專利名稱：D-絲氨酸酶法轉化制備方法
技術領域：
本發明屬于醫藥生物技術領域，具體涉及D-絲氨酸酶法轉化制備方法。
二背景技術：
D-絲氨酸是一種重要的手性中間體，在新藥研究、有機合成和多肽合成等領域的 應用正引起人們越來越多的關注。同時，D-絲氨酸也廣泛應用于醫學研究中，以D-絲氨酸 為中心的研究已經成為目前神經科學領域的熱點之一。例如，D-絲氨酸不僅用于合成治療 結核病的特效藥D-環絲氨酸，還可作為制備其它醫藥中間體的重要原料。另外D-絲氨酸 還可顯著改善孤獨癥病人的社交退縮，并可用于治療精神分裂癥等腦疾病。
D-絲氨酸很難從自然界中獲得，目前研究或產業化一般通過拆分外消旋絲氨酸的 方法制備，拆分的方法有生物酶法、化學拆分法和物理拆分法。
1、生物酶法 生物酶法制備D-絲氨酸又可分為生物酶拆分法和生物酶合成法。 Ikeda等(US7186532， 2007)利用具有較高L-絲氨酸脫氨酶活性的微生物作用于
DL-絲氨酸，通過選擇性降解L-絲氨酸而獲得D-絲氨酸。 池田創等(CN1531599，2004)利用高活性的L-絲氨酸脫氨酶重組菌株與含有 DL-絲氨酸的介質混合分解L-絲氨酸，然后從該介質中提取殘存的D-絲氨酸。
日本專禾U (Japanese Published Unexamined Patent Application No. 64-2594) 報導在含有DL-絲氨酸的培養基中培養假絲酵母屬(Candida)、球擬酵母屬(Torulopsis) 或隱球菌屬(Cryptococcus)等能同化L_絲氨酸而不同化D_絲氨酸的微生物，從培養液中 分離D-絲氨酸。 日本專禾U (Japanese Published Unexamined Patent Application No. 5-91895) 使具有酪氨酸酶活性的微生物與含有DL-絲氨酸和酚的反應液互相作用，將L-絲氨酸轉換 成L-酪氨酸，提取殘存的D-絲氨酸。 2008年，龐敏等(食品與發酵工業，2008)利用E.coli Blt7_A的色氨酸酶酶促 轉化DL-絲氨酸，將DL-絲氨酸的拆分和L-色氨酸的合成同步化。朱延新等(CN1834257, 2006)用乙酰甘氨酸為起始原料，制備乙酰-DL-絲氨酸，再用酰化酶或蛋白酶拆分得到 D-絲氨酸。 安樂城正等(CN101040047，2007)發現一種具有由甲醛和甘氨酸合成D_絲氨酸活 性的新型酶DNA并構建了該酶的基因工程菌，能夠利用lOOmM甘氨酸和甲醛以70%以上的 高反應收率合成D-絲氨酸。 日本專禾U (Japanese Published Unexamined PatentApplication No. 61-152291) 公開報導了通過微生物作用，由DL-羥甲基乙內酰脲生成N-氨基甲酰基-D-絲氨酸，然后 水解得到D-絲氨酸的方法。 以上提及酶法制備D-絲氨酸的方法存在酶活低，L-絲氨酸分解不完全，需要進行 DL-絲氨酸分離，生成的D-絲氨酸濃度低等不利因素，用作D-絲氨酸工業生產都有難度。
2、化學拆分法 2005年，秦為民等(化學試劑，2005)以2_N_ (N'-芐基)脯氨酰_氨基_ 二苯甲 酮甘氨酸席夫堿Ni(II)復合物與聚甲醛反應，生成2-N-(N'-芐基)脯氨酰-氨基-二苯 甲酮絲氨酸席夫堿Ni (II)復合物，經水解制備了 D-或L-絲氨酸。 2007年，吳劉洋等(氨基酸和生物資源，2007)以DL_絲氨酸為原料經過酯化、拆 分和水解制備D-絲氨酸，總收率為74. 8%，光學純度達到98%以上。
