來源于玉米自交系18-599編碼多藥物及毒素外排蛋白的基因序列的制作方法

專利名稱：來源于玉米自交系18-599編碼多藥物及毒素外排蛋白的基因序列的制作方法
技術領域：
本發明屬于植物基因工程技術領域，特別涉及一種來源于玉米自交系18-599編 碼多藥物及毒素外排蛋白的基因序列。
背景技術：
酸性土壤是指pH值小于5. 5，礦質營養元素失衡的一類土壤，主要分布在熱帶、亞 熱帶以及溫帶地區的發展中國家。據統計，酸性土壤大約占全世界陸地總面積的30% ，占耕 種總面積的50%。在我國，磚紅壤、紅壤、赤紅壤這些典型的酸性土壤廣泛分布在南方十四 個省區，總面積達203萬平方公里，約占全國耕地面積的21 % 。并且隨著工業的快速發展和 人類活動的加劇，土壤酸化程度還在加劇，酸化面積還在增加。在酸性土壤上，作物的生長 發育受到抑制，導致產量降低，經濟效益下降。酸性土壤影響作物生長發育的土壤因素主要 為Al3+毒、Mn2+毒、H+毒害及礦質營養的匱乏。土壤中的鋁有多種存在形式，其中無機離子 態鋁如Al3+、 Al (0H)2+對植物根系的毒害作物最大，而其他形態的鋁則毒性較小。正常土壤 中的鋁大多呈非水溶態，通常以硅酸鹽態或氧化態存在，對植物沒有毒害作用，但在pH小 于5的酸性條件下，鋁主要以Al3+形式存在。由于Al3+的交換量占土壤陽離子交換總量的 20% -80%，酸性土壤中其他陽離子易于淋失，導致鉀、鈣、鎂、硼等營養元素的缺失及磷的 固定。因此，酸性土壤中作物生長障礙直接與Al3+升高有關，酸鋁毒害是酸性土壤上作物產 量提高的最主要限制因子，可導致作物減產40%。由于酸性耕地的生產潛力還有很大的上 升空間，因此提高酸性土壤上的農作物產量引起了廣泛的關注，成為全球上除作物抗干旱 脅迫外的第二大研究熱點。撒施石灰在一定程度上可以降低土壤的酸性，從而降低酸鋁毒 害，但這種物理措施很難在各地廣泛的普遍實施并且效果不理想。為了保障作物糧食供給， 提高單位面積的產量，充分發揮現有耕地的生產潛力，克隆新的抗酸鋁基因，培育新的作物 轉基因抗酸鋁自交系和進行遺傳改良已成為農作物育種的重中之重，也是開發利用酸性土 壤的最有希望的辦法。 作物抗酸鋁毒害的機制主要有兩種促進根系Al3+的外排或忍耐Al3+在根系和植 株地上部位的積累。但迄今為止，大多數的實驗證據表明Al3+的外排與Al3+激活的有機酸 (organic acid，0A)從植物根際細胞壁和共質體的外排有關。并且有證據表明共質體內鋁 毒解除機制也與Al3+和OA螯合形成復合體有關。經遺傳學和生理學研究發現，許多作物基 因型差異所導致的抗酸鋁能力差異的機制之一是由于抗酸鋁能力強的品系根系頂端能外 排一種或多種有機陰離子(通常為蘋果酸或檸檬酸的陰離子)，而這些有機陰離子能迅速 螯合根系附近的Al3+或者根系質外體的Al3+。不同植物種類分泌不同的0A，玉米主要分泌 檸檬酸和蘋果酸，豆科植物主要分泌檸檬酸，小麥主要分泌蘋果酸、煙草和番木瓜分泌檸檬 酸，蕎麥和芋頭主要分泌草酸。不同種類的有機酸解除Al3+毒害的能力也不同，檸檬酸的能 力最強，其螯合Al3+的能力是蘋果酸的6-8倍，其次為草酸和蘋果酸。 目前發現的抗酸鋁基因主要有兩類，Al3+激活的蘋果酸轉運子(Al3+ -activatedmalate transportor, ALMT)家族禾口多禾中毒素及藥物夕卜排(multi—drug and toxin extrusion,MATE)家族的膜蛋白。盡管這些蛋白家族的成員存在核苷酸序列和蛋白結構的 差異，但都是通過改善有機離子外排的方式提高對酸鋁毒害的抗性。 ALMT蛋白具有一個功能未知的蛋白家族5結構域(uncharacterisedprotein family five domain, UPF0005)，并且所有成員具有極度保守的19個氨基酸。這些蛋白的 氨基末端比較保守，但羧基末端分化比較大。雖然在多種植物(包括小麥、玉米、水稻、大 麥、黑麥、蕎麥、黑小麥、油菜、擬南芥、苜蓿)中都展開了抗酸鋁脅迫研究，并首先克隆了小 麥的TaALMTl(4i3+ -activated邁alate transporter)基因，隨后通過同源序列比對等方 法，在玉米、水稻、油菜、擬南芥、黑麥等植物中陸續發現了 TaALMTl基因的直向同源物。
