專利名稱：：一種提高質粒dna在大腸桿菌工程菌中比含量的培養基的制作方法
技術領域：
：本發明一種提高質粒DNA在大腸桿菌工程菌中比含量的培養基屬于生物領域，特別是涉及一種培養基。
背景技術：
：隨著近年來重組DNA技術和基因組測序的發展，基因治療和DNA疫苗研究領域取得重大進展。而攜帶有外源基因的質粒DNA為基因治療和DNA疫苗研究開發中使用的主要藥物載體。目前，治療性的質粒DNA臨床用量已達到了mg級，因此大量制備的質粒DNA需要工業規模的大腸桿菌工程菌發酵技術來制備。在發酵工藝方面，早期的質粒發酵培養基配來源于重組蛋白基因工程菌培養基。但由于與表達重組蛋白為目標的工程菌不同，以表達質粒DNA為目標的大腸桿菌工程菌的發酵工藝不需要考慮其蛋白表達產物的影響因素，而僅需為細菌的大量增殖和內含質粒的高效擴增提供最適的發酵條件，因此運用于蛋白發酵的培養基不一定適用于質粒DNA的發酵工藝。此后不斷有學者進行這方面的研究，如根據化學計量模式(stoichiometricmodel)的方法重新對培養基配方進行設計和優化。在發酵策略方面，為了提高細菌發酵密度，與重組蛋白工程菌發酵工藝相似，現有的質粒DNA發酵工藝普遍采用補料-分批發酵(fed-batch)的方法進行，即在發酵過程中基礎培養基碳源、氮源等營養成分衰竭時，通過限制性流加補料的方式提高菌體生長密度和目標產物的表達總量。到目前為止，現有文獻公開的質粒DNA工程菌發酵工藝目標主要以提高質粒總產量或單位體積質粒產量為目標。而良好的質粒DNA發酵工藝除了能生產較高的質粒DNA總量外，還應能提高單位菌量的質粒DNA含量，即質粒DNA的比含量。質粒DNA比含量的提高不僅減輕下游的純化負擔，還可減少試劑的消耗，節約成本。如現有的大規模質粒純化制備是主要以發酵獲得的工程菌在堿裂解法的基礎上以色譜純化技術純化而得。由于一定的菌量對應一定比例的堿裂解試劑，因此提高質粒DNA比含量則意味著相同消耗量的堿裂解試劑可以得到更高含量質粒原液，而且由于相應降低了質粒提取液中的宿主DNA、RNA、蛋白以及內毒素的比例，意味減輕了下游分子篩排阻層析和離子交換色譜純化的負擔。已知增加質粒DNA比含量的方法主要通過"饑餓效應"，即通過非細菌菌體增殖的最適條件下，如碳源或氮源缺乏、較低的生長溫度、偏酸或偏堿的ra值和限制溶氧量等，菌體將減少RNA和蛋白質的合成，而是趨向于將營養底物轉化成質粒，從而提高菌體質粒拷貝數。除了通過"饑餓效應"提高質粒DNA比含量外，現有發酵工藝的研究文獻并沒有通過培養基組分的優化配置提高質粒DNA比含量的方法。我們在研究中發現，現有的運用于質粒DNA工程菌高密度表達的培養基雖然可以達到較高的菌體密度和質粒總量的目標，但質粒DNA比含量普遍較低(質粒DNA比含量小于1.6mg/g濕菌)。利用現有的培養基配方，即使在發酵工藝中用到"饑餓效應"的策略后質粒DNA比含量有了一定程度提高，但結果仍不令人滿意。為了有利于質粒DNA的純化，有必要開發出一種適用于工程菌高密度發酵培養且能顯著提高質粒DNA比含量的培養基。
發明內容本發明的目的在于提供一種可以明顯提高大腸桿菌工程菌在增殖生長過程中質粒DNA的合成效率，提高質粒DNA比含量，對發酵培養基不同營養組分配比之間進行優化的一種提高質粒DNA在大腸桿菌工程菌中比含量的培養基。本發明的目的是通過以下措施來達到的，本發明的培養基每升包含有下列配比組分酵母提取物(yeastextract)5.OOg/L甘油(glycerol)7.75ml/L硫酸銨((NH4)2S04)3.0g/L磷酸氫二鈉(Na2HP04)6.0g/L磷酸二氫鉀(KH2P04)3.0g/L檸檬酸(citricacid)1.7g/L硫酸鎂(MgS04)1.2g/L其中，酵母提取物(yeastextract)由英國0X0ID公司提供，產品型號LP0021。培養基用IMol/LNaOH等堿性溶液調pH值至7.0。在使用本發明的培養基進行質粒DNA發酵時，按上述配比組分配制的培養基，在分批發酵(batchfermentation)模式下可單獨用于質粒DNA工程菌的發酵培養。