專利名稱：：一種生物脫氮劑及其應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及微生物領域，具體涉及一種具有脫氮生物學活性的細菌、培養該細菌的方法，以該菌為主要組成成分的生物脫氮劑的制備，及其在降解水體氮素中的應用。
背景技術：
：氮素循環是自然界中最為重要的生態系統物質循環的組成之一。然而，氮肥的使用及高密度水產養殖的發展，在帶來巨大經濟效益的同時也造成了嚴重的環境問題。在水產養殖中，因氮磷元素含量過高而造成的富營養化情況頻繁出現，除使水質惡化及破壞其中的生物平衡外，其中的氨氮和亞硝態氮對養殖動物具有較強毒性，特別是亞硝態氮在養殖條件下轉化速率低，使得高密度養殖的水體中亞硝酸鹽積累極為突出，尤其是大雨過后，亞硝酸鹽含量極其容易嚴重超標，由其造成的水產養殖動物病害甚至死亡現象已多見報道[NiJY，GuB，ShaoCS.AcaseofdetoxicationofnitritepoisoningLitopenaeusvannamei.ScientiFishFarming,2004，4:49.XuPF，ZengXK.AalysisofnitriteharmforfarmingLitopenaeusvannameiinfreshwaterandco皿termeasure.FisheryModernization,2006，2:38-39.]。如在對蟲下養殖中，亞硝酸鹽含量超過0.lppm達到O.3ppm以上時，很容易造成對蝦中毒，且不易搶救。傳統上采用活性污泥直接投入，后又采用固定化光合細菌來進行脫氮處理。人們曾利用硝化菌群除氮，但是硝化作用的終產物是硝酸鹽，會破壞生物圈氮素的平衡且該產物能誘發人類的高鐵血紅蛋白癥。由于在魚蝦養殖過程中必須充氧來保證水中的溶解氧量，那么厭氧反硝化細菌的脫氮作用也不能得到充分發揮。因此，人們將注意力轉移到好氧反硝化細菌，因為其可以在有氧條件下進行反硝化將硝酸鹽和亞硝酸鹽轉化成氣態氮，且可將氨在好氧條件下直接轉化成氣態產物。與傳統的生物脫氮工藝相比，好氧反硝化細菌的出現可以使生物脫氮在同一反應器中完成，實現真正意義上的同步硝化反硝化。目前，關于利用好氧反硝化細菌實現的生物脫氣已經有成功應用的矛艮道。Gupta等[GuptaAB，GuptaSK.SimultaneousCarbonandNitrogenRemovalinaMixedCultureAerobicRBCBiofilm[J].WatRes，1999，33(2):555-561.]用含有Thiosphaerapantotropha(現更名為Paracoccusdenitrificans)的生物轉盤處理不同濃度的生活污水；Kshirsagar等[KshirsagarM，GuptaAB，GuptaSK.AerobicDenitrificationStudiesonActivatedSludgeMixedwithThiosphaerapantotropha[J]EnvironTechnol，1994，16(1):35-43.]利用兩個操作條件完全相同的氧化溝來處理模擬肥料工業廢水，其中一氧化溝內投加有Paracoccusdenitrificans，另一沒有投加的氧化溝為對照系統；Pai等[PaiSL，ChongNM，ChenCH.PotentialApplicationsofAerobicDenitrifyingBacteriaasBioagentsinWastewaterTreatment[J].BioresourceTechnology,1999，68(2):179—185.]也曾將好氧反硝化細菌T6和硝化污泥投加到同一好氧反應器中。利用好氧反硝化細菌發展好氧脫氮技術具有以下幾個優點[HuangHK，TsengSK.NitratereductionbyCitrobacterdiversusunderaerobicenvironment[J].ApplMicrobiolBiotechnol，2001，55:90-94.]:第一、使石肖化-反硝化反應在同一個反應器中進行，可以大大減少占地面積和建設資金；第二、使用好氧反硝化細菌可以減少處理過程中加入調節系統pH的化學物質，降低成本；第三、在處理過程中好氧反硝化細菌更容易控制。