專利名稱：一種快速檢測轉基因煙草外源基因拷貝數的方法
技術領域：
本發明涉及一種快速檢測轉基因煙草外源基因拷貝數的方法，屬于基因工程領域。
二背景技術：
在轉基因植物中，外源基因是被隨機地插入到植物基因組中的，而插入到不同或 相同位置染色體的多個轉基因拷貝經常會導致基因沉默。只有插入單拷貝或雙拷貝的外源 基因的植物才能產生高水平的表達，所以檢測轉基因拷貝數，選擇單拷貝或雙拷貝轉基因 株系進行后期功能鑒定至關重要。 目前判斷基因拷貝數的方法主要有Southern雜交、實時熒光定量PCR，還包括熒 光原位雜交、比較基因組雜交，對于Southern雜交，該方法通過基因組酶切、電泳、轉膜、雜 交等步驟，可判斷拷貝數；對于實時定量PCR，該方法通過監測PCR過程中產物的實時變化， 可判斷基因拷貝數；而對于熒光原位雜交、比較基因組雜交該兩種技術，其工作量、費用和 困難程度比之Southern雜交有過之而不及。 煙草是一種轉基因研究的模式植物，轉化體系成熟，易于獲得陽性植株。本發明的 成功運用，將給今后運用轉基因技術研究基因功能帶來極大的便利。
三、
發明內容
技術問題 本發明的目的是公開一種快速檢測轉基因煙草外源基因拷貝數的方法，為廣大轉 基因工作者提供一種快速而成本低廉的轉基因拷貝數檢測的方法，尤其是對單拷貝和雙拷 貝基因的鑒定。
技術方案 煙草純合微衛星(SSR)位點的獲得一人工合成短截SSR核苷酸片段一將合成片段 插入含有欲轉入基因的植物雙元表達載體一采用農桿菌介導葉盤法轉化煙草一煙草抗性 苗的獲得一煙草抗性苗DNA的提取一PCR擴增一判斷轉入外源基因拷貝數。
1、快速檢測轉基因煙草外源基因拷貝數的方法，其具體步驟如下
1)人工合成序列'SSR-95'并加入HindIII、 Sphl酶切位點； 2)將步驟1)所述序列'SSR-95'插入到含有目的基因的植物雙元表達載體 pCAMBIA-1301的相應酶切位點，轉化至大腸桿菌DH5a菌株，PCR檢測后，提取陽性菌液質 粒，將其轉化至農桿菌EHA105菌株，PCR檢測后獲得陽性菌株；
3)將步驟2)所述陽性農桿菌EHA105菌株采用葉盤法轉化至煙草'K326';
4)將步驟3)所述煙草進行GUS染色，獲得GUS陽性株系； 5)采用常規CTAB法提取步驟4)所述GUS陽性株系的DNA，將其稀釋至50-100ng/ y 1 ，用引物P-F : 5' -TCGGGTCGTTACAACTGATG-3'禾P P-R : 5' -CCACGTCATTCGGAGTTGTT-3'進行 PCR擴增，經2X瓊脂糖凝膠電泳檢測，發現兩條條帶，其中一條為內源SSR片段'SSR-168'，另一條為外源合成的短截片段'SSR-95';當'SSR-95'亮度低于'SSR-168'時，則表示與片 段'SSR-95' —同轉入煙草基因組的目的基因為單拷貝； 當'SSR-95'亮度高于'SSR-168'時，則表示轉入的目的基因為多單拷貝；當兩者 亮度一致時，則表示所轉入的目的基因為雙拷貝。
有益效果 使用Southern雜交檢測轉基因株系的拷貝數，DNA的需求量較大，同時也要花費 較長的時間，而采用實時熒光定量PCR檢測轉基因株系的拷貝數，則需要昂貴的熒光定量 PCR儀，但本發明只需采用一對SSR特異引物對轉基因植物進行PCR檢測，就可以快速檢測 轉基因株系的拷貝數，簡單易行，尤其是對插入單拷貝和雙拷貝外源基因株系的檢測。
四
圖1為植物雙元表達載體'pSSR-C0PY' T-DNA區域結構示意圖
