專利名稱：：人baff-r基因啟動(dòng)子活性的測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種人BAFF-R基因啟動(dòng)子活性的測(cè)定方法。
背景技術(shù)：
：BAFF-R是腫瘤壞死因子受體家族中的一員，是B淋巴細(xì)胞剌激因子(Blymphocytestimulator,BLyS)，也禾爾為(BcellactivatingfactorsbelongingtotheTNFfamily,BAFF)的特異性受體。BLyS通過與三個(gè)受體穿膜蛋白活化物(TACI)、B細(xì)胞成熟抗原(BCMA)和BAFF受體(BAFF-R)結(jié)合，參與B、T淋巴細(xì)胞的增殖和功能的調(diào)節(jié)。BLyS表達(dá)過度會(huì)使B淋巴細(xì)胞不斷增殖并分泌自身抗體增多，導(dǎo)致一系列自身免疫病的發(fā)生，還會(huì)使淋巴細(xì)胞增殖失控從而引起B(yǎng)細(xì)胞惡性腫瘤的發(fā)生。BLyS的三個(gè)受體中BAFF-R是其特異性受體能與其特異性結(jié)合，BAFF-R對(duì)于BLyS介導(dǎo)的B細(xì)胞的存活和成熟是必要的[7]。目前對(duì)BAFF-R的表達(dá)水平與疾病的發(fā)生、發(fā)展的研究較多，而對(duì)BAFF-R基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控方面的研究尚未見相關(guān)報(bào)導(dǎo)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種易操作、準(zhǔn)確的人BAFF-R基因啟動(dòng)子活性的測(cè)定方法。本發(fā)明的技術(shù)解決方案是—種人BAFF-R基因啟動(dòng)子活性的測(cè)定方法，其特征是包括下列步驟(1)引物設(shè)計(jì):用引物設(shè)計(jì)軟件按疊瓦方式在BAFF-R基因5'側(cè)翼序列設(shè)計(jì)八個(gè)片段的引物，八對(duì)引物具有相同的下游引物，引物的3'端加限制性內(nèi)切酶HindlII位點(diǎn)，5'端加限制性內(nèi)切酶MluI位點(diǎn)，同時(shí)在兩端分別添加6個(gè)保護(hù)堿基，便于酶切插入到載體的多克隆位點(diǎn)；八個(gè)片段的引物序列及下游引物序列為4<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>其中1-8為八個(gè)不同長(zhǎng)度片段的上游引物序列，9為八叫、片段3'端共同的下游引物序列；上述引物作為擴(kuò)增相應(yīng)產(chǎn)物Bl(549bp)、B2(691bp)，B3(878bp)、B4(973bp)、B5(1129bp)、B6(1538bp)、B7(1681bp)、B8(1823bp)(即Bl、B2、B3、B4、B5、B6、B7、B8)的引物，BlB8分別與上述引物18對(duì)應(yīng)；(2)BAFF-R基因5'側(cè)翼區(qū)的克隆從人全血中提取基因組DNA作為模板，應(yīng)用LATaq酶PCR擴(kuò)增目的片度B8(1823bp);用限制性內(nèi)切酶Mlu1、HindIII酶切膠回收純化后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物B8及pGL3-Basic載體，酶切產(chǎn)物經(jīng)T4連接酶連接，連接混合產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5a，酶切測(cè)序鑒定陽性克隆，得到陽性重組質(zhì)粒，命名為pGL3-B8，即pGL3-B8(-1562+261);(3)BAFF-R基因5'側(cè)翼區(qū)序列缺失質(zhì)粒的構(gòu)建以重組質(zhì)粒pGL3-B8為模板，PCR擴(kuò)增目的片段B1_B7，同構(gòu)建重組質(zhì)粒pGL3-B8的方法一樣，得到7個(gè)重組體，分別命名為pGL3-Bl、pGL3-B2、pGL3-B3、pGL3-B4、pGL3-B5、pGL3-B6、pGL3-B7;(4)細(xì)胞培養(yǎng)Raji、KM3細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)于含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中含100U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素，置于5%C02，37。