MATE基因編碼有機離子轉運蛋白，MATE蛋白在擬南芥中屬于一個具有58成員的 家族，最先發現這種蛋白能通過向外運輸毒素而起到抗菌作用。高粱的SbMATE是經圖位克 隆的一個MATE家族的抗鋁毒基因，在擬南芥中過量表達時能引起A1"激活的檸檬酸外排和 抗鋁毒能力的增加。此外，還通過同源克隆方法克隆了大麥的HvAACTl基因，并在小麥分離 群體中，通過定位發現一個新的抗鋁毒位點4BL Xce。與檸檬酸分泌有關。
由此可見，分泌蘋果酸和檸檬酸是植物拮抗酸鋁脅迫的兩種重要手段，ALMT和 MATE這兩個蛋白家族部分成員作為A1"誘導的離子通道蛋白能特異性地或選擇性地排出 蘋果酸和檸檬酸等有機酸離子到質外體或共質體，而另外一些成員則能促進有機酸離子到 根際的運輸，進而螯合根際Al3+或通過離子平衡而起到拮抗鋁毒作用。由于這些抗酸鋁基 因的表達水平與有機酸的分泌及抗酸鋁能力呈正相關，因此可通過基因工程的手段把這些 候選基因用于提高酸性土壤農作物的抗酸鋁能力。由于檸檬酸螯合Al3+的能力比蘋果酸 強，因此利用MATE類的基因可能培育出很強的抗鋁毒品種。 目前，編碼多藥物及毒素外排蛋白抗酸鋁基因只從高粱和大麥中克隆得到，因而 在用于基因工程轉化時存在抗酸鋁遺傳基礎狹窄，抗性較差，并且由于這些基因都已申請 專利，使用時具有很大的局限性，難以在我國推廣使用。18-599是四川農業大學玉米研究所 自主選育的產量高、配合力高、抗逆性較強的骨干自交系，在西南地區的雜交制種中得到了 廣泛應用。

發明內容
本發明的主要目的就是根據上述編碼多藥物及毒素外排蛋白抗酸鋁基因來源有 限、存在抗酸鋁遺傳基礎狹窄、抗性較差、推廣使用具有很大局限性等問題，提供一種從糧 食作物玉米自交系18-599中得到的編碼多藥物及毒素外排蛋白的基因序列，以克服多藥 物及毒素外排蛋白的基因的物種局限性和在我國推廣使用的局限性，并且具有相對良好的 安全性，推廣使用時更容易被人們接受。 為了實現上述發明目的，本發明采用的技術方案如下 來源于玉米自交系18-599編碼多藥物及毒素外排蛋白的基因序列，該序列具有
如SEQ ID NO. 1所述的cDNA序列。 其所對應的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所述。 上述來源于玉米自交系18-599編碼多藥物及毒素外排蛋白的基因序列，可通過 包括下述主要步驟的方法克隆得到
(1)、提取總RNA:取玉米自交系18-599的發芽7天的水培幼苗，用pH 4. 0的A1K (S04) 2. 2H20處理 24小時，然后取根尖部位，用Trizol (Takara公司)提取得到總RNA ;
(2)、合成cDNA第一鏈 以步驟(1)提取得到的總RNA為模板，使用引物為oligo(dT)10和六聚體隨機引 物，利用Takara公司的PrimeScriptTM RT reagent Kit反轉錄試劑盒進行反轉錄合成得到 cDNA第一鏈； 反應體系及反應條件為5Xbuffer 2ul;RT enzyme mix 0. 5 u 1 ;oligodt 0. 5 ii 1 ;random60. 5 ii 1 ;總RNA 500ng ;H20定容到10 ii 1 ;37。C反應15min，80。C處理5min 滅活反轉錄酶的活性；
(3) 、 PCR擴增得到cDNA全長 以步驟(2)得到的cDNA為模板，利用下述基因特異性引物ZmMATE OX F和引物 ZmMATE OX R : ZmMATE OX F:GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTAAATGGCAGAATGCGTG，
ZmMATE OX R:GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTATCAGTTCCGGAGAAAC ;
