專利名稱：小鼠卵母細胞體外成熟培養方法及孤雌胚胎干細胞系的建立方法
技術領域：
本發明涉及胚胎干細胞系技術領域，具體涉及一種小鼠卵母細胞體外成熟培養方
法及孤雌胚胎干細胞系的建立方法。
背景技術：
在缺少雄性配子基因組的情況下直接激活M II期卵子能夠形成孤雌囊胚，從這個 孤雌囊胚中可以分離得到孤雌胚胎干細胞。孤雌胚胎干細胞具有一般受精胚來源的胚胎干 細胞的一般特征。 目前建立的胚胎干細胞株主要來源于囊胚，囊胚的內細胞團的分離非常重要。分 離囊胚內細胞群的方法主要有免疫外科法和機械法，在胚胎內細胞團(ICM)分離過程中選 擇一種對ICM細胞繼續增殖能力損傷最小的方法有助于提高原代克隆的質量。目前比較常 用的方法是免疫外科法，該法主要應用于高質量的囊胚ICM分離。2004年AmitAmit，M.， et al. ， Feeder layer_andserum_free culture of human embryonic stem cells.Biol R印rod， 2004. 70 (3) :p. 837-45.首次報道了通過機械法分離ICM建立人ES細胞系，這種 方法對ICM的損傷較少。 生殖系轉移作為檢驗胚胎干細胞多能性的金標準即將干細胞注入不同品系的小 鼠囊胚內產生嵌合體小鼠，并檢測其生殖系轉移能力。 將孤雌胚胎干細胞注射進囊胚腔，移植后產生嵌合體鼠。通過對嵌合體鼠組織中 孤雌細胞的分化研究發現，孤雌胚胎干細胞較廣泛地參與各個臟器的形成，但與受精胚來 源的胚胎干細胞相比，孤雌胚胎干細胞在大多數嵌合組織中的參與度較低，某些組織如骨 骼肌其嵌合度極低。雖然孤雌胚胎干細胞不僅具有與供體相同的免疫原性而且它的制造能 夠為社會倫理所接受，但是其較低的發育能力限制了將來的臨床應用，孤雌胚胎干細胞生 殖系轉移效率不到10%，遠遠低于正常胚胎干細胞生殖系轉移效率40 100%。
將未成熟期(GV期)的卵細胞在體外進行成熟培養至體外成熟期(M II期)也可 以用來進行后續的孤雌胚胎干細胞系的建立，目前，大多數未成熟卵體外成熟培養配方較 復雜，試劑價格昂貴，且培養的效果不理想，常存在發育潛能差，卵子的紡錘體和極體異常 等問題。
發明內容
本發明的目的在于針對現有技術中存在的未成熟卵體外成熟培養的配方成本高、 成分復雜且卵子成熟低等不足，提供一種配方簡單有效且卵子成熟率達到83%以上的小鼠 卵母細胞體外成熟培養方法。 本發明的另一個目的在于提供一種根據上述由未成熟卵體外成熟培養得到的成
熟卵孤雌激活從而建立孤雌胚胎干細胞系的方法。 本發明的上述目的是通過如下方案予以實現的
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—種小鼠卵母細胞體外成熟培養方法，該方法是從小鼠卵巢中取出未成熟卵，在
未成熟卵培養液中培養15 16個小時，制備得到小鼠成熟卵母細胞。 上述未成熟卵培養液的配方為95體積％ MEM培養基，5體積％胎牛血清，0. 24mM
丙酮酸鈉，1.5單位/ml人絨毛膜促性腺激素(HGG)，l單位/ml孕馬血清促性腺激素
(PMSG);所述MEM培養基和胎牛血清均可采用市場上均有銷售的成品。 上述培養方法中， 一般選擇從小鼠卵巢中取處于GV期的卵丘_卵母細胞復合體。 上述培養方法中，培養15 16小時后，可采用透明質酸酶消化吹打去除卵丘細
胞，然后再用HKS0M洗3 4次終止透明質酸酶的消化作用；這一步可以去除卵丘顆粒細
胞，為下步孤雌激活做準備；所述HKS0M為添加H印es的KS0M培養液。 上述培養方法中，將未成熟卵在未成熟卵培養液中培養15 16個小時，可采用本
