專利名稱：一種酶解小麥蛋白制備小麥蛋白源阿片活性肽的方法
技術領域：
本發明涉及一種利用蛋白酶酶解制備小麥蛋白源阿片活性肽的方法，屬于小麥蛋
白深加工技術領域。
背景技術：
小麥面筋蛋白俗稱谷朊粉，是小麥淀粉生產的副產品，目前主要用于食品與飼料 工業中，如作為面粉品質改良劑，螃蟹、甲魚等的飼料粘結劑，營養添加劑等。隨著面筋產量 的持續增大，其傳統市場已趨飽和，并造成過剩。因此開發小麥面筋蛋白的新用途勢在必 行。 食物蛋白源生物活性肽是現代營養學及食品學研究的熱點和極具發展前景的功 能因子，近年來受到廣泛重視。目前已從各種食物蛋白的不同酶解產物中分離鑒定出阿片 肽、血管緊張素轉化酶抑制肽(降壓肽)、免疫調節肽、抗菌肽、抗血栓肽、礦物元素吸收促 進肽、降膽固醇肽等。這些活性肽的組成氨基酸并不一定是必需氨基酸，這使得那些原本 認為生物價不高的蛋白質資源能夠得到更充分地利用，成為能更好滿足人類保健需要的基 料。 阿片肽是一類通過與阿片受體結合而發揮阿片樣生理作用的小分子生物活性肽， 具有抗腹瀉，促進攝食，鎮痛，鎮靜，調節睡眠，緩解壓力與緊張，抑制胃腸道運動和消化液 的分泌，促進電解質的吸收，調節內分泌，抑制細胞分裂和分化，調節免疫功能，影響生殖與 泌乳，調節心血管系統等許多生理功能，而且其毒性遠較嗎啡小，是一類有前途的安全有效 的治療藥物。因此，阿片肽在醫藥及動物生產領域具有非常廣闊的應用前景。
阿片肽分為內源性阿片肽和外源性阿片肽兩種。目前研究較多的外源性阿片肽主 要是來源于食物中蛋白質水解后產生的小肽片段，它們同內源性阿片肽(E0P)或嗎啡類藥 物一樣具有阿片活性，能參與調節動物的生理活動。外源阿片肽廣泛存在于食物蛋白質序 列中，如小麥、大豆、大米、牛奶、血等蛋白序列中含有許多具有阿片活性的肽段，這些食物 在消化過程中釋放出阿片肽，并可能被小腸完整吸收。它們可剌激胰島素和消化道生長抑 素的分泌、調節動物行為、促進腸道吸收水分和電解質、調節消化道運動、剌激攝食、抑制呼 吸和調整睡眠模式等。 這類外源阿片肽類最早是在酪蛋白酶解產物中被發現的，也是目前研究最深入的 一類。1979年，Brantl等首先報道豚鼠在飼喂一種酪蛋白酶解制劑時，回腸縱行肌毛細血 管中存在一種呈阿片肽活性的物質，命名為P _酪啡肽-7(13 -Casomorphin-7, P -CM-7)， 它是含有7個氨基酸殘基的寡肽(Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly-Pro-Ile)，它與y型受體具有良 好的親和力，并呈現出阿片肽類所具有的特征，如依賴性、呼吸抑制性等。之后又分離得到 P -CM-7的前體P -CM-ll (Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly-Pro-Ile-Pro-Asn-Ser-Leu)，在多種動 物的乳蛋白中具有保守性。幾種肽鏈較短的e-CM均是十一肽自羧基端水解不同數目的氨 基酸殘基后的產物，它在阿片肽受體分析中顯示很高的親和性。這種肽被認為可能直接作 用于消化道中的阿片肽受體以影響胃腸道的運動或者作為胃腸道激素的外源性調節劑，也
3可能在小腸刷狀緣降解成更小的疏水性阿片肽，穿過腸粘膜進入外周血液，再透過血腦屏 障與腦中的阿片肽受體結合，即使是成年人在大量飲用牛奶后，其小腸內容物中也能檢測 到顯著量的這種阿片肽的免疫反應物。 近些年來，研究者對酶法增溶小麥面筋蛋白進行了大量研究，面筋蛋白的溶解性 直接影響著其起泡和乳化等功能特性。但對小麥面筋蛋白源生物活性肽的研究報道較少， 尤其是對于小麥蛋白源阿片肽的制備及其性質還未見報道。
發明內容
本發明提供了一種通過酶水解小麥蛋白制備阿片活性肽的工藝，獲得的肽含量 高，阿片活性高，促進了谷朊粉的綜合利用。 本發明的技術方案一種酶法制取小麥蛋白源阿片活性肽的方法，所述方法步驟 為 (1)配制小麥蛋白漿料以小麥蛋白為原料，加水調至小麥蛋白質量濃度為 5% -6% ; (2)第一步酶解調整pH值為1.5 2.0，溫度為36 38t:，添加胃蛋白酶酶解， 加酶量為小麥蛋白重量的1.0% 1.5%，酶解時間9 2處； (3)第二步酶解再調節pH值為8. 3 8. 7，添加胰蛋白酶在溫度46 48"酶解