通過PCR擴增得到目的cDNA片段； PCR的反應體系為IOXKOD buffer 5 ii 1 ;25mM MgS04 3 ii 1 ;dNTP (各2mM) 5 ii 1 ; cDNA模板2 ii 1 (40ng);引物ZmMATE OX F (10 ii M)和ZmMATE OXR (10 ii M)各1. 5 ii 1 ;KOD DNA聚合酶1 ii 1 (Toyobo公司)；H20 31 ii 1 ; PCR反應程序95。C預變性2分鐘；95。C變性30秒；56。C退火30秒；70。C延伸50 秒；共35個循環。 將得到的目的cDNA片段回收、克隆入pD0NR207 (invotrgen公司)，即可測序得到 該片段的序列。 與現有技術相比，本發明的有益效果是 本發明克服了多藥物及毒素外排蛋白的基因的物種局限性和在我國推廣使用的 局限性。同時由于這個基因來源于人們的主要作物——玉米，具有相對良好的安全性，因此 轉基因作物推廣使用時更容易被人們接受。


圖1為玉米根尖中提取得到的總RNA瓊脂糖凝膠電泳檢測結果； 圖2為根據玉米根尖總RNA合成、并進一步擴增得到ZmMATE基因的cDNA瓊脂糖
凝膠電泳檢測結果； 圖3為鋁離子誘導ZmMATE基因的表達瓊脂糖凝膠電泳檢測結果；
圖4為植物表達載體pMDC32-MATE的結構示意圖； 圖5為酸鋁毒害條件下野生型和轉ZmMATE基因的擬南芥根系生長發育情況(T23 為轉ZmMATE基因株系，Col-O為野生型株系)； 圖6為酸鋁毒害條件下野生型和轉ZmMATE基因的擬南芥根系長度變化； 圖7為酸鋁毒害條件下野生型和轉ZmMATE基因的擬南芥根系擰檬酸的分泌情況。
具體實施例方式
下面結合具體實施方式
對本發明的上述發明內容作進一步的詳細描述。 但不應將此理解為本發明上述主題的范圍僅限于下述實施例。在不脫離本發明上
述技術思想情況下，根據本領域普通技術知識和慣用手段，做出各種替換和變更，均應包括
在本發明的范圍內。 實施例1 本實施例為玉米幼苗總RNA的提取
1. RNA的提取，方法如下 (1)取玉米自交系18-599的發芽7天的水培幼苗，用pH 4. 0的 30 ii MA1K(S04)2. 21120處理24h后取根尖1cm部位共lOOmg，加液氮研磨后用Trizol (Takara 公司)提取總RNA ; (2)加入1ml Trizol提取液，充分混勻后，加入200 yl氯仿，混勻后靜置5分鐘， 4°C ， 12000rpm離心10分鐘； (3)取上清液，加入等體積的異丙醇，顛倒混勻后，4°C ， 12000rpm離心10分鐘； (4)棄上清液，沉淀用70%的無水乙醇洗，4°C ， 12000rpm離心5分鐘； (5)重復步驟3和4，所得沉淀即為RNA ; (6)將RNA干燥后，用50 的DEPC處理水溶解。 2.基因組DNA的去除 (1)將20-50iig RNA溶于水中，力口入lOXDnase buffer 5iil，5u/iil RNAfree DNase 2iil，40u/iil RNase Inhibi tor 0.5iil，力QRNA free H20至50 ii 1， 37 °C處理 25min，去除基因組DNA的污染； (2)酚氯仿異戊醇(25 : 24 : 1)抽提一次，取上清液，加入1/10V的3麗aAc， 用兩倍體積無水乙醇沉淀RNA，70X乙醇洗一次，自然干燥后溶于20iU水中即得到總RNA 產物； (3) RNA質量檢測用分光光度計測定RNA含量和質量質量好的RNA其OD26。/OD28。比值在2. 0左右， 按照RNA含量調整為500ng進行反轉錄。
3.試驗結果 采用瓊脂糖凝膠電泳鑒定總RNA產物的結果見圖1，圖中可見明顯的RNA條帶。
實施例2 本實施例為本發明ZmMATE基因cDNA的克隆 1.試驗方法 (l)cDNA第一條鏈的合成 以實施例l得到的RNA為模板，使用引物為oligo(dT)lO和六聚體隨機引物，利用
Takara公司的PrimeScript RT reagent Kit反轉錄試劑盒合成cDNA第一條鏈； 反應體系及反應條件為5Xbuffer 2ul;RT enzyme mix 0. 5 u 1 ;oligodt