好氧反硝化細菌脫氮技術的關鍵在于，在一定的條件下(如溫度，pH，C/N比)，該反硝化細菌本身具有高效的硝態、亞硝態氮的脫除能力，同時具有較好的外界環境耐受性，如對鹽度，重金屬離子的耐受性等。因此，篩選同時具有這兩方面能力的好氧反硝化細菌對于這項技術的應用具有很重要的意義。目前已報道的好氧反硝化細菌大多存在硝態、亞硝態氮的脫除能力不強，缺乏對高濃度的硝酸鹽、亞硝酸鹽的耐受性，處理時間過長，效率不高等問題。王弘宇等[王弘宇，馬放，蘇俊峰，等.2007.不同碳源和碳氮比對一株好氧反硝化細菌脫氮性能的影響[J].環境科學學報，27(6):968-972]報道了一株好氧反硝化細菌能在8-10h，將初始濃度150mg/L的硝酸鹽降解90%以上。可見，對初始硝酸鹽、亞硝酸鹽的耐受性也是限制其應用的重要因素之一。"硝化-反硝化"脫氮工藝的過程為，有機氮一NH4+-N—N02—-N—N03—_N—N02—_N—氮氣逸出，在此過程中，N03—-N的生成不僅延長了反應歷程，且造成了能量和外加碳源的浪費，因此現在更多的采取"亞硝化_反硝化"脫氮工藝。這就要求菌群能快速利用N02—-N，使反應快速進行，從而提高該脫氮工藝的效率。
發明內容本發明的一個目的是提供一種新的具有脫氮生物學活性的細菌，該細菌具有脫除水體氮素的能力。本發明的另一個目的是提供一種組合培養條件，使該細菌能體現更強的氮素脫除能力。本發明的再一個目的是提供了一種發酵罐培養條件，使該細菌能實現大規模高密度的培養。本發明的再一個目的是提供一種生物脫氮劑的劑型組成方式，使其在處理水體氮素污染時更具實用性和可操作性。本發明的再一個目的是提供本發明的細菌在水體生物脫氮中的應用。單獨使用該生物脫氮劑即可有效脫除水體中的氮素。本發明公開了一株具有脫氮生物活性的細菌，該細菌具有較高的反硝化活性和單株硝態氮/亞硝態氮脫除能力。這類菌株是好氧反硝化細菌，在生物脫氮中能有效地將N03—-N或N02—-N直接轉化成菌體的自身組成物質，也能將N03—-N或N02—_N通過反硝化作用轉化為各種氮元素的氣體方式如NO、N20和N2氣體逸出。更具體地，這類細菌是假單胞菌屬的一類細菌。本發明的公開的細菌命名為假單胞菌DN-2，Pseudomonassp.DN-2，保藏號為CGMCCNo.2917，保藏時間2009年2月23日，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。本發明以泥塘和植被較豐富的土壤4份(南京市紫金山一處植被下土壤；南京市紫金山一處泥塘內淤泥；中國藥科大學校園花壇內土壤；南京市玄武湖湖邊淤泥)為供試土樣，經富集培養，分離純化、活性檢驗，獲得了大量的具有反硝化活性的菌株，初步確認它們具有硝態氮/亞硝態氮脫除能力。這些菌株分屬于假單胞菌屬、芽孢桿菌屬等。具體地，從土壤中篩選到的這十株不同種屬的細菌，這9株細菌都具有相似生物學功能，其較高的反硝化活性和單株硝態氮/亞硝態氮脫除能力通過富集培養和分離篩選得到了集中表現，但9株菌在形態學上有差異。各株細菌在分離培養及上的形態特征見表1。表1菌株DN-1至DN-9的菌落菌體形態及其來源<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>注來源1為南京市紫金山一處植被下土壤；2為南京市紫金山一處泥塘內淤泥；3為中國藥科大學校園花壇內土壤；4南京市玄武湖湖邊淤泥。+表示有動力；-表示無動力發明人從9株細菌對其亞硝態氮脫除能力進行反復檢測比較，結果發現分離自南京市紫金山一處植被下土壤的編號DN-2的細菌表現出較高的反硝化活性和單株硝態氮/亞硝態氮脫除能力，經鑒定屬于假單胞菌屬，Pseudomcmassp.DN-2。該菌株(以下簡稱假單胞菌DN-2)具有以下特征1.菌落形態特征在反硝化培養基的瓊脂平板上，恒溫3(TC好氧培養3天后形成不規則多邊形樣菌落，呈淡黃色，表面褶皺，質地干硬，不易挑起，基質未見明顯的可溶性色素產生。2.菌體形態特征桿狀，菌體大小約0.30.5X1.52.0um，革蘭氏陰性，無內生孢子。3.主要生理生化試驗見表2:最適培養溫度為30°C，pH8.5，好氧。表2DN-2菌株的生理生化特性<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>注+表示陽性反應或能利用；-表示陰性反應或不能利用。