專利名稱：軍曹魚免疫球蛋白κ鏈的基因序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種蛋白編碼序列，尤其是涉及一種軍曹魚免疫球蛋白k鏈的
基因序列。
背景技術(shù)：
免疫球蛋白屬體內(nèi)的多功能免疫球蛋白，也是再次免疫應(yīng)答的主要抗體，主要以 分泌形式存在于血液和其它體液中介導(dǎo)體液免疫。Ig單體包括兩條相同的分子量較大的 重鏈和兩條相同的分子量較小的輕鏈，重鏈(heavy chain, H鏈)和輕鏈(light chain, L 鏈)是由不同染色體上的多基因座編碼。其生物學(xué)活性是特異性結(jié)合抗原或通過重鏈C區(qū) 介導(dǎo)一系列生物學(xué)效應(yīng)，包括中和毒素作用、親和細(xì)胞而導(dǎo)致吞噬調(diào)理作用、胞外殺傷及免 疫炎癥、介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)激活補(bǔ)體途徑等。
隨著海水養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，病害問題日趨嚴(yán)重，雖然利用一些藥物取得了一定的防 治效果，但是長期的施藥不僅會導(dǎo)致水體的污染，也會造成諸多耐藥性病原體的產(chǎn)生，為進(jìn) 一步的防治工作變得更為復(fù)雜。因此從魚體自身入手，提高魚體免疫力是病害防治的趨勢。 特異性防御機(jī)制在水生動物防止感染中扮演重要角色，魚類免疫系統(tǒng)尤其是體液免疫系統(tǒng) 承擔(dān)著相當(dāng)部分的工作，受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。其中免疫球蛋白，又是魚類特異性體 液免疫應(yīng)答中最主要的介質(zhì)。因此，對魚類免疫球蛋白的研究理所當(dāng)然地成為魚類免疫學(xué) 研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種軍曹魚免疫球蛋白k鏈的基因序列。
本發(fā)明通過以近源物種免疫球蛋白k鏈基因的CDS序列的保守區(qū)設(shè)計的兼并引 物，并用PCR法擴(kuò)增，結(jié)合RACE技術(shù)克隆到軍曹魚免疫球蛋白k鏈基因的全表達(dá)序列；通 過對IgK基因設(shè)計有效地鑒定引物，從而可以通過半定量來分析該基因的表達(dá)水平和組 織分布情況。具體DNA核苷酸及相應(yīng)的氨基酸序列如下CAGCTGTCCTTCATCACAACACAAGACACAGAAATCCTCCTCATCAAAAACCTTTG 61
M T L NSVLIWTLLCCCFTESRGQV TVTQSGAVSSALGGSVRITC RTSQNVYGSNYLAWYQQRDG EKPKLLIYGASYRASGIPGRE T
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AAAAAAAA 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)本基因的獲得不僅為研究魚類免疫球蛋白在體液免疫中的作用， 為進(jìn)一步探討魚類免疫球蛋白體液反應(yīng)的發(fā)生機(jī)理奠定基礎(chǔ)，而且通過基因序列可以獲得 具有生物活性的純化蛋白，為研究新型的抗病免疫抗體提供理論基礎(chǔ)。
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841 959 961 969
圖1是本發(fā)明在鯊魚弧菌剌激前和剌激后192h體內(nèi)的不同組織器官中的表達(dá)；
HK :頭腎；liver :肝臟；Intestine :腸Gill :鰓；Spleen :脾；brain :腦。
具體實(shí)施例方式
1.總RNA的提取 取健康的軍曹魚(體重約1000g)在養(yǎng)殖桶中養(yǎng)殖3日后，腹腔注射lml的鯊魚弧 菌(JT2)。剌激192h后，解剖魚體取出頭腎約250mg，放入-8(TC冰箱備用。取備用組織約 lOOmg用剪刀剪碎加入lml的Trizol (美國invitrogen公司)進(jìn)行勻漿，按照試劑盒說明 提取總RNA。 2. cDNA第一鏈的合成 取軍曹魚總RNA5iig與反轉(zhuǎn)錄引物(oligodT接頭引物)1 (1Opmol/L)混合， 65。C加熱5min后，立即放置冰上靜置2min，然后加入5Xbuffer， 10mmol/LdNTP混合液， Ribo皿clease Inhibitor, M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶，反應(yīng)體系為20 ii 1 。反應(yīng)程序?yàn)?7°C 、60min， 最后放入-S(TC保存?zhèn)溆谩?
