專利名稱：一種基于微衛星指紋圖譜的湖羊和無角陶塞特羊鑒別方法
技術領域：
本發明構建了湖羊和無角陶塞特的微衛星指紋圖譜，屬于分子遺傳學領域，適用
于湖羊和無角陶塞特羊及其雜交后代的鑒定。
二背景技術：
湖羊原產我國太湖流域，素以波浪型羔皮和高繁殖力聞名于世，是我國重點保護 的綿羊品種資源。具有性成熟早、四季發情、多胎率高、肉質細嫩鮮美、耐濕熱、耐粗飼等優 良特性。近年來，由于羔皮市場疲軟，羊肉市場持續堅挺，純種湖羊飼養的經濟效益下降，加 之原產地太湖流域經濟發達，湖羊養殖比較效益較低，因此純種湖羊數量銳減。湖羊由于具 有高繁殖力的特性，主要作為雜交的母本利用，而無角陶賽特羊具有生長發育快、個體大、 胴體品質好和產肉性能高等特點，是常用的優良雜交父本之一。目前我國綿羊品種市場還 欠規范，用高代雜交羊以次充好，假冒偽劣的現象時有發生，由于高代雜交羊與純種羊僅根 據形態特征對其進行鑒定有一定困難，而生產性能的鑒定周期長、費用高，因此建立一種準 確、快速、客觀的鑒定方法對于肉羊產業具有重要意義，另外純種湖羊的鑒別對于湖羊的資 源保護也具有重要價值。 隨著分子生物學研究水平的快速發展，特別是微衛星分子標記技術的發展為該 問題的解決提供了技術基礎。微衛星(Microsatellite)又稱為簡單序列重復(Short Sequence R印eat， SSR)，以2_6bp的短核苷酸為基本單位，呈串聯重復狀廣布于生物體整 個基因組，平均每10kb就出現一個。因其在基因組中數量多、分布廣、多態性豐富、易于檢 測、呈共顯性遺傳進化、所受選擇壓力小等優點，已廣泛應用于人類親子鑒定、個體識別領 域。目前利用分子遺傳標記研究無角陶賽特羊、湖羊等親緣關系、遺傳多樣性、雜種優勢及 與生產性能關聯的報道較多，而利用分子標記對無角陶賽特羊和湖羊進行種質鑒定仍未見 報道。本發明建立純種湖羊和純種無角陶賽特微衛星指紋圖譜，并以此為基礎準確快速的 對其進行種質鑒定。
三、
發明內容
技術問題 本發明的目的是克服傳統的品種鑒定方法存在的準確性差、成本高以及時間長等 方面的缺陷，提供一種能快速、準確的鑒定純種湖羊、無角陶賽特及其雜交后代的DNA指紋
圖譜方法。 技術方案 —種基于微衛星指紋圖譜的湖羊和無角陶塞特羊鑒別方法，其特征在于采集代表
性樣本，篩選微衛星標記構建湖羊和無角陶賽特羊指紋圖譜，以此進行湖羊和無角陶塞特
羊及其雜交后代的鑒定。其步驟包括 (1)提取湖羊和無角陶賽特羊基因組DNA ; (2)采用微衛星引物，以湖羊和無角陶賽特羊基因組DNA為模板進行PCR擴增分
4析； (3)選擇有品種特征性的引物，即含有特異性條帶能區分湖羊和無角陶賽特羊的 引物，構建微衛星指紋圖譜； 所選擇的具有品種特征性的微衛星引物為 MCM147 上游引物序列TCCGATGTTAGATGACTTTTGTGC 下游引物序列AGCTGGTATCTGTGTCTGTCATCC 擴增湖羊和無角陶賽特羊的DNA，獲得192bp和208bp的湖羊特有片斷及221bp的
陶賽特羊特有片斷。
或BMS1248 上游引物序列GTAATGTAGCCTTTTGTGCCG
下游引物序列TCACCAACATGAGATAGTGTGC 擴增湖羊和無角陶賽特羊的DNA，獲得141bp的湖羊特有片斷和135bp的陶賽特羊
的特有片斷。
或RM128 上游引物序列GTGAGGAGGAGGGGCGAGGAG
下游引物序列AGGCCTGTGAGAAGATGGTGAG 擴增湖羊和無角陶賽特羊的DNA，獲得114bp、121bp、123bp的湖羊特有片斷和 153bp的陶賽特羊特有片斷。
或ILSTS58 上游引物序列GCCTTACTACCATTTCCAGC
下游引物序列CATCCTGACTTTGGCTGTGG 擴增湖羊和無角陶賽特羊的DNA，獲得127bp、129bp、148bp、196bp的湖羊特有片 斷和228bp的陶賽特羊的特有片斷。
或BMS744 上游引物序列CCGAGTGGAGTTCACACAAC
下游引物序列CATAGGGTCACAAAGAGCTGG 擴增湖羊和無角陶賽特羊的DNA，獲得142bp的湖羊特有片斷和152bp、159bp的陶