4.系統進化分析對假單胞菌DN-2的16SrDNA基因進行擴增并進行測序，所測序列用BLAST軟件與GenBank數據庫進行相似性分析，并與相似序列在ClustalX(l.8)軟件中進行多重序列比對分析，最后用MEGA(3.1)軟件中Neighbor-Joining法構建系統進化樹。5.脫氮活性分別以0.616g/LNaN03或0.5g/LNaN02為唯一氮源時，或以兩者各半的濃度為混合氮源，以5.Og/L乙酸鈉為碳源，培養12h左右，硝態氮和亞硝態氮的脫除率均可達到100%;分別以5.Og/L可溶性淀粉、葡萄糖、甘露醇為碳源時，在培養24h時，硝態氮或亞硝態氮的脫除率可達到100%。當NaN02濃度達到4g/L時，能在54h內徹底還原；當濃度達到5g/L時，仍能緩慢降解。參照伯杰氏細菌鑒定手冊第九版的分類鑒定，該菌株屬于假單胞菌屬，對其16SrRNA進行系統進化分析，用CLUSTAL_1.8和Mega軟件構建進化樹，發現其與假單胞菌屬中的產堿假單胞菌(Pseudomonasalcaligenes)禾P門多薩假單胞菌(Pseudomonasmendocina)的親緣關系最近。假單胞菌DN-2，已于2009年2月27日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號為CGMCCNo.2917。本發明從土壤中分離得到的假單胞菌DN-2，在含硝酸鹽/亞硝酸鹽的水體中，不僅能將硝酸鹽/亞硝態氮快速的轉化為菌體自身的組成物質，并且具有較高的反硝化活性。這種作用發生的環境是在好氧條件之下，并且在較高的C/N摩爾比條件下，生物學活性更強。本發明的假單胞菌DN-2可以用以下方法培養在下列條件下培養溫度2040°C;溶氧搖瓶轉速60180rpm;pH5.010.0;碳源選自乙酸鈉、葡萄糖、甘露醇、麥芽糖、蔗糖或可溶性淀粉；C/N摩爾比為120;初始NaN02濃度0.55.Og/L。。優選的培養條件是溫度2535°C;溶氧搖瓶轉速90150rpm;pH7.010.0;碳源選自乙酸鈉、葡萄糖、甘露醇或可溶性淀粉；C/N摩爾比為1220;初始NaN02濃度0.54.Og/L。更優選的培養條件是溫度3(TC;溶氧搖瓶轉速120rpm;pH8.5;C/N摩爾比為12;碳源為乙酸鈉；初始NaN02濃度2.Og/L。—種大規模高密度培養本發明假單胞菌DN-2的方法，包括在2040°C，攪拌轉速80120r/min，通氣量0.040.06vvm，接菌量36%，初始pH8.5的條件下發酵罐培養細菌。最佳的方法組合包括在3(TC、攪拌轉速100r/min、通氣量0.05vvm、接菌量5X，初始pH8.5的條件下發酵罐培養。—種對水體進行生物脫氮的方法，包括將本發明的假單胞菌DN-2培養后，懸浮于脫脂牛奶并凍干，將凍干粉直接投入水體，菌體的投入量為1.0100cfu/m3。較優地，對本發明假單胞菌DN-2進行大規模高密度培養后，通過12，OOOg，4t:離心15min收獲菌體，重懸于530%的脫脂牛奶，凍干處理。菌體凍干粉(1.0X107CfU/g)直接投入淡水養殖水體，使其終濃度為2.050cfu/m3。最佳的方法組合包括將單胞菌DN-2進行大規模高密度培養后，通過12，000g，4t:離心15min收獲菌體，重懸于15%的脫脂牛奶，凍干處理。菌體凍干粉(1.0X107cfU/g)直接投入淡水養殖水體，使其終濃度為3cfu/m3。本發明的假單胞菌DN-2是既具有較高的反硝化活性又具有單株硝態氮/亞硝態氮脫除能力的細菌。在常規的生長條件下就可表現出反硝化活性，并在單獨存在時體現硝態氮/亞硝態氮脫除能力。在合適的pH值、溫度、唯一碳源、C/N比，等組合培養條件下，假單胞菌DN-2能體現更強的反硝化活性和硝態氮/亞硝態氮脫除能力。本發明從土壤中分離篩選的假單胞菌DN-2可在含有較高濃度的硝酸鹽/亞硝酸鹽水體中生長繁殖，通過細菌體內的生物反應過程，能快速地將一部分硝態氮/亞硝態氮轉化成菌體自身物質，另一部分轉化為N2排出，使得水體中的殘余硝態氮/亞硝態氮維持在較低的水平，經假單胞菌DN-2生物處理的養殖水體可達到對淡水魚蝦類相對安全的水平。本發明提供了從土壤中分離篩選的假單胞菌DN-2在水體生物脫氮的應用。在本發明的具體實施例中，假單胞菌DN-2，CGMCCNo.2917應用于水體中氮素污染物的脫除。