專利名稱：glmM基因敲除菌株、制備方法、篩選結核分枝桿菌磷酸葡糖胺變位酶抑制劑的用途及方法
技術領域：
本發明涉及一種用于篩選抗結核藥物的菌株，尤其是一種glmM基因敲除菌株、制 備方法、篩選結核分枝桿菌磷酸葡糖胺變位酶抑制劑的用途及方法。
背景技術：
結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)是引起結核病(tuberculosis) 的病原菌，據WHO報道[1]，目前全球有近1/3的人已感染結核分枝桿菌，每年新發結核病人 @ 9000 力。(multi drug resistant,MDR) Μ^&Γ&ΜΜ (extensive drug resistant, XDR)菌株的出現，現有一些一線及二線抗結核藥物都無法有效地治愈結核病，導致每年約有200萬人死亡，結核病已成為全世界成人因傳染病而死亡的主要疾病之
ο目前，新藥研制已由過去大多數隨機、偶然和被動的藥物發現過程變為主動的以 明確靶標為依據的新藥開發過程，以細菌代謝途徑中的酶或蛋白質作為靶標來篩選先導化 合物，是目前研發新的抗生素的一種策略[3’4]。研究表明，分枝桿菌與革蘭氏陰性菌和革蘭 氏陽性菌相比，具有特殊的細胞壁結構，其核心結構由分枝菌酸、聚阿拉伯半乳糖及肽聚糖 三種大分子所構成[4’5’6]。分枝菌酸由含70-90碳原子的脂類分子組成，形成致密的低通 透性外層，肽聚糖位于細胞壁的最內層并與細胞質膜相連。分枝菌酸與中層的聚阿拉伯糖 (由呋喃型阿拉伯糖殘基聚合而成)及聚半乳糖(由呋喃型半乳糖殘基聚合而成)連接后 再通過銜接二糖(L-鼠李糖-N-乙酰葡糖胺，L-Rhamnose-N-GlcNAc)共價連接到肽聚糖大 分子上。因此，銜接二糖是維持分枝桿菌細胞壁完整性的重要結構。N-乙酰葡糖胺既是銜 接二糖的組成成分，又是肽聚糖的組成成分，其糖基供體為UDP-N-乙酰葡糖胺。UDP-N-乙 酰葡糖胺的生物合成途徑包括由三種酶所催化的四步反應[4]，其中磷酸葡糖胺變位酶催化 第二步反應，使葡糖胺-6-磷酸轉變為葡糖胺-1-磷酸。由此可見，磷酸葡糖胺變位酶是N-乙酰葡糖胺賴以存在的必要條件，亦是維持分 枝桿菌細胞壁完整性的關鍵。但是，迄今為止還沒有以磷酸葡糖胺變位酶為抗結核藥物的 作用靶標，從已有組合化合物庫及中藥中篩選出有效的磷酸葡糖胺變位酶抑制劑的相關報 道。
發明內容
本發明是以參與結核分枝桿菌細胞壁中關鍵組分生物合成的磷酸葡糖胺變位酶 為對象，提供一種glmM基因敲除菌株、制備方法、篩選結核分枝桿菌磷酸葡糖胺變位酶抑 制劑的用途及方法。本發明的技術解決方案是一種glmM基因敲除菌株，屬于分枝桿菌屬恥垢分枝 桿菌種，拉丁文學名Mycobacterium smegmatis，菌株代碼ML2009，已在中國微生物菌種保 藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)保藏，菌種保藏代號CGMCC 3418，菌種保藏日期2009-11-06。—種上述glmM基因敲除菌株的制備方法，其特征在于按如下步驟進行a.用分子克隆技術從恥垢分枝桿菌基因組中克隆Msm glmM基因并插入卡那霉素 抗性(kanK)基因，使Msm glmM基因突變以產生突變基因AglmM;b.通過DNA同源重組，使突變基因AglmM整合到恥垢分枝桿菌基因組中，產生同 時攜帶正常基因Msm glmM及突變基因Δ glmM的菌株MLl ；C.用分子克隆技術從結核分枝桿菌基因組中克隆Mtb glmM基因，并構建PCG-Mtb glmM表達載體；d.將pCG-Mtb glmM表達載體轉化到MLl菌株中，當Mtb glmM基因能夠補償MLl 菌株中Δ glmM突變基因的功能時，通過DNA同源重組方式將MLl菌株基因組中的正常基因 Msm glmM刪除，產生恥垢分枝桿菌glmM基因敲除菌株ML2009。一種上述glmM基因敲除菌株在篩選結核分枝桿菌磷酸葡糖胺變位酶抑制劑中的 用途。一種上述用glmM基因敲除菌株篩選結核分枝桿菌磷酸葡糖胺變位酶抑制劑的方 法，其特征在于按如下步驟進行e.將glmM基因敲除菌株ML2009按1 2000稀釋接種到含有被篩選物的LB液體 培養基中，被篩選物的濃度為2 20ug/ml，在30°C條件下，每間隔24小時，用酶標儀測定 菌株ML2009在600nm處的光吸收值；f.