3.引物設(shè)計依據(jù)，引物合成的方法
使用構(gòu)建的Smart cDNA文庫擴(kuò)增cDAN片斷，用設(shè)計的中間片斷引物進(jìn)行PCR擴(kuò) 增，擴(kuò)增片段大小約為406bp。引物設(shè)計后提交上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行DNA合成。
4.對軍曹魚免疫球蛋白k鏈基因cDNA全序列的克隆 使用構(gòu)建的Smart cDNA文庫擴(kuò)增cDAN片斷，用設(shè)計的中間片斷引物進(jìn)行PCR擴(kuò) 增，擴(kuò)增片段大小約為406bp。 以上述合成的第一鏈cDNA作為模板，用設(shè)計的中間片斷引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng) 體系為10x Buffer2. 5ii L， lOmmol/L dNTP 0. 5 ii L， 1Onmol/L弓|物KF禾口 KR各0. 5 ii L， Taq 酶0. 25 ii L，用PCR水將反應(yīng)體系補(bǔ)充至25 y L。反應(yīng)條件為1個循環(huán)，94t:變性3min ;35 個循環(huán)94。C變性35s，56。C退火45s，72。C延伸lmin ;1個循環(huán)，72。C延伸10min ;4。C保溫。 所擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物用1 %的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，拿未純化的PCR液由上海英駿生物技 術(shù)有限公司進(jìn)行雙向測序。 根據(jù)已得到的cDNA片段序列設(shè)計特異性引物。利用cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù) (R即idAmplification of cDNA ends, RACE)對目的基因的3'和5'末端進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
在3' RACE中，利用降落PCR (touchdown PCR)方法，用接頭引物和R3Kf進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。 在5' RACE中，利用末端轉(zhuǎn)移酶和dCTP在cDNA末端加上poly (C)尾后，以加尾后 的cDNA作為模板，利用特異性引物和OligodG進(jìn)行PCR擴(kuò)增。 所得到的PCR產(chǎn)物在1 %的瓊脂糖凝膠電泳上進(jìn)行分離檢測后，將PCR產(chǎn)物純化 后，克隆到pMD-18T載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Escherichia coli)5Ha感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性 克隆，用M13引物對質(zhì)粒DNA進(jìn)行測序，測序所得序列再與中間片段引物擴(kuò)增所得的序列利 用DNAStar軟件進(jìn)行拼接。
5.對軍曹魚k鏈基因的測定 所得到的PCR產(chǎn)物在1 %的瓊脂糖凝膠電泳上進(jìn)行分離檢測后，將PCR產(chǎn)物純化 后，克隆到pMD-18T載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Escherichia coli)5Ha感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性 克隆，用3730測序儀對質(zhì)粒DNA進(jìn)行測序。測序結(jié)果用BLAST軟件進(jìn)行同源性測定，來確 定為軍曹魚k鏈基因的同源序列。
6、免疫后免疫球蛋白k鏈的分布和表達(dá) 為檢測k鏈基因在魚體內(nèi)的表達(dá)情況，腹腔注射0. 1ml活的JT2濃度為107個/ ml軍曹魚4條，另取3條健康的軍曹魚作為對照。取Oh和192h兩個時間點(diǎn)的頭腎、脾臟、肝 臟等器官各約lOOmg，按照試劑盒說明提取總RNA，并合成cDNA第一鏈，作為半定量PCR檢 測的模板。根據(jù)已克隆到的軍曹魚k鏈基因的表達(dá)序列設(shè)計一對特異性引物，對目的基因 的cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，P-actin基因作為內(nèi)參，擴(kuò)增片段大小約為150bp。反應(yīng)參數(shù)為94t:， 3min ;94。C ， 30s ;57。C ， 30s ;72。C ， lmin，共40個循環(huán)，最后終延伸為72°C ， 10min。 PCR的產(chǎn) 物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。圖1所示，在未受剌激的健康魚中，K基因在肝臟和 鰓中的表達(dá)量較高，而在腸和腦組織中幾乎沒有表達(dá)。經(jīng)JT2剌激192h后，在采樣的各個 組織中均有表達(dá)，如圖1所示，尤其以頭腎、腸、鰓和脾等免疫及免疫相關(guān)器官的表達(dá)量較 正常水平明顯升高，腦組織有K鏈基因的少量表達(dá)。