本發明的假單胞菌DN-2是一株好氧異養微生物，它能對富營養化水體，特別是含硝態氮/亞硝酸鹽的水體進行氮素無害化生物處理，經假單胞菌DN-2生物處理的淡水養殖水體達到對淡水魚蝦類相對安全的水平。假單胞菌DN-2的水體無害化處理是在有氧條件下進行的，不需要特殊的設備和額外的處理條件，硝態氮/亞硝態氮被大量轉化為菌體自身的組成物質以及對環境無害的氮氣，細菌可以作為魚類的食物從而循環進入食物鏈，從7而在實現環境保護的同時，真正做到了能源和物質的無害、合理再循環。在本發明中反硝化是指微生物將N03—依次還原為N02—，N20、NO和N2的過程。附圖1假單胞菌DN-2的形態圖A菌體透射電鏡照片(20000X);B菌體顯微照片(1000X);C平皿菌落圖附圖2假單胞菌DN-2的16SrDNA系統進化樹附圖3菌株生長曲線與NaN02/NaN03還原曲線附圖4菌株對NaN02和NaN03同時存在下的還原曲線附圖5初始pH對菌株亞硝酸鹽還原活性的影響附圖6初始NaN02濃度對菌株亞硝酸鹽還原活性的影響附圖7發酵過程中NaN02濃度和pH變化附圖8發酵過程中菌濃度和P02變化附圖9NaCl對菌株亞硝酸鹽還原活性的影響附圖10蛋白胨對菌株亞硝酸鹽還原活性的影響附圖11金屬離子Co27Cu2+對菌株亞硝酸鹽/硝酸鹽還原活性的影響具體實施例方式實施例1培養基和試劑的配制1.1反硝化細菌富集培養基4.0gNaN02，5.OgNaAc，O.03gMgS047H20，0.01gMnS044H20，0.75gK2HP04，0.25gNaH2P04，1，000mldH20，用H3P04調節pH至8.0，0.7kg/cm2高壓蒸汽滅菌20min。1.2反硝化細菌分離培養基2.0gNaN02，5.OgNaAc，0.03gMgS047H20，0.OlgMnS04*4H20，0.75gK2HP04，0.25gNaH2P04，1，000mldH20，1.5%瓊脂粉，用H3P04調節pH8.0，0.7kg/cm2高壓蒸汽滅菌20min。1.3格利斯試劑溶液I:稱取磺胺酸0.5g溶于150ml醋酸溶液(30%)，保存于棕色瓶；溶液II:稱取a-萘胺0.5g加入50ml蒸餾水中，煮沸后，緩緩加入150ml醋酸溶液(30%)中，保存于棕色瓶。N02—能與格利斯試劑反應生成紫紅色化合物，此反應不受N03—-N的干擾。取供試液50iU滴于白瓷板上，滴加格利斯試劑I50ia，混勻，靜置10min，滴加2X醋酸溶液及格利斯試劑II各50ii1，觀察顯色反應，顯紫紅色表示供試液中含有N02—，當CN。2—>1.Omg/L時顯棕紅色并生成沉淀。以此法作N(V定性測定。1.4反硝化培養基NaN020.5g/L(或NaN030.616g/L)，CH3COONa5.Og/L，MgS040.03g/L，MnS040.01g/L，FeS040.01g/L，K2HP040.75g/L，NaH2P040.25g/L，瓊脂15g/L，pH8.0，121。C滅菌20min。1.5萘乙二胺法N02-N測定用顯色劑稱取20.0g4-氨基苯磺酰胺，1.00gN_(1_萘基)-乙二胺二鹽酸鹽溶于250mlH20及50ml磷酸，以ddH20定容至500ml，貯存于棕色瓶，25"穩定一個月。1.6二苯胺試劑稱取0.5g二苯胺溶于100ml濃硫酸中，倒入20ml蒸餾水中，避光保存。取培養液50iU滴于白瓷板上，另滴加二苯胺試劑和濃硫酸各50iU，若變藍色，則說明有硝酸鹽生成。實施例2分離鑒定具有反硝化活性的異養細菌菌株2.1土壤來源南京市紫金山一處植被下土壤；南京市紫金山一處魚塘內淤泥；中國藥科大學校園花壇內土壤；南京市玄武湖湖邊淤泥。2.2富集培養分別稱取10g放入250ml三角瓶，分別加入反硝化細菌富集培養基100ml，于28°C、120r/min培養，培養2d后每12h，分別用格利斯法和二苯胺法檢測培養液中N02—和N03—濃度。選擇冊2—濃度顯著降低而未產生N(V的培養液(即與格利斯試劑反應后紅色變淺，而與二苯胺試劑反應未產生藍色，排除異養硝化細菌)，棄去液體，保留底泥，加入新鮮培養基繼續培養，富集目的細菌。所有顏色反應均作不接菌的空白培養基對照。