0. 5 ii 1 ;random60. 5 ii 1 ;總RNA 500ng ;H20定容到10 ii 1 ; 37"反應15min，8(TC處理5min滅活反轉錄酶的活性。 (2)雙鏈cDNA的合成
6
利用同源比對得到的序列信息設計ZmMATE基因特異性引物如下
ZmMATE OX F :GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTAAATGGCAGAATGCGTG，
ZmMATE OX R :GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGG GTATCAGTTCCGGAGAA AC);
通過PCR擴增得到目的cDNA片段； PCR的反應體系為IOXKOD buffer 5 ii 1 ;25mM MgS04 3 ii 1 ;dNTP (各2mM) 5 ii 1 ; cDNA模板2 ii 1 (40ng);引物ZmMATE OX F (10 ii M)和ZmMATE OXR (10 ii M)各1. 5 ii 1 ;KOD DNA聚合酶1 ii 1 (Toyobo公司)；H20 31 ii 1 ; PCR反應程序95。C預變性2分鐘；95。C變性30秒；56。C退火30秒；70。C延伸50
秒；共35個循環。 2.試驗結果 采用瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物為一條約2000bp的片段(見圖2);將該片段回收后克隆入pD0NR207 (invitrogen公司)，測序得到該片段的cDNA序
列，如SEQ ID NO. 1所述。 實施例3 本實施例為用酸性溶液中Al3+的處理玉米18-599幼苗后檢測編碼多藥物及毒素
外排蛋白基因ZmMATE的表達情況( — )試驗方法 1.植物樣品的處理和RNA提取取玉米自交系18-599的發芽7天的水培幼苗，用pH 4. 0的30 y MA1K (S04) 2. 2H20 分別處理0、12、24小時后取根尖部位，用Trizol (Takara公司)提取總RNA。
2. cDNA的合成及轉錄 以實施例1得到的RNA為模板，使用引物oligo(dT) 10和六聚體隨即引物，利用
Takara公司的反轉錄試劑盒PrimeScriptTM RT reagent Kit進行反轉錄合成cDNA第一鏈。 再利用ZmMATE基因特異性引物ZmMATE rt F(gacaggcggtgcttgcaagc)和引物
ZmMATE rt R(gcgcagaaaggtacagcagg)(擴增本發明基因的部分片段)， 以及作為內參的ACTIN基因的特異引物ACT rt F(GCATCACACCTTCTACAACGA)和
ACT rt R(CAGCCTGGATAGCAACATACAT); 通過PCR擴增分別得到大約400bp的cDNA片段。 PCR的反應體系為10XrTaq buffer 5 ii 1 ;dNTP (各2mM) 5 ii 1 ;玉米cDNA模板 2iil(40ng);引物ZmMATE rt F(或ACT rt F) (10 ii M) 、 ZmMATErt R(或ACT rt R) (lOMm) 各1. 5ii 1 ;rTaq DNA聚合酶1 ii 1 ;H20 31 ii 1。 PCR反應程序94。C預變性5分鐘；94。C變性30秒；56。C退火30秒；72。C延伸30 秒；共35個循環。 在以ACTIN作內參基因的情況下，獲得ZmMATE基因受鋁離子誘導表達及表達強度
與誘導時間的關系。
( 二 )試驗結果 采用瓊脂糖凝膠電泳檢測用鋁離子誘導Oh時ZmMATE基因不表達；誘導12h和24h 后，ZmMATE基因被誘導表達，且表達強度在處理24h時達到最高，得到ZmMATE基因約400bp 的擴增產物和ACTIN基因片段。而在沒有鋁離子誘導時，ZmMATE基因不表達，說明ZmMATE基因表達受鋁離子的誘導，且表達強度在一定范圍內隨著鋁離子處理時間的延長而增加(見 圖3)。 實施例4 本實施例為植物表達載體pMDC32-MATE的構建及在擬南芥中的轉化