序列表 〈110〉中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所
〈120〉軍曹魚免疫球蛋白k鏈的基因序列
〈160>2
〈210>1
〈211>969
〈212>RNA
〈213>軍曹魚(Rachycentron canadium Linnaeus) 〈220〉
〈221>3， UTP
〈222〉 (782)(969)
〈220〉
〈221>5， UTP 〈222〉 (1) . (52) 〈220〉 〈221>CDS
〈222>(53). . (781) 〈220〉
〈221>PolyA site 〈222〉 (936) . (969) 〈400>1
CAGCTGTCCTTCATCACAACACAAGACACAGAAATCCTCCTCATCAAAAAC .^jv' CTTTG 61
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0113]
0114] 0115] 0116] 0117] 0118] 0119] 0120] 0121] 0122] 0123] 0124] 0125]
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F G G 124
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G F P 164
WEE 184
T L R 204
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K G K A T 156
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V L G K D 196
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I E E L E 150
S D W S L 170
S R S P G 190
L P A D Q 210
Q T L V A 230
N S Q R V N T 122
R P T L T V L 142
L M C L A N R 162
G S S I S S S 182
G L Y S W
S V T C E
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481
541
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721
D Q C P Q
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A 氺 242
841 959 961
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〈210>2
〈211>242
〈212>RNA
〈213>軍曹魚(Rachycentron canadium Linnaeus) 〈400>2
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G G S V R 40
0126] 1
0127] I T C R
R A S G I 80
0128] 41 76
0129] P G R F
N S Q R 120
0130] 81
6 12 18 24 30 36
TSQNVYGSNYLAWYQQRDGEKPKLLIYGASY
46 52 58 64 70
TGSGSNSDFTLTISGVQTEDAAVYYCQSYHE
86 92 98 104 110116 VNTFGGGTRLDIGSDTRPTLTVLPPSIEELEKGKA T L M C L 160 121 126 132 138 144 150
156 ANRGFPSDWSLAWKVGGSSISSSWEESRSPGVLGK D G L Y S 200 161 166 172 178 184 190
196 WSSTLRLPADQWKKLDSVTCEATQGSQTLVAETLR R D Q C P 240 201 206 212 218 214 220
226 Q A. 24權(quán)利要求
一種軍曹魚免疫球蛋白κ鏈的基因序列，其特征在于它的DNA核苷酸及相應(yīng)的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所述。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種軍曹魚免疫球蛋白κ鏈的基因序列，它的DNA核苷酸及相應(yīng)的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所述。本基因的獲得不僅為研究魚類免疫球蛋白在體液免疫中的作用，為進(jìn)一步探討魚類免疫球蛋白體液反應(yīng)的發(fā)生機(jī)理奠定基礎(chǔ)，而且通過基因序列可以獲得具有生物活性的純化蛋白，為研究新型的抗病免疫抗體提供理論基礎(chǔ)。
文檔編號C12N15/13GK101709303SQ20091021368
公開日2010年5月19日 申請日期2009年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月10日
發(fā)明者侯月娥, 馮娟, 徐力文, 王江勇, 蘇友祿, 茅莉娜, 郭志勛 申請人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所