專利名稱：：一種耐有機溶劑脂肪酶、其應用及其產生菌株的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種耐有機溶劑脂肪酶，該耐有機溶劑脂肪酶在有機相中催化合成生物柴油的應用，屬于微生物學與酶學領域。
背景技術：
：脂肪酶(Lipase,EC3.1.1.3)是一類水解酶，能催化天然油脂底物水解，產生甘油二酯、甘油單酯，脂肪酸和甘油，在非水相中能催化合成、轉酯、氨解等反應，因此被廣泛運用于精細化工、洗滌、醫藥、食品、造紙、皮革加工、紡織和飼料工業等領域。脂肪酶的很多底物不溶于，因此非水相中進行反應有利于增加底物溶解度，從而提高產率，降低成本。非水催化同時還具有以下優點具有高度的立體選擇性和區域選擇性，有機介質可改變選擇性；控制反應平衡向所需方向移動，如水解酶在有機介質中能催化脫水縮合反應；有效防止微生物污染，產物易于分離純化等。近年來，采用動植物油脂與低碳醇進行酯交換反應制備生物柴油成為的研究熱點，其中的反應物動植物油脂不溶于水，所以非水催化將大大提高產率。然而，催化反應所用的脂肪酶大多是商品酶，成本昂貴，且現有的酶在有機溶劑中的穩定性較差。因此開發出在有機溶劑中具有高活性的脂肪酶是推進脂肪酶工業化應用的重要環節。天然具有有機溶劑穩定性的脂肪酶為近年來發現的一類新型脂肪酶，具有能穩定存在于有機溶劑中的天然特性。這類脂肪酶通常由耐有機溶劑極端微生物產生。雖然已經有文章公開一些極端微生物所產的耐有機溶劑脂肪酶，但有機溶劑耐受能力較低，酶產量較低，不易純化，從而影響其應用于工業催化。
發明內容本發明的目的是提供一種耐有機溶劑脂肪酶的產生菌，以及用該產生菌制備而得的耐有機溶劑脂肪酶和該脂肪酶在有機相中催化合成生物柴油的應用。本發明提供一種耐有機溶劑脂肪酶產生菌，該菌為銅綠假單胞菌，命名為PseudomonasaeruginosaLX1，其保藏登記號為CCTCCNO:M209221。為了實現本發明的目的，本發明首先從中國境內的油污土樣中篩選獲得一株耐有機溶劑脂肪酶產生菌株LX1。對其進行生物學特征鑒定，該菌株為革蘭氏陰性菌株，無芽孢。在肉湯培養基中生長24h后，菌落直徑大小為1.5mm2mm，生長范圍為24°C37。C，最適生長溫度為27°C，生長pH為6.011.0，最適生長pH為8.0。其生理生化特性表現在過氧化氫酶反應、氧化酶反應、硝酸還原反應、明膠反應結果為陽性，在有氧條件下生長。經BI0L0G全自動細菌鑒定儀鑒定和16SrDNA序列分析，表明該菌株為Pseudomonasaeruginosa,命名為PseudomonasaeruginosaLK1。本發明對PseudomonasaeruginosaLX1進行了產酶條件優化，優化后產酶量高達40.81U/mL，比優化前8.5U/mL提高了3.8倍。本發明對該菌產生的胞外酶進行了純化，經過兩步分離純化得到電泳純的耐有機3溶劑脂肪酶，命名為耐有機溶劑LX1脂肪酶，其比活性達到156.19U/mg。本發明對該菌所產耐有機溶劑LX1脂肪酶進行固定化，通過載體硅藻土吸附后用戊二醛交聯，制備的固定化酶活力為16.5U/g。實驗表明該游離耐有機溶劑LXl脂肪酶和固定化耐有機溶劑LX1脂肪酶在多種有機溶劑中均具有較好的耐受性。本發明對該耐有機溶劑LX1脂肪酶進行了酶學性質的研究。該耐有機溶劑脂肪酶的最適反應pH為7.0，為中性脂肪酶，該脂肪酶在pH6.510.5的范圍具有很高的穩定性，在pH12.0的溶液中保溫lh以后仍然保留65%以上酶活力。其最佳反應溫度為40°C，6(TC處理lh，其殘余酶活為初始酶活的60%，表明其具有良好的熱穩定性。此酶的最佳人工底物為對硝基苯酚棕櫚酸酯。本發明PseudomonasaeruginosaLX1產生的耐有機溶劑LX1脂肪酶具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列，含有536個氨基酸。該耐有機溶劑脂肪酶的編碼基因具有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列，具有1611個核苷酸，與銅綠假單胞菌PseudomonasaeruginosaPA01氨肽酶基因同源性為99%，為首次報道的脂肪酶基因。