( — )試驗方法 1.植物表達載體pMDC32-MATE的構建
利用下述基因特異性引物ZmMATE 0X F:GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTAAAT GGCAGAATGCGTG，ZmMATE OX R:GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTATCAGTTCCGGAGAAAC ; 進行PCR擴增，得到ZmMATE DNA片段，通過BP反應連接到Gateway系統的
pD0NR207上，構建成入門載體pD0NR207-MATE-0X。BP反應體系為ZmMATE PCR產物3 ii 1 ， pD0NR207 (150ng/ ii 1) 0. 5 ii 1 ， TE 0. 5 ii 1 ，
BP Clonase II enzyme mix 1 ii 1， 25。C連接2小時。 轉化挑單菌落測序分析無突變，然后將入門載體pD0NR207-MATE-0X與目標載體 pMDC32通過LR反應，生成植物表達載體pMDC32-MATE。LR反應體系為pD0NR207-MATE-0X(150ng/ii 1， pMDC32(150 iig/
ii 1)0. 5ii 1， TE 2. 5ii 1， LR Clonase II enzyme mix 1 ii 1，25。C連接2小時。
2. pMDC32-MATE載體通過花序浸泡法轉化擬南芥 將pMDC32-MATE載體轉入農桿菌菌株GV3101，檢測正確后用于擬南芥的花序浸泡 轉化。擬南芥Col-0種植在1/2MS培養基上，16h光照/8小時黑暗，23°C的條件下培養30d， 將攜帶pMDC32-MATE載體的農桿菌(0D6。。 = 0. 8) 150ml離心后用含有0. 1 % Silwet L-77 的5%蔗糖懸浮，浸泡擬南芥花莖lmin，然后將其用塑料薄膜覆蓋24h，隨后去掉薄膜在正 常條件培養30d左右，收取T。代種子。用20mg/l的潮霉素篩選T。代，抗性植株結實得到L 代種子，進一步篩選鑒定得到純合的T2代轉基因種子用于根系抗酸鋁的敏感性檢測。
( 二 )試驗結果 通過Gateway系統的BP和LR反應，將ZmMATE基因的cDNA片段連接到植物表達 載體pMDC32上(見圖4)。通過花序浸泡法得到過量表達ZmMATE基因的擬南芥轉基因植 株，并通過潮霉素篩選得到純合的T2代種子。
實施例5 本實施例為檢測過量表達ZmMATE基因的擬南芥轉基因株系的根系發育狀況，確 定ZmMATE基因的抗酸鋁功能。
( — )實驗方法 純合的擬南芥T2代種子在培養皿中培養10天后，將擬南芥幼苗轉移至pH值為4. 7 的MS培養基，并分別添加2iiM和6.0iiM A1C13。每個培養皿10棵擬南芥，每2天更換一 次培養基，共處理7天。根系長度用掃描儀掃描后，用ImageJ軟件進行測量，檢測ZmMATE 基因在擬南芥根系生長發育過程中對酸鋁毒害反應的關系。
(二)實驗結果 用2iiM和4. OiiM A1C13處理3個轉基因株系T5、T12和T237d后，發現野生型擬 南芥的根系生長明顯受到抑制(約50% )(見圖6)，而轉基因株系T5和T23的根系發育受
8抑制較小，根系較長；尤其在用2 M鋁離子處理時，T23根系長度與野生型Col-0對比明顯 (見圖5)。說明轉化ZmMATE基因的擬南芥根系對酸鋁的反應敏感性降低，抗酸鋁毒害的能 力增強，能保持正常的生長發育。
實施例6 本實施例為收集轉基因擬南芥株系T23根系分泌物，通過酶法檢測檸檬酸的含