2.3分離篩選土樣富集培養6天后將富集培養液分別涂布于分離用瓊脂平板，28t:靜置培養23d至菌落生成，選取菌落生長數量在30100之間的平板，分別挑取各單菌落于含NaN02500mg/L的液體富集培養基中培養，并檢測N02—濃度降低情況和有無N03—生成(即與格利斯試劑反應后紅色變淺，而與二苯胺試劑反應未產生藍色，排除異養硝化細菌)。選擇作用強的菌株培養液，吸取O.5ml移入新鮮富集培養液中培養。重復以上操作數次，直至獲得目的菌株。所有顏色反應均作不接菌的空白培養基對照。根據各菌株的形態及其培養特征，判斷DN-1在固體培養基表面的菌落有滑動現象，細胞聚集成團，可能包埋在粘液層中，但未見孢子囊及囊柄，可能屬于粘細菌目下產孢粘細菌科的某個屬。DN-2菌體為短桿狀，革蘭氏陰性，由亞硝酸鹽獲得能量，在平板上生成的菌落無滑動現象，判斷為反硝化細菌。DN-3.......DN-9各菌株細胞非絲狀，具有鞭毛，革蘭氏陰性，為非彎曲桿菌，其中DN-3為芽孢桿菌。2.4活性菌株的生理學鑒定參照伯杰氏細菌鑒定手冊第九版。細菌特征見表3。表3菌株DN-1至DN-9的生理生化特征菌株編號試驗名稱___DN-1DN-2DN-3DN-4DN-5DN-6DN-7DN-8DN-9過氧化氫酶++++++十++石蕊牛奶-+----+--硫化氫產生+—++++++脲酶-++--—-—-葡萄糖發酵-++++-—-—乳糖發酵-—-----——麥芽糖發酵-+++---—蔗糖發酵-+---—---硝酸鹽還原++--+++-+甲基紅---+十-+++V-P-—---+--+吲哚試驗—-—-—---—枸癥酸鹽利用+++++++++明膠液化_+--■___根據以上試驗結果判斷DN-2可能屬于假單胞菌屬，DN-3從屬于芽孢桿菌科、梭菌屬，生有鞭毛，脲酶試驗陽性，在肉湯培養基中生成硫化氫，無牛奶凝固現象，可能為類腐敗梭菌或破傷風梭菌。DN-4DN-9各菌株全部為兼性厭氧細菌，接觸酶陽性，在肉湯培養基中生成硫化氫，無牛奶凝固現象，糖發酵試驗和MVIC試驗結果不完全一致，其中DN-4、DN-5、DN-7、DN-8可能屬于腸桿菌科埃希氏菌族檸檬酸菌屬或沙門氏菌屬；DN_6、DN_9可能屬于腸桿菌科克氏桿菌族或變形桿菌族。實施例3假單胞菌DN-2的鑒定1.菌體形態特征(見附圖1-A/B):菌體為桿狀，菌體大小約0.30.5X1.52.0m，革蘭氏染色陰性，無芽孢，能運動。2.菌落形態特征(見附圖1-C):在反硝化培養基的瓊脂平板上，恒溫3(TC好氧培養3天后形成不規則多變性樣菌落，呈淡黃色，表面褶皺，質地干硬，不易挑起，基質未見明顯的可溶性色素產生。3.主要生理生化特性見表4，對照菌株為假單胞菌的模式菌株銅綠假單胞菌(PseudomonasaeruginosaATCC27853)，以及產減假單胞菌(PseudomonasalcaligenesATCC14909)和門多薩假單胞菌(PseudomonasmendocinaATCC25411)。表4DN-2與假單胞菌屬內相關菌株生理生化特性的比較菌株生理生化特性DN-2(ATCC27853)(ATCCU909)(ATCC25411)鞭毛ND111熒光色素—+—一非熒光色素綠膿菌素—+—綠針菌素————橘黃色盼嗪色素———+水解明膠+++—淀粉———積累PHB一一—一反硝化++—+生K:4'C——-一41°C++++精氨酸雙水解酶++++脂酶(吐溫80)++++氧化酶++++甲基紅試驗一一—VP試驗—一——觸酶++++n引哚試驗H2S產生利用葡萄糖米概+:陽性;-:陰性;ND:未檢測；PHB:聚P_羥基丁酸酯4.系統進化分析對假單胞菌DN-2的16SrDNA基因進行擴增并進行測序，所測序列用BLAST軟件與GenBank數據庫進行相似性分析，并與相似序列在ClustalX(l.8)軟件中進行多重序列比對分析，最后用MEGA(3.1)軟件中Neighbor-Joining法構建系統進化樹(見附圖2)。從進化樹中可見，DN-2屬于假單胞菌屬，并與該屬中的產堿假單胞菌(Pseudomonasalcaligenes)禾口門多薩假單胞菌(Pseudomonasmendocina)構成一個分支。5.脫氮活性以0.5g/LNaN02為唯一氮源時，以5.0g/L乙酸鈉為碳源，培養12h左右，亞硝態氮的脫除率可達到100%;以0.616g/LNaN03為唯一氮源時，以5.0g/L乙酸鈉為碳源，培養20h左右，硝態氮的脫出率可達到100X(見附圖3);培養分別以5.0g/L可溶性淀粉、葡萄糖、甘露醇為碳源時，在培養24h后，亞硝態氮的脫除率可達到100%。