可運用"饑餓效應"策略，如降低發酵溫度、限制溶氧值來進一步提高質粒DNA比含量。在使用本發明的培養基進行質粒DNA發酵時，按上述配比組分配制的培養基，在補料-分批發酵(fed-batchfermentation)模式下，與補料培養基聯用，可用于高密度質粒DNA工程菌發酵培養。可運用"饑餓效應"策略，如降低發酵溫度、限制溶氧值來進一步提高質粒DNA比含量。本發明的培養基能顯著提高質粒DNA比含量水平，從而有利于下游質粒DNA純化，提高大腸桿菌工程菌在增殖生長過程中質粒DNA的合成效率，可減少試劑的消耗，節約成本。具體實施例方式下面結合實施例對本發明作進一步說明。實施例1:不同培養基搖瓶發酵結果比較(l)實驗材料真核表達質粒pcDNAS2S由解放軍458醫院肝病研究所構建；宿主菌DH5a由拜迪公司保存；質粒pcDNAS2S轉化DH5a，獲得工程菌DH5a/pS2S，拜迪公司保存；酵母提取物(YeastExtract)由英國0X0ID公司提供，產品型號LP0021、胰蛋白胨(Tryptone)購自0X0ID公司；質粒小量抽提試劑盒，購自QIAGEN公司；紫外可見分光光度計，日本日立公司UV-300型。甘油(glycerol)、氯化鈉(NaCl)、葡萄糖(glucose)、擰檬酸(citricacid)、硫酸銨((朋4)2504)、硫酸鎂(MgS0》、磷酸鹽(Na2HP04、KH2P04)、氨芐西林(ampicillin，AMP)等，均為國產分析純。(2)實驗過程按表1配制培養基，分裝至三角錐瓶中(20ml/瓶)，滅菌后添加AMP至100yg/ml。于LB培養基中加入瓊脂(15g/L)，鋪平皿，接種工程菌，于37t:培養過夜。挑單個菌落，接種于5mlLB(含AMP100yg/ml)中，37。C振蕩培養至A6。。為0.6時，分別取菌液200ul接種到各培養基中按預設的培養參數進行培養。培養結束后分析收菌量(濕菌重)、質粒含量(mg/L)，并計算質粒含量對菌量的比值。表1培養基配方表<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>注配方I來源饒桂榮等。治療性雙質粒HBVDNA疫苗工程菌的中試發酵工藝研究，中國生物制品學雜志2007年2月第20巻第2期，第110-113頁。配方II來源MichaelK.etal.GrowthMediumSelectionandItsEconomiclmpactonPlasmidDNAProduction.JournalOfBioscienceAndBioengineering，Vol104(6)，490-497，2007.配方III來源Kevin0.etal.StrategiesforhightitreplasmidDNAproductioninEscherichiacoliDH5a，ProcessBiochemistry42，1039—1049，2007(3)實驗結果實驗結果見表2:表2DH5a/pS2S工程菌在不同配方培養基的搖瓶發酵結果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>從表2可以看出，在不同的溫度、搖瓶速度的情況下，利用本發明配方配制的培養基培養表達的質粒DNA比含量都明顯高于其他配方的結果。實施例2:按照本發明配方配制的培養基大規模發酵工藝研究實驗(1)發酵采用fed-batch模式，發酵罐50L(德國B.Braun公司產品)，發酵培養基按具體實施例配方表1配制，配40L，發酵罐原位滅菌后備用。補料培養基配方如下YeastExtract100g/l，Glycerol400ml/L。共配IOL，滅菌備用。(2)實驗過程如下①搖瓶培養所用培養基為本發明的培養基，用凍存菌種接種于搖瓶培養基中，37t:劇烈振蕩16hr至對數生長期(A6。。為0.8)。