspProAspAlaProSerProSerAsnPro
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859095
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<210>2
<211>175
<212>PRT
<213>GmFTL2
<400>2
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1
Glu
Gly
Ala
Tyr
65
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Val lie
Asn Arg
35 Asn Gln 50
Thr Met
Phe Thr Gly Pro Pro Thr
Phe
Arg 145 Phe
Arg 130 Glu
Asp 20 Glu
Ser 5
Pro
Val Pro Arg
Val Leu Arg Glu
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Phe Phe Asn
Asn 100 Gly
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Arg
Phe
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Val
Val
70
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Asn Pro Leu Glu lie Asn
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Ser
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Gly Pro Asp
Glu Gly Asp Ala
Val Gly Pro Phe Leu Lys
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lie Val Tyr Glu
Gly Asn His Arg
His Trp Leu Glu
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Val 105 Val
Val
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Val
Pro
75
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Asp 60
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Pro
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lie
15
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Asp Ser Tyr
lie Pro Glu
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Gly Trp Gly
Phe Val Leu Arg
Ser 170
Leu 155 Gly
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Ser 110 Arg
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Gln
Asn
Ala
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Tyr
Val
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Pro 80 Thr
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Gln
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0114]<210>30115]<211>5280116]<212>DNA0117]<213>GmFTLl0118]<400>30119]atgcctagtggtagtaggaa0120]ccctttgaaagttctattcc0121]tgtgagcttaaaccttctca0122]ctcaggaaattctacactat0123]agtttcagagagtatcttca0124]ttcggtaacgagatcgtaag0125]gtgtttgtgttattccgtca
ccctcttgtt gttgggcgtg tttcagggtg acctatggta agttcccaac caacctagag ggtcatggtg gatcctgatg ttggttggtg actgatattc ctatgaaagc ccgcgaccca acagtttaga cagagggtgt
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1.大豆GmFTLl蛋白，其特征在于，其具有如SEQID No. 1所示的氨基酸序列或該序列 經替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
2.大豆GmFTL2蛋白，其特征在于，其具有如SEQID No. 2所示的氨基酸序列或該序列 經替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
3.編碼權利要求1所述的大豆GmFTLl蛋白的基因。
4.編碼權利要求2所述的大豆GmFTL2蛋白的基因。
5.如權利要求3所述的基因，其特征在于，其具有如SEQID No. 3所示的核苷酸序列或 該序列經替換、缺失或添加一個或幾個核苷酸形成的具有同等功能的核苷酸序列。
6.如權利要求4所述的基因，其特征在于，其具有如SEQID No. 4所示的核苷酸序列或 該序列經替換、缺失或添加一個或幾個核苷酸形成的具有同等功能的核苷酸序列。
7.含有權利要求3-6任一項所述基因或其片段的載體。
8.含有權利要求7所述載體的宿主。
9.含有權利要求3-6任一項所述基因或其片段的轉化植物細胞。
10.權利要求3-6任一項所述的基因或其片段在調節植物光周期和開花時間中的應
全文摘要
本發明公開了一種大豆GmFTL1蛋白和GmFTL2蛋白，其具有如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的氨基酸序列或該序列經替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。過表達大豆開花基因GmFTL1和GmFTL2可明顯促進植物(擬南芥)開花，使開花時間縮短，生育期縮短。可用于解決雜交育種中的花期不遇問題、各種作物、蔬菜、水果、花卉的生育期控制問題、光周期敏感性問題和引種問題。
文檔編號C12N15/63GK102079779SQ200910237919
公開日2011年6月1日 申請日期2009年11月26日 優先權日2009年11月26日
發明者傅永福, 張曉玫 申請人:中國農業科學院作物科學研究所