或添加胰酶在36 38t:酶解，加酶量為小麥蛋白重量的0. 5% 1. 0%，酶解4 6h ; (4)后處理酶解完畢調節pH 7. 0 7. 2，滅酶，冷卻，3000rpm離心20min，取上清
液經活性炭吸附脫色，3000Da超濾膜分離，干燥得到小麥蛋白源阿片活性肽粉。 所采用小麥蛋白原料為谷朊粉或者由小麥粉提取制備的小麥蛋白，其中蛋白質干
基含量不低于75%。 離體豚鼠回腸是公認的P， k阿片受體分布組織，是常用的利用外周神經研究中 樞神經系統阿片類物質作用的工具。本發明采用豚鼠回腸法測定小麥活性肽的阿片活性， 結果表明制備所得的小麥蛋白源阿片活性肽具有顯著的阿片活性，而原料小麥蛋白則不具 有阿片活性。根據文獻報道及實驗結果，確定ICs。值小于3mg/ml即認為樣品具有顯著的阿 片活性，IC5。值大于50mg/ml即認為樣品不具有阿片活性。 在相同試驗條件下對嗎啡的阿片活性進行了測量，其IC5。值為0.05mg/mL。所制 備的小麥蛋白源阿片肽的ICs。值，與嗎啡相比要高一些。這主要是由于小麥蛋白經過酶解 之后得到的肽是一種混合物，鑒于小麥蛋白活性肽粉的營養補充和保健作用，以及進一步 分離純化得到小麥蛋白源阿片肽純品的成本等問題，本發明僅通過3000Da超濾膜對小麥 蛋白源阿片肽進行初步富集。 由于阿片肽具有鎮痛，鎮靜，促進攝食，抑制胃腸道運動和消化液的分泌，調節內 分泌，調節免疫功能，影響生殖與泌乳，調節心血管系統等許多生理功能，故可在此基礎上 進一步嘗試開發生產食品添加劑，將小麥蛋白源阿片活性肽作為功能因子添加到保健食品 中。還可應用到動物飼料工業中，從而提高畜禽奶產量和生長效率，這對促進綠色飼料產業 和綠色畜禽產業的發展，提高畜禽產品品質等具有極其重大的意義。從醫療及實用意義上 看，尋找高效低毒不成癮的鎮痛藥物一直是人們長期盼望的目標。 本發明的有益效果本發明通過酶解制備小麥蛋白源阿片活性肽，擴大了小麥蛋白的應用范圍，旨在促進小麥蛋白的深度利用與開發，尋找有效減輕阿片類藥物副作用的 新物質提供理論依據和有效途徑。
圖1采用本發明方法制備所得小麥蛋白源阿片活性肽的HPSEC譜圖。
具體實施例方式
實施例1 :配制小麥蛋白溶液，采用豚鼠回腸法測定小麥蛋白是否具有阿片活性， 結果表明，即使加入測試槽使小麥蛋白濃度達到50mg/mL，仍未觀察到抑制豚鼠回腸收縮的 現象，且和空白對照組(臺氏液)沒有明顯差別。因此小麥蛋白不具有阿片活性。
實施例2 :采用離體豚鼠回腸來檢測嗎啡的阿片活性，其IC5。值為0. 05mg/mL。
實施例3 :5. Og谷朊粉分散于lOOmL水溶液中，調節pH7. 0，攪拌20min。調節溫度 為5(TC，添加中性蛋白酶酶解，加酶量為谷朊粉重量的1. 0%，水解時間為12h。水解完畢， 95。C滅酶10min，冷卻，3000rpm離心20min，上清液經活性炭吸附脫色，3000Da超濾膜分離 制備得到小麥肽產品。采用豚鼠回腸法檢測，發現此條件所制備的小麥肽不具有阿片活性。
實施例4 :5. Og谷朊粉分散于100mL、0. 02mol/L的鹽酸水溶液中，攪拌20min，采 用lmol/L的鹽酸調節溶液pH為2. 0。調節溶液溫度為37t:，添加胃蛋白酶酶解，加酶量為 谷朊粉重量的1. 0%，水解時間為12h。水解完畢采用lmol/LNaOH溶液調節pH為8. 5，調節 溫度為47°C ，添加胰蛋白酶酶解，加酶量為小麥蛋白重量的1. 0% ，保持pH恒定酶解6h，反 應結束后調節pH為7. 0，95。C滅酶10min，冷卻，3000rpm離心20min，上清液經活性炭吸附 脫色，3000Da超濾膜分離制備得到小麥活性肽產品。采用豚鼠回腸法檢定表明小麥活性肽 具備阿片活性，IC5。值為1. 56±0. 58mg/mL。 實施例5 :以小麥蛋白為原料，加水調至質量百分比為5. 0% ，調整pH值為1. 