賽特羊特有片斷。
或BP28 上游引物序列AGGTGACAGGTGAGAGGGC
下游引物序列CCTCCACAACACCATCCTTC擴增湖羊和無角陶賽特羊的DNA，獲得214bp、226bp、229bp、231bp、233bp的湖羊 特有片斷和253bp、262bp、264bp的陶賽特羊特有片斷。
或ILSTS56 上游引物序列GCTACTGAGTGATGGTAGGG
下游引物序列AATATAGCCCTGGAGGATGG 擴增湖羊和無角陶賽特羊的DNA，獲得182bp、184bp的湖羊特有片斷和170bp的陶 賽特羊特有片斷。
或CHIRUC5 上游引物序列GCCTCAGGAAAGACAAAGTCAC 下游引物序列GCACCTCCACCCCTTCATA 擴增湖羊和無角陶賽特羊的DNA，獲得260bp、272bp、276bp、278bp、282bp、286bp
的湖羊特有片斷。
或BMS875 上游引物序列TCCAGCTTGAATCCCTTCC
下游引物序列AAGCAAAGGCTGGGAACAC 擴增湖羊和無角陶賽特羊的DNA，獲得111bp、117bp、122bp的湖羊的特有片斷。
或D216028 上游引物序列TGGATCTCTTTCTCCCCACTT
下游引物序列CAGCAGTGCCCACTTGTTCT 擴增湖羊和無角陶賽特羊的DNA，獲得214bp、216bp、229bp、236bp的湖羊特有片 斷。 有益效果本發明具有以下優點 (1)本發明創建了湖羊、無角陶塞特羊微衛星指紋圖譜，公開了用微衛星指紋分析 技術對綿羊種質鑒定的研究結果，建立的方法能從遺傳本質上對湖羊、無角陶塞特及其雜 交羊進行鑒定，比傳統的外形鑒定準確、可靠。 (2)采用本發明的方法對湖羊、無角陶塞特及其雜交羊進行真實檢測時，用目前廣 泛應用的快速、微量DNA提取法提取待測樣品DNA，進行微衛星檢測，幾小時內就能得到準 確的結果。 (3)由于本發明微衛星指紋圖譜以模式圖的形式表達，直觀、易懂，便于應用。
四
圖1根據微衛星分子標記方法所繪制的湖羊DNA指紋圖譜的模式圖。橫坐標為 所選擇的具有品種特征性的引物(1-10分別為MCM147、BMS1248、RM128、 ILSTS58、 BMS744、 BP28、 ILSTS56、 CHIRUC5、 BMS875和D216028， M為Marker pUC18/MspI)，縱坐標為分子量。
圖2根據微衛星分子標記方法所繪制的無角陶賽特羊DNA指紋圖譜的模式圖。橫 坐標為所選擇的具有品種特征性的引物(1-10分別為MCM147、 BMS1248、 RM128、 ILSTS58、 BMS744、 BP28、 ILSTS56、 CHIRUC5、 BMS875和D216028， M為Marker pUC18/MspI)，縱坐標為 分子量。
五具體實施方式
材料與方法
( — )樣本 采用2個綿羊品種共114份耳組織樣品。其中湖羊83只、陶塞特31只，均采自江 蘇省，其中湖羊采自蘇州市湖羊保種場和湖羊保護區。
(二)方法 (1)采用常規的酚-氯抽提法提取2個綿羊群體基因組DNA。
(2)選擇183對引物對2個綿羊群體的基因組DNA多態性進行初步分析。PCR反應 體系為20 ii L :10X緩沖液2 ii L，MgCl2 (25mmol/L) 1-1. 6 ii L，弓l物(10 ii mol/L)各0. 6 ii L， dNTPs (lOmmol/L) 0. 4 ii L， Taq酶(5U/ ii L) 0. 2 ii L，模板DNA 15_30ng，補充雙蒸水至20 ii L。 PCR擴增反應程序為94。C預變性5min，94。C變性30s， 52-66。C退火30s，72。C延伸30s，經 30個循環，于72t:延伸5min，4t:保存。擴增產物在12X非變性聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳 分離，銀染法顯色，顯色后用上海培清凝膠成像系統拍照，根據分子量標準PUC18 DNA/MspI Marker，采用該系統自帶的SensiAnsys凝膠圖像分析軟件計算微衛星等位基因的大小，獲 取群體基因型資料。