本發明還提供耐有機溶劑LX1脂肪酶在有機相酶催化反應中的應用。所述的有機相酶催化反應可以為合成生物柴油的酯交換反應。所述的耐有機溶劑脂肪酶在有機溶劑叔丁醇體系或無溶劑中，催化底物大豆油和甲醇酯交換合成清潔能源生物柴油，轉化率達8090%。本發明的有益效果在于菌株PseudomonasaeruginosaLX1的耐有機溶劑LX1脂肪酶產率高，發酵30h脂肪酶活力達到40.81U/mL;耐有機溶劑LX1脂肪酶易純化、比活高，經過硫酸銨沉淀和離子交換層析后比活達到156.19U/mg;該脂肪酶作用pH范圍廣、耐高溫，對有機溶劑耐受性強尤其是對甲醇、乙醇和叔丁醇的耐受性使其能夠應用于生物柴油的合成。圖1為耐有機溶劑LX1脂肪酶的SDS-PAGE電泳圖，其中泳道l，Marker;泳道2，粗酶液；泳道3，硫銨沉淀后酶液；泳道4，純酶液(經硫銨沉淀、離子交換層析后得到的純酶液)；圖2顯示耐有機溶劑脂肪酶LX1的最適反應pH;圖3顯示耐有機脂肪酶LX1的pH穩定性；圖4顯示耐有機溶劑脂肪酶LX1的最適反應溫度；圖5顯示耐有機溶劑脂肪酶LX1的溫度穩定性；圖6顯示耐有機溶劑脂肪酶LX1的底物特異性，其中p-Nitrophenylpalmitate(C16)為對硝基苯酚棕櫚酸酯，p-Nitrophenylacetate(C2)為對硝基苯酚乙酸酉旨，p—Nitrophenylbutyrate(C4)為X寸石肖基苯酷丁酸酉旨，p—Nitrophenylcaprate(C8)為X寸硝基苯酚辛酸酯，p-Nitrophenyldecanoate(C10)為對硝基苯酚癸酸酯，p-Nitrophenylstearate(C18)為對硝基苯酚硬脂酸酯(C18)。本發明的微生物分類命名為銅綠假單胞菌PseudomonasaeruginosaLX1，保藏日期為2009年10月13日，保藏單位全稱為中國典型培養物保藏中心，簡稱CCTCC，保藏編號CCTCCNO:M209221。具體實施方式實施例一本實驗說明產耐有機溶劑脂肪酶天然菌株的篩選程序。初篩采用如下方法以不同濃度環己烷、甲苯、匿SO等有機溶劑為篩選壓力從油污土樣中篩選獲得耐有機溶劑極端微生物，然后采用橄欖油羅丹明B平板從其中篩選出6株脂肪酶高產菌株。橄欖油羅丹明B平板的具體配方為酵母膏lg/L，玉米漿5mL/L，iyiP04lg/L，MgS047H200.5g/L，橄欖油60mL/L，RhodaminB0.024g/L。為了獲得優良的耐有機溶劑脂肪酶產生菌，通過檢測搖瓶產酶能力及脂肪酶有機溶劑穩定性對上述6株菌進行復篩。將6株菌分別接種到產酶發酵培養基，具體配方為玉米漿15mL/L，尿素5g/L，葡萄糖5g/L，葵花籽油5mL/L，K2HP042g/L，MgS047H200.5g/L，pH7.5。培養溫度為30。C，培養時間為48h，搖床轉速為180rpm。將發酵液在10，OOOrpm，4t:下離心10min，取上清為粗酶液。檢測各菌所產粗酶液脂肪酶活力和有機溶劑穩定性，其中菌株LX1的粗酶液的脂肪酶活力達到8.5U/mL，具有優良的有機溶劑穩定性。有機溶劑穩定性的檢測方法1.5mL粗酶液中分別加入0.5mL的十六烷、十四烷、十二烷、癸烷、壬烷、辛烷、庚烷、己烷、辛醇、庚醇、己醇、戊醇、異丙醇、丙酮、甲醇、甘油、二甲基甲酰胺(DMF)和二甲基亞砜(DMSO)中的一種有機溶劑，于3(TC、150rpm震蕩處理lh，檢測脂肪酶殘余酶活。脂肪酶活力檢測方法(以對硝基苯酚棕櫚酸酯為底物)為A溶液0.05M的Na2HP0412H20-NaH2P042H20緩沖液(pH7.0)，其中含有0.6%(m/v)TritonX-100和0.1%(m/v)的阿拉伯樹膠；B溶液稱取3mg的對硝基苯酚棕櫚酸酯(p-Nitrophenylpalmitate，pNPP)，溶解在lmL的異丙醇中；A溶液與B溶液按體積比9:1制成濃度為16.5mM的對硝基苯酚棕櫚酸酯底物溶液。反應體系中先加入10iiL稀釋適當倍數的酶液，以滅活的酶液為空白對照，再加入240iiL底物溶液，在酶標儀中進行反應，反應溫度為4(TC，反應時間為10min，在410nm波長下檢測反應結束時生成的對硝基苯酚(pNP)的量。每l個單位(U)脂肪酶酶活定義為，在相應條件下，每毫升酶液每分鐘催化產生1iimol對硝基苯酚(pNP)所需的酶量。