C恒溫培養(yǎng)，12d傳代一次；(5)重組報(bào)告基因質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞Raji、KM3兩種細(xì)胞各分為11組(l)pGL3-Bl組；(2)pGL3-B2組；(3)pGL3-B3組；(4)pGL3-B4組；(5)pGL3-B5組；(6)pGL3-B6組；(7)pGL3-B7組；(8)pGL3-B8組；(9)pGL3-Contro1組；(10)pGL3-Basic組；(ll)無質(zhì)粒空白對(duì)照組，各組均以psv-P-gal質(zhì)粒作為內(nèi)參照，將構(gòu)建的pGL3-Bl、pGL3-B2、pGL3_B、pGL3_B4、pGL3_B、pGL3_B6、pGL3_B7、pGL3-B8八種重組質(zhì)粒以及陰性對(duì)照pGL3-Basic，陽性對(duì)照pGL3-Contro1，分別轉(zhuǎn)染Raji、KM3細(xì)胞，同時(shí)共轉(zhuǎn)染psv-P-gal內(nèi)參質(zhì)粒，空白對(duì)照組不轉(zhuǎn)染任何質(zhì)粒；(6)熒光素酶活性檢測(cè)對(duì)步驟(5)中的各組，在轉(zhuǎn)染48h后分別收集并裂解細(xì)胞，進(jìn)行熒光素酶活性檢測(cè)lXPBS洗滌細(xì)胞2次，加入200ii1IX裂解液，凍融一次后移入1.5mlE卯endorf管中，12000g/min，4t:離心2min，取20iU裂解上清液，用化學(xué)發(fā)光儀檢測(cè)熒光素酶活性；取50ii1裂解上清液，加入50iU13-半乳糖苷酶檢測(cè)試劑，酶標(biāo)儀測(cè)定13_半乳糖苷酶的活性；熒光素酶活性與e-半乳糖苷酶活性的比值為熒光素酶的相對(duì)活性。引物設(shè)計(jì)軟件為Primerpremier5.0。步驟(2)中PCR反應(yīng)條件為94°C，1.5min;94。C，39S;56。C，45S，72°C，lmin，35個(gè)循環(huán)；最后72t:延伸5min;PCR產(chǎn)物經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色并照相予以鑒定。步驟(5)中脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑和質(zhì)粒之間的比例為3iU:4iig，待測(cè)質(zhì)粒和內(nèi)參照質(zhì)粒的比例為4:i。本發(fā)明易操作、準(zhǔn)確，測(cè)定了BAFF-R基因5'上游序列在不同細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄活性的差異及其不同區(qū)域轉(zhuǎn)錄活性的差異，確定了BAFF-R基因的核心啟動(dòng)子所在區(qū)域，對(duì)于研究BAFF-R基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的作用，及闡明該基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明圖1是PCR擴(kuò)增BAFF-R基因5'上游序列片段B8的示圖。圖2是pGL3-B8的酶切鑒定結(jié)果示圖。圖3是PCR擴(kuò)增BAFF-R基因5'上游序列片段BlB7結(jié)果示圖。圖4是重組質(zhì)粒pGL3-BlB8的酶切鑒定結(jié)果示圖。圖5是不同重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染不同細(xì)胞(Raji、KM3細(xì)胞)后熒光素酶的相對(duì)活性示圖。圖5中A:pGL3-Bl(-288+261);B:pGL3-B2(-430+261);C:pGL3—B3(-617+261);D:pGL3-B4(-712+261);E:pGL3-B5(-868+261);F:pGL3-B6(-1277+261);G:pGL3-B7(-1420+261);H:pGL3-B8(-1562+261);1:pGL3-Basic(ap<0.05)。具體實(shí)施例方式—種人BAFF-R基因啟動(dòng)子活性的測(cè)定方法，其特征是包括下列步驟材料菌株DH5a為本單位保存菌種，人Burkitt's淋巴瘤細(xì)胞株Raji由南通大學(xué)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)，多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株KM3由上海第二軍醫(yī)大學(xué)贈(zèng)送。