2、物理拆分法 2007年，Se皿g-Hee Son等(Journal of Applied Polymer Science, 2007)運 用傳統的制備反滲透膜的界面聚合技術制備了分子印跡復合膜，該膜能夠有效的選擇透過 D-絲氨酸。當光學拆分外消旋絲氨酸時，D-絲氨酸的擴散速率比L-絲氨酸快，復合膜中的 D-絲氨酸濃度會隨著時間的延長而增加，當操作時間達60h時復合膜中絲氨酸對映體過量 值為80%左右。 馬云峰等(CN1900052，2007)以誘導結晶法制備左旋絲氨酸和右旋絲氨酸，收率 96%以上。
發明內容
D-絲氨酸酶法轉化制備過程中，反應條件溫和，L-色氨酸合成酶專一性強，轉化 效率高，提取工藝簡單，且產生高附加值的L-色氨酸。本發明的目的在于避免上述現有技 術中的不足之處而提供一種高效、低成本的D-絲氨酸及L-色氨酸的制備方法。
本發明可以通過以下技術方案來達到
D-絲氨酸酶法轉化制備方法，其步驟為 (1)色氨酸合成酶基因工程菌BA3(張緒梅等，生物技術通訊，2006)，在含有IPTG 或乳糖的培養基中培養，誘導產生高活力的色氨酸合成酶； (2)采用游離細胞法，將含酶細胞或酶提取液與緩沖液配制的含有DL-絲氨酸的 轉化液混合后，再加入適量的吲哚和表面活性劑，在30 5(TC條件下進行酶促轉化反應， 最適轉化溫度35 45°C。 (3)將反應生成物進行分離，得到高純度的D-絲氨酸，同時還得到L-色氨酸。 上述步驟(1)中的培養基碳源采用葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、果糖和/或乳糖，其濃度
為1 20g/L，氮源采用有機氮源，如牛肉膏、酵母膏、玉米漿、蛋白胨、豆餅水解液和/或蛋
白質水解物，其濃度為1 30g/L，加入IPTG或乳糖誘導，其濃度為0. 05 10g/L。 上述步驟(2)的轉化液緩沖體系為磷酸緩沖液、硼酸緩沖液和/或碳酸緩沖液，使
轉化液pH7. 5 9. 5，最適轉化液pH8 9 ;在轉化液中加入表面活性劑，如吐溫_80，十六
烷三甲基溴化銨(CTAB)，聚乙二醇辛基苯基醚(0P)，其濃度為0. 005 5g/L。 上述步驟(3)中分離反應體系中D-絲氨酸和L-色氨酸的方法是采用等電點結晶
法或等電點結晶與離子交換樹脂分離相結合的方法。 本發明與現有技術相比具有如下優點 (1)本發明采用色氨酸合成酶基因工程菌BA3在優選的培養基中培養可以高產率 的生成色氨酸合成酶，使反應有非常高的轉化率和反應速率，D-絲氨酸及L-色氨酸的光學 純度達到99%以上。
(2)本發明采用游離細胞法轉化DL-絲氨酸，同時制備得到D-絲氨酸及L-色氨 酸，原料價格低廉，操作簡便，大大提高反應速率，簡化工藝流程。 (3)D-絲氨酸和L-色氨酸的理化性質差異很大，利用溶解度的差異就可以分離制 備，成本低，工藝流程簡單，適合工業化生產。
(4)具有原料來源豐富，價格低廉，轉化時間短，操作簡便，生產成本低等優點。
四具體實施方式
實施例一 1.將1000mL發酵液離心得到的色氨酸合成酶基因工程菌20g加入到0. lmol/L磷 酸緩沖液(pH8. 5)配制的1000mL轉化液中，轉化液含6% DL-絲氨酸(g/mL) 、33g吲哚和 0.5X吐溫-80(g/mL)溶液6mL， 37。C酶促反應18h。反應液中析出白色固體物，反應體系中 L-色氨酸濃度為5. 5 % ，對L-絲氨酸摩爾轉化率為95 % 。 2.將反應液4000rpm離心10min，收集濕細胞和白色固體混合物79g，用500mL純 水溶解固體混合物，滴加6mol/L NaOH調pH12 13，攪拌升溫到60 8(TC將固體L_色氨 酸溶解完全，加活性炭脫色除菌體，濾液用6mol/L HC1調pH至5. 