實施例二本實驗說明耐有機溶劑脂肪酶產生菌LX1的生物學性質、鑒定及其產酶條件研允。菌株LX1的生物學性質革蘭氏染色表明此菌株為革蘭氏陰性菌株，無芽孢。在肉湯培養基中生長24h后，菌落大小直徑為1.5mm2mm，生長溫度范圍為24°C37。C，最適生長溫度為27°C，生長pH范圍為6.011.0，最適生長pH為8.0，其生理生化特性表現在，過氧化氫酶反應、氧化酶反應、硝酸還原反應、明膠反應結果為陽性，在有氧條件下生長。菌株LX1的菌種鑒定經BIOLOG自動細菌鑒定儀鑒定和16SrDNA序列分析，表明該菌株為銅綠假單胞菌，并將其命名為PseudomonasaeruginosaLX1。[OO33]PseudomonasaeruginosaLX1產酶條件研究采用單因素替換法研究發酵培養基的碳源(葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、淀粉、糊精)、氮源(玉米漿、酵母膏、牛肉膏、酵母粉、胰蛋白胨、玉米粉)、誘導劑(葵花籽油、菜籽油、花生油、橄欖油、大豆油、玉米油、油酸、棕櫚酸、三丁酸甘油酯)、初始PH，菌種的接種齡、接種量，發酵溫度及搖床轉速等對PseudomonasaeruginosaLX1產脂肪酶的影響，并用響應曲面法優化其產酶水平，得出優化后的培養基組分為葡萄糖5g/L，玉米漿20mL/L，牛肉膏10g/L，MgS047H200.5g/L，K2HP043H202g/L，菜籽油5mL/L，發酵初始pH8.0;優化后的培養條件為接種量5%(V/V)，接種齡10h，發酵溫度27°C，搖床轉速220rpm，裝液量40mL/250mL。在此優化條件下，發酵30h后，酶活力達到40.81U/mL，與初始培養基及培養條件下酶活8.5U/mL相比，提高了3.8倍，高于已報道來源于Pseudomonasaeruginosa的耐有機溶劑脂肪酶活力。實施例三本實驗說明耐有機溶劑LX1脂肪酶的純化程序。將PseudomonasaeruginosaLX1在產酶培養基中培養30h后，發酵液在10，000rpm，4t:離心10min，取上清為粗酶液；將粗酶液置于冰浴中，先用20%飽和度的硫酸銨沉淀，離心后取上清，再用50%飽和度的硫酸銨沉淀，沉淀用0.01M的pH7.10的Tris-HCl緩沖液溶解，透析除鹽。將以上處理得到的酶液，采用DEAE-S印haroseFF離子交換層析柱進行純化，以0.01M的Tris-HCl(pH7.10，NaCl含量為lmol/L)緩沖液進行洗脫，收集脂肪酶活力峰。通過SDS-PAGE電泳圖(圖l)，發現兩步純化后的耐有機溶劑脂肪酶(命名為耐有機溶劑LX1脂肪酶)已達電泳純，該脂肪酶亞基分子量約為56kDa。純化倍數為4.29倍，回收率為41.09%，最終脂肪酶比活達到156.19U/mg，匯總見表1。表1耐有機溶劑LX1脂肪酶的純化步驟及結果總活力(u)總蛋白(mg)比活力(U/mg)回收率(%)純化倍數粗酶液721.2219.8036.431001硫酸銨沉淀423.606.5664.6258.731.77DEAE-SepharoseFF296.361.90156.1941.094.29注蛋白質濃度采用考馬斯亮蘭法測定實施例四本實驗說明耐有機溶劑LX1脂肪酶編碼基因的分離克隆程序。采用酚-氯仿法抽提菌體總DNA。將純化的耐有機溶劑LX1脂肪酶做LC-MS/MS(委托國家生物醫學分析中心(NBCA)進行LC/MS/MS序列分析)測定其氨基酸片段，結果表明該酶與銅綠假單胞菌PseudomonasaeruginosaPA01中氨肽酶序列最相近，因此在此酶CDS兩端外各約150bp處設計引物，擴增耐有機溶劑LXl脂肪酶的CDS編碼序列。將含有CDS編碼序列的PCR片段電泳回收后克隆到pMD18-T載體，進行序列分析。設計的引物為LU1(SEQID:3):GCTTATCGATCATCGCCTCACLD1(SEQID:4):CGAACTGGGGCTGGACATPCR反應參數為94。C預變性2min;94。C變性30sec;65。C退火30sec，72°C延伸lmin30sec;循環30輪后，72。C保溫10min。根據該反應條件，擴增到了1.9kb的PCR片段。