專利名稱：：一種提取甘薯塊根rna的方法及其應用的制作方法
技術領域：
：本發明屬于分子生物學領域，特別涉及一種提取甘薯塊根RNA的方法及其應用。
背景技術：
：甘薯是重要的工業原料、生物質能源和保健食品。因此，人們亟需更為深入地了解甘薯的遺傳信息，而提取高純度、高質量的RNA是了解甘薯遺傳信息的必要前提和關鍵。甘薯塊根富含多糖(主要是淀粉)、酚類及其它次生代謝產物，嚴重影響了RNA的提取。其中多糖的理化性質與核糖核酸RNA非常相似，在沉淀RNA時，蛋白多糖和RNA—塊沉淀下來，產生難溶的膠狀物復合體，在去除多糖的同時RNA也被帶走，造成RNA大量丟失。此外，甘薯塊根富含的酚類化合物易產生褐化效應(Browningeffect)，使勻漿液呈褐色，其氧化產物與RNA不可逆結合，也會導致RNA活性喪失或產生不溶性復合物。因此，用常規的RNA提取方法難以提取出高質量的塊根總RNA，影響了對甘薯分子生物學的研究.目前，RNA的提取方法很多，采用Trizol試劑盒、SDS法以及常規的CTAB等方法均不能提取出大量的高質量甘薯塊根RNA。You等(2003)利用胍鹽一SDS裂解液，結合CsCI梯度離心提取了甘薯膨大初期塊根的總RNA。為了避免淀粉的膨脹和凝膠化，MohanKumar等(2007)通過SDS和高鹽沉淀法從甘薯塊根中提取總RNA，但是，這些方法或存在所用裂解液毒性大或存在費時費力等不足。近年來，國內外也相繼開發出了一些總RNA抽提試劑(盒)用于富含多糖和多酚等特殊植物材料的RNA提取，但結果不理想。
發明內容本發明的首要目的在于克服現有技術的缺點與不足，提供一種提取甘薯塊根RNA的方法。該方法提取的甘薯塊根總RNA獲得率高、量大，并且質量好、純度高、完整性好。本發明的另一目的在于提供上述提取甘薯塊根RNA的方法的應用。本發明的目的通過下述技術方案實現一種提取甘薯塊根RNA的方法，包含以下步驟(1)將甘薯塊根放入液氮中，迅速研磨成粉末狀，加入65t:預熱的RNA提取緩沖液；RNA提取緩沖液的用量為每15g甘薯塊根用15ml;(2)將4ml多糖去除液加入到步驟(1)所得的混合液中，冰上放置10分鐘；(3)用氯仿異戊醇混合液抽提步驟(2)得到的混合液，收集上清液；這個步驟可達到去除多糖和蛋白的目的；(4)將步驟(3)收集的上清液中的RNA沉淀，離心，回收沉淀，干燥，用DEPC處理水溶解；(5)用無RNase的DNase處理步驟(4)得到的RNA溶液，可將痕量DNA污染去除；(6)用苯酚、氯仿異戊醇混合液依次抽提步驟(5)的RNA溶液，進一步純化RNA，取上清；(7)將步驟(6)得到的上清液中的RNA沉淀，離心，回收沉淀，洗滌，干燥，得到高純度的甘薯塊根RNA;步驟(1)中所述RNA提取緩沖液含有濃度為50mMTris-HCl(pH9.0)，14%CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)(w/v)，13MNaCl，25mMEDTA(pH8.0)，12%PVP(聚乙烯吡咯烷酮)(w/v)，l2%(體積百分比)P-巰基乙醇，l/3總體積的水飽和酚(pH4.3);步驟(1)中所述多糖去除液含有體積百分比為1030%的乙醇和終濃度為0.40.6mol/L的醋酸鉀。步驟(3)和步驟(6)中所述的氯仿異戊醇混合液為氯仿與異戊醇按體積比24:1混合而得；步驟(3)中所述的氯仿異戊醇混合液的用量優選為相當于步驟(2)得到的混合液的1倍體積；步驟(3)所述的抽提為劇烈振蕩后，優選至少2000Xg離心至少15min;步驟(3)中所述的抽提的次數優選為2次；步驟(4)中所述RNA沉淀是往步驟(3)中的上清液中加入LiCl，LiCl的終濃度為1.52.5mol/L，冰上放置過夜；步驟(5)中所述的處理的條件優選為37C反應30分鐘；步驟(6)中所述的苯酚的用量優選為相當于步驟(5)得到的混合液的1倍體積；步驟(6)中所述的氯仿異戊醇混合液的用量優選為相當于步驟(5)得到的混合液的1倍體積；步驟(6)所述的抽提為劇烈震蕩后，優選至少10000Xg離心至少10min;步驟(6)中所述的抽提的次數優選為2次；步驟(7)中所述RNA沉淀是往步驟(6)中的上清液中加入2倍體積的無水乙醇和終濃度為0.30.6mol/L的醋酸鈉，-7(TC放置20分鐘;步驟(7)中所述的洗滌為通過體積百分比為70%乙醇溶液洗滌。RNA抽提中所用的試劑和耗材均用DEPC進行處理，根據《分子克隆》的指導進行。