哺乳動(dòng)物基因組DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒(碧云天)；PCR試劑、DNAMarker(大連寶生物Takara公司)；pGL3-Basic載體，pGL3-Contro1質(zhì)粒，內(nèi)參照質(zhì)粒psv-P-gal質(zhì)粒，熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒，T4連接酶，限制性內(nèi)切酶Mlu1、HindlII、質(zhì)粒抽提試劑盒，購(gòu)自Promega公司；胎牛血清，RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑為美國(guó)Invitrogen公司的廣PR5(1)引物設(shè)計(jì):用引物設(shè)計(jì)軟件Primerpremier5.0按疊瓦方式在BAFF-R基因5'側(cè)翼序列設(shè)計(jì)八個(gè)片段的引物，八對(duì)引物具有相同的下游引物，引物的3'端加限制性內(nèi)切酶HindIII位點(diǎn)，5'端加限制性內(nèi)切酶MluI位點(diǎn)，同時(shí)在兩端分別添加6個(gè)保護(hù)堿基，便于酶切插入到載體的多克隆位點(diǎn)；八個(gè)片段的引物序列及下游引物序列為<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>其中l(wèi)-8為八個(gè)不同長(zhǎng)度片段的上游引物序列，9為八個(gè)片段3'端共同的下游引物序列；上述引物作為擴(kuò)增相應(yīng)產(chǎn)物Bl(549bp)、B2(691bp)，B3(878bp)、B4(973bp)、B5(1129bp)、B6(1538bp)、B7(1681bp)、B8(1823bp)(即Bl、B2、B3、B4、B5、B6、B7、B8)的引物，BlB8分別與上述引物18對(duì)應(yīng)；(2)BAFF-R基因5'側(cè)翼區(qū)的克隆從人全血中提取基因組DNA作為模板，應(yīng)用上述引物，LATaq酶PCR擴(kuò)增目的片度B8;PCR反應(yīng)條件為94。C，1.5min;94。C，39S;56。C，45S，72°C，lmin，35個(gè)循環(huán)；最后72。C延伸5min;PCR產(chǎn)物經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色并照相予以鑒定。用限制性內(nèi)切酶Mlu1、HindIII酶切膠回收純化后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物B8及pGL3-Basic載體，酶切產(chǎn)物經(jīng)T4連接酶連接，連接混合產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5a，酶切測(cè)序鑒定陽性克隆，得到陽性重組質(zhì)粒，命名為pGL3-B8，即pGL3-B8(-1562+261);(3)BAFF-R基因5'側(cè)翼區(qū)序列缺失質(zhì)粒的構(gòu)建以重組質(zhì)粒pGL3-B8為模板，PCR擴(kuò)增目的片段B1_B7，同構(gòu)建重組質(zhì)粒pGL3-B8的方法一樣，得到7個(gè)重組質(zhì)粒，分別命名為pGL3-Bl、pGL3-B2、pGL3-B3、pGL3-B4、pGL3-B5、pGL3-B6、pGL3-B7[艮卩pGL3-Bl(-288+261)、pGL3-B2(-430+261)、pGL3-B3(-617+261)、pGL3-B4(-712+261)、pGL3-B5(-868+261)、pGL3-B6(-1277+261)、pGL3-B7(-1420+261)];(4)細(xì)胞培養(yǎng)Raji、KM3細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)于含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中含100U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素，置于5%C02，37。C恒溫培養(yǎng)，12d傳代一次；(5)重組報(bào)告基因質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞Raji、KM3兩種細(xì)胞各分為11組(1)pGL3-Bl組；(2)pGL3-B2組；(3)pGL3-B3組；(4)pGL3-B4組；(5)pGL3-B5組；(6)pGL3-B6組；(7)pGL3-B7組；(8)pGL3-B8組；(9)pGL3-Contro1組；(10)pGL3-Basic組；(ll)無質(zhì)?？