參照伯杰氏細菌鑒定手冊第九版的分類鑒定，結合菌株的生理生化反應和系統進化分析，菌株DN-2屬于假單胞菌屬，并與產堿假單胞菌(Pseudomonasalcaligenes)和門11多薩假單胞菌(Pseudomonasmendocina)的進化距離最近，但菌株DN-2的淀粉水解及菌落形態等特征又與斯氏假單胞菌(Pseudomonasstutzeri)—致，區別于以上同分支的兩株菌。故假單胞菌DN-2可能是假單胞菌屬中的新種或新的亞種，暫時將其命名為假單胞菌DN-2。假單胞菌DN-2已于2009年2月27日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號為CGMCCNo.2917。假單胞菌DN-2菌株的培養特征和個體形態特征見圖1中的A、B和C。實施例4假單胞菌DN-2的培養和硝態氮/亞硝態氮還原活性4.1好氧反硝化細菌為異養菌，須添加有機碳源才能正常生長和進行反硝化作用。在反硝化培養基中，分別以5.Og/L①乙酸鈉、②葡萄糖、③甘露醇、④麥芽糖、⑤蔗糖和⑥可溶性淀粉為唯一碳源，O.5g/LNaN02為唯一氮源時，30°C，120rpm搖床培養12h后，萘乙二胺法定量測定殘余N02—-N的濃度，考查其對還原活性的影響(見表5)。表5不同碳源培養時的N02—-N還原率(12h)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>4.2從反硝化瓊脂斜面上接兩環菌苔裝入有100ml反硝化培養基的250ml錐形瓶中，在2830°C，120130rpm搖床培養12h。按5%接種量接種，將5ml種子培養液轉移至裝有100ml反硝化培養基的250ml錐形瓶中。培養溫度分別為20、25、30、35、40°C;溶氧，即搖床轉速分別為60、90、120、150、180rpm;培養基初始pH分別為6、7、7.5、8、8.5、9、10;通過改變乙酸鈉濃度來改變C/N(摩爾比)分別為1、4、8、12、16、20;初始NaN02濃度分別為0.5、l、2、3、4、5g/L(以乙酸鈉為唯一碳源，同時保持C/N為12)。設不接種對照組，每組實驗均為三個重復。對于不同初始pH組和不同初始NaN02濃度組均每2h取樣，其余均12h后取樣，12，000g離心lmin，萘乙二胺法定量測定殘余N02—_N的濃度，并計算N02—_N的還原率。結果見表5.1，表5.2，附圖5，表5.3，附圖6。表5.1不同溫度培養時的N02—-N還原率(12h)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>還原率為被脫除的亞硝酸鹽的濃度與初始培養基中亞硝酸鹽的濃度的比值。表5.2不同轉速培養時的N02—-N還原率(12h)轉速(rpm)6090120150180還原率(％)61.894.610098.557.0表5.3不同C/N培養時的N02—-N還原率(12h)C/N148121620還原率(％)4.628.464.2100100100好氧反硝化細菌為異養菌，須添加有機碳源才能正常生長和進行反硝化作用。實驗表明，菌株以乙酸鈉為碳源時，培養12h后N(V-N全部被還原，即最適碳源為乙酸鈉，而培養溫度、初始pH等因素都對菌體脫除亞硝態氮的作用有很大的影響。培養溫度為3(TC時，菌株生長和進行反硝化作用的各類酶活性較高，且菌株適宜在偏堿性的條件下生長和進行反硝化作用。C/N不低于12時，培養12h后N(V-N全部被還原，菌體生長和反硝化作用不再受碳源限制。這與目前研究所表明的過剩的C源基質有利于高活性的好氧反硝化相一致。此外，菌株在初始NaN02濃度不高于4g/L時，對還原活性影響不大，初始NaN02濃度高于5g/L時，會抑制菌株的生長而影響其還原活性。初始NaN02濃度為2g/L時，N02—-N平均還原速率最高，可達20.3mgL-1h—、假單胞菌DN-2菌株達到最佳的生長狀態和最高亞硝態氮還原速率的條件為溫度30°C，初始pH8.5，以乙酸鈉為唯一碳源，并維持C/N比(mol/mo1)為12，初始NaN02濃度2.Og/L;溶氧搖瓶轉速120rpm條件下培養細菌。