領域技術人員進行卵細胞培養時的常規操作，如微滴法培養。 為克服以往分離胚胎干細胞方法的不足，并結合未成熟卵來源的孤雌胚胎的特 點，本發明還針對上述未成熟卵體外成熟培養后得到的成熟卵細胞，提供了一套新的孤雌 胚胎干細胞系的建立方法，該方法包括如下步驟 (1)將上述體外培養成熟的小鼠卵子在Ca" free KS0M培養基中孤雌激活后，然 后將其移至KS0M培養基中培養，胚胎發育成囊胚； (2)將上述孤雌激活發育的囊胚移入經絲裂霉素處理的飼養層細胞上進行培養；
(3)挑取飼養層上克隆中央致密的細胞團進行機械傳代，酶傳擴增，從而得到孤雌 胚胎干細胞系。 上述步驟(1)中，所述KSOM培養基為市售成品，所述Ca" free KSOM培養基為市 售成品。 上述步驟(1)中，體外培養成熟的小鼠卵子在Ca" free KSOM培養基中孤雌激活， 通常激活需要3 5個小時就可以，然后移至KS0M中培養，通常培養約24小時就要開始觀 察成熟卵激活發育情況，孤雌激活的卵子發育為2細胞；培養96小時就可以觀察到成熟卵 發育成囊胚。 對胚胎干細胞的分離，本領域技術人員的常規操作是采用絲裂霉素處理的成纖細 胞來分離胚胎干細胞，因此上述步驟(2)中，所述絲裂霉素處理的飼養層細胞，也可以是采 用絲裂霉素處理的成纖細胞作為飼養層細胞，用來分離本發明的孤雌激活胚胎干細胞，將 孤雌激活發育的囊胚移入絲裂霉素處理的飼養層上進行培養分離，可以采用本領域常用的 培養液，也可以采用如下培養液配方Knockout DMEM(市售)為基礎液，Knockout血清替代 品(KSR，市售)、1000IU/ml白血病抑制因子、lmM L-谷氨酰氨(市售)、0. lmM MEM非必需 氨基酸(市售)、0. lmM 13 -巰基乙醇(市售)、50IU/ml青霉素和50IU/ml鏈霉素。均能實 現本發明。 上述步驟(3)中，挑取飼養層上克隆中央致密的細胞團，采用機械傳代方法，機械 分散呈多塊，將分散的細胞團重新再次接種到新的經絲裂霉素處理的飼養層細胞上再次培 養生長，這一步所用的試劑及操作同步驟(2)。 上述步驟(3)中，傳統方法一般是在培養第五天左右挑克隆，并大多為酶傳，本發 明這里采用培養8 12天(也就是其囊胚生長第十天左右)挑取克隆，先是機械傳代2 3代，再轉為酶傳，從而獲得孤雌胚胎干細胞系。
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與現有技術相比，本發明具有如下有益效果 1.本發明的未成熟卵培養液主要是在基礎培養液中加入了兩種簡單而有效的激 素(HGG和PMSG)，并且兩種激素的用量合適，但并未添加其它作用機理還存有爭議的激素， 如E2、孕激素等； 2.本發明的孤雌胚胎干細胞系的建立是采用從小鼠卵巢分離未成熟卵進行體外 成熟培養后再進行孤雌激活胚胎干細胞系建立的，該方法能得到無免疫原性的干細胞系， 同時在全能性上又與受精胚胎來源的干細胞相當，對利用人的未成熟卵體外成熟并分離孤 雌胚胎干細胞具有指導意義； 3.本發明的小鼠未成熟卵體外成熟培養液配方，不但成分簡單成本低廉，而且此 配方培養液用于小鼠未成熟卵體外成熟培養，其成熟率達到83%以上，通過該配方體外培 養成熟的卵子可以作為實驗材料，進一步進行卵子的體外受精，卵子的孤雌激活及胚胎干 細胞的分離等研究； 4.針對當前人卵子捐贈不足，輔助生殖臨床未成熟卵大量廢棄等情況，本發明的 小鼠卵母細胞體外成熟培養方法及孤雌胚胎干細胞系的建立方法，為開發利用人的未成熟 卵體外成熟培養、利用體外成熟的卵子進一步研究孤雌胚胎及用于胚胎干細胞的分離奠定 ^石出； 5.傳統分離干細胞方法中培養液中用胎牛血清，每一批次血清存在差異，其成分 復雜，且含許多細胞生長因子，但同時也含大量促細胞分化因子，使干細胞分離效率低，而 本發明的方法在用囊胚內細胞團原代培養中，一般在第io天左右，內細胞團生長明顯突 出，此時用酶傳或機械傳，并且用替代血清，從而得到穩定的干細胞系。