瞻讓?duì)照組，各組均以psv-P-gal質(zhì)粒作為內(nèi)參照，將構(gòu)建的pGL3-Bl、pGL3-B2、pGL3-B、pGL3-B4、pGL3-B、pGL3-B6、pGL3-B7、pGL3-B8八種重組質(zhì)粒以及陰性對(duì)照pGL3-Basic，陽性對(duì)照pGL3-Contro1，分別轉(zhuǎn)染Raji、KM3細(xì)胞，同時(shí)共轉(zhuǎn)染psv-P-gal內(nèi)參質(zhì)粒，空白對(duì)照組不轉(zhuǎn)染任何質(zhì)粒；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑和質(zhì)粒之間的比例為3iU:4iig，待測(cè)質(zhì)粒和內(nèi)參照質(zhì)粒的比例為4:1。(6)熒光素酶活性檢測(cè)對(duì)步驟(5)中的各組，在轉(zhuǎn)染48h后分別收集并裂解細(xì)胞，進(jìn)行熒光素酶活性檢測(cè)1XPBS洗滌細(xì)胞2次，加入200iUIX裂解液，凍融一次后移入1.5mlE卯endorf管中，12000g/min，4t:離心2min，取20iU裂解上清液，用化學(xué)發(fā)光儀檢測(cè)熒光素酶活性；取50ii1裂解上清液，加入50iU13-半乳糖苷酶檢測(cè)試劑，酶標(biāo)儀測(cè)定13_半乳糖苷酶的活性；熒光素酶活性與e-半乳糖苷酶活性的比值為熒光素酶的相對(duì)活性。然后將得到的熒光素酶活性檢測(cè)數(shù)據(jù)用統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件分析。熒光素酶相對(duì)活性用x±s表示，組間差異采用t檢驗(yàn)進(jìn)行比較。結(jié)果表明8種重組質(zhì)粒在兩種細(xì)胞中啟動(dòng)子活性水平差異程度相似，其中①pGL3-B2、pGL3-B3、pGL3-B5、pGL3-B6熒光素酶活性較低，并且它們之間沒有明顯的差異(t值P>0.05);②pGL3-Bl與pGL3-B2相比，熒光素酶的相對(duì)活性顯著增強(qiáng)(t值P<0.05);③pGL3-B4與pGL3-Bl相比，熒光素酶的相對(duì)活性顯著增強(qiáng)(t值P<0.05);pGL3-B7與pGL3-B4相比，熒光素酶的相對(duì)活性顯著增強(qiáng)(t值P<0.05);⑤pGL3-B8與pGL3-B7相比，熒光素酶的相對(duì)活性明顯降低(t值P<0.05)。8權(quán)利要求一種人BAFF-R基因啟動(dòng)子活性的測(cè)定方法，其特征是包括下列步驟(1)引物設(shè)計(jì)用引物設(shè)計(jì)軟件按疊瓦方式在BAFF-R基因5’側(cè)翼序列設(shè)計(jì)八個(gè)片段的引物，八對(duì)引物具有相同的下游引物，引物的3’端加限制性內(nèi)切酶HindIII位點(diǎn)，5’端加限制性內(nèi)切酶MluI位點(diǎn)，同時(shí)在兩端分別添加6個(gè)保護(hù)堿基，便于酶切插入到載體的多克隆位點(diǎn)；八個(gè)片段的引物序列及下游引物序列為其中1-8為八個(gè)不同長(zhǎng)度片段的上游引物序列，9為八個(gè)片段3’端共同的下游引物序列；上述引物作為擴(kuò)增相應(yīng)產(chǎn)物B1、B2、B3、B4、B5、B6、B7、B8的引物，B1～B8分別與上述引物1～8對(duì)應(yīng)；(2)BAFF-R基因5’側(cè)翼區(qū)的克隆從人全血中提取基因組DNA作為模板，應(yīng)用LATaq酶PCR擴(kuò)增目的片度B8；用限制性內(nèi)切酶MluI、HindIII酶切膠回收純化后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物B8及pGL3-Basic載體，酶切產(chǎn)物經(jīng)T4連接酶連接，連接混合產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α，酶切測(cè)序鑒定陽性克隆，得到陽性重組質(zhì)粒，命名為pGL3-B8；(3)BAFF-R基因5’側(cè)翼區(qū)序列缺失質(zhì)粒的構(gòu)建以重組質(zhì)粒pGL3-B8為模板，PCR擴(kuò)增目的片段B1-B7，同構(gòu)建重組質(zhì)粒pGL3-B8的方法一樣，得到7個(gè)重組質(zhì)粒，分別命名為pGL3-B1、pGL3-B2、pGL3-B3、pGL3-B4、pGL3-B5、pGL3-B6、pGL3-B7；(4)細(xì)胞培養(yǎng)Raji、KM3細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)于含有10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中含100U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素，置于5％CO2，37℃恒溫培養(yǎng)，1～2d傳代一次；(5)重組報(bào)告基因質