由于初始NaN02濃度2.Og/L時所需的時間為20h，而初始NaN02濃度0.5g/L時則只需10h左右，且已經能完全滿足菌體的生長，因此后續實驗中初始NaN02濃度定為0.5g/L。以0.5g/L初始NaN02的培養條件下，假單胞菌DN-2菌株約在24h時達到生長穩定期，濕重約合25g/L(見附圖3)。同樣的，以0.616g/LNaN03為唯一氮源，溫度3(TC，初始pH8.5，以乙酸鈉為唯一碳源，并維持C/N比(mol/mo1)為12，溶氧搖瓶轉速120rpm條件下培養該細菌時，在約20個小時時脫氮率達到100%(見附圖3)。當分別以0.25g/L和0.308g/L(換算后，亞硝態氮和硝態氮各3.6mM)的NaN02、NaN03作為混合氮源時，假單胞菌DN-2對此兩種氮素的脫出率在llh時均達100%(見附圖4)。硝態氮在5h時即出現快速降解，而亞硝態氮則在7h時出現快速降解。說明當兩種氮素同時存在時，假單胞菌DN-2優先利用硝酸鹽。實施例5假單胞菌DN-2的發酵罐大規模培養從反硝化瓊脂斜面上接兩環菌苔裝入有100ml反硝化培養基的250ml錐形瓶中，在3(TC，120rpm搖床培養12h。按5%接種量接種，將500ml種子培養液轉移至裝有9.5L發酵培養基的IOL發酵罐中。根據搖瓶實驗的研究結果，確定最佳發酵罐的培養條件3(TC、攪拌轉速100r/min、通氣量0.05vvm、接菌量5X，發酵培養基組成(g/L):NaN020.5，CH3COONa5，MgS047H200.03，MnS044H200.01，FeS047H200.01，K2HP040.75，NaH2P040.25，初始pH調節至8.5。N02—-N在10h內全部被還原，而pH在Oh10h內上升(見附圖7)，與反硝化作用產堿吻合。由于菌株以NaN02為唯一氮源，10h后以5mgL—1h—1的速度補加NaN02。補加NaN02后仍檢測不到N02—_N，NaN02加入后立即被反硝化作用轉化或利用合成細胞物質。培養24h后，用活菌技術法測定菌濃，其濃度達到最大值1.2X10"cfu/ml，而p02在24h后開始回升(見附圖8)，菌株生長進入平臺期。培養24h可收獲較高濃度的菌體，有利于實際應用中的大規模使用。實施例6假單胞菌DN-2在水體中的脫氮6.1不同濃度的NaCl下，假單胞菌DN-2在水體中的脫氮效果從反硝化瓊脂斜面上接兩環菌苔裝入有100ml反硝化培養基的250ml錐形瓶中，在30°C，120rpm搖床培養12h。按5%接種量接種，將5ml種子培養液轉移至裝有100ml反硝化培養基的250ml錐形瓶中。反硝化培養基中NaCl濃度分別為0，0.5，1，1.5，2.5，3.5%，假單胞菌DN-2在水體中的脫氮效果見附圖9。結果表明，NaCl濃度不高于15g/L時，對菌株的還原活性沒有明顯影響；NaCl濃度過高時，則會影響菌體生長而抑制其反硝化作用。水產養殖的水體中存在一定的鹽濃度，淡水鹽濃度一般不超過O.5g/L，海水平均鹽濃度為35g/L。菌株由土壤中篩選得到，并不適應海水的高鹽濃度。但就普通淡水養殖的水體，并不影響其還原活性，可快速去除水體中的亞硝酸鹽。6.2不同濃度的蛋白胨下，假單胞菌DN-2在水體中的脫氮效果從反硝化瓊脂斜面上接兩環菌苔裝入有100ml反硝化培養基的250ml錐形瓶中，在3(TC，120rpm搖床培養12h。按5%接種量接種，將5ml種子培養液轉移至裝有100ml反硝化培養基的250ml錐形瓶中。反硝化培養基中蛋白胨濃度分別為O，O.05，0.l，O.2，0.5，1.0X，假單胞菌DN-2在水體中的脫氮效果見附圖10。結果表明，蛋白胨濃度在Og/L10g/L的范圍內對菌株的還原活性沒有明顯影響。水體中存在一定濃度的含氮有機物時，不影響菌株對亞硝酸鹽的還原。6.3—定濃度的重金屬離子下，假單胞菌DN-2在水體中的脫氮效果從反硝化瓊脂斜面上接兩環菌苔裝入有100ml反硝化培養基的250ml錐形瓶中，在3(TC，120rpm搖床培養12h。按5%接種量接種，將5ml種子培養液轉移至裝有100ml反硝化培養基的250ml錐形瓶中。分別以亞硝態氮和硝態氮為唯一氮源的條件下，培養8h時，分別加入經膜過濾除菌的2.5mM的Co2+和Cu2+溶液，假單胞菌DN-2在水體中的脫氮效果見附圖11(A/B)。結果表明，2.5mM的Co2+和Cu2+能明顯抑制菌株對氮素的還原。