所述提取甘薯塊根RNA的方法適用于富含多糖、多酚等難提RNA植物組織的總RNA提取。本發明的方法中，RNA提取緩沖液中的13_巰基乙醇和PVP可以避免多酚類物質對RNA分離的干擾作用，而且，與PVP結合的多酚可以在氯仿抽提時直接除去。本發明同時采用了2種方法沉淀與去除多糖，一是在RNA提取緩沖液中加入高濃度的鹽份NaCl，二是在RNA溶液中加入一定比例的無水乙醇和醋酸鉀，可以使多糖快速沉淀下來，而RNA仍然保留于溶液中，去除了多糖對RNA提取的影響，得到了高質量的RNA，具有較大的實際應用價值。本發明相對于現有技術，具有如下的優點及有益效果本發明所述提取甘薯塊根RNA的方法提取的甘薯塊根總RNA獲得率高、量大，并且質量好、純度高、完整性好，可以滿足反轉錄、Northern雜交、cDNA文庫構建、轉錄組分析等分子生物學研究。圖1為本發明的方法和常規的TRIZOL法分別提取的甘薯塊根RNA的瓊脂糖凝膠電泳圖，其中4泳道1、2和3分別為本發明所述方法提取的甘薯塊根發育初期、中期和后期的總RNA;泳道4為常規的TRIZOL法提取的甘薯塊根發育初期的總RNA。圖2為以本發明方法提取的甘薯塊根發育初期的RNA為模板的RT-PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳圖。具體實施例方式下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限于此。實施例1(1)試劑的配制A、DEPC水的配制加0.1%(體積比)DEPC至重蒸水中，攪拌4小時以上，置于37。C處理過夜，121。C滅菌20min;B、lmol/LTris-HCl(pH9.0):100ml滅菌的DEPC水加12.114gTris，用濃鹽酸調節pH值至9.0;C、0.5mol/LEDTA(pH8.0):將18.61gEDTANa2.H20，用未滅菌的DEPC水溶解，定容至100ml，用NaOH顆粒調節其pH值至8.0，121。C滅菌20min;D、8mol/LliCl:將33.912gLiCl用未滅菌的DEPC水溶解，定容至100ml，121°C滅菌20min;E、4mol/LNaCl:將23.26gNaCl用未滅菌的DEPC水溶解，定容至100ml，12rC滅菌20min;F、5mol/L醋酸鉀將49.07g醋酸鉀用未滅菌的DEPC水溶解，定容至100ml，121°C滅菌20min;G、RNA提取緩沖液(配制100ml):5mllmol/LTris-HCl(p服0)、50ml4mol/LNaCl、5ml0.5mol/LEDTA(pH8.0)、4gCTAB禾P2gPVP混勻，接著用滅菌的DEPC水定容至65ml，使用前加入33ml水飽和酚(pH4.3)和2mlP-巰基乙醇。H、多糖去除液(配制100ml):30ml無水乙醇、10ml5M醋酸鉀和60ml滅菌的DEPC水混合而得。1、氯仿異戊醇混合液(配制100ml):96ml氯仿與4ml異戊醇混合而得。(2)不同發育時期的甘薯塊根的總RNA提取A、取大田生長的甘薯品種廣薯87的塊根發育初期(生育期50天)、中期(生育期80天)和后期(生育期140天)的甘薯塊根組織各3g，分別立即放入液氮中研磨成粉末狀，然后迅速加入到65t:預熱的15mlRNA提取緩沖液中，劇烈振蕩10分鐘。B、加入4ml多糖去除液，冰上放置10分鐘C、加入等體積氯仿異戊醇，劇烈振蕩10分鐘，于4°C、2000Xg離心20分鐘，取上清；再次加等體積氯仿異戊醇，混勻，振蕩10分鐘，于4t:、2000Xg離心15分鐘。D、取上清，加1/3體積的8mol/LLiCl，冰上沉淀8小時以上。E、于4。C、2000Xg離心20分鐘，棄上清。F、沉淀用70%乙醇漂洗1次，于4°C、11400Xg離心10分鐘，吹干，加500ii1DEPC5水溶解。G、用12個單位的DNase37。C消化處理30分鐘去除痕量的DNA污染。H、加入等體積苯酚抽提蛋白，劇烈振蕩10分鐘，于4t:、11400Xg離心IO分鐘，取上清。再用等體積氯仿去除多余苯酚和蛋白，劇烈振蕩10分鐘，于4t:、11400Xg離心10分鐘。1、取上清，加入1/10體積3mol.L—1醋酸鈉(pH5.2)，2倍體積的無水乙醇，-70。C放置2小時，于4°C、11400Xg離心20分鐘，回收沉淀。J、沉淀用70%乙醇漂洗，于4°C、11400Xg離心10分鐘，吹干，溶于100iilDEPC-H20中，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性，保存于-70°C。