圖2為拷貝數檢測原理示意圖 圖3為轉基因煙草拷貝數2%瓊脂糖凝膠電泳檢測圖 M :DNA分子量Marker ;1 :陽性外源SSR質粒對照；2 :陰性內源SSR片段對照；3-6 : 轉基因株系A-D 圖4為轉MdCAXl基因煙草生根苗
五具體實施例方式
1、煙草品種'K326'純合微衛星(SSR)位點'PT1199'的獲得 Bindler等(Bindler G，van der Hoeven R，Gunduz I et al. A microsatellite
marker basedlinkage map of tobacco [J]. Theor. Appl. Genet. ， 2007， 114 :341-349)獲得
一個一.倍體煙草品種'K326'純合微衛星(SSR)位點'PT1199'，合成該位點的特異引物如下P-F :5' -TCGGGTCGTTACAACTGATG-3'
P-R:5' -CCACGTCATTCGGAGTTGTT-3'
進行PCR擴增，反應體系(25 ii 1)如下
煙草DNA(100ng/ii 1)1 ii 1HiFi Taq(5U/ii 1)0. 2ii 1上游引物(lOiiM)1 ii 1下游引物(lOiiM)1 ii 1Buffer I(IOX)2. 5ii 1d證(10mM)0. 5ii 1無菌ddH2018. 8ii 1反應程序如下94°C 5min ;35個循環:94°C 30s，54。C 30s，72。C 30s ;72。C 5min ;10。C 20min將擴增片段于2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，使用凝膠回收試劑盒(愛思進生物技術有限公司生產)回收該片段，繼而連接到PMD18-T(購自大連寶生物有限公司)克 隆載體中，轉化大腸桿菌DH5 a菌株(購自全式金生物技術有限公司)，經藍白斑篩選，
4挑取白色菌落進行培養，PCR鑒定陽性克隆，交由上海英俊生物技術有限公司測序，獲得長度為168bp預期片段'SSR-168' (Bindler G， van der Hoeven R， Gunduz I etal. Amicrosatellite marker based linkage map of tobacco[J]. Theor. Appl. Genet. ，2007，114 :341-349)。 2、煙草品種'K326，純合微衛星(SSR)位點'PT1199'短截片段'SSR-95'的獲得
根據測序獲得的片段'SSR-168'，從其中間截去長度為73bp序列，獲得片段'SSR-95'，在其兩端加入Hind III、 Sph I酶切位點，將該序列交由金斯特生物技術有限公司人工合成，獲得一個'PUC57-SSR'克隆載體質粒(PUC57克隆載體，金斯特生物技術有限公司)。 3、載體構建 將上述獲得的含有SSR短截片段的'PUC57-SSR'克隆載體質粒，使用內切酶HindlII、Sph I(購自大連寶生物有限公司)進行雙酶切，反應體系(50iU)如下
PUC57-SSR質粒(50ng/ ii 1)38 ii 1 HindlII(15U/ii 1) 1 ii 1 Sphl(15U/ii 1) K Buffer (10 X) 5 ii 1 無菌ddH20 5 ii 1 將上述樣品混勻后，于37°C的水浴鍋中，酶切2-3h后，在2 %的瓊脂糖凝膠中進行檢測。