圖1為實施例1中小鼠未成熟卵孤雌激活發育的胚胎光鏡圖；其中，1是小鼠PMSG 42 46小時后收集卵丘復合體(C0C) ，2是體外培養15小時
后的卵丘復合體(C0C) ，3是體外培養15小時后去除顆粒細胞的卵子，4是孤雌激活的2細
胞胚胎，5是孤雌激活的囊胚，6是對照組體內成熟卵孤雌激活的囊胚； 圖2為含FBS或KSR的干細胞培養液分離培養的干細胞光鏡圖； 其中，l為采用含FBS的干細胞培養液原代培養的內細胞團第10天的生長形態，2
為采用含FBS的干細胞培養液機械傳代后生長的克隆，3為采用含FBS的干細胞培養液經
0. 25%胰酶傳代生長的克隆，4為采用含KSR的干細胞培養液原代培養的內細胞團第10天
的生長形態，5為采用含KSR的干細胞培養液機械傳代后生長的克隆，6為采用含KSR的干
細胞培養液經0. 25%胰酶傳代生長的克隆； 圖3為實施例2制備所得胚胎干細胞和受精卵來源的胚胎干細胞的克隆形態及核 型分析對比光鏡圖； 其中，1為受精卵來源的胚胎干細胞的克隆形態，2為實施例2制備所得胚胎干細 胞的克隆形態，3為受精卵來源的胚胎干細胞的核型，4為實施例2制備所得胚胎干細胞的 核型； 圖4為實施例2制備所得胚胎干細胞和受精卵來源的胚胎干細胞的分子生物學特 性免疫熒光染色 其中，1為受精卵來源的胚胎干細胞的0CT-4陽性克隆，2為實施例2制備所得胚
胎干細胞的0CT-4陽性克隆，3為受精卵來源的胚胎干細胞的SSEA-1陽性克隆，4為實施例
2制備所得胚胎干細胞的SSEA-1陽性克隆，5為受精卵來源的胚胎干細胞的AKP活性陽性
克隆，6為實施例2制備所得胚胎干細胞的AKP活性陽性克隆； 圖5為實施例2制備所得胚胎干細胞體外分化免疫熒光染色圖； 其中，1和4為GFAP抗體(外胚層)免疫熒光染色，2和5為免疫熒光染色，MF20
抗體(中胚層)，3和6為AFP抗體(內胚層)免疫熒光染色； 圖6為1116pES p6和1114pES p13分化的畸胎瘤組織切片(HE染色)圖；
其中，l為1116pES p6分化的畸胎瘤，2為1114pES p13分化的畸胎瘤，3為MEF陰 性對照，4、5和6為1116pES p6分化的畸胎瘤組織切片，4為神經組織(外胚層)，5為肌肉 (中胚層)，6為腺體(內胚層)，7、8和9為1114pESpl3分化的畸胎瘤組織切片，7為神經 管(外胚層)，8為軟骨(中胚層)，；9為纖毛柱狀上皮(內胚層)；
圖7為嵌合體小鼠和生殖系轉移的后代； 其中，1為未成熟卵孤雌胚胎干細胞的嵌合體，2為未成熟卵孤雌胚胎肝細胞的嵌 合體所產生的生殖系轉移后代；3為受精卵來源的胚胎干細胞的嵌合體，4為受精卵來源的 胚胎干細胞的嵌合體的生殖系轉移后代。
具體實施例方式
下面結合具體實施例對本發明做進一步地描述，但具體實施例并不對本發明做任 何限定。 實施例l小鼠未成熟卵的收集和體外成熟培養 首先按照配方配制小鼠未成熟卵培養液95體積％ MEM(購自Invitrogen) ， 5體 積％胎牛血清(購自Hyclone)，O. 24mM丙酮酸鈉(購自sigma) ， 1. 5units/mlHGG (購自 sigma) ， lunit/ml PMSG(購自sigma)。 按照5IU/只的劑量給雌性小鼠注射孕馬血清促性腺激素(PMSG)，待42 46小時 后將小鼠斷脊椎處死，取出小鼠卵巢置于含20mM HEPES(HEPES是本領域常用的培養基，市 售)的未成熟卵培養液中，用小號針頭將卵巢中卵泡內的卵丘_卵母細胞復合體取出，在顯 微鏡下觀察確認為GV期卵子，放入事先預熱(> 1小時)的未成熟卵培養液中培養，培養 方法采用本領域常規的微滴法培養，每滴100微升，每滴約放十多個卵丘復合體。