(三)結果與分析 分子標記篩選結果表明，有10對微衛星引物在湖羊和無角陶賽特2個品種間具 有特征性條帶。MCM147引物含有192bp、208bp湖羊特有片斷，221bp的陶賽特羊特有片 斷；BMS1248含有141bp的湖羊特有片斷，135bp的陶賽特羊的特有片斷；RM128含114bp、 121bp、123bp的湖羊特有片斷，153bp的陶賽特羊特有片斷；ILSTS58含127bp、129bp、 148bp、 196bp的湖羊特有片斷，228bp的陶賽特羊的特有片斷；BP28含214bp、 226bp、 229bp、 231bp、233bp的湖羊特有片斷，253bp、262bp、264bp的陶賽特羊特有片斷；ILSTS56含 182bp、184bp的湖羊特有片斷，170bp的陶賽特羊特有片斷；CHIRUC5含有260bp、272bp、 276bp、278bp、282bp、286bp的湖羊特有片斷；BMS875含有lllbp、 117bp、 122bp的湖羊的特 有片斷；D216028含214bp、216bp、229bp、236bp的湖羊特有片斷；BMS744含142bp的湖羊特 有片斷，152bp、159bp的陶賽特羊特有片斷。 將這10對引物以基因座位為橫坐標，分子量為縱坐標繪制DNA指紋圖譜(圖1、 2)。這一 DNA指紋圖譜中湖羊和陶賽特羊均有其特異的DNA指紋，可以把這兩個品種彼此 區分開，同時可以根據該圖譜判定是否為湖羊和陶賽特的雜交品種。通過指紋圖譜可以準 確快速的對湖羊和無角陶塞特羊及其雜交后代進行種質鑒定。序列表〈110〉江蘇省農業科學院〈120〉 一種基于微衛星指紋圖譜的湖羊和無角陶塞特羊鑒別方法〈130〉說明書〈140>00〈141>2009-11-16〈160>20〈170>PatentIn version 3.1〈210>1〈211>24〈212>DNA〈213〉人工〈220〉〈221〉引物MCM147上〈222〉 (1) . (24)〈223〉
7
〈400>1tccgatgtta gatgacttttgtgc〈210>2〈211>24〈212>DNA<213>人工〈220〉〈221〉引物MCM147下〈222〉 (1) . (24)〈223〉〈400>2agctggtatc tgtgtctgtcatcc〈210>3〈211>21〈212>DNA〈213〉人工〈220〉<221>引物BMS1248上〈222〉 (1) (21)〈223〉〈400>3gtaatgtagc cttttgtgccg〈210>4<211>22〈212>DNA〈213〉人工〈220〉 [o川]〈221〉引物BMS1248下 〈222>(1). . (22)<223>〈400>4tc3cc朋cat gagategtgtgc〈210>5〈211>21〈212>DNA<213>人工〈220〉〈221〉引物RM128上〈222〉 (1) . (21):0122] :0123] :0124]
〈223〉
〈400>5
gtg￡lgg￡lgg￡l ggggCg3gg3 g
:0125] <210〉6
:0126] 〈211〉22
:0127] 〈212〉DNA
:0128] 〈213〉人工
:0129] 〈220>
:0130] 〈221〉引物RM128下
:0131] 〈222〉 (1) (22)
:0132] 〈223〉
:0133] 〈400〉6
:0134] aggcctgtga gaagatggtg ag 22
:0135] 〈210>7
:0136] 〈211>20
:0137] 〈212〉DNA
:0138] 〈213〉人工
:0139] 〈220〉
:0140] 〈221〉引物ILSTS58上
:0141] 〈222>(1). (20)
:0142] 〈223〉
:0143] 〈400〉7
:0144] gccttactac catttccagc 20