將此片段連接到pMD18-T載體，進行序列測定。結果表明，此片段有一個全長為1611bp的閱讀框，含有信號肽序列24個氨基酸，編碼成熟蛋白氨基酸498個。與銅綠假單胞菌6PseudomonasaeruginosaPA01氨肽酶基因同源性為99%。實施例五本實驗說明耐有機溶劑LXl脂肪酶的固定化方法。在250mL搖瓶中加入lg硅藻土和5mL耐有機溶劑LXl脂肪酶(按照實施例3獲得)，在水浴搖床中(2(TC，120rpm)固定lh，倒出上清，并且用pH7.0磷酸緩沖液洗滌3遍，再加入0.5%(v/v)的戊二醛溶液5mL，在水浴搖床中(20°C，120rpm)固定lh后倒出上清，冷凍干燥即制備得到交聯的固定化脂肪酶。所制備的固定化脂肪酶活力為16.5U/g。實施例六本實驗說明耐有機溶劑LXl脂肪酶的酶學性質。耐有機溶劑LXl脂肪酶的有機溶劑耐受性向12種有機溶劑中分別加入耐有機溶劑LXl脂肪酶(按照實施三制備)，其混合比例為1:3(V/V)，對照中不添加有機溶劑。3(TC，150rpm振蕩48h后取樣，以對硝基苯酚棕櫚酸酯為底物檢測脂肪酶活力。固定化耐有機溶劑LXl脂肪酶(按照實施例四制備)在有機溶劑中處理lh，結果如表2所示。耐有機溶劑LX1脂肪酶具有良好的有機溶劑耐受性，游離耐有機溶劑LX1脂肪酶在25X(v/v)的正十六烷、異辛烷、正己烷、丙酮、DMF、匿SO和甘油中與對照(不加有機溶劑)相比半衰期變大，但固定化耐有機溶劑LXl脂肪酶有機溶劑耐受性發生了改變，在游離酶耐受性較差的有機溶劑叔丁醇和乙腈中固定化酶的半衰期大于10天。該脂肪酶對于甲醇、乙醇和叔丁醇的耐受性可以指導生物柴油的合成。表2有機溶劑對LXl脂肪酶的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注括號中的數據為耐有機溶劑LXl脂肪酶在不同有機溶劑中的半衰期耐有機溶劑LX1脂肪酶最適反應pH和pH穩定性的檢測以不同pH緩沖液溶解的對硝基苯酚棕櫚酸酯為底物，pH7.0條件下的脂肪酶活力為對照(100X)，不同pH體系中的酶活如圖2所示。耐有機溶劑LXl脂肪酶的最適反應pH為7.0，是中性脂肪酶。以原始酶液的脂肪酶活力為對照，檢測該酶的pH穩定性(圖3)。將耐有機溶劑LX1脂肪酶加入不同pH的緩沖溶液中3(TC保溫lh后測殘余酶活，實驗表明該脂肪酶在pH6.510.5的范圍內具有較高的穩定性，在pH12.0的溶液中保溫lh后，仍然保留65%的活力。耐有機溶劑LX1脂肪酶最適反應溫度和熱穩定性的檢測最適反應溫度的測定在0.05MNa2HP0412H20-NaH2P04*21120緩沖體系(pH7.0)中進行，在不同的溫度下以對硝基苯酚棕櫚酸酯為底物進行酶促反應。結果顯示該酶的最適反應溫度為4(TC(圖4)，在6(TC條件下反應仍然具有最佳情況下20%的酶活力。熱穩定性測定耐有機溶劑LX1脂肪酶在30°C、40°C、50°C、60°C、70°C下處理lh以后，測定殘留酶活。由圖5可以看出該脂肪酶具有較好的熱穩定性，在6(TC處理lh后仍然保留60%的活力。耐有機溶劑LX1脂肪酶底物特異性的檢測參照以對硝基苯酚棕櫚酸酯為底物的脂肪酶活力測定方法來檢測底物特異性，將對硝基苯酚棕櫚酸酯(C16)分別替換為對硝基苯酚乙酸酯(C2)，對硝基苯酚丁酸酯(C4)，對硝基苯酚辛酸酯(C8)，對硝基苯酚癸酸酯(C10)，對硝基苯酚硬脂酸酯(C18)。結果如圖6，耐有機溶劑LX1脂肪酶的最適人工底物為對硝基苯酚棕櫚酸酯。耐有機溶劑LX1脂肪酶催化性能檢測由于該脂肪酶與銅綠假單胞菌PseudomonasaeruginosaPA01氨肽酶基因同源性為99%，因此采用檢測其催化性能的方式來進一步確定其為脂肪酶。以對硝基苯酚棕櫚酸酯為底物(脂肪酶底物)時，該酶轉化數為6.1*105S—、以丙氨酸對硝基苯胺為底物(氨肽酶底物)時，該酶轉化數6.0*1035—、可以看出，該酶對對硝基苯酚棕櫚酸酯的催化效率遠遠大于丙氨酸對硝基苯胺，因此該酶的天然底物為酯類(脂類)物質而不是酰胺類物質，我們所研究的耐有機溶劑LX1脂肪酶確實是新型的脂肪酶。