使用凝膠回收試劑盒(愛思進生物技術有限公司生產)回收切下的小片段，將回收的該片段亞克隆到含有目的基因MdCAXl(NCBI登錄號為FJ008870)植物雙元表達載體pCAMBIA-1301的相應酶切位點(圖l)，連接體系(20iU)如下 pCAMBIA-1301 (50ng/ ii 1) 1 ii 1 片段'SSR-95， (10ng/ii 1) 15 iU T4-連接酶(350U/ ii 1) 1 ii 1 Buffer (10 X) 2 ii 1 無菌ddH20 1 ii 1 將上述樣品混勻后，于PCR(型號為PTC-100)儀上16。C連接2h，轉化至大腸桿菌DH5 a菌株，PCR檢測后，提取陽性菌液質粒，進行酶切驗證，將該質粒命名為'pSSR-COPY'。應用凍融法將其轉化至農桿菌EHA105菌株，挑取陽性克隆進行PCR檢測檢測，獲得陽性菌株。 4、農桿菌介導'pSSR-COPY'轉化煙草'K326' 接種含有質粒'pSSR-COPY'的農桿菌EHA105單菌落于40ml含Km 50mg L—1的YEB液體培養基中，28。C培養至0D600約0. 5，5000rpm離心10min，菌體用40ml MS液體培養基(不含激素，不調PH)重新懸浮；將煙草葉片剪成l-2cm2的葉塊，放入上述用無菌液體MS培養基稀釋過的農桿菌中，浸泡3min，其間不斷輕搖幾次；取出材料，放在無菌濾紙上吸去多余菌液，接種于共培養培養基(MS+BA 1. Omg L—丄+NAA 0. 2mg L-、 pH 5. 8)中，28t:共培養2-3d ;共培養結束后，將煙草葉片轉入篩選培養基(MS+BA 1. Omg L—^NAA0. 2mg L—'+hyg. 30mg L—、b 500mg L-、 pH 5. 8)中，直接置于25。C下光照培養，每天光照16小時，光強為40-50 ii mol *m—2 s—、經過20-30天培養，在葉片邊緣出現抗性芽，將抗性芽轉入新鮮的篩選培養基，待抗性芽長至3-5cm時，剪下，轉入生根培養基(1/2MS+IBA
0. 2mg L—丄+hyg. 30mg L—丄+cb 200mg L—、 pH5. 8) ， 15-20天即可生根，共獲得了 48棵潮霉
素抗性植株。 5、GUS染色檢測 從抗性植株和非轉基因對照的頂端幼葉上剪取l-2cm2的葉塊，放入裝有GUS染色液的離心管中，37t:培養箱中進行GUS組織染色，6-10h后取出葉片，用70X的乙醇脫色，結果表明，在48棵潮霉素抗性植株中，共有4棵煙草潮霉素抗性苗呈GUS組織染色陽性，分別命名為A、B、C、D。
6、拷貝數檢測 圖2為拷貝數檢測原理示意圖，本文中轉入到煙草基因組中的SSR片段比內源SSR片段短73bp，通過SSR片段兩側的引物PCR擴增后，轉基因陽性植株應該有兩條片段出現，內源SSR片段長度為168bp，外源SSR片段長度為95bp。因為本文中選擇的二倍體煙草品種'K326'的SSR位點是純和的，即該煙草染色體中有兩個相同的該SSR位點，在基因組中該位點是雙拷貝的，所以根據內外源片段PCR擴增產物的亮度對比，即可判斷與其一同轉入煙草基因組的外源目的基因MdCAXl的拷貝數。當'SSR-95'亮度低于'SSR-168'時，則表示所轉入的目的基因MdCAXl為單拷貝；當'SSR-95'亮度高于'SSR-168'時，則表示所轉入的目的基因MdCAXl為多單拷貝；當兩者亮度一致時，則表示所轉入的目的基因MdCAXl為雙拷貝。 采用常規CTAB法提取步驟5所述GUS染色陽性株系的DNA，將其稀釋至50-100ng/iiL，進行PCR擴增，引物與反應體系同步驟1，反應程序如下94 °C 5min ;25個循環94。C 30s，54。C 20s，72。C 15s ;72。C 5min ;10。C 20min。