:0145] 〈210〉8
:0146] <211〉20
:0147] 〈212>DNA
:0148] 〈213〉人工
:0149] 〈220〉
:0150] 〈221〉引物ILSTS58下
:0151] 〈222〉 (1). . (20)
:0152] 〈223〉
:0153] 〈400>8
:0154] catcctgact ttggctgtgg 20
:0155] 〈210〉9
:0156] 〈211〉20 〈212〉DNA 〈213〉人工 〈220〉 〈221〉引物BMS744上
9:0161]
:0162] :0163] :0164]
〈222〉 (1) (20)
〈223〉
〈400〉9
ccgagtggag ttcacacaac
:0165] 〈210〉10
:0166] 〈211>21
:0167] 〈212>DNA
:0168] 〈213〉人工
:0169] 〈220〉
:0170] 〈221〉引物BMS744下
:0171] 〈222〉 (1) (21)
:0172] 〈223〉
:0173] 〈400〉 10
:0174] catagggtca caaagagctg g 21
:0175] 〈210〉11
:0176] 〈211>19
:0177] 〈212〉DNA
:0178] 〈213〉人工
:0179] 〈220〉
:0180] 〈221〉引物BP28上
:0181] 〈222〉 (1) (19)
:0182] 〈223〉
:0183] 〈400〉 11
:0184] aggtgacagg tgagagggc 19
:0185] 〈210>12
:0186] 〈211〉20
:0187] 〈212〉DNA
:0188] 〈213〉人工
:0189] 〈220>
:0190] 〈221〉引物BP28下
:0191] 〈222〉 (1) (20) 〈223〉 <400〉12 cctccacaac accatccttc 20 〈210>13 〈211〉20 〈212〉DNA <213>人工 〈220〉
〈222〉 (1) . (20)〈223〉〈400>13gctactgagt g3tggteggg〈210〉14〈211>20〈212>DNA〈213〉人工<220>〈221〉引物ILSTS56下〈222〉 (1) . (20)〈223〉〈400>14aatatagccc tggaggatgg〈210>15〈211〉22〈212>DNA〈213>人工<220><221>引物CHIRUC5上〈222〉 (1) (22)〈223〉〈400>15gcctcaggaa 3gac3朋gtc〈210>16〈211>19〈212>DNA〈213〉人工〈220>〈221〉引物CHIRUC5下<222>(1).. (19)〈223〉〈400>16gcacctccac cccttcata〈210>17〈211>19〈212>DNA〈213〉人工
i兌明 書 8/9頁
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19
〈220〉〈221〉引物BMS875上〈222〉 (1) . (19)〈223〉〈400>17tccagcttga atcccttcc〈210>18〈211>19〈212>DNA〈213〉人工〈220〉〈221>引物BMS875下<222>(1). . (19)<223>〈400>1833gC333ggC tggg朋C3C〈210>19〈211>21〈212>DNA〈213〉人工<220>〈221〉引物D216028上〈222〉 (1) . (21)〈223〉〈400>19tggatctctt tctccccact t〈210>20<211>20〈212〉DNA〈213〉人工〈220〉〈221〉引物D216028下〈222>(1).. (20)〈223〉〈400>20cagcagtgcc cacttgttct
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權利要求