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞Raji、KM3兩種細(xì)胞各分為11組(1)pGL3-B1組；(2)pGL3-B2組；(3)pGL3-B3組；(4)pGL3-B4組；(5)pGL3-B5組；(6)pGL3-B6組；(7)pGL3-B7組；(8)pGL3-B8組；(9)pGL3-Control組；(10)pGL3-Basic組；(11)無質(zhì)粒空白對(duì)照組，各組均以psv-β-gal質(zhì)粒作為內(nèi)參照，將構(gòu)建的pGL3-B1、pGL3-B2、pGL3-B、pGL3-B4、pGL3-B、pGL3-B6、pGL3-B7、pGL3-B8八種重組質(zhì)粒以及陰性對(duì)照pGL3-Basic，陽性對(duì)照pGL3-Control，分別轉(zhuǎn)染Raji、KM3細(xì)胞，同時(shí)共轉(zhuǎn)染psv-β-gal內(nèi)參質(zhì)粒，空白對(duì)照組不轉(zhuǎn)染任何質(zhì)粒；在轉(zhuǎn)染48h后對(duì)各組分別收集并裂解細(xì)胞，進(jìn)行熒光素酶活性檢測(cè)。F2009102131571C00011.tif2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人BAFF-R基因啟動(dòng)子活性的測(cè)定方法，其特征是步驟(5)中裂解細(xì)胞、進(jìn)行熒光素酶活性檢測(cè)的具體方法是lXPBS洗滌細(xì)胞2次，加入200iUIX裂解液，凍融一次后移入1.5mlE卯endorf管中，12000g/min，4。C離心2min，取20yl裂解上清液，用化學(xué)發(fā)光儀檢測(cè)熒光素酶活性；取50ia裂解上清液，加入50iai3-半乳糖苷酶檢測(cè)試劑，酶標(biāo)儀測(cè)定P-半乳糖苷酶的活性；熒光素酶活性與P-半乳糖苷酶活性的比值為熒光素酶的相對(duì)活性。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的人BAFF-R基因啟動(dòng)子活性的測(cè)定方法，其特征是引物設(shè)計(jì)軟件為Primerpremier5.0。4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的人BAFF-R基因啟動(dòng)子活性的測(cè)定方法，其特征是步驟(2)中PCR反應(yīng)條件為94。C，1.5min;94。C，39S;56。C，45S，72°C，lmin，35個(gè)循環(huán)；最后72。C延伸5min;PCR產(chǎn)物經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色并照相予以鑒定。5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的人BAFF-R基因啟動(dòng)子活性的測(cè)定方法，其特征是步驟(5)中脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑和質(zhì)粒之間的比例為3iU:4yg，待測(cè)質(zhì)粒和內(nèi)參照質(zhì)粒的比例為4:1。全文摘要本發(fā)明公開了一種人BAFF-R基因啟動(dòng)子活性的測(cè)定方法，包括引物設(shè)計(jì)、BAFF-R基因5’側(cè)翼區(qū)的克隆、BAFF-R基因5’側(cè)翼區(qū)序列缺失質(zhì)粒的構(gòu)建、細(xì)胞培養(yǎng)、重組報(bào)告基因質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞、熒光素酶活性檢測(cè)等步驟。本發(fā)明易操作、準(zhǔn)確，測(cè)定了BAFF-R基因5’上游序列在不同細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄活性的差異及其不同區(qū)域轉(zhuǎn)錄活性的差異，確定了BAFF-R基因的核心啟動(dòng)子所在區(qū)域，對(duì)于研究BAFF-R基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的作用，及闡明該基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。文檔編號(hào)C12Q1/66GK101781679SQ20091021315公開日2010年7月21日申請(qǐng)日期2009年10月19日優(yōu)先權(quán)日2009年10月19日發(fā)明者丁偉峰,叢輝,倪紅兵,浦江,王惠民,王旭東,王躍國(guó),袁宏香,鞠少卿申請(qǐng)人:南通大學(xué)附屬醫(yī)院