培養約15 16個小時后，用透明質酸酶中將顆粒細胞(卵丘細胞)去除，然后將 小鼠卵母細胞移至HKS0M中洗3 4次終止透明質酸酶的消化作用，從而完成小鼠未成熟 卵的體外成熟培養，觀察卵子成熟情況，如圖1所示。
實施例2孤雌胚胎干細胞的分離
本實施例的KSOM培養基為市售。 將上述實施例1中體外培養成熟的小鼠卵子移至事先預熱(> 1小時)Ca2+ -free KSOM培養基中激活4小時，然后移至KSOM培養基中培養，約24小時觀察卵子激活發育情 況，培養96小時后可觀察到卵子發育形成囊胚，將囊胚移入絲裂霉素處理的飼養層成纖細 胞的四孔板上，每孔大約IO個囊胚，此處采用的培養液配方為以Knockout DMEM(購自 Invitrogen)作為基礎液，Knockout血清替代品(KSR，購自Invitrogen) ， 1000IU/ml白血病抑制因子、lmM L-谷氨酰氨(購自Invitrogen)、0. ImM MEM非必需氨基酸(購自Sigma)、
0. ImM P -巰基乙醇(購自Sigma) 、50IU/ml青霉素和50IU/ml鏈霉素。 從培養第二天開始，每天將培養液半量更換新的培養液，當囊胚培養到第10天
時，進行機械傳代，機械傳代時挑取克隆中央致密的細胞團，機械分散呈多塊，將分散的細
胞團再次接種到絲裂霉素處理的飼養層成纖細胞的四孔板上，這里的操作同前，每天半量
換培養液(培養液也同前)，3 5天機械傳代一次，機械傳代3次后轉為酶傳代，酶傳代采
用0. 25%的胰酶進行傳代，從而得到小鼠孤雌胚胎干細胞系。 本實施例中機械傳代、酶傳代均采用本領域的常規操作。 本實施例同時還采用KSR替換FBS作為干細胞培養液進行一組平行試驗，然后對
比FBS和KSR的不同，所分離培養的干細胞有何不同，結果如圖1所示。 圖2中，1 3是采用含FBS的干細胞培養液分離培養的干細胞，4 6是采用含
KSR的干細胞培養液分離培養的干細胞；1和4是原代培養的內細胞團第10天的生長形
態。由圖中可以看出，l中細胞核不清晰，周圍滋養外胚層細胞生長，而4中克隆明顯，邊界
清楚，細胞核明顯；2和5是機械傳代后生長的克隆，由圖中可以看出2中的細胞克隆相對5
中的細胞克隆顯得更加扁平；3和6是經0. 25%胰酶傳代生長的克隆。 由圖2中可以看出添加FBS和KSR的培養液都能分離未成熟卵孤雌干細胞；但用
KSR的原代克隆典型，機械傳代穩定，酶傳亦可得到穩定的干細胞系。而應用FBS的原代克
隆有部分分化細胞，傳代效率明顯低于應用KSR。 實施例3小鼠孤雌胚胎干細胞系的多能性研究 觀察實施例2得到的小鼠孤雌胚胎干細胞和受精卵來源的干細胞，可以發現雖然 實施例2的胚胎干細胞是通過未成熟卵在體外成熟培養后再孤雌激活發育的，但是其和受 精卵來源的干細胞在形態以及生長速度上并無差異，核型分析也都顯示為正常的40條，如 圖3所示。 0CT-4為轉錄因子，可在細胞核中表達。本實施例對實施例2得到的小鼠孤雌胚胎 干細胞和受精卵來源的干細胞都進行0CT-4表達，結果如圖3所示，實施例2得到的小鼠孤 雌胚胎干細胞和受精卵來源的干細胞都呈現0ct-4陽性克隆，0ct-4染色都是克隆中央細 胞染色很深，尤其是中央多層緊密堆積的細胞。 SSEA-1為小鼠胚胎干細胞表面存在的特異性細胞表面抗原，當細胞分化時其表 達消失。本實施例對實施例2得到的小鼠孤雌胚胎干細胞和受精卵來源的干細胞都進行 SSEA-1表達，結果圖4所示，實施例2得到的小鼠孤雌胚胎干細胞和受精卵來源的干細胞都 呈現SSEA-1陽性克隆，SSEA-1染色均為深著色。 本實施例對實施例2得到的小鼠孤雌胚胎干細胞和受精卵來源的干細胞都進行 堿性磷酸酶(AKP)染色，由圖4可以看出，堿性磷酸酶染色顯示兩種干細胞克隆均為深藍 色，而周圍成纖細胞不著色，表明兩種干細胞都為陽性反應。 綜上所述，實施例2得到的小鼠孤雌胚胎干細胞和受精卵來源的干細胞從分子生 物學特性0CT-4表達、SSEA-1表達和AKP活性方面是無差異的，都具有干細胞的特征性表 達。 實施例4小鼠孤雌胚胎干細胞的體外分化 實施例2得到的小鼠孤雌胚胎干細胞體外分化，采用如下操作步驟