將所測吸光度值與反應條件同e步驟、培養基中無被篩選物時測得的glmM基因 敲除菌株ML2009在30°C條件下、600nm處的標準光吸收值對比，篩選磷酸葡糖胺變位酶抑 制劑。本發明是以參與結核分枝桿菌細胞壁中關鍵組分生物合成的磷酸葡糖胺變位酶 為對象，構建了 glmM基因敲除菌株ML2009，并以ML2009菌株作為高通量篩選磷酸葡糖胺變 位酶抑制劑的細胞模型，可在組合化合物庫及中藥中篩選出有效的磷酸葡糖胺變位酶抑制 劑，制備抗結核藥物。因磷酸葡糖胺變位酶是N-乙酰葡糖胺賴以存在的必要條件，亦是維 持分枝桿菌細胞壁完整性的關鍵，抑制磷酸葡糖胺變位酶即抑制了銜接二糖的生物合成途 徑，從而破壞分枝桿菌細胞壁的完整性，導致細菌的死亡，具有高藥效性；另外，在人體細胞 中，UDP-乙酰葡糖胺的合成途徑與結核分枝桿菌有所不同，不存在磷酸葡糖胺變位酶，因此 結核分枝桿菌磷酸葡糖胺變位酶所催化的反應在人體細胞中不存在，以磷酸葡糖胺變位酶 為靶酶所研發的抗結核藥物將對人體無害，克服了現有抗菌藥物也殺害正常細胞的缺點。glmM基因敲除菌株保藏日期2009-11-06。保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)。菌株保藏代號CGMCC 3418。
具體實施例方式驗證Mtb glmM是磷酸葡糖胺變位酶的編碼基因首先利用生物信息學方法將大腸桿菌(Escherichia coli) glmM基因編碼的磷酸 葡糖胺變位酶[7]對結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)的全基因組數據庫進行 BLASTp分析，篩查出編碼結核分枝桿菌磷酸葡糖胺變位酶的glmM基因。然后，克隆了結核分枝桿菌Mtb glmM基因并構建了 pET-Mtb glmM表達載體，將pET_Mtb glmM轉化大腸桿 菌BL21(DE3)菌株(購于Novagen公司)中，使Mtb GlmM蛋白在BL21 (DE3)菌株表達，用 Ni-NTA純化Mtb GlmM蛋白，將純化的Mtb GlmM蛋白與底物葡糖胺_6_磷酸進行孵育，Mtb GlmM蛋白使底物葡糖胺-6-磷酸轉變為產物葡糖胺-1-磷酸，而葡糖胺-1-磷酸可被檢測 出來，表明Mtb glmM基因是結核分枝桿菌磷酸葡糖胺變位酶的編碼基因。制備glmM基因敲除菌株a.由于結核分枝桿菌具有致病性且生長緩慢，直接對結核分枝桿菌基因組中的 glmM基因進行敲除極其困難，因恥垢分枝桿菌(Mycobacteriumsmegmatis)具有與結核分 枝桿菌相同的細胞壁結構、無病原性且生長速度快，因此用分子克隆技術從恥垢分枝桿菌 mc2155 菌株(購自 American Type CultureCollection, ATCC# 為 700084)的基因組中克 隆Msm glmM基因并插入卡那霉素抗性(kanK)基因，使Msm glmM基因突變以產生突變基 因 AglmM ；b.通過DNA同源重組，使突變基因Δ glmM整合到恥垢分枝桿菌mc2155菌株基因 組中，產生同時攜帶正常基因Msm glmM及突變基因Δ glmM的菌株MLl ；c.用分子克隆技術從結核分枝桿菌H37Rv菌株的基因組DNA(購自American Type Culture Collection，ATCC# 為 25618D-5)中克隆 Mtb glmM 基因，并構建 pCG-Mtb glmM 表 達載體；d.將pCG-Mtb glmM表達載體轉化到MLl菌株中，當Mtb glmM基因能夠補償MLl 菌株中Δ glmM突變基因的功能時，通過DNA同源重組方式將MLl菌株基因組中的正常基因 Msm glmM刪除，產生恥垢分枝桿菌glmM基因敲除菌株ML2009(即基因組中只有突變基因 Δ glmM存在)，用Southern印記及PCR方法檢測ML2009。glmM基因敲除菌株屬于分枝桿菌屬、恥垢分枝桿菌種，菌株代碼ML2009，拉丁文 學名Mycobacterium smegmatis,已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心 (CGMCC)保藏，菌種保藏代號CGMCC 3418，菌種保藏日期2009-11_06。pCG-Mtb glmM表達載體攜帶溫度突變型復制起點在允許溫度30°C條件下， pCG-Mtb glmM表達載體可以在分枝桿菌中復制，而在非允許溫度42°C條件下，pCG-Mtb glmM表達載體不能在分枝桿菌中復制。