電泳檢測RNA的完整性上樣量1iU，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，結果如圖1所示，泳道1、2和3分別為本發明所述方法提取的甘薯塊根發育初期、中期和后期的總RNA;泳道4為常規的TRIZOL法提取的甘薯塊根發育初期的總RNA。從圖1可以看出，經本發明方法提取的RNA經電泳檢測可見清晰的28s和18s條帶，且條帶無拖尾現象，無基因組DNA的污染。而用常規的TRIZOL試劑盒(Invitrogen，美國)提取的甘薯塊根發育初期的RNA(操作規程嚴格按照試劑盒的說明書進行)有明顯的降解、拖尾現象，且28s和18s的主帶不明顯。提取RNA的純度檢測用NanoDropspectrophotometer(ND-1000，NanoDropTechnologies，Inc.Wilmington,DEUSA)檢測實施例1RNA的純度，結果如表1所示。從表1可以看出，經本發明方法提取的RNA經NanoDrop檢測其A260/A280比值均在1.99-2.11之間，A260/A230比值均在2.13-2.35之間，產量可高達528.12yg/g甘薯塊根鮮重。較Kim和Hamada(2005)方法的177iig/g甘薯i央根鮮重(KimS.H.，andHamadaT.，2005，RapidandreliablemethodofextractingDNAandRNAfromsweetpotato，Biotechnol.Lett.，27(23-24):1841-1845)和MohanKumar等(2007)的237iig/g甘薯土央根鮮重(MohanK麗rG.N.，IyerS.，andRichardK麗lesN.，2007，ExtractionofRNAfromfresh，frozen,andlyophilizedtuberandroottissues,J.Agr.FoodChem.，55(5):1674-1678)的產量均高。說明所提RNA純度較高，產量較大，可以滿足不同分子生物學研究的要求。表1RNA樣品的純度檢測<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>(3)總RNA的逆轉錄及特異基因的擴增以上述提取的發育初期的甘薯塊根總RNA為模板，用Promega公司的M-MLV反轉錄酶合成cDNA第1鏈后，稀釋10倍作為PCR擴增的模板。PCR反應體系(25yL)中包括liilcDNA，0.4mmo1dNTP，上下游引物各lOpmol，1UTaq酶。擴增甘薯ADP葡萄糖焦磷酸化酶的引物序列分別為上游P1，5'-ATGGAATTTTGTGCAACTTTGA-3';下游P2，5'-CCCGGGCTATACGACGGTTCCATCA-3'。cDNA模板在94°C變性5分鐘后，擴增(94°C40秒，60°C40秒，72t:90秒)35個循環；最后72"C延伸10分鐘。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物，結果如圖2所示。以本發明方法提取的總RNA為模板，甘薯AGPase基因特異引物Pl、P2進行RT-PCR，能成功擴增出預期的目的片段，說明該法提取的RNA樣品質量好，可以進一步用于后續試驗。實施例2(1)試劑的配制A、RNA提取緩沖液(配制100ml):5mllmol/LTris-HCl(p服0)、25ml4mol/LNaCl、5ml0.5mol/LEDTA(pH8.0)、lgCTAB禾PlgPVP混勻，接著用滅菌的DEPC水定容至66ml，使用前加入33ml水飽和酚(pH4.3)和lmlP-巰基乙醇。B、多糖去除液(配制100ml):10ml無水乙醇、8ml5M醋酸鉀和82ml滅菌的DEPC水混合而得。(2)甘薯塊根發育后期的總RNA提取同實施例1步驟(2)的操作，區別僅在于所用樣品為發育后期(生育期140天)的甘薯塊根組織lg。提取得到總RNA經1.0X瓊脂糖凝膠電泳檢測，28S、18S和5.8S帶型清晰，說明得到的總RNA完整性較好；經NanoDropspectrophotometer檢測，A260/A280比值均為2.01，A260/A230比值均為2.24，產量為498.85yg/g甘薯塊根鮮重。