實施例七本實驗說明耐有機溶劑LX1脂肪酶在有機相中制備生物柴油合成的應用以5mmo1(4.5g)的大豆油和15mmo1(600yL)的甲醇作為反應底物，其中甲醇一步加入；以叔丁醇、正己烷、異辛烷作為溶劑或無溶齊U，溶劑的加入量為5mL;加入lg固定化耐有機溶劑LXl脂肪酶，在3(TC，轉速150rpm條件下反應，定時取樣。樣品用正己烷稀釋適當倍數，采用GC進行檢測(以不同的脂肪酸甲酯為標準品)。結果表明，叔丁醇為最佳溶劑，生物柴油的轉化率24h后達到80%90%。SEQUENCELISTING〈110〉南京工業大學〈120〉一種耐有機溶劑脂肪酶、其應用及其產生菌株〈130〉njut20092〈160>4〈170>PatentInversion3.3〈210>1〈211>1611〈212>DNA〈213>PseudomonasaeruginosaLX1〈220〉〈221>CDS〈22:(1608)〈220〉〈221>sig_peptide〈22:..(72)〈220〉〈221>mat_peptide〈22:L5)..0〈400>1Eltgage朋c朋g朋c朋tetc3gatacgCEletcggcgccetcgccetc48MetSerAsnLysAsnAsnLeuArgTyrAlaLeuGlyAlaLeuAlaLeu-35-30-25tcggtttecgccgCEltecctggcggCElccttcgg朋gcgc朋CElgttc96SerValSerAlaAlaSerLeuAlaAlaProSerGluAlaGinGinPhe-20-15-103CCgagttctgg3Cgcccggcaaaccc朋cccgtcgatetgctcg144ThrGluPheTrpThrProGlyLysProAsnProSerlieCysLysSer_5_11510ccgttgctggtcage3CCccgcttggcctgccgcgctgcctggcc192ProLeuLeuValSerThrProLeuGlyLeuProArgCysLeuGinAla152025age朋cgtggtc朋gcgcctgCElg朋gctggagg￡lCategccElgtetc240SerAsnValValLysArgLeuGinLysLeuGluAsplieAlaSerLeu303540朋cg￡lCggc朋ccgcgccgccgcc3CgccgggctacCElggcctecgtc288AsnAspGlyAsnArgAlaAlaAlaThrProGlyTyrGinAlaSerVal455055g￡lCtacgtg朋gCElg3CCctgCElggccggctac朋ggtcagegtg336AspTyrValLysGinThrLeuGinLysAlaGlyTyrLysValSerVal606570CElgcccttcccgttc3CCgcctactacccgaaaggcccgggtagectg384GinProPheProPheThrAlaTyrTyrProLysGlyProGlySerLeu75808590agegcc3CCgtgccgCElgccggtc3CCtacg朋tgggag朋ggatttc432SerAlaThrValProGinProValThrTyrGluTrpGluLysAspPhe951001059ctgtcgCElg3CCgaggCElggcgacgtcaccgccaaggtggtc480[o川]ThrTyrLeuSer110GinThrGluAlaGly115AspValThrAlaLysValVal120ccggtgg￡lCctgtecetcggcgccggcaacacctecaccageggttgc528ProValAspLeuSerLeuGlyAlaGlyAsnThrSerThrSerGlyCys125130135gaggcgg朋g￡lCttcgcc朋cttcccggccggctcgategcgctgate576GluAlaGluAspPheAlaAsnPheProAlaGlySerlieAlaLeulie140145150CElgcgcggc3CCtgc朋cttcgagCElgaaggccgagaacgccgcggcc624GinArgGlyThrCysAsnPheGluGinLysAlaGluAsnAlaAlaAla155160165170gccggcgccgccggggtgateatettc朋ccagggc朋C3CCgacgac672AlaGlyAlaAlaGlyVallieliePheAsnGinGlyAsnThrAspAsp175180185cgc朋gggcctggag朋cgtc3CCgtgggcgagtectecgagggcggc720ArgLysGlyLeuGluAsnValThrValGlyGluSerTyrGluGlyGly190195200ateccggtgatettcgcc3CCtacg￡lCaacggcgtggcctggtcgcag768lieProValliePheAlaThrTyrAspAsnGlyValAlaTrpSerGin2052102153CCccgg￡lCctgCElgttgC3Cctggtggtcgacgtggtacgcaagaag816ThrProAspLeuGinLeuHisLeuValValAspValValArgLysLys2202252303CCgag3CCtac朋cgtggtcgccgagacccgtcgcggcaacccgaac864ThrGluThrTyrAsnValValAlaGluThrArgArgGlyAsnProAsn235240245250朋cgtggtgEltggtcggcgcgC3Cetcgactcggtgttcgaaggcccc912AsnValValMetValGlyAlaHisLeuAspSerValPheGluGlyPro255260265ggtate朋cg￡lC朋cggttcgggcagegccgcccaactggagatggcc960GlylieAsnAspAsnGlySerGlySerAlaAlaGinLeuGluMetAla270275280gtgctgctggcc朋ggcgctgccggtcaacaaggtgcgcttcgcctgg1008ValLeuLeuAlaLysAlaLeuProValAsnLysValArgPheAlaTrp285290295tggggcgccgagg朋gccggcctggtgggctcgacccactecgtgcag1056TrpGlyAlaGluGluAlaGlyLeuValGlySerThrHisTyrValGin30030531010ccgg朋gag朋g朋gaagateaaggcctecctgaacttc1104AsnLeuAlaProGluGluLysLysLyslieLysAlaTyrLeuAsnPhe315320325330g￡lCEltgateggctcgccg朋cttcggcaacttcatetatgacggcgac1152AspMetlieGlySerProAsnPheGlyAsnPhelieTyrAspGlyAsp335340345ggttecg￡lCttcggcetcCElgggtccgcccggctcggccgccategag1200GlySerAspPheGlyLeuGinGlyProProGlySerAlaAlalieGlu350355360cgcctgttcg朋gcctacttccgcctgcgcggccagcaatcggaaggc1248ArgLeuPheGluAlaTyrPheArgLeuArgGlyGinGinSerGluGly3653703753CCgagategacttccgctecg￡lCtacgccgagttcttcaacageggc1296ThrGlulieAspPheArgSerAspTyrAlaGluPhePheAsnSerGly380385390ategccttcggcggcctgttc3CCggcgccgagggcctgaagaccgaa1344lieAlaPheGlyGlyLeuPheThrGlyAlaGluGlyLeuLysThrGlu395400405410gagCElggcgC3g朋gtacggcggcaccgccggcaaggcctecgacgag1392GluGinAlaGinLysTyrGlyGlyThrAlaGlyLysAlaTyrAspGlu415420425tgctacC3Cage朋gtgcg￡lCggc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