( — )試驗方法 生長10d的擬南芥根系浸在0. 5mM CaCl2(pH4. 5)溶液中處理過夜，隨后取出將其 根系浸在含有50mM AICIJ勺O. 5mM CaCl2(pH4. 5)中處理24h。最后收集的根系處理液先 后用陽離子交換樹脂(16X14mm) (5g酸性AmberlitelR-120B resin填充)和陽離子交換 樹脂(16X 14mm) (2g AG 138resin(100 200目；甲酸形式)填充)收集。陽離子交換樹脂 用2N HC1洗脫，然后離心干燥(4(TC干燥)。收集物用lmL超純水溶解，然后用酶法檢測根 系分泌物中檸檬酸的含量(Delhaize et al. ，1993)。
(二)試驗結果 用鋁離子處理根系24h后收集轉基因擬南芥的根系分泌物，然后將根系分泌物分 別用酸性和甲酸形式陽離子交換柱回收，隨后洗脫溶解于水中用酶法檢測。轉基因株系T23 的檸檬酸分泌量明顯高于野生型擬南芥，說明ZmMATE基因能通過促進檸檬酸的分泌提高 轉基因的抗酸鋁毒害能力(見圖7)。 試驗結論實施例3中ZmMATE基因受鋁離子誘導表達；實施例4、5和6中構建 ZmMATE基因的過量表達載體將其在擬南芥中過量表達后，轉基因擬南芥根系的發育受到的
抑制較小，根系長度隨鋁離子濃度的升高而減少；轉基因擬南芥根系檸檬酸的分泌量也比
野生型Col-0有所增加，這些實驗結果說明ZmMATE基因的表達受鋁離子誘導；ZmMATE基因
在擬南芥中過量表達時能部分拮抗酸鋁毒害對擬南芥根系發育的抑制，并且ZmMATE基因
這種拮抗酸鋁毒害的作用很可能是通過促進根系檸檬酸的分泌而實現。 序列表 〈110〉四川農業大學 〈120〉來源于玉米自交系18-599編碼多藥物及毒素外排蛋白的基因序列
〈160>2
〈210>1
〈211>1662
〈212>DNA 〈213〉來源于玉米自交系18-599編碼多藥物及毒素外排蛋白的基因cDNA序列
〈400〉 1 atggaggaca acggtgccgc cgccgccgcc gccgctcccg cgacgagcat gcctgccgag 60
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9
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〈400>2Met Glu Asp Asp Gly Ala Ala AlaAla Ala Ala Ala ProAla Thr Ser151015Met Pro Ala Glu Lys Arg Val AlaVal lie Gin Gly AspAla Pro Pro202530Glu Pro Ala Ala Gly Leu Leu ProCys Gly Pro Arg LysThr Gly Leu354045His Leu Phe Val Met Asp lie ArgSer Val Phe Lys LeuAsp Gly Leu505560Gly Ser Glu Val Leu Arg lie AlaVal Pro Ala Ser LeuAla Leu Ala65707580Ala Asp Pro Leu Ala Ser Leu ValAsp Thr Ala Phe lieGly Arg Leu859095
10
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1權利要求
來源于玉米自交系18-599編碼多藥物及毒素外排蛋白的基因序列，該序列具有如SEQ ID NO.1所述的cDNA序列。
2. 根據權利要求1所述的序列，其特征在于所述的cDNA序列對應的氨基酸序列如 SEQ ID NO. 2所述。
全文摘要
本發明公開了一種來源于玉米自交系18-599編碼多藥物及毒素外排蛋白的基因序列，該序列具有如SEQ ID NO.1所述的cDNA序列。該序列克服了多藥物及毒素外排蛋白的基因的物種局限性和在我國推廣使用的局限性；同時由于這個基因來源于人們的主要作物——玉米，具有相對良好的安全性，因此轉基因作物推廣使用時更容易被人們接受。
文檔編號C12N15/10GK101760465SQ20091021628
公開日2010年6月30日 申請日期2009年11月23日 優先權日2009年11月23日
發明者張素芝, 榮廷昭 申請人:四川農業大學