上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護范圍之內。SEQUENCELISTING〈110〉廣東省農業科學院作物研究所〈120〉一種提取甘薯塊根RNA的方法及其應用〈130>1〈160>2〈170>PatentInversion3.2〈210>1〈211>22〈212>DNA〈213>artificialsequence〈220〉〈223〉上游引物〈400>1atggaattttgtgcaactttga22〈210>2〈211>25〈212>DNA〈213〉artificialsequence〈220〉〈223>下游引物〈400>2cccgggctatacgacggttccatca2權利要求一種提取甘薯塊根RNA的方法，其特征在于包含以下步驟(1)將甘薯塊根放入液氮中，研磨成粉末狀，加入65℃預熱的RNA提取緩沖液；RNA提取緩沖液的用量為每1～5g甘薯塊根用15ml；(2)將4ml多糖去除液加入到步驟(1)所得的混合液中，冰上放置10分鐘；(3)用氯仿異戊醇混合液抽提步驟(2)得到的混合液，收集上清液；(4)將步驟(3)收集的上清液中的RNA沉淀，離心，回收沉淀，干燥，用DEPC處理水溶解；(5)用無RNase的DNase處理步驟(4)得到的RNA溶液；(6)用苯酚、氯仿異戊醇混合液依次抽提步驟(5)的RNA溶液，取上清；(7)將步驟(6)得到的上清液中的RNA沉淀，離心，回收沉淀，洗滌，干燥，得到高純度的甘薯塊根RNA；所述RNA提取緩沖液含有pH9.0、50mM的Tris-HCl，質量體積比為1～4％的十六烷基三甲基溴化銨，1～3M的NaCl，pH8.0、25mM的EDTA，質量體積比為1～2％的聚乙烯吡咯烷酮，體積百分比為1～2％的β-巰基乙醇，相當于所述RNA提取緩沖液總體積1/3的pH值為4.3的水飽和酚；所述多糖去除液含有體積百分比為10～30％的乙醇和終濃度為0.4～0.6mol/L的醋酸鉀；所述的氯仿異戊醇混合液為氯仿與異戊醇按體積比24∶1混合而得。2.根據權利要求1所述提取甘薯塊根RNA的方法，其特征在于步驟(3)中所述的氯仿異戊醇混合液的用量為相當于步驟(2)得到的混合液的1倍體積；步驟(3)中所述的抽提為劇烈振蕩后，至少2000Xg離心至少15min。3.根據權利要求1所述提取甘薯塊根RNA的方法，其特征在于步驟(4)中所述RNA沉淀是往步驟(3)中的上清液中加入LiCl，LiCl的終濃度為1.52.5mol/L，冰上放置過夜。4.根據權利要求1所述提取甘薯塊根RNA的方法，其特征在于步驟(5)中所述的處理的條件為37t:反應30分鐘。5.根據權利要求1所述提取甘薯塊根RNA的方法，其特征在于步驟(6)中所述的苯酚的用量為相當于步驟(5)得到的混合液的1倍體積。6.根據權利要求1所述提取甘薯塊根RNA的方法，其特征在于步驟(6)中所述的氯仿異戊醇混合液的用量為相當于步驟(5)得到的混合液的1倍體積。7.根據權利要求1所述提取甘薯塊根RNA的方法，其特征在于步驟(6)中所述的抽提為劇烈震蕩后，至少10000Xg離心至少10min。8.根據權利要求1所述提取甘薯塊根RNA的方法，其特征在于步驟(7)中所述RNA沉淀是往步驟(6)中的上清液中加入2倍體積的無水乙醇和終濃度為0.30.6mol/L的醋酸鈉，-70。C放置20分鐘。9.根據權利要求1所述提取甘薯塊根RNA的方法，其特征在于步驟(7)中所述的洗滌為通過體積百分比為70%乙醇溶液洗滌。10.權利要求18任一項所述提取甘薯塊根RNA的方法用于富含多糖和/或多酚的植物組織的總RNA提取。全文摘要本發明公開了一種提取甘薯塊根RNA的方法及其應用。本發明通過使用β-巰基乙醇和聚乙烯吡咯烷酮，避免多酚類物質對RNA分離的干擾作用；另外再使用高濃度的NaCl、無水乙醇和醋酸鉀，使多糖快速沉淀，避免多糖對RNA提取的影響。在避免多酚類物質和多糖對RNA分離的干擾作用時，RNA仍然保留于溶液中，得到了質量好、純度高、完整性好的RNA，而且RNA獲得率高、量大。本發明具有較大的實際應用價值，可以滿足反轉錄、Northern雜交、cDNA文庫構建、轉錄組分析等分子生物學研究。文檔編號C12N15/10GK101781646SQ20091021422公開日2010年7月21日申請日期2009年12月25日優先權日2009年12月25日發明者張雄堅,房伯平,溫少旋,王章英,羅忠霞,陳新亮,陳景益,黃立飛申請人:廣東省農業科學院作物研究所