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將實施例2得到的小鼠孤雌胚胎干細胞用胰酶消化后，重貼成纖細胞(MEF)去除 MEF后，在無白血病抑制因(LIF)的干細胞培養液(市售)中懸浮培養2天，形成類球形團 結構，稱擬胚體(EB)，挑選大小適中狀態好的擬胚體放入孔板中讓其貼壁生長，培養8 18 天后，可觀察到有自發節律性收縮的細胞，分化第18天熒光免疫檢測到代表3個胚層的標 志性表達GFAP抗體(外胚層)、MF20抗體(中胚層)和AFP抗體(內胚層)，如圖5所示。
GFAP(Glial Fibrillary Acid Protein)是神經膠質細胞特異性表達抗體，MF20 抗體是心肌特異性表達抗體，AFP (Alpha-Fetoprotein)為甲胎蛋白，這些結果表明實施例 2得到的小鼠孤雌胚胎干細胞在體外具有三個胚層的分化潛能。
實施例5小鼠孤雌胚胎干細胞在裸鼠皮下分化形成畸胎瘤 將8個實施例2得到的小鼠孤雌胚胎干細胞注入有免疫缺陷的裸鼠的皮下，約十 天能觀察到瘤樣團塊開始出現，4周后8個未成熟卵孤雌干細胞系注射的裸鼠都出現了較 明顯的腫瘤，大小直經約l 2cm。圖6中l為小鼠未成熟卵孤雌干細胞系(實施例2得到 的一種小鼠孤雌胚胎干細胞，命名為1116pESp6)分化的畸胎瘤；2為小鼠未成熟卵孤雌干 細胞系(實施例2得到的一種小鼠孤雌胚胎干細胞，命名為1114pES p13)分化的畸胎瘤；3 為MEF陰性對照。顯微鏡下發現所有的畸胎瘤都分化出3個胚層組織，包括發育不成熟的 神經、肌肉、軟骨、腺體和鱗狀上皮組織等。
實施例6小鼠孤雌胚胎干細胞體內分化形成嵌合體 本實施例首先用昆明白小鼠作為宿主囊胚，本課題先是用昆明白小鼠做宿主囊 胚，將實施例2得到的小鼠孤雌胚胎干細胞注射移植到昆明白小鼠囊胚中，共注射移植了 12個囊胚，出生5只小鼠，有2只嵌合，嵌合鼠比率為40% 。 然后本實施例又采用ICR小鼠做宿主囊胚，將實施例2得到的小鼠孤雌胚胎干細 胞的早代、近中代和晚代干細胞分別注射移植到ICR小鼠囊胚中，制備嵌合體。早代干細胞 共注射移植了 78個囊胚，出生12只小鼠，有三只嵌合，嵌合鼠比率為25% ;近中代干細胞 (第21代)共注射移植了 42個囊胚，出生7只小鼠，有3只嵌合，嵌合鼠的比率為43%;晚 代干細胞(第54代)共注射了 45個囊胚，17只出生，10只嵌合，嵌合鼠的比例為59% 。
為更好地檢測干細胞生殖系轉移效率，采用BalB/c小鼠做宿主囊胚，同時將實 施例2得到的小鼠孤雌胚胎干細胞的早代干細胞以及受精卵來源的干細胞第8代干細胞分 別注射移植入該宿主囊胚，然后分析嵌合體。 實施例2得到的小鼠孤雌胚胎干細胞的早代干細胞共注射移植了 214個囊胚，出
生了 32個小鼠，其中22個嵌合，嵌合鼠比率為69% 。而受精卵來源的干細胞第8代干細胞
注射移植了 25個囊胚，出生了 12個小鼠，有7個嵌合，嵌合鼠的比率為58%。 本實施例中所用到的昆明白小鼠、ICR小鼠和BalB/c小鼠均為本領域技術人員進