取400ml菌液接種到發酵罐的發酵培養基中，開始進行fed-batch模式的發酵培養②batch階段接種后首先為batch階段。在batch階段，溫度控制在35t:;通過補加10X濃氨水溶液控制pH值在7.0;d02控制在30X左右，開始階段攪拌速度設為200rpm，通氣量為40L/min。當d02水平低于閾值28%時，攪拌速度增加10rpm以促使d02控制在30%，在batch階段攪拌速度最高值設為400rpm。在batch階段后期由于氧供應不足d02將會下降，最低至2%左右。batchphase末期營養組分將消耗盡，此時工程菌代謝將趨于停止，故d02值將在短期內躍升，當d02達到15%時。發酵開始進入fed階段。③在fed階段，發酵溫度升至37°C;d02值依然控制在30%左右，當d02值低于30%時攪拌速度以lOrpm的增幅增加，直至達到最高轉速(800rpm);在fed階段，當d02值高于50%、pH值高于7.2時表明生長限制性的碳源缺失，此時按預設的補料速度進行補料(補料值為4mL/min)，直到d02值低于50%或pH值低于7.2時停止補料；在fed階段，通氣量保存不變，當攪拌速度達到最高轉數時，d02因供氧矛盾而趨于下降，當d02趨于零值時停止發酵。④在發酵過程中，每隔lh取樣，檢測菌密度、濕菌量和質粒含量，并計算質粒含量對菌量的比值。其中，質粒抽提采用QIAGEN質粒小量抽提試劑盒按操作說明進行。菌密度的測定采用紫外分光光度計測定600nm波長的A值。質粒含量采用紫外分光光度計測定260nm波長的A值確定。質粒純度的測定采用紫外分光光度計測定260nm、280nm波長的吸收比值確定(符合質量標準的比值應在1.75-1.85之間)，并進行瓊脂糖凝膠電泳，經凝膠成像系統掃描，并分析超螺旋質粒的比例(符合質量標準的超螺旋比值應>90%)。實驗結果見表3。由結果可知，利用本發明培養基的發酵工藝可制得大量的合符質量標準的質粒DNA。質粒DNA比含量可達到2.4，已超過現有文獻(饒桂榮等。治療性雙質粒HBVDNA疫苗工程菌的中試發酵工藝研究，中國生物制品學雜志2007年2月第20巻第2期，第110-113頁)報道的檢測結果。表3利用本發明的培養基進行DH5a/pS2S工程菌進行補料_分批(fed-batch)發酵的結果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>權利要求一種提高質粒DNA在大腸桿菌工程菌中比含量的培養基，其特征是每升包含有下列配比組分酵母提取物不是5.00g/L，甘油7.75ml/L，硫酸銨3.0g/L，磷酸氫二鈉6.0g/L，磷酸二氫鉀3.0g/L，檸檬酸1.7g/L，硫酸鎂1.2g/L，培養基用1Mol/LNaOH等堿性溶液調pH值至7.0。2.根據權利要求1所述的一種提高質粒DNA在大腸桿菌工程菌中比含量的培養基，其特征是在分批發酵模式下單獨用于質粒DNA工程菌的發酵培養。3.根據權利要求1所述的一種提高質粒DNA在大腸桿菌工程菌中比含量的培養基，其特征是在補料_分批發酵模式下，與補料培養基聯用，可用于質粒DNA工程菌發酵培養。酵母提取物不是甘油硫酸銨磷酸氫二鈉磷酸二氫鉀檸檬酸硫酸鎂全文摘要本發明一種提高質粒DNA在大腸桿菌工程菌中比含量的培養基屬于生物領域，本發明的培養基每升包含有下列配比組分酵母提取物5.00g/L，甘油7.75ml/L，硫酸銨3.0g/L，磷酸氫二鈉6.0g/L，磷酸二氫鉀3.0g/L，檸檬酸1.7g/L，硫酸鎂1.2g/L，培養基用1mol/LNaOH等堿性溶液調pH值至7.0。本發明的培養基能顯著提高質粒DNA比含量水平，從而有利于下游質粒DNA純化，提高大腸桿菌工程菌在增殖生長過程中質粒DNA的合成效率，可減少試劑的消耗，節約成本。文檔編號C12N1/20GK101768560SQ20091021372公開日2010年7月7日申請日期2009年12月2日優先權日2009年12月2日發明者丘力功,王燦頂,蔡小杰,趙亮,韋劍申請人:廣州拜迪生物醫藥有限公司