一種基于微衛星指紋圖譜的湖羊和無角陶塞特羊鑒別方法，其步驟包括1)提取湖羊和無角陶賽特羊基因組DNA；2)采用微衛星引物，以湖羊和無角陶賽特羊基因組DNA為模板進行PCR擴增分析；3)獲得區分湖羊和無角陶賽特羊的特異性條帶，從而區分湖羊和無角陶賽特羊。
2. 按權利要求l所述的鑒別方法，其特征是， 用引物MCM147上游引物序列TCCGATGTTAGATGACTTTTGTGC 下游引物序列AGCTGGTATCTGTGTCTGTCATCC擴增湖羊和無角陶賽特羊的DNA，獲得192bp和208bp的湖羊特有片斷及221bp的陶賽 特羊特有片斷；或者用引物BMS1248上游引物序列GTAATGTAGCCTTTTGTGCCG下游引物序列TCACCAACATGAGATAGTGTGC擴增湖羊和無角陶賽特羊的DNA，獲得141bp的湖羊特有片斷和135bp的陶賽特羊的特 有片斷；或者用引物RM128上游引物序列GTGAGGAGGAGGGGCGAGGAG 下游引物序列AGGCCTGTGAGAAGATGGTGAG擴增湖羊和無角陶賽特羊的DNA，獲得114bp、121bp、123bp的湖羊特有片斷和153bp的 陶賽特羊特有片斷；或者用引物ILSTS58上游引物序列GCCTTACTACCATTTCCAGC下游引物序列CATCCTGACTTTGGCTGTGG擴增湖羊和無角陶賽特羊的DNA，獲得127bp、129bp、148bp、196bp的湖羊特有片斷和 228bp的陶賽特羊的特有片斷； 或者用引物BMS744上游引物序列CCGAGTGGAGTTCACACAAC 下游引物序列CATAGGGTCACAAAGAGCTGG擴增湖羊和無角陶賽特羊的DNA，獲得142bp的湖羊特有片斷和152bp、159bp的陶賽特羊特有片斷；或者用引物BP28上游引物序列AGGTGACAGGTGAGAGGGC 下游引物序列CCTCCACAACACCATCCTTC擴增湖羊和無角陶賽特羊的DNA，獲得214bp、226bp、229bp、231bp、233bp的湖羊特有 片斷和253bp、262bp、264bp的陶賽特羊特有片斷； 或者用引物ILSTS56 上游引物序列GCTACTGAGTGATGGTAGGG 下游引物序列AATATAGCCCTGGAGGATGG擴增湖羊和無角陶賽特羊的DNA，獲得182bp、184bp的湖羊特有片斷和170bp的陶賽特羊特有片斷；或者用引物CHIRUC5上游引物序列GCCTCAGGAAAGACAAAGTCAC 下游引物序列GCACCTCCACCCCTTCATA擴增湖羊和無角陶賽特羊的DNA，獲得260bp、272bp、276bp、278bp、282bp、286bp的湖 羊特有片斷；或者用引物BMS875上游引物序列TCCAGCTTGAATCCCTTCC下游引物序列AAGCAAAGGCTGGGAACAC擴增湖羊和無角陶賽特羊的DNA，獲得111bp、117bp、122bp的湖羊的特有片斷；或者用引物D216028上游引物序列TGGATCTCTTTCTCCCCACTT下游引物序列CAGCAGTGCCCACTTGTTCT擴增湖羊和無角陶賽特羊的DNA，獲得214bp、216bp、229bp、236bp的湖羊特有片斷。
全文摘要
本發明公布了湖羊和無角陶賽特羊的微衛星指紋圖譜，屬于分子生物學領域。其建立方法包括以下步驟(1)湖羊和無角陶賽特羊DNA的提取；(2)微衛星引物的篩選和擴增；(3)選擇有品種特征性的引物構建指紋圖譜。該DNA指紋圖譜中湖羊和無角陶賽特都有特異的DNA指紋，因此可以將湖羊和無角陶賽特羊及其雜交品種分開。本發明DNA指紋圖譜以圖的形式表現，直觀、易懂。本發明能從遺傳本質上對湖羊和無角陶賽特及其雜交品種進行種質鑒定，因此準確、可靠，檢測迅速。
文檔編號C12Q1/68GK101705297SQ20091023427
公開日2010年5月12日 申請日期2009年11月18日 優先權日2009年11月18日
發明者豐秀靜, 劉鐵錚, 孟春花, 曹少先, 曾檢華 申請人:江蘇省農業科學院