專利名稱：原位qcm環介導恒溫核酸擴增快速檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種恒溫核酸擴增檢測方法，特別是一種原位QCM環介導恒溫核酸擴 增快速檢測方法，屬分子生物學檢測技術領域，可用于病原菌以及其他生物核酸的快速檢 測。
背景技術：
常規的病原菌檢測方法(例如，大量增殖菌數、菌落純化分離、外部形態結構和生 理生化鑒定以及血清學鑒定等)由于其耗時費力、步驟繁瑣等不足之處，已經愈來愈滿足 不了人類對致病微生物快速、簡易、高特異性的鑒定要求。因此，研究人員從分子生物學水 平來研究病原菌的核酸結構和分子特征，以提高對病原菌的檢測和研究能力。目前，在病原 菌的分子生物學檢測方法中，核酸擴增法是最有效的方法之一。聚合酶鏈式反應(PCR)方法是至今使用最廣泛的核酸擴增方法，它作為一種簡便 高效的基因擴增技術在病原菌檢測過程中發揮著重大作用。但其操作過程必須有高精密的 溫度循環裝置及配套檢測裝備，使得該方法難以在基層廣泛推廣應用。除此以外，還有其他 核酸擴增方法，比如核酸序列擴增法(NASBA)、自序列復制法(3SR)和鏈置換復制法(SDA)。 這些方法的檢測水平都不少于10個拷貝，耗時1小時左右可將目標核酸擴增到相似的范圍 內，但它們對目標序列的擴增特異性不強，需要復雜的后續實驗操作手段來檢測擴增產物。DNA 環介導恒溫核酸擴增(loop-mediated isothermal amplification of DNA, LAMP)技術，是日本榮研化學開發的替代PCR的簡便、快速、準確并成本低廉的核酸檢測方 法，已在世界范圍申請技術專利。LAMP技術克服以往基因擴增方法的不足，在等溫條件下 能夠特異性、高效、快速地進行核酸的擴增，具有很多的優越性。雖然已公開的LAMP技術具 有高靈敏性，能在等溫條件下高效地擴增核酸，但是現有技術也有不足之處，主要是1、為 了滿足擴增所需要的DNA的量，必須增殖病原菌的數量；但是，對于一些特殊的樣品，細菌 的增殖是很困難的；2、僅憑反應生成的乳白色沉淀物判斷結果，不夠清楚準確，也不易實現 反應小型化，限制其進一步發展；3、需要對引物進行熒光標記，在熒光顯微鏡下觀察判斷結 果；4、檢測時間較長，需要0. 5至1. 5小時進行循環鏈置換反應。
發明內容
本發明的目的在于針對上述現有技術的不足，在環介導恒溫核酸擴增(LAMP)技 術平臺引入石英晶體微天平OiCM)技術，提供一種原位QCM環介導恒溫核酸擴增快速檢測 方法，該方法特異性強、靈敏度高、檢準率高、檢測速度快、鑒定簡便。為達到本發明的目的，采用如下技術方案一種原位QCM環介導恒溫核酸擴增快速檢測方法，通過使用特異性引物，利用環 介導恒溫核酸擴增LAMP技術平臺擴增靶基因的特定區域，其特征在于，將引物固定于石英 晶體微天平QCM電極上，在安裝該電極的QCM檢測池中配置反應體系，在63-65°C恒溫反應 的同時，利用石英晶體微天平OiCM)技術進行在線檢測，包括如下步驟
(1)模板DNA提取采用常規的方法提取DNA。如將試樣細胞懸浮于磷酸緩沖液 中，10000-12000rpm離心2_3分鐘，去掉上清液，然后.加入樣品提取液與沉淀的細胞均勻 混合；在水浴中煮沸IOmin后，置冰水中冷卻IOmin ； 10000—12000rpm離心分離2min，上清 液即可作為模板DNA使用。(2)引物固定采用巰基化試劑分子組裝方法，將環介導恒溫擴增反應體系中的4 個引物G個引物包括2個內引物FIP和BIP、2個外引物F3和B3)之一固定于QCM電極上。(3)反應體系配置在安裝上述步驟(2)所述電極的QCM檢測池中加入lOpmol/L 的另三條引物、反應緩沖液、BstDNA聚合酶、模板DNA和雙蒸水；(4)核酸擴增反應與在線檢測在63-65°C恒溫反應，用QCM儀器在線檢測頻率變 化，在10分鐘內觀察到頻率發生周期性波動變化，波動周期在2-5秒，頻率曲線呈鋸齒狀， 說明體系中發生了擴增反應，則判定試樣為陽性(試樣含有靶基因)，否則為陰性；所述的樣品提取液為20mMpH8. 0 WiTris-HCUmMEDTAU. 2% TritonX-IOO 的混合液。所述的引物包括兩條外引物、兩條內引物，其中一條內引物的5'端用巰基修飾。所述的反應緩沖液組分為IOx聚合酶反應緩沖液IOmMdNTP 150mMMgS04 = 5 · 1 · 2 ο本發明提供的原位QCM環介導恒溫基因擴增快速檢測方法，具有以下有益效果 檢測之前不需要對待檢菌進行培養，直接對樣本中的病原微生物進行原位基因擴增；擴增 和在線檢測10分鐘內即可同時完成；高特異性，假陽性檢測率極低；靈敏度高，在復雜體系 中可檢測到單細胞的靶目標。