9，酸化液冷卻至室溫，析 出的結晶真空過濾，用少量純水洗滌，烘干得33. 2gL-色氨酸，比旋光度[a ]D2° :-30. 0° (C =1， H20)。 3.將890mL離心上清液與580mL L_色氨酸結晶母液合并，混合液用6mol/LHCl調 pH至3. 5，加純水稀釋到2000mL上氫型陽離子樹脂柱，吸附飽和后，采用2%和4%氨水洗 脫，分別收集洗脫液濃縮結晶、精制得L-色氨酸10.3g，比旋光度[a]D2°:-31.9° (C = 1， H20) ， D-絲氨酸23. 5g，比旋光度[a ]D2。 :_13. 9° (C = 5， 5MHC1)，結晶母液循環使用。
實施例二 1.將1000mL發酵液離心得到的色氨酸合成酶基因工程菌21g加入到0. lmol/L磷 酸緩沖液(pH8. 8)配制的lOOOmL轉化液中，轉化液含10% DL-絲氨酸(g/mL) 、55g吲哚和 0. 5X吐溫-80(g/mL)溶液6mL， 4(TC酶促反應20h。反應液中析出白色固體物，反應體系中 L-色氨酸濃度為8. 9 % ，對L-絲氨酸摩爾轉化率為92 % 。 2.將反應液4000rpm離心10min，收集濕細胞和白色固體混合物149g，用700mL純 水溶解固體混合物，滴加6mol/LNaOH調pH12 13，攪拌升溫到60 8(TC將固體L_色氨 酸溶解完全，加活性炭脫色除菌體，濾液用6mol/L HC1調pH至5. 9，酸化液冷卻至室溫，析 出的結晶真空過濾，用少量純水洗滌，烘干得60. 6gL-色氨酸，比旋光度[a ]D2° :-30. 1° (C =1， H20)。 3.將880mL離心上清液與780mL L-色氨酸結晶母液合并，混合液用6mol/LHCl調 pH至3. 5，加純水稀釋到2200mL上氫型陽離子樹脂柱，吸附飽和后，采用2%和4%氨水洗 脫，分別收集洗脫液濃縮結晶、精制得L-色氨酸12. lg，比旋光度[a]D2°:-32.r (C= 1， H20) ， D-絲氨酸39. 5g，比旋光度[a]D2° :-13.8° (C = 5， 5MHC1)，結晶母液循環使用。
實施例三 1.將1000mL發酵液離心得到的色氨酸合成酶基因工程菌22g加入到0. lmol/L碳 酸鈉緩沖液(pH9. 5)配制的lOOOmL轉化液中，轉化液含15% DL-絲氨酸(g/mL) 、83g吲哚 和0.05X0P溶液(g/mL)6mL，37t:酶促反應22h。反應液中析出白色固體物，反應體系中
5L-色氨酸濃度為13. 2 % ，對L-絲氨酸摩爾轉化率為91 % 。 2.將反應液4000rpm離心10min，收集濕細胞和白色固體混合物175g，用900mL純水溶解固體混合物，滴加6mol/L NaOH調pH12 13，攪拌升溫到60 8(TC將固體L_色氨酸溶解完全，加活性炭脫色除菌體，濾液用6mol/L HCl調pH至5. 9，酸化液冷卻至室溫，析出的結晶真空過濾，用少量純水洗滌，烘干得88. 5gL-色氨酸，比旋光度[a ]D2Q :-29. 8° (C=1， H20)。 3.將860mL離心上清液與980mL L_色氨酸結晶母液合并，混合液用6mol/LHCl調pH至3. 5，加純水稀釋到2500mL上氫型陽離子樹脂柱，吸附飽和后，采用2%和4%氨水洗脫，分別收集洗脫液濃縮結晶、精制得L-色氨酸17.3g，比旋光度[a]D2°:-31.7° (C = 1，H20) ， D-絲氨酸59. 2g，比旋光度[a]D2°:-13.5° (C = 5， 5MHC1)，結晶母液循環使用。