因此，當水體中存在高濃度的重金屬離子時，應先對水體進行處理除去過高的重金屬離子，再使用假單胞菌DN-2脫氮。實施例7假單胞菌DN-2在實際淡水養殖水體中的脫氮按照實施例5，將發酵罐(B.BraunBiotechInternational,10L)培養24小時假單胞菌DN-2菌體通過12，OOOg，在4"下離心15min收集，懸浮于15%的脫脂牛奶并凍干。得到的凍干粉(1.0X107cfU/g)直接投入淡水養殖池塘，菌體的投入量為10.0cfu/m3。每天測定池塘水體的pH、硝態氮及亞硝態氮的濃度(見表6)。結果表明，在水溫25°C、pH8.6的池塘水環境下，水中N02—_N從菌體投放后的第3d開始下降，到18d時已由1.47mg/L下降至0.49mg/L，假單胞菌DN-2降解亞硝態氮的效果非常明顯，能在不采取其他方法的情況下，較快地將水體亞硝態氮降解至對魚蝦相對安全的水平。在整個觀察過程中，pH在8.4-8.9的范圍間波動，這個范圍適合假單胞菌DN-2及其他反硝化細菌的生長。表6假單胞菌DN-2對淡水養殖水體中亞硝態氮的脫除t/dCN02W(mg/L)CN03:N/(mg/L)PH,廠C01.4690.0498.4224.511.478O馬8.4224.921.455O扁8.4624.61.3630.009828.5024.741.3090,0338.6024.51.2550.06658.7025.061.240O扁8.7424.771,2170.1968.7024.581.0330.3608.7225.091.1390.3678.8224.8101.1930.2958.8624.7110.9220.2958.6524,6120.8470.7868.6924.8130.7300.3938.9224.9140.7320.1648.9024.7150.5180.2298.8624.5160.5620.3278.6024.6170.4910.06558.7624.9180.4900.06558.6424.71權利要求一種具有脫氮生物活性的細菌，保藏號是CGMCCNo.2917。2.—種培養權利要求1中所述細菌的方法，該方法是在下列條件下培養溫度2040°C;溶氧搖瓶轉速60180rpm;pH5.010.0;碳源選自乙酸鈉、葡萄糖、甘露醇、麥芽糖、蔗糖或可溶性淀粉；C/N摩爾比為120;初始NaN02濃度0.55.0g/L。3.權利要求2的方法，該方法是在下列條件下培養溫度2535°C;溶氧搖瓶轉速90150rpm;pH7.010.0;碳源選自乙酸鈉、葡萄糖、甘露醇或可溶性淀粉；C/N摩爾比為1220;初始NaN02濃度0.54.Og/L。4.權利要求3的方法，該方法是在下列條件下培養溫度3(TC;溶氧搖瓶轉速120rpm;pH8.5;C/N摩爾比為12;碳源為乙酸鈉；初始NaN02濃度2.Og/L。5.—種大規模培養權利要求1中所述細菌的方法，包括在204(TC，攪拌轉速80120r/min，通氣量0.040.06vvm，接菌量36%，初始pH8.5的條件下發酵罐培養細菌。6.權利要求5的方法，包括在3(TC、攪拌轉速100r/min、通氣量0.05vvm、接菌量5X，初始pH8.5的條件下發酵罐培養細菌。7.—種權利要求l中所述的細菌在水體生物脫氮中的應用。8.—種對水體進行生物脫氮的方法包括將權利要求1的細菌培養后，懸浮于脫脂牛奶并凍干，將凍干粉直接投入水體，菌體的投入量為1.0100cfu/m3。全文摘要本發明涉及微生物領域，涉及一種生物脫氮劑及其應用。更具體地，涉及一種具有脫氮生物學活性的細菌、培養該細菌的方法，以該菌為主要組成成分的生物脫氮劑的制備，及其在降解水體氮素中的應用。本發明的細菌命名為假單胞菌DN-2，Pseudomonassp.DN-2，保藏號為CGMCCNo.2917，保藏時間2009年2月27日，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。文檔編號C12R1/38GK101712943SQ200910233990公開日2010年5月26日申請日期2009年10月22日優先權日2009年10月22日發明者周長林,洪秀娟,竇潔,賈源賓申請人:中國藥科大學;南京曜動節能環保科技有限公司