具體實施例方式下面提供具體實施例進一步闡述本發明的技術方法，但本發明不限于實施例。實施例用本發明的原位QCM環介導恒溫基因擴增快速檢測方法檢測大腸桿菌 0157，所用引物如下BIP 5' -GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAATCATCGCACCGTCAA-3‘FIP 3' -TCATCGCACCGTCAAAGGAACCGTTACCGGGCAATAAGGAAC-5‘B3 5' -TCATCGCACCGTCAAAGGAACC-3‘
F3 3' -GTGAAATTATCGCCACGTTCGG-5‘按以下步驟進行(1)模板DNA提取取120 μ 1 0157菌液于離心管中，10000r/min離心aiiin，去上 清液，加入200μ 1樣品提取液于離心管中，與沉淀所得菌體混合均勻；沸水中煮10分鐘后 立即置于冰上冷卻10分鐘；lOOOOr/min離心2分鐘，上清液即可作為模板DNA使用。(2)引物固定將內引物BIP進行巰基修飾，取濃度為lOpmol/L經巰基修飾的BIP 引物 οομ 1，加到石英電極檢測面的金膜上于室溫反應1小時，然后用雙蒸水洗滌兩次，完 成引物固定。(3)反應體系配置在安裝步驟(2)所述石英電極的IsQCM檢測池中加入IOpmol/ μ 1另三條引物各加40μ 1，，反應緩沖液480μ l，BstDNA聚合酶40μ 1，模板DNA170y 1，加 雙蒸水180 μ 1。
(4)核酸擴增反應與在線檢測63-65°C恒溫反應；用QCM儀器在線檢測并記錄頻 率變化，從加入反應液開始計時，10分鐘內頻率曲線出現兩段特異性頻率周期性波動變化， 波動周期在3. 1-3. 3秒，頻率曲線呈鋸齒狀，判定該試樣為陽性(試樣含有大腸桿菌0157 靶基因)；對照2#QCM檢測池(與IsQCM檢測池平行加樣，其中模板DNA2 μ 1用非大腸桿菌 0157DNA取代)頻率曲線呈不規律變化，無鋸齒狀頻率曲線出現，判定該試樣為陰性(試樣 不含有大腸桿菌0157靶基因)。經多次反復試驗，未發現假陽性。
權利要求
1.一種原位QCM環介導恒溫核酸擴增快速檢測方法，通過使用特異性引物，利用環介 導恒溫核酸擴增LAMP技術平臺擴增靶基因的特定區域，其特征在于，將引物固定于石英晶 體微天平QCM電極上，在安裝該電極的QCM檢測池中配置反應體系，在63-65°C恒溫反應的 同時，利用石英晶體微天平OiCM)技術進行在線檢測。
2.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述引物固定是，采用巰基化試劑分 子組裝方法，將環介導恒溫擴增反應體系中的4個引物G個引物包括2個內引物FIP和 BIP、2個外引物F3和B3)之一固定于QCM電極上。
3.根據權利要求1或2所述的檢測方法，其特征在于，所述配置反應體系是，在安裝所 述電極的QCM檢測池中分別加入另三條引物、反應緩沖液、BstDNA聚合酶、模板DNA及雙蒸 水。
4.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述在線檢測是，用QCM儀器在線檢 測頻率變化，在10分鐘內觀察到頻率發生周期性波動變化，頻率曲線呈鋸齒狀，說明體系 中發生了擴增反應，則判定試樣含有靶基因即為陽性，否則為陰性。
全文摘要
本發明屬分子生物學檢測技術領域，公開了一種原位QCM環介導恒溫核酸擴增快速檢測方法，包括如下步驟將環狀介導恒溫擴增反應體系中的4個引物(4個引物包括2個內引物FIP和BIP、2個外引物F3和B3)之一經巰基修飾后采用分子組裝方法固定于QCM電極上；將配制好的核酸擴增反應物加到QCM檢測池中；63-65℃恒溫反應；用QCM儀器在線動態監測頻率變化，可在10分鐘內觀察、分析判斷出反應產物，判定試樣為陽性或陰性。本發明的檢測無需熒光標記、特異性高、靈敏度高、快速，可以實現樣品原位檢測并且鑒定簡便。
文檔編號C12Q1/04GK102094079SQ20091022744
公開日2011年6月15日 申請日期2009年12月11日 優先權日2009年12月11日
發明者俞宏, 崔學晨, 崔實, 張利群, 李燕國 申請人:崔學晨