行相關實驗時所常用的小鼠品種。 實施例7生殖系轉移的檢測 為進一步檢測嵌合體是否獲得生殖傳遞能力，本實施例選擇前面6中的部分嵌合 體小鼠與其相應的雄鼠或雌鼠交配，根據是否產生非白色小鼠，證明其是否具有生殖系轉 移能力。 選擇實施例6中，由實施例2得到的小鼠孤雌胚胎干細胞注射移植到宿主囊胚得 到的嵌合體(12只)進行了 10只雌鼠，2只雄鼠交配，檢測發現有3只雌鼠為生殖系嵌合，這3只雌鼠中有一只ICR嵌合體，另外兩只都是BalB/C嵌合體，其交配出生的小鼠的情況 分別為 (1) —只為ICR嵌合體交配出生的17只小鼠中有2只非白色，其生殖系轉移效 率為12% ; (2)另2只均為BalB/C嵌合體其中l只交配第一胎出生全為非白色小鼠，其生 殖系轉移效率為100%，第二胎出生10只小鼠，有5只為非白色小鼠，其生殖系轉移效率為 50% ;另1只嵌合體小鼠在交配后第一胎娩出5只小鼠，1只為非白色，其生殖系轉移效率 為20%。 同時作為參照組，也選擇了實施例6中受精卵來源的干細胞第8代干細胞注射移 植得到的BalB/c嵌合體進行了 7只交配檢測，其中3只交配后有非白色小鼠產生，其生殖 系轉移效率為100%至33%之間。 圖7給出嵌合體小鼠和生殖系轉移的后代的實際照片圖。 生殖系轉移是檢測干細胞多能性的金標準，實驗數據顯示分離得到的未成熟卵孤 雌干細胞生殖系轉移率為12 100%之間，遠遠高于以往孤雌胚胎干細胞生殖系轉移率低 于10%的文獻報道。
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權利要求
一種小鼠卵母細胞體外成熟培養方法，其特征在于該方法是從小鼠卵巢中取出未成熟卵，置于未成熟卵培養液中培養15～16個小時，從而制備得到小鼠成熟卵母細胞，所述未成熟卵培養液的配方為95體積％MEM培養基、5體積％胎牛血清、0.24mM丙酮酸鈉、1.5單位/ml人絨毛膜促性腺激素和1單位/ml孕馬血清促性腺激素。
2. 根據權利要求1所述培養方法，其特征在于所述未成熟卵為GV期的卵丘-卵母細胞 復合體。
3. 根據權利要求1所述培養方法，其特征在于所述未成熟卵在未成熟卵培養液中培養 15 16個小時后，采用透明質酸酶消化吹打去除卵丘細胞，然后再用HKS0M洗3 4次終 止透明質酸酶的消化作用。
4. 一種利用權力要求1所述方法培養的成熟卵建立孤雌胚胎干細胞系的方法，其特征 在于該方法包括如下步驟(1) 將經權利要求l所述方法體外培養成熟的小鼠卵在Ca" free KSOM培養基中孤雌 激活后，移至KS0M培養基中培養發育成囊胚；(2) 將上述囊胚移入經絲裂霉素處理的飼養層細胞上進行培養；(3) 挑取飼養層上克隆中央致密的細胞團進行機械傳代，酶傳擴增，從而得到孤雌胚胎 干細胞系。
5. 根據權利要求4所述建立方法，其特征在于所述步驟(3)中，培養8 12天后，挑取 飼養層上克隆中央致密的細胞團，機械傳代2 3代，再酶傳擴增。
全文摘要
本發明公開一種小鼠卵母細胞體外成熟培養方法及孤雌胚胎干細胞系的建立方法，該體外成熟培養方法是將未成熟卵在加有HCG和PMSG的基礎培養液中培養，其成熟率可達到83％以上。本發明孤雌胚胎干細胞系的建立是將經體外成熟培養的小鼠卵進行孤雌激活培養發育得到胚胎干細胞系的，該方法獲得的肝細胞無免疫原性，同時在全能性上又與受精胚胎來源的干細胞相當，對利用人的未成熟卵體外成熟并分離孤雌胚胎干細胞具有指導意義。針對當前人卵子捐贈不足，輔助生殖技術臨床未成熟卵大量廢棄等情況，本發明的兩種方法結合起來，為開發利用人的未成熟卵體外成熟培養、利用體外成熟的卵子進一步研究孤雌胚胎及用于胚胎干細胞的分離奠定基礎。
文檔編號C12R1/91GK101735978SQ20091021436
公開日2010年6月16日 申請日期2009年12月29日 優先權日2009年12月29日
發明者劉忠, 劉林, 呂祁峰, 周玲君, 黃軍就 申請人:中山大學