實施例四 1.將1000mL發酵液離心得到的色氨酸合成酶基因工程菌25g加入到0. lmol/L硼酸緩沖液(pH9. 0)配制的1000mL轉化液中，轉化液含20X DL-絲氨酸(g/mL) 、 lllg吲哚和0. 05% CTAB(g/mL)6mL，45t:酶促反應26h。反應液中析出白色固體物，反應體系中L-色氨酸濃度為17%，對卜絲氨酸摩爾轉化率為88%。 2.將反應液4000rpm離心10min，收集濕細胞和白色固體混合物220g，用1100mL純水溶解固體混合物，滴加6mol/L NaOH調pH12 13，攪拌升溫到60 80°C將固體L-色氨酸溶解完全，加活性炭脫色除菌體，濾液用6mol/L HC1調pH至5. 9，酸化液冷卻至室溫，析出的結晶真空過濾，用少量純水洗滌，烘干得106.2g L-色氨酸，比旋光度[a]d20 :-30. 2° (C = 1， H20)。 3.將830mL離心上清液與1200mL L-色氨酸結晶母液合并，混合液用6mol/LHCl調pH至3. 5，加純水稀釋到2800mL上氫型陽離子樹脂柱，吸附飽和后，采用2%和4%氨水洗脫，分別收集洗脫液濃縮結晶、精制得L-色氨酸19.2g，比旋光度[a]D2°:-31.4° (C =1， H20) ， D-絲氨酸82. 2g，比旋光度[a ]D20 :_13. 2° (C = 5， 5MHC1)，結晶母液循環使用。
權利要求
一種D-絲氨酸酶法轉化制備方法，其特征是由以下步驟構成(1)具有高活力L-色氨酸合成酶的基因工程菌，在含有IPTG(異丙基硫代半乳糖苷)或乳糖的培養基中培養，產生高活力的L-色氨酸合成酶；(2)用游離細胞法，將含酶細胞或酶提取液與緩沖液配制的含有DL-絲氨酸的轉化液混合，再加入適量的吲哚、表面活性劑和磷酸吡哆醛，在30～50℃條件下進行酶促反應，最適轉化溫度35～45℃。將反應生成物進行分離，得到高純度的D-絲氨酸，同時還得到L-色氨酸。
2. 根據權利要求l所述D-絲氨酸酶法轉化制備方法，其特征在于步驟(2)所用的 DL-絲氨酸濃度為10g/L 500g/L，最適濃度為50g/L 300g/L，緩沖液包括磷酸緩沖液、 碳酸緩沖液或硼酸緩沖液，使轉化液pH7. 5 9. 5，最適轉化液pH8 9。
3. 根據權利要求l所述的D-絲氨酸酶法轉化制備方法，其特征在于步驟(2)所述的 表面活性劑包括吐溫-80、十六烷基三甲基溴化銨和聚乙二醇辛基苯基醚，其濃度(g/L)為 0. 005 5. 0。
4. 根據權利要求l所述的D-絲氨酸酶法轉化制備方法，其特征在于步驟(2)分離 D-絲氨酸和L-色氨酸的方法為等電點結晶法或等電點結晶與離子交換樹脂分離相結合的 方法。
全文摘要
本發明屬于醫藥生物技術領域的D-絲氨酸酶法轉化制備方法。該制備方法采用DL-絲氨酸作為原料，將具有高L-色氨酸合成酶活性的基因工程菌與含有DL-絲氨酸的轉化液混合，30～50℃下進行酶促反應，然后用等電點結晶法或等電點結晶與離子交換樹脂相結合的方法分離轉化產物，得到高純度D-絲氨酸和L-色氨酸。該方法實現了D-絲氨酸和L-色氨酸的同時生產，具有原料價格低廉，操作簡便，轉化時間短，生產成本低等優點。
文檔編號C12P13/06GK101717810SQ20091023361
公開日2010年6月2日 申請日期2009年10月26日 優先權日2009年10月26日 公開號200910233616.發明者劉均忠, 劉茜, 焦慶才, 趙根海 申請人:南京大學