5，添 加胃蛋白酶酶解，加酶量為谷朊粉重量的1.0% ;酶解溫度37t:，水解時間12h。水解完畢 調節pH為8. 5，溫度37t:，添加胰酶酶解，加酶量為小麥蛋白重量的0. 5X，保持pH恒定酶 解6h，酶解完畢調節pH為7. 0，滅酶，冷卻，3000rpm離心20min，上清液經活性炭吸附脫色， 3000Da超濾膜分離制備得到小麥活性肽產品。采用豚鼠回腸法檢定表明小麥活性肽具備顯 著的阿片活性，IC5。值為1. 29±0. 38mg/mL。所得小麥阿片活性肽產品經HPSEC檢測分析， 分子量主要集中于2000以下(如圖1所示)。 實施例6 :豚鼠回腸(GPI)離體檢定法測定小麥蛋白肽的阿片活性 臺氏(Tyrode)液的配制NaCl 8g， KC1 0. 2g， CaCl2 0. 2g， NaHC03 0. lg， MgCl2
0. lg， NaH2P04 0 . 05g，葡萄糖1. Og，加蒸餾水至1000mL。 實驗前動物禁食12 24h，飲水不限，取豚鼠一只，擊頭致死，立即剖腹，棄去近回 盲瓣10cm的部分，剪下回腸上半段，浸入臺氏液中，將腸系膜沿腸壁小心剪掉，用臺氏液將 腸內容物沖凈，剪成2-2. 5cm長的腸段備用。將腸段固定于裝有37t:臺式液的恒溫離體器 官實驗儀中，持續供給95%的02和5% C02混合氣體，經張力換能器將腸段縱肌方向收縮活 動的信號輸入到LMS-2B型二道生理儀，描記收縮活動曲線。腸段在0. 8g的前負荷下溫育， 每20min更換一次新鮮的臺式液(37°C )，靜置30min后，待腸段自發活動平穩時用微量注 射器于浴槽深處給藥。藥物濃度均指溶于肌槽中臺氏液后的最終濃度。以累計濃度法加入
5待測樣液(所制備肽粉溶解液)，記錄量效關系，然后用臺式液反復沖洗標本，待張力恢復正常后，再加入下一個樣品。在浴槽中先后加入0. 2mL、10—7mol/L的納洛酮，觀察納洛酮存在與否對阿片活性的影響。 用半數抑制濃度IC5。值來評價樣品的阿片活性的強弱。IC5。值是指在相同實驗條件下，能使離體腸段的自主收縮抑制50%的樣品濃度。IC5。值越小，表明阿片活性越強。
權利要求
一種酶法制取小麥蛋白源阿片活性肽的方法，其特征在于所述方法步驟為(1)配制小麥蛋白漿料以小麥蛋白為原料，加水調至小麥蛋白質量濃度為5％-6％；(2)第一步酶解調整pH值為1.5～2.0，溫度為36～38℃，添加胃蛋白酶酶解，加酶量為小麥蛋白重量的1.0％～1.5％，酶解時間9～24h；(3)第二步酶解再調節pH值為8.3～8.7，添加胰蛋白酶在溫度46～48℃酶解或添加胰酶在36～38℃酶解，加酶量為小麥蛋白重量的0.5％～1.0％，酶解4～6h；(4)后處理酶解完畢調節pH 7.0～7.2，滅酶，冷卻，3000rpm離心20min，取上清液經活性炭吸附脫色，3000Da超濾膜分離，干燥得到小麥蛋白源阿片活性肽粉。
2. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于所采用小麥蛋白原料為谷朊粉或者由小麥 粉提取制備的小麥蛋白，其中蛋白質干基含量不低于75%。
全文摘要
一種酶解小麥蛋白制備小麥蛋白源阿片活性肽的方法，屬于小麥蛋白深加工技術領域。本發明以小麥蛋白為原料，加水調至一定的質量百分比，調節一定的溫度、pH，先采用胃蛋白酶酶解，然后改變酶解條件，采用胰蛋白酶或胰酶進行酶解，水解完畢調節pH至中性，滅酶，冷卻，離心，取上清液經過脫色、3000Da超濾膜分離，干燥得到小麥蛋白源阿片活性肽粉。采用豚鼠回腸法測定阿片活性表明，制備所得的小麥蛋白源活性肽具有顯著的阿片活性，而原料小麥蛋白則不具有阿片活性。本發明通過酶解制備小麥蛋白源阿片活性肽，擴大了小麥蛋白的應用范圍，為促進小麥蛋白的深度開發與利用提供理論依據和有效途徑。
文檔編號C12P21/06GK101717805SQ20091023173
公開日2010年6月2日 申請日期2009年12月1日 優先權日2009年12月1日
發明者華欲飛, 周惠明, 孔祥珍, 錢海峰 申請人:江南大學