結果如圖3所示，株系A、 C、 D中'SSR-95'擴增片段亮度弱于內源SSR片段'SSR-168'，因此該3個株系中插入的目的基因MdCAXl為單拷貝；而株系B的'SSR-95'擴增片段亮度要遠遠高于內源SSR片段'SSR-168'，這說明基因組中整合了多個拷貝的目的基因MdCAXl。序列表〈110〉南京農業大學〈120〉 一種快速檢測轉基因煙草外源基因拷貝數的方法〈130〉說明書〈160>3〈170>PatentIn version 3. 1〈210>1〈211>20〈212>DNA〈213〉人工合成〈220〉〈221〉引物P-F左端〈222〉 (1) (20)〈223〉〈400>1
tcgggtcgtt acaactgatg20〈210>2〈211>20〈212>DNA〈213〉人工合成〈220〉〈221〉引物P-R右端〈222>(1).. (20)〈223〉〈400>2ccacgtcatt cggagttgtt 20〈210>3〈211>95〈212>DNA〈213〉人工合成〈220〉〈221>SSR-95〈222>(1). . (95)〈223〉〈400>3tcgggtcgtt acaactgatg gttgtcttgt ggtcagaaca ggtccccaac accacacactc朋朋3ccte gacate3C3a ctccg朋tg3 cgtgg
權利要求
快速檢測轉基因煙草外源基因拷貝數的方法，其具體步驟如下1)人工合成序列‘SSR-95’并加入HindIII、SphI酶切位點；2)將步驟1)所述序列‘SSR-95’插入到含有目的基因的植物雙元表達載體pCAMBIA-1301的相應酶切位點，轉化至大腸桿菌DH5α菌株，PCR檢測后，提取陽性菌液質粒，將其轉化至農桿菌EHA105菌株，PCR檢測后獲得陽性菌株；3)將步驟2)所述陽性農桿菌EHA105菌株采用葉盤法轉化至煙草‘K326’；4)將步驟3)所述煙草進行GUS染色，獲得GUS陽性株系；5)采用常規CTAB法提取步驟4)所述GUS陽性株系的DNA，將其稀釋至50-100ng/μl，用引物P-F5’-TCGGGTCGTTACAACTGATG-3’和P-R5’-CCACGTCATTCGGAGTTGTT-3’進行PCR擴增，經2％瓊脂糖凝膠電泳檢測，發現兩條條帶，其中一條為內源SSR片段‘SSR-168’，另一條為外源合成的短截片段‘SSR-95’；當‘SSR-95’亮度低于‘SSR-168’時，則表示與片段‘SSR-95’一同轉入煙草基因組的目的基因為單拷貝；當‘SSR-95’亮度高于‘SSR-168’時，則表示轉入的目的基因為多單拷貝；當兩者亮度一致時，則表示所轉入的目的基因為雙拷貝。
全文摘要
本發明涉及“一種快速檢測轉基因煙草外源基因拷貝數的方法”，屬于基因工程領域。人工合成一條95bp中間短截片段，克隆到含有目的基因的植物雙元表達載體pCAMBIA-1301，轉化至大腸桿菌DH5α菌株，再轉化至農桿菌EHA105菌株，PCR檢測后獲得陽性菌株再轉化至煙草‘K326’。將獲得的陽性植株，進行PCR擴增，根據擴增獲得的片段‘SSR-168’和‘SSR-95’電泳條帶的亮度比較就可以確定與片段‘SSR-95’一同轉入的外源基因的拷貝數。本發明只需采用一對SSR特異引物對轉基因植物進行PCR檢測，就可以快速檢測轉基因株系的拷貝數，簡單易行，尤其是對插入單拷貝和雙拷貝外源基因株系的檢測。
文檔編號C12N15/84GK101717825SQ20091023438
公開日2010年6月2日 申請日期2009年11月24日 優先權日2009年11月24日
發明者喬玉山, 徐長寶, 渠慎春, 王三紅, 章鎮, 蔡斌華, 許寬勇, 陶建敏, 高志紅 申請人:南京農業大學