在30°C和42°C條件下，每間隔24小時測定ML2009 菌株在600nm處的光吸收值以獲得生長曲線，結果ML2009菌株在30°C條件下能夠生長； 而在42°C條件下，ML2009菌株停止生長而死亡。說明在30°C時pCG-Mtb glmM表達載體 上的Mtb glmM基因補償了 ML2009菌株中Δ glmM突變基因的功能；而在42°C條件下由于 pCG-Mtb glmM不能復制而導致Mtb glmM基因丟失，無法補償ML2009菌株中Δ glmM突變基 因的功能，使MJ2009菌株停止生長而死亡。將ML2009菌株在30°C條件下生長24小時后，轉入42°C條件下繼續生長3天及6 天，分別收獲細菌，制備掃描電鏡樣品，用掃描電鏡觀察ML2009菌株的細胞形態。發現隨著 在42°C條件下培養時間的延長，ML2009菌株中的glmM基因逐漸減少，ML2009菌株的細胞 形態學發生較大的改變，一部分細菌發生裂解，再次證明glmM基因是分枝桿菌生長必需基 因。篩選結核分枝桿菌磷酸葡糖胺變位酶抑制劑的方法如下e.將glmM基因敲除菌株ML2009與LB液體培養基按1 2000稀釋并充分混勻，然后分裝到96孔板中，每孔為200ul，將96個被篩選物按2 20ug/ml加入每孔培養基中， 在30°C條件下，每間隔24小時，用酶標儀測定菌株ML2009在600nm處的光吸收值；f.將所測吸光度值與反應條件同e步驟、培養基中無被篩選物時測得的glmM基因 敲除菌株ML2009在30°C條件下、600nm處的標準光吸收值對比，篩選磷酸葡糖胺變位酶抑 制劑。如檢測(5次以內)發現在600nm處的光吸收值降低，則在培養基中含有的被篩選 物是磷酸葡糖胺變位酶抑制劑，可從現有組合化合物庫、中藥及天然產物中篩選磷酸葡糖 胺變位酶抑制劑，以發現先導化合物。參考文獻1. WHO report 2006. Global tuberculosis control survei 1 lance planningfinancing, Geneva. WH0/HTM/TB/2006. 3622. Jain A. and Mondal R. Extensively drug-resistant tuberculosis currentchallenges and threats. FEMS Immunology and Medical Microbiology 2008, 53 :145-150.3. Anishetty S. , Pulimi M. and Pennathur G. Potential drug targets inMycobacterium tuberculosis through metabolic pathway analysis. ComputationalBiology and Chemistry 2005,29:368-378.4. Brennan P. J. Structure, function, and biogenesis of the cell wall ofMycobacterium tuberculosis. Tuberculosis 2003,83:91-97.5. Barry C. Ε. , Crick D. C. and McNeil M. R. Targeting the formation of the cellwall core of M. tuberculosis. Infectious Disorders-Drug Targets 2007,7: 182-202.6. Brennan P. J. and Crick D. C. The cell-wall core of Mycobacteriumtuberculosis in the context of drug discovery. Current Topics in MedicinalChemistry 2007,7(5) :475_488.7. Mengin-Lecreulx D. , and van Heijenoort J. Characterization of the essentialgene glmM encoding phosphoglucosamine mutase in Escherichia coli. Journal ofBiological Chemistry 1996,271:32—39.
權利要求
一種glmM基因敲除菌株(Mycobacterium smegmatis ML2009)，CGMCC3418。
2.一種如權利要求1所述glmM基因敲除菌株的制備方法，其特征在于按如下步驟進行a.用分子克隆技術從恥垢分枝桿菌的基因組中克隆MsmglmM基因并插入卡那霉素抗 性(kanK)基因，使Msm glmM基因突變以產生突變基因AglmM;b.通過DNA同源重組，將突變基因AglmM整合到恥垢分枝桿菌基因組中，產生同時攜 帶正常基因Msm glmM及突變基因Δ glmM的菌株MLl ；c.用分子克隆技術從結核分枝桿菌的基因組中克隆MtbglmM基因，并構建pCG-Mtb glmM表達載體；d.將pCG-MtbglmM表達載體轉化到MLl菌株中，當Mtb glmM基因能夠補償MLl菌株 中Δ glmM突變基因的功能時，通過DNA同源重組方式將MLl菌株基因組中的正常基因Msm glmM刪除，產生恥垢分枝桿菌glmM基因敲除菌株ML2009。
3.—種如權利要求1所述glmM基因敲除菌株在篩選結核分枝桿菌磷酸葡糖胺變位酶 抑制劑中的用途。
4.一種如權利要求3所述用glmM基因敲除菌株篩選結核分枝桿菌磷酸葡糖胺變位酶 抑制劑的方法，其特征在于按如下步驟進行e.將glmM基因敲除菌株ML2009按1 2000稀釋接種到含有被篩選物的LB液體培養 基中，被篩選物的濃度為2 20ug/ml，在30°C條件下，每間隔24小時，用酶標儀測定菌株 ML2009在600nm處的光吸收值；f.將所測吸光度值與反應條件同e步驟、培養基中無被篩選物時測得的glmM基因敲除 菌株ML2009在30°C條件下、600nm處的標準光吸收值對比，篩選磷酸葡糖胺變位酶抑制劑。
全文摘要
本發明公開一種以參與結核分枝桿菌細胞壁中關鍵組分生物合成的磷酸葡糖胺變位酶為對象，構建了glmM基因敲除菌株ML2009(Mycobacterium smegmatis)，CGMCC 3418，ML2009菌株可作為高通量篩選磷酸葡糖胺變位酶抑制劑的細胞模型，可從組合化合物庫、中藥及天然產物中篩選有效的磷酸葡糖胺變位酶抑制劑，制備抗結核藥物，具有高藥效性；另外，在人體細胞中，UDP-乙酰葡糖胺的合成途徑與結核分枝桿菌有所不同，不存在磷酸葡糖胺變位酶，因此結核分枝桿菌磷酸葡糖胺變位酶所催化的反應在人體細胞中不存在，以磷酸葡糖胺變位酶為靶酶所研發的抗結核藥物將對人體無害，克服了現有抗菌藥物也殺害正常細胞的缺點。
文檔編號C12R1/34GK101928691SQ20091022016
公開日2010年12月29日 申請日期2009年11月26日 優先權日2009年11月26日
發明者李爽, 辛毅, 馬郁芳 申請人:大連醫科大學